KR20100108413A - 바실러스 및 스트렙토마이세스 종 내 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 (ｓｓｉ) 단백질의 발현 - Google Patents

Abstract

신호 서열 및 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 (SSI) 단백질을 함유하는 융합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 스트렙토마이세스 및 바실러스 숙주 세포와, 이러한 세포를 사용하여 SSI 단백질을 제조하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 스트렙토마이세스 숙주 세포이고, 신호 서열은 celA 신호 서열이다. 다른 구현예에서, 숙주 세포는 비활성화된 프로테아제 유전자를 함유하는 게놈을 가지고 있는 바실러스 숙주 세포이다.

Description

바실러스 및 스트렙토마이세스 종 내 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 (ＳＳＩ) 단백질의 발현 {EXPRESSION OF STREPTOMYCES SUBTILISIN INHIBITOR (SSI) PROTEINS IN BACILLUS AND STREPTOMYCES SP.}

프로테아제는 많은 시판 제품에서 발견되며, 현재의 가장 큰 용도는 세탁 세제에서 사용되는 것이다. 그러나, 많은 프로테아제들이 불안정하고, 자가-가수분해 또는 자가분해를 겪는다고 알려져 있다. 이러한 불안정성은, 특히 프로테아제가 제품 내에서 활성인 경우에는 프로테아제-함유 제품의 유통 기간에 제한을 가할 수 있다.

액체 세탁 세제 내의 프로테아제는 많은 상이한 방식으로 안정화될 수 있다. 예를 들어, 액체 세탁 세제 내의 프로테아제는 1,2-프로판디올과 붕산의 조합과 같은 소분자에 의해 안정화될 수 있다. 이러한 분자는 미희석된 세탁 세제 내의 자가분해적 프로테아제 활성을 최소화하고 세탁 세제 사용 희석시 프로테아제로부터 용리되어, 프로테아제가 활성이 되도록 한다. 다른 경우에서, 액체 세탁 세제 내의 프로테아제는 상기 프로테아제의 단백질성 억제제에 의해 안정화될 수 있다. 단백질성 프로테아제 억제제는, 사용되는 프로테아제과 함께 제조될 수 있고 추가로 소분자 억제제보다 훨씬 더 적은 농도로 사용될 수 있다는 점에서 소분자 프로테아제 억제제에 비해 유리하다.

본 출원은 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 단백질 ("Streptomyces Subtilisin Inhibitor: SSI 단백질") 로 알려져 있는 단백질성 프로테아제 억제제의 제조에 관한 것이다. SSI 단백질은 가정용 세제 제품에서 흔히 발견되는 프로테아제인 서브틸리신의 억제제이다.

발명의 요약

신호 서열 및 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 (SSI) 단백질을 함유하는 융합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 스트렙토마이세스 종 (Streptomyces sp.) 및 바실러스 종 (Bacillus sp.) 숙주 세포와, 이러한 세포를 사용하여 SSI 단백질을 제조하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 스트렙토마이세스 숙주 세포이고, 재조합 핵산은 celA 신호 서열인 신호 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 숙주 세포는 1 종 이상의 비활성화된 프로테아제 유전자를 함유하는 게놈을 가지고 있는 바실러스 숙주 세포이다.

특정 구현예에서, a) celA 신호 서열; 및 b) 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 (SSI) 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 스트렙토마이세스 종 숙주 세포가 제공된다. 상기 세포는 상기 세포로부터 배양 배지 내로 상기 SSI 단백질을 분비할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 SSI 단백질은 자연 발생적 SSI 단백질과 비교하여, 서브틸리신의 존재하에 안정성이 증가되고/거나 서브틸리신에 대한 친화성이 감소될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 SSI 단백질은 위치 62 에 Lys, 위치 63 에 Ile, 위치 73 에 Pro, 위치 83 에 Cys 및 위치 98 에 Glu 를 갖는, SEQ ID NO: 1 과 적어도 95% 일치하는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

특정 구현예에서, celA 신호 서열은 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans) 의 celA 유전자에 의해 인코딩되는 신호 서열일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 celA 신호 서열은 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

스트렙토마이세스 종 숙주 세포는, 특정 경우에 비활성화된 ssi 유전자를 함유할 수 있는 S. 리비단스 (S. lividans) 숙주 세포일 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 재조합 핵산은 프로모터 및 터미네이터에 작동가능하게 연결되어 SSI 단백질의 발현을 위한 발현 카세트를 형성할 수 있다. 상기 재조합 핵산은 상기 스트렙토마이세스 종 숙주 세포 내 상기 SSI 융합 단백질의 발현에 최적화된 코돈일 수 있다. 재조합 핵산은 상기 숙주 세포의 게놈 내에 또는 상기 세포 내에서 자가 복제되는 벡터 내에 존재할 수 있다.

다수의 상기 기재된 스트렙토마이세스 종 숙주 세포 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물이 제공된다. 바람직한 구현예에서, 상기 세포 배양물은 SSI 단백질을 포함한다.

상기 기재된 스트렙토마이세스 숙주 세포를 배양하여 배양 배지 내로 상기 SSI 단백질이 분비되도록 하는 것을 포함하는 SSI 단백질의 제조 방법이 제공된다. 상기 방법은 상기 배양 배지로부터 상기 SSI 단백질을 회수하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 단백질과 세탁 세제를 조합하여, 서브틸리신 프로테아제 및 상기 SSI 단백질을 모두 함유하는 세제를 제조할 수 있다. 상기 세탁 세제는 무-붕사 세탁 세제일 수 있다.

대안적인 구현예에서, a) 신호 서열; 및 b) 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 (SSI) 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 바실러스 종 숙주 세포가 제공된다. 상기 숙주 세포는 세포로부터 SSI 단백질을 분비할 수 있고, 상기 숙주 세포는 비활성화된 aprE, nprE, epr, ispA, bpr, vpr, wprA, mpr-ybjF 및/또는 nprB 유전자를 가질 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 SSI 단백질은 자연 발생적 SSI 단백질과 비교하여, 서브틸리신의 존재하에 안정성이 증가되고/거나 서브틸리신에 대한 친화성이 감소될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 단백질은 위치 62 에 Lys, 위치 63 에 Ile, 위치 73 에 Pro, 위치 83 에 Cys 및 위치 98 에 Glu 를 갖는, SEQ ID NO: 1 과 적어도 95% 일치하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 신호 서열은 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 의 aprE 유전자에 의해 인코딩되는 신호 서열일 수 있다.

바실러스 종 숙주 세포는 degU^Hy32, oppA, ΔspoIIE3501, ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpr, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybjF, ΔnprB, amyE::xylRPxylAcomK-ermC 유전형을 가질 수 있고, 특정 구현예에서, B. 서브틸리스 숙주 세포일 수 있다.

상기 재조합 핵산은 프로모터 및 터미네이터에 작동가능하게 연결되어 SSI 단백질의 발현을 위한 발현 카세트를 형성할 수 있다. 상기 재조합 핵산은 상기 바실러스 종 숙주 세포 내에서 상기 SSI 융합 단백질의 발현에 최적화된 코돈일 수 있다. 재조합 핵산은 상기 숙주 세포의 게놈 내에 또는 상기 세포 내에서 자가 복제되는 벡터 내에 존재할 수 있다.

다수의 상기 기재된 바실러스 종 숙주 세포 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 배양 배지는 SSI 단백질을 함유할 수 있다.

상기 기재된 바실러스 세포를 배양하여 배양 배지 내로 상기 SSI 단백질이 분비되도록 하는 것을 포함하는 SSI 단백질의 제조 방법이 제공된다. 상기 방법은 상기 배양 배지로부터 상기 SSI 단백질을 회수하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 SSI 단백질과 세탁 세제를 조합하여, 서브틸리신 프로테아제 및 상기 SSI 단백질을 모두 함유하는 세제를 제조할 수 있다. 상기 세탁 세제는 무-붕사 세탁 세제일 수 있다.

상세한 설명

정의

본원에 다르게 정의되지 않는 경우, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. [Singleton, et al, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994)], 및 [Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)] 에 본 발명에서 사용되는 많은 용어에 대한 일반적인 의미가 제공되어 있다. 본원에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 및 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기재되어 있다.

본원에 참조되는 모든 특허 및 공보는, 이러한 특허 및 공보 내에 기재되어 있는 모든 서열을 포함하여 참조로써 표현적으로 인용된다.

수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다. 다르게 지시되지 않는다면, 핵산은 5' 에서 3' 방향으로 좌에서 우로 표기하며; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 좌에서 우로 각각 표기한다.

본원에 제시된 표제는 전체로서 명세서에 대한 참조가 될 수 있는 본 발명의 다양한 양상 또는 구현예의 제한이 아니다. 따라서, 바로 이하에 정의된 용어는 전체로서 명세서에 대한 참조로서 더욱 완전히 정의된다.

"프로모터" 라는 용어는 본원에서, 세포 내에서 하류방향 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시하는 핵산으로서 정의된다. 특정 경우에서, 폴리뉴클레오티드는 코딩 서열을 함유할 수 있고, 프로모터는 번역가능한 RNA 로의 코딩 서열의 전사를 지시할 수 있다.

"코딩 서열" 이라는 용어는 본원에서, 프로모터를 비롯한 적합한 통제 서열의 통제하에 놓이는 경우, 폴리펩티드로 번역될 수 있는 mRNA 로 전사되는 핵산으로서 정의된다. 코딩 서열은 예를 들어 단일 오픈 리딩 프레임, 또는 인트론에 의해 분리된 여러 오픈 리딩 프레임을 함유할 수 있다. 코딩 서열은 예를 들어 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 재조합 DNA 일 수 있다. 코딩 서열은 일반적으로 시작 코돈 (예를 들어, ATG) 에서 시작하고, 중지 코돈 (예를 들어, UAA, UAG 및 UGA) 에서 끝난다.

"재조합" 이라는 용어는 숙주 세포에서 자연 발생되지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 말한다. 재조합 분자는 자연 발생되지 않는 방식으로 함께 연결된 2 종 이상의 자연 발생적 서열을 함유할 수 있다.

"이종" 이라는 용어는 정상적으로는 서로 관련되어 있지 않은 요소를 말한다. 예를 들어, 숙주 세포가 이종 단백질을 생성하는 경우, 상기 단백질은 상기 숙주 세포에서 정상적으로는 생성되지 않는다. 마찬가지로, 이종 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는, 야생형 숙주 세포 내에서 통상 작동가능하게 연결되지 않은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터이다. 폴리뉴클레오티드 또는 단백질과 관련하여 "상동" 이라는 용어는, 숙주 세포에서 자연 발생되는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 말한다.

