CN112538493A - 全基因组沉默子筛选系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全基因组沉默子筛选系统，该系统包括MAS‑seq载体，该MAS‑seq载体包括强启动子、同源臂、标记基因、poly A位点，该MAS‑seq载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该MAS‑seq载体在同源臂间插入沉默子序列时，可以大大降低标记基因mRNA的表达丰度，通过测序检测标记基因mRNA的表达量，表达量低的即表明插入序列为沉默子序列。由此可以用于大规模筛选基因组沉默子，该系统灵敏，且操作便捷，可大规模使用和广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种全基因组沉默子筛选系统及其应用。
背景技术
人类基因组中有超过98%都属于非编码序列：包括重复区域，非编码