"작동가능하게 연결된" 이라는 용어는 요소들이 기능적으로 관련되도록 하는 요소의 배열을 말한다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 서열의 전사를 통제하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고, 신호 서열은 신호 서열이 숙주 세포의 분비 시스템을 통해 단백질을 유도하는 경우 단백질에 작동가능하게 연결된다.

"핵산" 이라는 용어는 DNA, RNA, 단일 또는 이중 가닥 및 이의 변형체를 포함한다. "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드" 라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "DNA 구축물" 이라는 용어는 2 종 이상의 DNA 폴리뉴클레오티드 절편을 포함하는 핵산 서열을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "리포터" 라는 용어는 쉽게 검출되고 측정되는 단백질을 말한다. 특정 경우에서, 리포터는 시각적으로 검출가능할 (예를 들어, 형광, 발광 또는 색상발현) 수 있다.

"신호 서열" 또는 "신호 펩티드" 라는 용어는 세포 외부로 단백질의 성숙 형태의 분비를 용이하게 하는 단백질의 N-말단 부분에 있는 아미노산의 서열을 말한다. 세포외 단백질의 성숙 형태는 분비 과정 동안 절단 제거되는 신호 서열이 결핍되어 있다.

본원에서 "벡터" 라는 용어는 1 종 이상의 세포 내에 도입되는 핵산 서열을 갖도록 디자인된 폴리뉴클레오티드로서 정의된다. 벡터에는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 파지 또는 바이러스 입자, DNA 구축물, 카세트 등이 포함된다. 발현 벡터에는 프로모터, 신호 서열, 코딩 서열 및 전사 터미네이터와 같은 조절 서열이 포함될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "발현 벡터" 라는 용어는 적합한 숙주 내에서 단백질의 발현에 영향을 줄 수 있는 적합한 통제 서열에 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 DNA 구축물을 의미한다. 이러한 통제 서열은 전사에 영향을 주기 위한 프로모터, 전사를 통제하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, mRNA 상의 적합한 리보솜 결합 부위를 인코딩하는 서열, 인핸서 및 전사 및 번역의 종결을 통제하는 서열을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "폴리펩티드" 및 "단백질" 이라는 용어는 상호교환적으로 사용되고, 임의의 수의 아미노산 잔기의 중합체에 대한 참조를 포함한다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생적 아미노산, 뿐 아니라 자연 발생적 아미노산 중합체의 인공적 화학 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드가 기능적으로 남아있는 식의, 보존된 아미노산 치환을 함유하는 중합체에 적용된다. "펩티드" 는 50 개 미만의 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드이다.

"숙주 세포" 는 숙주 세포의 게놈 내에 또는 숙주 세포의 게놈으로부터 자가 복제되는 염색체외부 벡터 내에 재조합 핵산을 함유하는 세포이다. 숙주 세포는 임의의 세포 유형일 수 있다.

"형질전환" 은 DNA 가 염색체외부 요소 또는 염색체 통합체로서 세포 내에 유지되도록 DNA 를 세포 내에 도입하는 것을 의미한다.

"비활성화된 유전자" 는 비활성화 전에는 단백질을 생성할 수 있는 (즉, 번역되어 전장의 촉매적으로 활성인 폴리펩티드를 생성할 수 있는 RNA 로 전사될 수 있는) 게놈의 유전자좌이다. 유전자는 전장의 촉매적으로 활성인 단백질로 전사 및 번역되지 않은 경우 비활성화된다. 유전자는 예를 들어, 전사에 필요한 서열을 변경함으로써, RNA 프로세싱에 필요한 서열을 변경함으로써 (예를 들어, 폴리-A 테일 첨가), 번역에 필요한 서열을 변경함으로써 비활성화될 수 있다. 결실된 유전자, 결실된 영역을 함유하는 유전자, 재배열된 영역을 함유하는 유전자, 비활성화 지점 돌연변이 또는 프레임쉬프트를 갖는 유전자 및 삽입을 함유하는 유전자가 비활성화 유전자의 유형이다. 유전자는 또한 안티센스, RNA 간섭 또는 유전자의 발현을 없애는 임의의 기타 방법을 사용하여 비활성화될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "회수된", "단리된", 및 "분리된" 이라는 용어는 자연적으로 관련된 하나 이상의 성분으로부터 제거된 단백질, 세포, 핵산 또는 아미노산을 말한다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "배양" 이라는 용어는 액체, 고체 또는 반고체 배지 내 적합한 조건하에서의 미생물 세포 집단의 성장을 말한다. 하나의 구현예에서, 배양은 관심의 외생 단백질 또는 기타 바람직한 최종 산물의 발효적 재조합 제조를 말한다. 전형적으로, 발효는 용기 또는 반응기에서 일어난다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "서브틸리신" 및 "서브틸리신 단백질" 이라는 용어는 펩티다아제의 S8 족의 세린 엔도펩티다아제를 말한다. 서브틸리신 단백질은 IUMBM 효소 명명법에 따라 EC 3.4.21.62 로서 기재되는 활성을 갖는다. 예시적 서브틸리신 단백질의 활성은 일반적으로 [Philipp et al, (Mol. Cell. Biochem. 1983 51 : 5-32)] 에 기재되어 있다.

본원에 사용되는 바와 같은 "스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 단백질" 또는 "SSI 단백질" 이라는 용어는, 스트렙토마이세스 알보그리세올러스 (Streptomyces albogriseolus) 유래의 자연 발생적 SSI 단백질을 말한다.

(SEQ ID NO: 1), 및 서브틸리신 프로테아제 억제 활성을 보유하는 단백질의 변이체가 하기에 더욱 상세히 기재될 것이다. SSI 단백질은 서브틸리신의 프로테아제 활성을 억제한다.

다르게 언급되지 않는 경우, 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 단백질 내의 모든 아미노산 위치는 [National Center of Biotechnology Information (NCBI)] 웹사이트에서 이용가능한 바와 같은, 디폴트 조건하에서의 BLASTP 프로그램 (Altschul, Nucl. Acids Res. 1997 25:3389-3402; Schaffer, Bioinformatics 1999 15:1000-1011) 을 이용하여 SEQ ID NO: 1 과 단백질을 정렬한 후 SEQ ID NO: 1 과 비교한 것이다.

SSI 단백질

상기 언급된 바와 같이, 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 (SSI) 단백질을 분비하는 숙주 세포가 제공된다. 주제의 숙주 세포는 작동가능한 연결 내에, 신호 서열 및 SSI 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산을 일반적으로 함유한다.

SSI 단백질은 스트렙토마이세스의 임의의 종 유래의 자연 발생적 SSI 단백질 (예를 들어, 스트렙토마이세스 알보그리세올러스의 SSI 단백질 (SEQ ID NO: 1)) 또는 서브틸리신 프로테아제 억제 활성을 보유하는 이의 변이체일 수 있다. 서브틸리신 프로테아제 억제 활성을 보유하는 변이체 SSI 단백질의 예는 알려져 있고 WO 00/01826 의 표 2-10, 뿐 아니라 본원에 참조로서 인용되는 참조문헌 Kojima et al., (J. Biochem (1991) 109:377-382), Kojima et al., (Protein Eng. (1990) 3:527-530), Tamura et al., (Biochemistry (1994) 33: 14512-14520), Tamura and Sturtevant (J. Mol. Biol. (1995) 249:625-635), Tamura and Sturtevant (J. Mol. Biol. (1995) 249:646-653) Ganz et al., (Protein Eng. Design and Selection (2004) 17:333-339) 및 WO 98/13387 에 열거된 대략 230 개의 SSI 단백질을, 상기 문헌에 기재된 임의의 및 모든 SSI 단백질 서열을 비롯하여 포함한다. 특정 구현예에서, SSI 단백질은 SEQ ID NO: 1 과 적어도 80% 일치하는, 예를 들어, SEQ ID NO: 1 과 적어도 85% 일치하는, 적어도 90% 일치하는, 적어도 95% 일치하는, 적어도 97% 일치하는 또는 적어도 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, SSI 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 과 적어도 90% 또는 적어도 95% 일치성을 가질 수 있고 SEQ ID NO: 1 에 대해 하기 아미노산 치환을 함유한다: A62K, L63I, M73P, D83C 및 S98E. 따라서, 특정 구현예에서, SSI 단백질의 아미노산 서열은 위치 62 에 Lys, 위치 63 에 Ile, 위치 73 에 Pro, 위치 83 에 Cys 및 위치 98 에 Glu 를 갖는, SEQ ID NO: 1 과 적어도 90% 또는 적어도 95% 일치할 것이고, SSI 에서의 이들 위치 각각은 SSI 단백질과 SEQ ID NO: 1 을, 예를 들어 디폴트 파라미터를 사용하는 BLASTP (Altschul, Nucl. Acids Res. (1997) 25:3389-3402; Schaffer, Bioinformatics (1999) 15: 1000-1011) 와 같은 표준 서열 정렬 방법을 사용하여 정렬하는 경우 SEQ ID NO: 1 과 비교하여 정의된다. 특정 구현예에서, SSI 단백질은 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

특정 구현예에서, 주제의 숙주 세포에 의해 제조되는 SSI 단백질은 스트렙토마이세스 알보그리세올러스의 자연 발생적 SSI 단백질 (SEQ ID NO: 1) 과 비교하여, 서브틸리신 프로테아제의 존재하에 안정성이 증가되거나 감소될 수 있다. 다른 구현예에서, 주제의 숙주에 의해 제조되는 SSI 단백질은 스트렙토마이세스 알보그리세올러스의 자연 발생적 SSI 단백질 (SEQ ID NO: 1) 과 비교하여, 서브틸리신 프로테아제에 대한 결합 친화성이 증가되거나 감소될 수 있다. 이러한 SSI 단백질의 여러 예는 이전 단락에서 기술된 참조문헌에 기재되어 있다.

하나의 구현예에서, SSI 단백질은 스트렙토마이세스 알보그리세올러스의 자연 발생적 SSI 단백질 (SEQ ID NO: 1) 보다, 서브틸리신 프로테아제 (예를 들어, BPN') 의 존재하에서 더욱 안정하고, 서브틸리신 프로테아제에 대한 친화성이 더욱 낮은 (예를 들어, 160 +/- 17 nM 의 K _i ) SSI 단백질인 [Ganz, supra] 에 논의된 바와 같은 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

재조합 핵산

주제의 세포의 재조합 핵산은 일반적으로 작동가능한 연결 내에: 프로모터, 신호 서열 및 SSI 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 코딩 서열, 및 터미네이터 서열을 포함하는 발현 카세트를 함유하며, 상기 발현 카세트는 숙주 세포 내 융합 단백질의 생성에 충분하다.

신호 서열, 프로모터 및 터미네이터의 선택은 대부분 사용되는 숙주 세포에 따라 다르다. 상기 언급된 바와 같이 특정 구현예에서, 스트렙토마이세스 숙주 세포가 사용되는 경우에는 신호 서열은 celA 신호 서열일 수 있다. 특정 경우에서, celA 신호 서열은 [Kluepfel et al. (Nature Biotechnol. 1996 14:756-759)] 에 기재된 바와 같은 S. 리비단스 셀룰라아제 A 유전자인 CelA 에 의해 인코딩되는 신호 서열일 수 있다. 특정 구현예에서, celA 신호 서열의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3 의 서열일 수 있다. 바실러스 숙주 세포가 사용되는 다른 구현예에서, 신호 서열은 융합 단백질을 바실러스 숙주 세포의 분비 경로 내로 유도할 수 있는 임의의 서열의 아미노산일 수 있다. 특정 경우에서, 사용될 수 있는 신호 서열에는 야생형 바실러스 세포로부터 분비되는 단백질의 신호 서열이 포함된다. 이러한 신호 서열에는 α-아밀라아제, 프로테아제, (예를 들어, aprE 또는 서브틸리신 E), 또는 β-락타마아제 유전자에 의해 인코딩되는 신호 서열이 포함된다. 예시적인 신호 서열에는 B. 스테아로테르모필러스 (B. stearothermophilus), B. 리케니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 서브틸리스 및 B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 바실러스 종 유래의, α-아밀라아제 유전자, 서브틸리신 유전자, β-락타마아제 유전자, 중립 프로테아제 유전자 (예를 들어, nprT, nprS, nprM), 또는 aprsA 유전자에 의해 인코딩되는 신호 서열이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 하나의 구현예에서, 신호 서열은 B. 서브틸리스의 aprE 유전자에 의해 인코딩된다 ([Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003 62:369-73] 에 기재되어 있음). 추가의 신호 펩티드는 Simonen and Palva (Microbiological Reviews 1993 57: 109-137), 및 기타 참조문헌에 기재되어 있다.

바실러스 및 스트렙토마이세스 숙주 세포에서 사용하는데 적합한 프로모터 및 터미네이터는 알려져 있고, apr (알칼리성 프로테아제), npr (중립 프로테아제), amy (α-아밀라아제) 및 β-락타마아제 유전자, 및 B. 서브틸리스 레반수크라아제 유전자 (sacB), B. 리케니포르미스 알파-아밀라아제 유전자 (amyL), B. 스테아로테르모필러스 말토젠성 아밀라아제 유전자 (amyM), B. 아밀로리퀘파시엔스 알파-아밀라아제 유전자 (amyQ), B. 리케니포르미스 페니실리나아제 유전자 (penP), B. 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자의 프로모터 및 터미네이터, WO 93/10249, WO 98/07846, 및 WO 99/43835 에 기재된 프로모터 및 터미네이터를 포함한다. 스트렙토마이세스 숙주 세포에서 사용하기 위한 발현 카세트는 예를 들어 "Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual" (Hopwood et al., Cold Spring Harbor Laboratories, 1985), Hopwood et al., (Hopwood et al., Regulation of Gene Expression in Antibiotic-producing Streptomyces. In Booth, I. and Higgins, C. (Eds) SYMPOSIUM OF THE SOCIETY FOR GENERAL MICROBIOLOGY, REGULATION OF GENE EXPRESSION, Cambridge University Press, 1986 pgs. 251-276), 및 Fornwald et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. 1987 84: 2130-2134), Pulido et al., (Gene. 1987 56:277-82); Dehottay et al., (Eur. J. Biochem. 1987 166:345-50), Taguchi (Gene. 1989 84:279-86), Schmitt-John et al., (Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992 36:493-8), Motamedi (Gene 1995 160:25-31) 및 Binnie (Protein Expr. Purif. 1997 11:271-8) 에 기재되어 있는 프로모터 및 터미네이터를 사용하여 구축될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본원에 참조로써 인용되는 WO 06/054997 에 기재되어 있는 프로모터인 A4 프로모터가 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 핵산을 함유하지 않는 다른 세포에 대한 재조합 핵산을 함유하는 세포의 선별을 위한 선별가능 마커를 추가로 함유할 수 있다. 예시적 선별가능 마커는 상기 문단에 언급된 참조 문헌에 기재되어 있으며, 항생제에 대한 내성 (예를 들어, 하이그로마이신, 블레오마이신, 클로르암페니콜, 플레오마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 티오스트렙톤, 등에 대한 내성) 을 제공하는 선별가능 마커를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

특정 구현예에서, 코딩 서열은 사용되는 숙주 세포 내에서의 융합 단백질의 발현에 최적화된 코돈일 수 있다. 많은 세포에서의 각각의 코돈의 용도를 나열하는 코돈 사용표가 당업계에 알려져 있고 (예를 들어, Nakamura et al., Nucl. Acids Res. 2000 28: 292) 또는 쉽게 유도가능하기 때문에, 이러한 핵산은 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 제공하도록 쉽게 디자인될 수 있다.

주제의 재조합 핵산은 숙주 세포의 게놈 내에 (예를 들어, 핵 게놈) 존재할 수 있고 (예를 들어, 통합된), 또는 숙주 세포 내에서 자가 복제되는 벡터 (예를 들어, 파지, 플라스미드, 바이러스, 또는 레트로바이러스 벡터) 내에 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 벡터는 숙주 세포 내에서의 단백질 발현을 위한 발현 벡터일 수 있고, 예컨대, 상기 언급된 제 2 발현 카세트를 추가로 함유할 수 있다.

스트렙토마이세스 및 바실러스 숙주 세포 내 재조합 단백질의 발현을 위한 벡터 시스템은 당업계에 잘 알려져 있어, 상기 언급된 것보다 더 상세히 논의할 필요는 없을 것이다.

숙주 세포

또한 주제의 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포는 B. 서브틸리스, B. 리케니포르미스, B. 렌투스, B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필러스, B. 알칼로필러스, B. 아밀로리퀘파시엔스, B. 클라우시이 (B. clausii), B. 할로두란스 (B. halodurans), B. 메가테리움 (B. megaterium), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 써큘란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus), 및 B. 투린지엔시스 (B. thuringiensis), 또는 S. 리비단스, S. 카르보필러스 (S. carbophilus). S. 코엘로콜로르 (S. coelocolor), S. 루비지노서스 (S. rubiginosus), R. 알보그리세올러스, 및 S. 헬바티커스 (S. helvaticus) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 바실러스 종 또는 스트렙토마이세스 종일 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 FDA 에 의해 GRAS 상태인 것으로 승인된 (즉, 일반적으로 안전하다고 승인됨 (Generally Recognized as Safe)) 단백질 제조에 사용되는 이력을 가진 균주의 세포일 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 일부 특히 바람직한 구현예에서, 바실러스 종 숙주 세포는 9 개의 비활성화된 프로테아제 유전자 (aprE, nprE, epr, ispA, bpr, vpr, wprA, mpr-ybjF 및 nprB) 를 함유한다. 일부 특정 구현예에서, 숙주 세포는 하기 유전형: degU^Hy32, oppA, ΔspoIIE3501, ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpr, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybjF, ΔnprB, amyE::xylRPxylAcomK-ermC 를 갖는 B. 서브틸리스 세포일 수 있다. 전체 B. 서브틸리스 게놈의 서열이 공개 이용가능하고 공표되었고 (예를 들어, Moszer, FEBS Lett. 1998 430:28-36 참조), B. 서브틸리스의 프로테아제가 확인되고 상세히 검토되었으며 (예를 들어, He et al., Res. Microbiol. 1991 142:797-803 참조), 바실러스 세포에 대한 유전자 붕괴법은 일반적으로 당업계에 잘 알려져 있으므로 (예를 들어, Lee et al., Applied and Environmental Microbiology 2000 66: 476-480; Ye et al., Proceedings of the International Symposium on Recent Advances in Bioindustry 1996 pp. 160-169, Seoul, Korea: The Korean Society for Applied Microbiology; Wu et al., J. Bacteriol. 1991 173:4952-4958; 및 Sloma et al., J. Bacteriol. 1991 173:6889- 6895 참조), 이러한 균주의 구축은 당업자의 능력 내에 있다.

특정 구현예에서, 비활성화된 SSI 유전자를 갖고 있는 스트렙토마이세스 숙주 세포가 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, SSI 단백질 제조용 재조합 핵산을 함유하는 것 외에도, 숙주 세포는 서브틸리신 단백질 발현을 위한 재조합 핵산을 추가로 함유할 수 있다 (즉, 세포에 의해 생성되는 SSI 단백질에 의해 억제되는 효소). 이와 같이, 특정 구현예에서, 세포는 작동가능한 연결 내에, 프로모터, 서브틸리신 단백질을 인코딩하는 코딩 서열 (상기 서브틸리신 단백질은 신호 서열 및 상기 서브틸리신 단백질을 포함하는 융합 단백질 내에 함유될 수 있음), 및 터미네이터 서열을 포함하는 발현 카세트를 함유할 수 있고, 발현 카세트는 숙주 세포 내 융합 단백질의 생성에 충분하다.

서브틸리신 단백질은 야생형 게놈에서 발견되는 아미노산 서열을 가질 수 있거나 (즉, 서브틸리신은 자연 발생적 서브틸리신일 수 있음), 자연 발생적 서브틸리신 변이체일 수 있으므로, 야생형 게놈에 의해 인코딩되는 서브틸리신과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 일치하는 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 예시적인 서브틸리신에는 ALCANASE® (Novozymes), FNA™ (Genencor), SAVINASE® (Novozymes), PURFECT™ (Genencor), KAP™ (Kao), EVERLASE™ (Novozymes), PURAFECT OXP™ (Genencor), FN4™ (Genencor), BLAP S™ (Henkel), BLAP X™ (Henkel), ESPERASE® (Novozymes), KANNASE™ (Novozymes) 및 PROPERASE™ (Genencor) 가 포함된다. 다른 구현예에서, 서브틸리신은 서브틸리신 168, 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 칼스버그 (Carlsberg), 서브틸리신 DY, 서브틸리신 147 또는 서브틸리신 309 일 수 있다 (예를 들어, EP414279B, WO 89/06279 및 Stahl et al., J. Bacteriol. 1984 159:811-818 참조). 본원에서 사용될 수 있는 예시적인 서브틸리신 및 기타 프로테아제에는 WO 99/20770; WO 99/20726; WO 99/20769; WO 89/06279; RE 34,606; 미국 특허 제 4,914,031 호; 미국 특허 제 4,980,288 호; 미국 특허 제 5,208,158 호; 미국 특허 제 5,310,675 호; 미국 특허 제 5,336,611 호; 미국 특허 제 5,399,283 호; 미국 특허 제 5,441,882 호; 미국 특허 제 5,482,849 호; 미국 특허 제 5,631,217 호; 미국 특허 제 5,665,587 호; 미국 특허 제 5,700,676 호; 미국 특허 제 5,741,694 호; 미국 특허 제 5,858,757 호; 미국 특허 제 5,880,080 호; 미국 특허 제 6,197,567 호; 및 미국 특허 제 6,218,165 호에 기재된 프로테아제가 포함된다. 서브틸리신은 일반적으로 Siezen (Protein Sci. 1997 6:501-523) 에서 상세히 검토되고, 세제-첨가 서브틸리신은 Bryan (Biochim. Biophys. Acta 2000 1543:203-222), Maurer (Current Opinion in Biotechnology 2004 15:330-334) 및 Gupta (Appl Microbiol Biotechnol. 2002 59: 15-32) 에서 상세히 검토된다. 관심의 특정 서브틸리신은 IUMBM 효소 명명법에 따라, EC 3.4.4.16 으로서 기재된 활성을 갖는다.

이러한 구현예에서, SSI 코딩 서열 및 서브틸리신 코딩 서열은 상이한 재조합 핵산, 또는 동일한 재조합 핵산 (예를 들어, 상이한 벡터 또는 동일한 벡터에 대한) 의 일부일 수 있다. 특정 구현예에서, SSI 단백질 및 서브틸리신은 세포 내에서 공동 발현될 수 있고, 이들 두 단백질은 숙주 세포로부터 배양 배지 내로 분비된다.

세포 배양물이 제공된다. 특정 구현예에서, 세포 배양물은 다수의, 상기 언급된 바와 같은 스트렙토마이세스 종 숙주 세포 또는 바실러스 종 숙주 세포, 및 배양 배지를 포함한다. 배양 배지는 SSI 단백질을 포함할 수 있고, 특정 구현예에서, 배양 배지는 SSI 단백질 및 서브틸리신 단백질 모두를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, SSI 단백질 및 서브틸리신 단백질은 성장 배지 내에서 함께 복합체를 형성할 수 있고, 예를 들어 배양 배지는 동량의 서브틸리신 단백질이 SSI 단백질의 부재하에 존재하는 배양 배지와 비교하여, 감소된 서브틸리신 프로테아제 활성을 나타낼 수 있다.

단백질 제조 방법

상기 기재된 세포를 사용하는 방법에 또한 제공된다. 특정 구현예에서, 주제의 방법은 주제의 세포를 배양하여 SSI 단백질을 제조하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 그리고 상기 논의된 바와 같이, 단백질은 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 본 방법의 특정 구현예는 배양 배지로부터 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 숙주 세포가 서브틸리신 단백질 발현을 위한 재조합 핵산을 함유하는지에 따라, SSI 단백질은 서브틸리신 단백질의 존재 또는 부재하에 성장 배지로부터 회수될 수 있다. 특정 구현예에서, SSI 단백질 및 서브틸리신 단백질은 배양 배지 내에서 복합체를 형성할 수 있고, SSI 단백질 및 서브틸리신 단백질을 함유하는 복합체는 배양 배지로부터 회수될 수 있다.

SSI 단백질은 임의의 편리한 방법에 의해, 예를 들어, 침전, 원심분리, 친화성, 여과에 의해 또는 당업계에 알려진 임의의 기타 방법에 의해 성장 배지로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 (Tilbeurgh et al., (1984) FEBS Lett. 16:215); 고해상력 물질을 사용하는 이온-교환 (Medve et al., (1998) J. Chromatography A 808: 153) 을 비롯한 이온-교환 크로마토그래피법 (Goyal et al., (1991) Biores. Technol. 36:37; Fliess et al., (1983) Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:314; Bhikhabhai et al., (1984) J. Appl. Biochem. 6:336; 및 Ellouz et al., (1987) Chromatography 396:307); 소수성 상호작용 크로마토그래피 (Tomaz and Queiroz, (1999) J. Chromatography A 865: 123); 2 상 분획 (Brumbauer, et al., (1999) Bioseparation 7:287); 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 DEAE 와 같은 양이온-교환 수지 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 및 겔 여과 (예를 들어, SEPHADEX G-75 사용) 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 세제-첨가 단백질은 배양 배지의 다른 성분으로부터 정제 없이 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 배양 배지의 성분은 간단하게 농축된 후, 예를 들어, 성장 배지의 다른 성분으로부터 SSI 단백질 (또는 SSI 단백질/서브틸리신 복합체) 의 추가 정제 없이 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 배양된 세포는 배치식, 공급-배치식 또는 연속 발효 조건하에서 배양될 수 있다. 종래의 배치식 발효 방법은 밀폐 시스템을 사용하는데, 배양 배지를 발효 공정 시작 전에 제조하고, 상기 배지에 바람직한 유기체(들) 을 접종하고, 발효는 배지에 임의의 성분을 연속 추가하지 않고 일어난다. 특정 경우에서, 성장 배지의 pH 및 산소 함량 (그러나 탄소원 함량은 제외) 은 배치식 방법 동안 변경될 수 있다. 배치식 시스템의 대사물질 및 세포 바이오매스는 발효를 중단하는 시간까지 끊임없이 변한다. 배치식 시스템에서, 세포는 통상 고정 로그상에서 고성장 로그상까지 진행하여 최종적으로 정치상에 도달하는데 이때 성장 속도는 감소하거나 중단된다. 처리가 없는 경우에는, 정치상 동안의 세포는 결국 죽는다. 일반적으로, 로그상의 세포가 최대의 단백질을 생성한다.

표준 배치식 시스템을 변형한 것이 "공급-배치식 발효" 시스템이다. 이 시스템에서, 영양분 (예를 들어, 탄소원, 질소원, 염, O₂, 또는 기타 영양분) 은 배양물 내의 농도가 역치값 이하로 떨어지는 경우에만 첨가된다. 대사물질 억압이 세포의 대사를 억제하곤 하는 경우 및 배지 내에 제한된 양의 영양분을 갖는 것이 바람직한 경우 공급-배치식 시스템이 유용하다. 공급-배치식 시스템 중에서의 실제 영양분 농도 측정은 pH, 용존 산소 및 CO₂ 와 같은 폐 가스의 부분압과 같은 측정가능한 인자의 변화에 근거하여 추정된다. 배치식 및 공급-배치식 발효는 통상적이고 당업계에 알려져 있다.

연속 발효는 규정된 배양 배지가 생반응기에 연속적으로 첨가되고 동량의 조건화 배지가 공정 동안 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 연속 발효는 일반적으로, 세포가 주로 로그상 성장에 있는 일정한 고밀도로 배양물을 유지한다.

연속 발효는 세포 성장 및/또는 최종 산물 농도에 영향을 주는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조정을 가능하게 한다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양분은 고정 속도로 유지되고, 모든 기타 파라미터가 조정되게 된다. 기타 시스템에서, 성장에 영향을 주는 다수의 인자는 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도를 일정하게 유지하면서 연속적으로 변형될 수 있다. 연속 시스템은 꾸준한 상태 성장 조건을 유지하도록 한다. 그러므로, 배지 배출로 인한 세포 손실은 발효 내 세포 성장 속도에 대해 균형이 맞춰질 수 있다. 연속 발효 공정을 위한 영양분 및 성장 인자 조정 방법 뿐 아니라, 생성물 형성 속도 최대화를 위한 기법이 알려져 있다.

사용 방법

상기 기재된 방법을 사용하여 제조되는 SSI 단백질은 세정 조성물 (예를 들어, 직물 세정 조성물 (예컨대 세탁 세제), 표면 세정 조성물, 식기 세정 조성물 및 자동 식기세척기 세제 조성물) 을 포함하나 이에 제한되지 않는 서브틸리신 프로테아제를 함유하는 임의의 생성물에 사용될 수 있다. 이러한 세정 조성물은 본원에 참조로서 인용되는 WO 0001826 에 더욱 상세히 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 세정 조성물은 무-붕사 조성물일 수 있다. 특정 구현예에서, SSI 단백질은 세정 조성물에 첨가하기 전에 서브틸리신 프로테아제와 복합체를 형성할 수 있다. 다른 구현예에서, SSI 단백질은 서브틸리신 프로테아제의 첨가 전, 첨가와 동시에, 또는 첨가 후에 세정 조성물에 첨가될 수 있다.

특정 구현예에서, SSI 단백질은 비이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제 또는 쯔비터이온성 계면활성제, 또는 이의 임의의 혼합물, 예를 들어, 음이온성 및 비이온성 계면활성제의 혼합물일 수 있는 계면활성제를 약 1% 내지 80%, 예를 들어, 5% 내지 50% (중량%) 포함하는 서브틸리신-함유 세탁 세제에 사용될 수 있다. 예시적인 계면활성제에는 선형 알킬 벤젠 술포네이트 및 선형 알킬 나트륨 술포네이트를 비롯한 알킬 벤젠 술포네이트 (ABS), 알킬 페녹시 폴리에톡시 에탄올 (예를 들어, 노닐 페녹시 에톡실레이트 또는 노닐 페놀), 디에탄올아민, 트리에탄올아민 및 모노에탄올아민이 포함된다. 세탁 세제 내에 존재할 수 있는 예시적인 계면활성제는 미국 특허 제 3,664,961 호, 제 3,919,678 호, 제 4,222,905 호 및 제 4,239,659 호에 기재되어 있다.

세탁 세제는 고체, 액체, 젤 또는 바 형태일 수 있고, 탄산나트륨, 중탄산나트륨과 같은 완충제, 또는 세제 빌더, 표백제, 표백 활성화제, 효소, 효소 안정화제, 비누거품 부스터 (suds booster), 억제제, 변색방지제, 부식방지제, 오염물 현탁화제, 오염물 방출제, 살균제, pH 조절제, 비-빌더 알칼리원, 킬레이트제, 유기 또는 무기 충전제, 용매, 히드로트롭, 광학 증백제, 염료 또는 향수를 추가로 함유할 수 있다. 세탁 세제는 SSI 단백질에 의한 서브틸리신-유도 분해로부터 보호되는 추가의 효소 (예를 들어, 또다른 프로테아제, 또는 아밀라아제, 펙테이트 리아제 또는 리파아제) 를 적어도 함유할 수 있다.

주제의 SSI 단백질은 펩티드 얼룩 제거를 필요로 하는 다양한 표면을 세정하는데 유용한 임의의 조성물에 사용될 수 있다. 이러한 세정 조성물에는 경질 표면 세정용 세제 조성물, 형태 비제한적임 (예를 들어, 액체, 젤, 바 및 과립 형태); 직물 세정용 세제 조성물, 형태 비제한적임 (예를 들어, 과립, 액체, 젤 및 바 제형); 식기세정 조성물 (형태 비제한적임); 구강 세정 조성물, 형태 비제한적임 (예를 들어, 치분 (dentifrice), 치약, 젤 및 구강세척 제형); 의치 세정 조성물, 형태 비제한적임 (예를 들어, 액체, 젤 또는 정제); 및 콘택트 렌즈 세정 조성물, 형태 비제한적임 (예를 들어, 액체, 정제) 이 포함된다.

세정 조성물은 또한 본원에 기재된 단백질 외에, 프로테아제 억제제와 상용가능한 1 종 이상의 세정 조성물 물질을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "세정 조성물 물질" 이라는 용어는, 바람직한 특정 유형의 세정 조성물 및 생성물의 형태 (예를 들어, 액체, 과립, 바, 스프레이, 스틱, 페이스트, 젤) 를 위해 선택되는 임의의 액체, 고체 또는 기체 물질을 의미하는 것으로, 상기 물질은 또한 조성물에 사용되는 변이체와 상용가능하다. 세정 조성물 물질의 구체적인 선택은 세정되는 표명 물질, 사용 동안 (예를 들어, 세척 세제 사용 동안) 의 세정 조건에 대한 조성물의 바람직한 형태를 고려하여 쉽게 이루어진다. 본원에 사용되는 바와 같은 "비-직물 세정 조성물" 에는 경질 표면 세정 조성물, 식기세정 조성물, 구강 세정 조성물, 의치 세정 조성물 및 콘택트 렌즈 세정 조성물이 포함된다.

SSI 단백질은 다양한 통상의 성분과 함께 사용되어 완전히 제형화된 경질-표면 세정제, 식기세정 조성물, 직물 세탁 조성물 등을 제공할 수 있다. 이러한 조성물은 액체, 과립, 바 등의 형태일 수 있다. 이러한 조성물은 30 중량%-60 중량% 의 계면활성제를 함유하는 현대식 "농축" 세제로서 제형화될 수 있다.

본원의 세정 조성물은 임의로, 그리고 바람직하게는, 다양한 음이온성, 비이온성, 쯔비터이온성 등의 계면활성제를 함유할 수 있다. 이러한 계면활성제는 전형적으로 조성물의 약 5% 내지 약 35% 의 수준으로 존재한다.

세제 세정 조성물에 유용한 매우 다양한 기타 성분은 기타 활성 성분, 담체, 히드로트롭, 프로세싱 보조제, 염료 또는 안료, 액체 제형용 용매 등을 비롯하여 본원에 조성물 내에 포함될 수 있다. 부가적인 비누거품 증가가 필요한 경우, C₁₀-C₁₆ 알콜아미드와 같은 비누거품 부스터가, 전형적으로는 약 1% 내지 약 10% 수준으로 조성물 내에 혼입될 수 있다.

세제 조성물은 담체로서 물 및 기타 용매를 함유할 수 있다. 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올인 저분자량 1 차 또는 2 차 알코올이 적합하다. 가용화 계면활성제의 경우 1 가 알코올이 바람직하나, 약 2 내지 약 6 개의 탄소 원자 및 약 2 내지 약 6 개의 히드록시기를 함유하는 것과 같은 폴리올 (예를 들어, 1,3-프로판디올, 에틸렌 글리콜, 글리세린, 및 1,2-프로판디올) 이 또한 사용될 수 있다. 조성물은 이러한 담체를 약 5% 내지 약 90%, 전형적으로 약 10% 내지 약 50% 함유할 수 있다.

본원의 세제 조성물은 수성 세정 작업에 사용하도록 제형화될 수 있고, 세척수의 pH 는 약 6.8 내지 약 11.0 일 것이다. 그러므로 최종 제품은 전형적으로 상기 수준에서 제형화된다. 추천되는 사용 수준으로 pH 를 조절하기 위한 기술에는 완충제, 알칼리, 산 등을 사용하는 것이 포함되고, 당업자에게 잘 알려져 있다.

다양한 표백 화합물, 예컨대 퍼카르보네이트, 퍼보레이트 등이 이러한 조성물에, 전형적으로 약 1 중량% 내지 약 15 중량% 의 수준으로 사용될 수 있다. 바람직한 경우, 이러한 조성물은 또한 당업계에 또한 잘 알려진 테트라아세틸 에틸렌디아민, 노나노일옥시벤젠 술포네이트 등과 같은 표백 활성화제를 함유할 수 있다. 사용 수준은 전형적으로 약 1 중량% 내지 약 10 중량% 범위이다.

다양한 오염물 방출제, 특히 음이온성 올리고에스테르 유형의 오염물 방출제, 다양한 킬레이트제, 특히 아미노포스포네이트 및 에틸렌디아민디숙시네이트, 다양한 점토 오염물 제거제, 특히 에톡실화 테트라에틸렌 펜타민, 다양한 분산제, 특히 폴리아크릴레이트 및 폴리아스파라테이트, 다양한 증백제, 특히 음이온성 증백제, 다양한 비누거품 억제제, 특히 실리콘 및 이차 알코올, 다양한 직물 유연제, 특히 스멕타이트 점토 등은 모두 약 1 중량% 내지 약 35 중량% 의 범위의 수준으로 이러한 조성물에서 사용될 수 있다. 표준 처방서 및 공개 특허는 이러한 통상적인 물질의 복합적인, 상세한 설명을 포함한다.

또한 세정 조성물에 효소 안정화제가 사용될 수 있다. 이러한 안정화제에는 프로필렌 글리콜 (바람직하게는 약 1% 내지 약 10%), 나트륨 포르메이트 (바람직하게는 약 0.1% 내지 약 1%) 및 칼슘 포르메이트 (바람직하게는 약 0.1% 내지 약 1%) 가 포함된다.

본 발명의 경질 표면 세정 조성물 및 직물 세정 조성물을 제형화하는 경우, 제작자는 다양한 빌더를 약 5 중량% 내지 약 50 중량% 의 수준으로 사용하고자 할 수 있다. 전형적인 빌더에는 1-10 마이크론 제올라이트, 시트레이트 및 옥시디숙시네이트와 같은 폴리카르복실레이트, 층상 실리케이트, 포스페이트 등이 포함된다. 다른 통상적인 빌더는 표준 처방서에 열거되어 있다.

기타 광학 성분에는 킬레이트제, 점토 오염물 제거/재침전 방지제, 중합체성 분산제, 표백제, 증백제, 비누거품 억제제, 용매 및 미적 작용제가 포함된다.

본 발명 및 이의 장점을 추가로 설명하기 위해, 하기의 구체적인 실시예가 본 발명을 설명하기 위해 제공되는 것이지 이의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하려고 제공되는 것은 아님을 이해하며 제시된다.

도 1 은 스트렙토마이세스 세포에서 celA 신호 서열-11AG8-SSI 융합 단백질로서 SSI 의 발현을 위해 디자인된 벡터 pKB128-STM-SSI-PG 의 맵을 보여준다.
도 2 는 스트렙토마이세스 세포에서 S.알보그리세올러스의 야생형 SSI 신호 서열을 사용하는 SSI 의 발현을 위해 디자인된 벡터 pKB105-SSI-PG 의 맵을 보여준다.
도 3 은 스트렙토마이세스 세포에서 celA 신호 서열을 사용하는 SSI 의 발현을 위해 디자인된 벡터 pKB105-celA-SSI-PG 의 맵을 보여준다.
도 4 는 다양한 스트렙토마이세스 세포에서의 SSI 발현을 나타내는 SDS-PAGE 젤을 보여준다.
도 5 는 S. 리비단스의 ssi 유전자를 비활성화시키도록 디자인된 벡터 pKB65-5'-apraR-3' 의 맵을 보여준다.
도 6 은 바실러스 세포에서 apreE 신호 서열-SSI 융합 단백질의 발현을 위해 디자인된 벡터 p3107-2 의 맵을 보여준다.
도 7 은 다양한 바실러스 세포에서의 SSI 발현을 나타내는 2 개의 SDS-PAGE 젤을 보여준다.

실시예 1

스트렙토마이세스 리비단스에서 셀룰로오스 융합으로서 스트렙토마이세스 서 브틸리신 억제제를 발현하는 균주의 구축

야생형 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 (SSI) 에 비해 5 개의 아미노산 치환을 함유하는 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 (SSI) 의 아미노산 서열 (A62K L61I M73P D83C S98E; SEQ ID NO:4) 을 Ganz 등 (Protein Engineering, Design & Selection 2004 17: 333-339) 으로부터 입수하였다. 상기 SSI 단백질을 인코딩하는 DNA (SEQ ID NO: 5) 를 DNA2.0 Inc. (Menlo Park, CA) 에 의해 합성하였다. 2 개의 올리고를 디자인하고 (SEQ ID NO: 6 및 SEQ ID NO: 7), 성숙 SSI-A62K L61I M73P D83C S98E 단백질을 인코딩하는 DNA 절편을 증폭하는데 사용하였다 (SEQ ID NO:8). 클로닝 목적을 위해 제한 효소 부위 NsiⅠ 을 DNA 의 5' 말단에 도입하고, 제한 효소 부위 BamHⅠ 을 DNA 의 3' 말단에 도입하였다. Invitrogen (Carlsbad, CA) 에 의해 프라이머를 합성하고, 이들을 DNA, 프라이머, 마스터 용액 및 Q 용액 (HOT StarTaq, QIAGEN Inc. (Valencia, CA)) 을 함유하는 PCR 반응 혼합물에서 DNA 절편을 증폭시키기 위한 PCR 에 사용하였다. PCR 반응을 98℃ 30 초, 62℃ 30 초 및 72℃ 1 분 8 초 동안의 사이클 30 회로 수행하였다. 72℃ 에서의 최종 신장을 5 분 동안 수행하고, 반응을 4℃ 로 냉각시켰다. NsiⅠ 에서 BamHⅠ DNA 절편을 NsiⅠ 및 BamHⅠ 으로 절단된 스트렙토마이세스 발현 플라스미드 pKB128 (SEQ ID NO:9) 내로 클로닝하여 발현 플라스미드 pKB128-STM-SSI-PG (도 1) 를 제작하였다. 플라스미드 pKB128 은, 3 개의 제한 효소 부위: NsiⅠ, MluⅠ 및 HapⅠ 을 함유하는 폴리링커 서열이 BamHⅠ 부위 전에 첨가되는 것을 제외하고는 플라스미드 pKB105 와 일치한다. 발현 플라스미드 (pKB128-STM-SSI-PG) 를 스트렙토마이세스 리비단스 균주 g3s3 내로 형질전환시키고, 형질전환체를 30℃ 에서 50 ug/ml 티오스트렙톤의 존재하에서 2 ~ 3 일 동안 TS 배지 내에서 선별 및 성장시켰다. 그 다음 세포를 항생제가 없는 배지로 옮기고 다시 3 일 동안 성장을 지속시켰다. 분취액을 새로운 튜브로 옮기고 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 상청액을 효소 활성 어세이 및 단백질 젤 분석에 사용하였다.

하나의 올리고를 디자인하고 (SEQ ID NO: 10), 처음 3 개의 아미노산 없이 성숙 SSI-A62K L61I M73P D83C S98E 단백질을 인코딩하는 DNA 절편 (SEQ ID NO:4) 을 증폭시키기 위해 사용하였다. 클로닝 목적을 위해 제한 효소 부위 NsiⅠ 을 DNA 의 5' 말단에 도입하고, 제한 효소 부위 BamHⅠ 을 DNA 의 3' 말단에 도입하였다. Invitrogen 에 의해 프라이머를 합성하고, 이들을 DNA, 프라이머, 마스터 용액 및 Q 용액 (HOT StarTaq, Qiagen) 을 함유하는 PCR 반응 혼합물에서 DNA 절편을 증폭시키기 위한 PCR 에 사용하였다. PCR 반응을 98℃ 30 초, 62℃ 30 초 및 72℃ 1 분 8 초 동안의 사이클 30 회로 수행하였다. 72℃ 에서의 최종 신장을 5 분 동안 수행하고, 반응을 4℃ 로 냉각시켰다. DNA 절편 (NsiⅠ 에서 BamHⅠ 절편, SEQ ID NO: 11) 을 NsiⅠ 및 BamHⅠ 으로 절단된 스트렙토마이세스 발현 플라스미드 pKB128 (SEQ ID NO: 9) 내로 클로닝하여 발현 플라스미드 (pKB128-STM-SSI-PG 짧은 것) 를 제작하였다. 상기 플라스미드는, 성숙 단백질의 N-말단의 3 개의 아미노산이 제거된 것을 제외하고는 pKB128-STM-SSI-PG (도 1) 와 일치한다. 상기 플라스미드를 스트렙토마이세스 리비단스 균주 g3s3 내로 형질전환시키고, 형질전환체를 30℃ 에서 50 ug/ml 티오스트렙톤의 존재하에서 2 ~ 3 일 동안 TS 배지 내에서 선별 및 성장시켰다. 그 다음 세포를 항생제가 없는 배지로 옮기고 다시 3 일 동안 성장을 지속시켰다. 분취액을 새로운 튜브로 옮기고 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 상청액을 효소 활성 어세이 및 단백질 젤 분석에 사용하였다.

실시예 2

SSI 유전자 유래의 신호 서열을 사용하는 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 변이체를 발현하는 균주의 구축

합성 DNA 서열 (SEQ ID NO: 5) 은 S. 알보그리세올러스의 SSI 신호 펩티드 (SEQ ID NO: 12) 에 작동가능하게 연결된 SEQ ID NO: 4 의 SSI 변이체를 인코딩한다. DNA 의 5' 말단에 도입된 NcoⅠ 부위는 위치 2 에 아미노산 글리신 잔기가 부가되는 결과를 낳았다. 또한 클로닝 목적을 위해 BamHⅠ 제한 부위를 DNA 의 3' 말단에 도입하였다. NcoⅠ 및 BamHⅠ 으로 합성 DNA 를 소화하였다. 절편을 젤로부터 단리하고, BamHⅠ 으로 완전히, NcoⅠ 으로 부분적으로 절단된 스트렙토마이세스 발현 플라스미드 pKB105 내로 클로닝하였다. 발현 플라스미드 (pKB105-SSI-PG, 도 2) 를 스트렙토마이세스 리비단스 균주 g3s3 내로 형질전환시켰다. 상기 형질전환체를 30℃ 에서 50 ug/ml 티오스트렙톤의 존재하에서 2 ~ 3 일 동안 TS 배지 내에서 선별 및 성장시켰다. 그 다음 세포를 항생제가 없는 제조 배지로 옮기고 다시 3 일 동안 성장을 지속시켰다. 분취액을 새로운 튜브로 옮기고 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 상청액을 효소 활성 어세이 및 단백질 젤 분석에 사용하였다.

실시예 3

CelA 신호 서열을 사용하여 스트렙토마이세스 리비단스에서 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 변이체를 발현하는 균주의 구축

1 개의 올리고를 디자인하고 (SEQ ID NO: 13), 올리고 (SEQ ID NO: 7) 와 함께 celA 신호 서열의 일부 및 성숙 SSI-A62K L61I M73P D83C S98E 단백질을 인코딩하는 DNA 절편 (SEQ ID NO: 14) 을 증폭하기 위해 사용하였다. SEQ ID NO: 14 에 의해 인코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 15 이다. Invitrogen 에 의해 프라이머를 합성하고, 이들을 DNA, 프라이머, 마스터 용액 및 Q 용액 (HOT StarTaq, Qiagen) 을 함유하는 PCR 반응 혼합물에서 DNA 절편을 증폭시키기 위한 PCR 에 사용하였다. PCR 반응을 98℃ 30 초, 62℃ 30 초 및 72℃ 1 분 8 초 동안의 사이클 30 회로 수행하였다. 72℃ 에서의 최종 신장을 5 분 동안 수행하고, 반응을 4℃ 로 냉각시켰다. 제한 효소 NheⅠ 및 BamHⅠ 으로 PCR 절편을 소화시켰다. 소화된 절편을 NheⅠ 및 BamHⅠ 으로 절단된 스트렙토마이세스 발현 플라스미드 pKB105 내로 클로닝하여, 발현 플라스미드 pKB105-celA-SSI-PG 를 제작하였다 (도 3). 발현 플라스미드를 스트렙토마이세스 리비단스 균주 g3s3 내로 형질전환시키고, 형질전환체를 30℃ 에서 50 ug/ml 티오스트렙톤의 존재하에서 2 ~ 3 일 동안 TS 배지 내에서 선별 및 성장시켰다. 그 다음 세포를 항생제가 없는 제조 배지로 옮기고 다시 3 일 동안 성장을 지속시켰다. 분취액을 새로운 튜브로 옮기고 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 상청액을 효소 활성 어세이 및 단백질 젤 분석에 사용하였다 (도 4).

실시예 4

스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 유전자의 결실을 함유하는 균주 구축

2 개의 올리고를 디자인하고 (SEQ ID NO: 16 및 SEQ ID NO: 17), 스트렙토마이세스 리비단스 SSI 유전자의 5' 말단을 증폭시키기 위해 사용하였다. 2 개의 다른 올리고를 디자인하고 (SEQ ID NO: 18 및 SEQ ID NO: 19), 스트렙토마이세스 리비단스 SSI 유전자의 3' 말단을 증폭시키기 위해 사용하였다. Invitrogen 에 의해 프라이머를 합성하고, 이들을 DNA, 프라이머, 마스터 용액 및 Q 용액 (HOT StarTaq, Qiagen) 을 함유하는 PCR 반응 혼합물에서 DNA 절편을 증폭시키기 위한 PCR 에 사용하였다. PCR 반응을 98℃ 30 초, 62℃ 30 초 및 72℃ 1 분 8 초 동안의 사이클 30 회로 수행하였다. 72℃ 에서의 최종 신장을 5 분 동안 수행하고, 반응을 4℃ 로 냉각시켰다. DNA 절편의 5' 말단 (SEQ ID NO: 20) 을 XbaⅠ 및 HindⅢ 로 절단하고, DNA 절편의 3' 말단 (SEQ ID NO: 21) 을 HindⅢ 및 PstⅠ 으로 절단하였다. 그 다음 이들을 XbaⅠ 및 PstⅠ 으로 절단된 플라스미드 pKB65 내로 클로닝하여 플라스미드 pKB65-5'/3' SSI 를 제작하였다. 아프라마이신 내성 유전자를 함유하는 HindⅢ DNA 절편 (SEQ ID NO: 22) 을 pKB65-5'/3' SSI 의 HindⅢ 부위 내로 클로닝하여 SSI 유전자 결실 플라스미드 pKB65/SSI5'/apra/3' (도 5) 를 제작하였다. 상기 플라스미드를 스트렙토마이세스 리비단스 균주 g3s3 내로 형질전환하였다.

실시예 5

바실러스 서브틸리스에서 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 변이체를 발현하는 균주의 구축

바실러스 서브틸리스 내 발현에 최적화된 코돈인, 하기 아미노산 치환: A62K, L63I, M73P, D83C, 및 S98E 을 갖는 스트렙토마이세스 알보그리세올러스 유래터의 SSI 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Philip J. Ganz, et. al. Protein Eng Des Sel. 2004 17:333-9) 를 합성하였다 (SEQ ID NO: 23). 폴리뉴클레오티드의 5' 말단은 HpaⅠ 제한 부위 (이탤릭체) 를 가지고 있고, 폴리뉴클레오티드의 첫번째 51 개 뉴클레오티드는 라이게이션시 완전한 aprE 분비 신호에 융합하도록 하는 aprE 분비 신호의 C-말단 17 개 아미노산을 인코딩한다. 3' 말단에는 HindⅢ 제한 부위가 있고, 바로 뒤에 SSI 유전자의 중지 코돈이 뒤따른다. SSI 단백질은 상기 서열의 뉴클레오티드 52 내지 390 에 의해 인코딩된다. 그 다음 본 유전자가 합성적으로 구축되었다 (DNA2.0 Inc., Menlo Park, CA).

상기 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 24 에 언급되어 있다. 단백질은 C-말단에 17 개의 아미노산 aprE 분비 신호를 가지고 있다.

SSI 코딩 서열을 HpaⅠ 및 HindⅢ 로 소화시킨 다음, 또한 HpaⅠ 및 HindⅢ 로 소화된 벡터 pJHaprEss 에 라이게이션시켰다. pJHaprEss 벡터는 E. 콜라이에서의 복제 및 선별 및 바실러스 서브틸리스에서의 통합체 선별을 가능하게 하는 pJH101 계 벡터이다 (Ferrari et al, J. Bacteriol., 152:809-814 [1983]). pJHaprEss 는 aprE 프로모터 및 분비 서열, 및 BPN' 전사 터미네이터를 가지고 있다. aprE 프로모터는 바실러스 서브틸리스 게놈 내로 통합되게 하고, SSI 유전자의 발현을 유도한다. 라이게이션체를 화학적 적격 E. 콜라이 (TOP10, Invitrogen) 내로 형질전환시켰다. 수득되는 플라스미드 p3107-2 를, TOP10 E. 콜라이로부터 단리한 다음, 제한효소 소화 및 아가로오스 젤 전기영동에 의해 입증하였다. 그 다음 p3107-2 를 B. 서브틸리스 균주 BG3594comK (2 개의 프로테아제 결실) 및 BG6006comK (9 개의 프로테아제 결실) 내로 형질전환하였다. 자일로오스 유도성 프로모터의 통제하에서 comK 유전자의 유도에 의해 B. 서브틸리스 균주를 적격화시켰다 (Hahn et al, Mol. Microbiol., 21 :763-775 [1996]). 5 ㎍/ml 클로르암페니콜을 함유하는 루리아 브로스 아가 (Luria Broth agar: LA) 플레이트 상에서 형질전환체를 선별하였다. 그 다음 유전자 증폭이 일어난 클론을 선별하기 위해 25 ㎍/ml 클로르암페니콜을 함유하는 LA 플레이트 상에서 여러 내성 클론을 선별하였다. SSI 를 발현하는 각각의 B. 서브틸리스 균주 BG3594comK(3594-4, 3594-5) 및 BG6006comK(6006-1, 6006-3) 의 2 가지 클론을 14 L 발효기에서 평가하였다. 다양한 시점에서 발효 상청액을 취하였고 환원 조건하에서 SDS PAGE 에 적용하였다 (도 7).

도 7 의 젤에서 제시될 수 있는 바와 같이, BG3594comK 클론보다 BG6006comK 클론의 발효 상청액에서 훨씬 더 많은 SSI 가 존재한다. 33 시간 지점에서의 SSI 의 농도는 다음과 같이 측정되었다:

클론# [ SSI ] g/L

3594-4 1.25

3594-5 1.51

6006-1 4.27

6006-3 3.85

상기 설명은 단지 예시적인 구현예의 원리를 설명하는 것이다. 당업자는 본원에 명시적으로 기재되거나 제시되지 않더라도 본 발명의 원리를 구현하고 본 취지 및 범주 내에 포함되는 다양한 방식을 고안할 수 있을 것임을 인지할 것이다. 또한, 본원에 언급된 모든 예 및 조건문은 원칙적으로 독자의 본 발명의 원리 및 본 출원인에 의해 제공되는 개념의 이해를 더욱 돕기 위한 것으로 의도되며, 이러한 구체적으로 언급된 예 및 조건에 대한 제한이 없는 것으로 해석된다. 게다가, 본 발명의 원리, 양상 및 구현예 뿐 아니라 이의 구체적인 예를 말하고 있는 본원의 모든 언급은, 이의 구조적 기능적 동등물을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 부가적으로는, 이러한 동등물에는 현행 공지된 동등물 및 미래에 개발될 동등물, 즉, 구조에 관계없이 동일한 기능을 수행하는 개발되는 임의의 요소들이 모두 포함되는 것으로 의도된다. 그러므로 본 발명의 범주는 본원에 제시되고 기재되는 예시적인 구현예에 제한되지 않는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Genencor International, Inc. Wang, Huaming Fox, Bryan <120> Expression of Streptomycin Subtilisin Inhibitor (SSI) proteins in Bacillus and Streptomyces sp. <130> GC929-PCT2 <140> Not yet assigned <141> 2008-01-29 <160> 24 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Streptomyces albogriseolus <220> <223> wild-type SSI <400> 1 Asp Ala Pro Ser Ala Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Val 1 5 10 15 Gly Lys Gly Val Ser Ala Thr Thr Ala Ala Pro Glu Arg Ala Val Thr 20 25 30 Leu Thr Cys Ala Pro Gly Pro Ser Gly Thr His Pro Ala Ala Gly Ser 35 40 45 Ala Cys Ala Asp Leu Ala Ala Val Gly Gly Asp Leu Asn Ala Leu Thr 50 55 60 Arg Gly Glu Asp Val Met Cys Pro Met Val Tyr Asp Pro Val Leu Leu 65 70 75 80 Thr Val Asp Gly Val Trp Gln Gly Lys Arg Val Ser Tyr Glu Arg Val 85 90 95 Phe Ser Asn Glu Cys Glu Met Asn Ala His Gly Ser Ser Val Phe Ala 100 105 110 Phe <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SSI protein containing five amino acid substitutions <400> 2 Asp Ala Pro Ser Ala Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr Val 1 5 10 15 Gly Lys Gly Val Ser Ala Thr Thr Ala Ala Pro Glu Arg Ala Val Thr 20 25 30 Leu Thr Cys Ala Pro Gly Pro Ser Gly Thr His Pro Ala Ala Gly Ser 35 40 45 Ala Cys Ala Asp Leu Ala Ala Val Gly Gly Asp Leu Asn Lys Ile Thr 50 55 60 Arg Gly Glu Asp Val Met Cys Pro Pro Val Tyr Asp Pro Val Leu Leu 65 70 75 80 Thr Val Cys Gly Val Trp Gln Gly Lys Arg Val Ser Tyr Glu Arg Val 85 90 95 Phe Glu Asn Glu Cys Glu Met Asn Ala His Gly Ser Ser Val Phe Ala 100 105 110 Phe <210> 3 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> celA signal sequence from S. lividans <400> 3 Met Gly Phe Gly Ser Ala Pro Ile Ala Leu Cys Pro Leu Arg Thr Arg 1 5 10 15 Arg Asn Ala Leu Lys Arg Leu Leu Ala Leu Leu Ala Thr Gly Val Ser 20 25 30 Ile Val Gly Leu Thr Ala Leu Ala Gly Pro Pro Ala Gln Ala 35 40 45 <210> 4 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SSI long form <400> 4 Ala Pro Gly Asp Ala Pro Ser Ala Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Thr Val Gly Lys Gly Val Ser Ala Thr Thr Ala Ala Pro Glu Arg 20 25 30 Ala Val Thr Leu Thr Cys Ala Pro Gly Pro Ser Gly Thr His Pro Ala 35 40 45 Ala Gly Ser Ala Cys Ala Asp Leu Ala Ala Val Gly Gly Asp Leu Asn 50 55 60 Lys Ile Thr Arg Gly Glu Asp Val Met Cys Pro Pro Val Tyr Asp Pro 65 70 75 80 Val Leu Leu Thr Val Cys Gly Val Trp Gln Gly Lys Arg Val Ser Tyr 85 90 95 Glu Arg Val Phe Glu Asn Glu Cys Glu Met Asn Ala His Gly Ser Ser 100 105 110 Val Phe Ala Phe 115 <210> 5 <211> 448 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSI coding sequence <400> 5 ccatgggccg gaacaccggc gctgggccat caccctcggt ctcacggcca ccgccgtctg 60 cggcccccct ctccggggcc gcgctcgccg ccccgggaga tgccccgtcc gcgctctacg 120 ccccctccgc cctggtgctg accgtcggca agggcgtcag cgcgacgacc gccgcaccgg 180 aacgcgcggt caccctgacc tgtgctccgg gcccgtcggg cacccacccg gcggccggct 240 cggcctgcgc ggacctggcc gccgtcggcg gcgacctgaa caagatcacg cggggcgagg 300 acgtcatgtg cccgcccgtg tacgacccgg tgctgctcac cgtgtgcggc gtctggcagg 360 gcaagcgggt ctcctacgag cgcgtcttcg agaacgagtg cgagatgaac gcgcacggct 420 cgagcgtctt cgccttctag ctggatcc 448 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 6 ggatgcatgc cccgggagat gccccgtccg cgctctac 38 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 7 ccggatccag ctagaaggcg aagacgctcg ag 32 <210> 8 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssi coding sequence <400> 8 ggatgcatgc cccgggagat gccccgtccg cgctctacgc cccctccgcc ctggtgctga 60 ccgtcggcaa gggcgtcagc gcgacgaccg ccgcaccgga acgcgcggtc accctgacct 120 gtgctccggg cccgtcgggc acccacccgg cggccggctc ggcctgcgcg gacctggccg 180 ccgtcggcgg cgacctgaac aagatcacgc ggggcgagga cgtcatgtgc ccgcccgtgt 240 acgacccggt gctgctcacc gtgtgcggcg tctggcaggg caagcgggtc tcctacgagc 300 gcgtcttcga gaacgagtgc gagatgaacg cgcacggctc gagcgtcttc gccttctagc 360 tggatccgg 369 <210> 9 <211> 8948 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vector sequence <400> 9 ctagagatcg aacttcatgt 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Leu Lys Arg Leu Leu Ala Leu Leu Ala Thr Gly Val Ser 20 25 30 Ile Val Gly Leu Thr Ala Leu Ala Gly Pro Pro Ala Gln Ala Ala Pro 35 40 45 Gly Asp Ala Pro Ser Ala Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr 50 55 60 Val Gly Lys Gly Val Ser Ala Thr Thr Ala Ala Pro Glu Arg Ala Val 65 70 75 80 Thr Leu Thr Cys Ala Pro Gly Pro Ser Gly Thr His Pro Ala Ala Gly 85 90 95 Ser Ala Cys Ala Asp Leu Ala Ala Val Gly Gly Asp Leu Asn Lys Ile 100 105 110 Thr Arg Gly Glu Asp Val Met Cys Pro Pro Val Tyr Asp Pro Val Leu 115 120 125 Leu Thr Val Cys Gly Val Trp Gln Gly Lys Arg Val Ser Tyr Glu Arg 130 135 140 Val Phe Glu Asn Glu Cys Glu Met Asn Ala His Gly Ser Ser Val Phe 145 150 155 160 Ala Phe <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 16 ggtctagagg ccgggtccga gaagtag 27 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 17 ggaagcttgt gtgcatcctt ccgctcgttt c 31 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 18 ggaagcttct gagggaccgg gaccgcc 27 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 19 aactgcagga ggacaccgcc ctgctg 26 <210> 20 <211> 1009 <212> DNA <213> Streptomyces lividans <400> 20 ggtctagagg ccgggtccga gaagtagttg gcggtgccga cgccgtgcag gaacggcagg 60 tacgcctggt cgaggtcgcg cgggcgccag gacagcagcg gcgtgtccag cgtgacgaac 120 agcgccgtgt acccggccgc ccgggcccgg tccaggaagc tgcgcgccac ctcgcggtcc 180 ttcggccagt acagctggaa ccagcgctcg gcgtcgccca tcgcctcggc gacctcctcc 240 atgggcgtgc tggaggcgga ggagaggatg tacggcacac cctgggccgc ggcggcccgg 300 gcggccgcgg gctccgcctc cgggtgcatg atcgacagca caccgaccgg cgcgagcgcc 360 agcggggcgg gcagggaacg gcccagcacc tcgacacgca ggtcgcgttc gtgcacgtcc 420 cgcagcatgc gcggaacgat ccggcgcctg gccagcgccg cccggttggc tcgggcggtg 480 ctgccgtcgc ccgcgctgcc cgcgacgtat ccgaaggggc cgggcccgag gcgccgctcg 540 gtcagctcct cgagccgggt caggtcggtg ggcagccgcg ggaccgcgcc cgtcatgccg 600 ttcagataga tctcgtactg gaaatccgcc cagtgcttcg gcatccccgg tccgcctctc 660 gtcgtcgagc tcgcgctgcc cggcaccata cccgcgagta tgccgggggt ggcggtcggg 720 gccgacggac ctgttccggg ggtgtttcag gcctattggc gaaggtgcgg atcacgccat 780 tcggccagtt ctgttctcaa taatcgatca agaaacgccc agttccggac ttggaacgtt 840 ctaattctgt gacttcacgc cactgattca atacgcaagg ttaccgaaac ccgtggggtc 900 gagatgagtt tcggtgcggg actcggcaga ctcgcgctcg ccgctccggc accgacgggt 960 cggaccggca ccaccctcga aacgagcgga aggatgcaca caagcttcc 1009 <210> 21 <211> 1009 <212> DNA <213> Streptomyces lividans <400> 21 ggaagcttct gagggaccgg gaccgccggg accgtgcggc gtgatcggct gctcgctact 60 ggggagtgcg agcgccgccg tacgggtccc gcgggcccgc accggggacg gcggacggag 120 tggggccgtc cgccgttctc ccggttcagg ggcacggtcg gccgttcgcg gccgggccgt 180 ccgcggccct ggcggaccgg gcacggtggc tggtgtcgca ccacggatag cgccgactgc 240 gccggcacgt gcacagcgcc acccggaagc ggtcggagga caccgtcgtc ccgtcctcca 300 gctccacctc caccgggcct tccaccagca gcggcccccg gcgctggacc ttgatccggc 360 gccgggcgtc ggacgggcgc gcgggctcag acggggagtt cggcacggac gaccaccagc 420 tcttcctcgt agtccgccag ggacagcagc ccgcgctgcc gcagccagcg ctcccggccg 480 cgcaccacgg gaccgaacgc gatccgccgc cgccgggtca ccgccgcctt cagccccgcc 540 tcgcgcagca gcgcctcggt cctcgcgggg tcactgagcg ccgactgcac gagcagcagc 600 accccgccgg ggcgcagcag ccggggtact tccaggcaga tccggtccag gaccatgcga 660 ccgtcgtggc ccgcgtccca ggcccgcgcg gcaccacgcg gccggcggcc ggtggcgggt 720 gccggcacat acggcggatt ggccagcacc aggtcgaacg actcgccgcg cacgggtgtg 780 aagaggttgc cgtgccggac gcggatccgc agcccggccc gggccgcgtt gagccgcgcg 840 gcgcacaccg cgcgccacga cacgtccacc gcggtcaccc ggccgccccg cccggccgca 900 gccagggcga gggcgcccga gccggttccc acgtcgagca cggcggcgcc cggcgggagc 960 gactcgtcgg acagcgcccc ggccagcagg gcggtgtcct cctgcagtt 1009 <210> 22 <211> 1085 <212> DNA <213> Streptomyces lividans <400> 22 aagcttgaag aaagacaatc cccgatccgc tccacgtgtt gccccagcaa tcagcgcgac 60 cttgcccctc caacgtcatc tcgttctccg ctcatgagct cagccaatcg actggcgagc 120 ggcatcgcat tcttcgcatc ccgcctctgg cggatgcagg aagatcaacg gatctcggcc 180 cagttgaccc agggctgtcg ccacaatgtc gcgggagcgg atcaaccgag caaaggcatg 240 accgactgga ccttccttct gaaggctctt ctccttgagc cacctgtccg ccaaggcaaa 300 gcgctcacag cagtggtcat tctcgagata atcgacgcgt accaacttgc catcctgaag 360 aatggtgcag tgtctcggca ccccataggg aacctttgcc atcaactcgg caagatgcag 420 cgtcgtgttg gcatcgtgtc ccacgccgag gagaagtacc tgcccatcga gttcatggac 480 acgggcgacc gggcttgcag gcgagtgagg tggcaggggc aatggatcag agatgatctg 540 ctctgcctgt ggccccgctg ccgcaaaggc aaatggatgg gcgctgcgct ttacatttgg 600 caggcgccag aatgtgtcag agacaactcc aaggtccggt gtaacgggcg acgtggcagg 660 atcgaacggc tcgtcgtcca gacctgacca cgagggcatg acgagcgtcc ctcccggacc 720 cagcgcagca cgcagggcct cgatcagtcc aagtggccca tcttcgaggg gccggacgct 780 acggaaggag ctgtggacca gcagcacacc gccgggggta accccaaggt tgagaagctg 840 accgatgagc tcggcttttc gccattcgta ttgcacgaca ttgcactcca ccgctgatga 900 catcagtcga tcatagcacg atcaacggca ctgttgcaaa tagtcggtgg tgataaactt 960 atcatcccct tttgctgatg gagctgcaca tgaacccatt caaaggccgg cattttcagc 1020 gtgacatcat tctgtgggcc gtacgctggt actgcaaata cggcatcagt taccgtgaga 1080 agctt 1085 <210> 23 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSI polynucleotide codon optimized for Bacillus <400> 23 gcgttaacgt taatctttac gatggcgttc agcaacatga gcgcgcaggc tgatgctcct 60 agtgccttgt acgcaccgtc tgccttggtc ttaactgtcg gcaagggcgt atcagctacc 120 acagctgcgc cggaacgtgc ggtcaccctg acatgtgctc ctggaccgtc cggcactcat 180 cctgctgctg gtagcgcgtg tgctgacctt gcggccgttg gcggggactt aaacaaaatc 240 acgagaggag aagatgtcat gtgcccgccg gtgtacgatc ctgtgctttt gacggtttgc 300 ggtgtttggc aaggcaaacg ggtttcttat gagcgggtgt tcgaaaacga gtgtgaaatg 360 aatgctcatg gttcttctgt tttcgccttt tgaaagctt 399 <210> 24 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> aprE-SSI fusion <400> 24 Ala Leu Thr Leu Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln 1 5 10 15 Ala Asp Ala Pro Ser Ala Leu Tyr Ala Pro Ser Ala Leu Val Leu Thr 20 25 30 Val Gly Lys Gly Val Ser Ala Thr Thr Ala Ala Pro Glu Arg Ala Val 35 40 45 Thr Leu Thr Cys Ala Pro Gly Pro Ser Gly Thr His Pro Ala Ala Gly 50 55 60 Ser Ala Cys Ala Asp Leu Ala Ala Val Gly Gly Asp Leu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Thr Arg Gly Glu Asp Val Met Cys Pro Pro Val Tyr Asp Pro Val Leu 85 90 95 Leu Thr Val Cys Gly Val Trp Gln Gly Lys Arg Val Ser Tyr Glu Arg 100 105 110 Val Phe Glu Asn Glu Cys Glu Met Asn Ala His Gly Ser Ser Val Phe 115 120 125 Ala Phe 130

Claims (23)

1. a) 신호 서열; 및
   b) 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 (Streptomyces Subtilisin Inhibitor: SSI) 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산
   을 포함하는 바실러스 종 (Bacillus sp.) 숙주 세포로서;
   상기 숙주 세포가 상기 세포로부터 상기 SSI 단백질을 분비하고, 상기 숙주 세포가 비활성화된 aprE, nprE, epr, ispA, bpr, vpr, wprA, mpr-ybjF 및 nprB 유전자를 갖고 있는 숙주 세포.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 SSI 단백질이 자연 발생적 SSI 단백질과 비교하여, 서브틸리신의 존재하에 안정성이 증가된 숙주 세포.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 SSI 단백질이 자연 발생적 SSI 단백질과 비교하여, 서브틸리신에 대한 친화성이 감소된 숙주 세포.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 SSI 단백질이 위치 62 에 Lys, 위치 63 에 Ile, 위치 73 에 Pro, 위치 83 에 Cys 및 위치 98 에 Glu 를 갖는, SEQ ID NO: 1 과 적어도 95% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 숙주 세포.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 신호 서열이 B. 서브틸리스의 aprE 유전자에 의해 인코딩되는 신호 서열인 숙주 세포.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 바실러스 종 숙주 세포가 degU^Hy32, oppA, ΔspoIIE3501, ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpr, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybjF, ΔnprB, amyE::xylRPxylAcomK-ermC 유전형을 갖고 있는 숙주 세포.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 바실러스 종 숙주 세포가 B. 서브틸리스 숙주 세포인 숙주 세포.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 핵산이 프로모터 및 터미네이터에 작동가능하게 연결되어 발현 카세트를 형성하는 숙주 세포.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 핵산이 상기 바실러스 종 숙주 세포 내에서 상기 SSI 융합 단백질의 발현에 최적화된 코돈인 숙주 세포.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 핵산이 상기 숙주 세포의 게놈 내에 또는 상기 세포 내에서 자가 복제되는 벡터 내에 존재하는 숙주 세포.
11. 다수의 제 1 항의 바실러스 종 숙주 세포 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물.
12. 제 1 항에 있어서, 상기 배양 배지가 상기 SSI 단백질을 포함하는 세포 배양물.
13. 제 1 항의 세포를 배양하여 배양 배지 내로 상기 SSI 단백질이 분비되도록 하는 것을 포함하는 SSI 단백질의 제조 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 배양 배지로부터 상기 SSI 단백질을 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
15. 제 13 항에 있어서, 상기 SSI 단백질과 세탁 세제를 조합하여, 서브틸리신 프로테아제 및 상기 SSI 단백질을 모두 함유하는 세제를 제조하는 것을 추가로 포함하는 방법.
16. 제 13 항에 있어서, 상기 세탁 세제가 무-붕사 세탁 세제인 방법.
17. a) celA 신호 서열; 및
    b) 스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 (SSI) 단백질을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산
    을 포함하는 스트렙토마이세스 종 (Streptomyces sp.) 숙주 세포로서;
    상기 숙주 세포가 상기 세포로부터 상기 SSI 단백질을 분비하는 숙주 세포.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 SSI 단백질이 자연 발생적 SSI 단백질과 비교하여, 서브틸리신의 존재하에 안정성이 증가된 숙주 세포.
19. 제 17 항에 있어서, 상기 SSI 단백질이 자연 발생적 SSI 단백질과 비교하여, 서브틸리신에 대한 친화성이 감소된 숙주 세포.
20. 제 17 항에 있어서, 상기 SSI 단백질이 위치 62 에 Lys, 위치 63 에 Ile, 위치 73 에 Pro, 위치 83 에 Cys 및 위치 98 에 Glu 를 갖는, SEQ ID NO: 1 과 적어도 95% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 숙주 세포.
21. 다수의 제 17 항의 스트렙토마이세스 종 숙주 세포 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물.
22. 제 17 항의 세포를 배양하여 배양 배지 내로 상기 SSI 단백질이 분비되도록 하는 것을 포함하는 SSI 단백질의 제조 방법.
23. 제 22 항에 있어서, 상기 SSI 단백질과 세탁 세제를 조합하여, 서브틸리신 프로테아제 및 상기 SSI 단백질을 모두 함유하는 세제를 제조하는 것을 추가로 포함하는 방법.

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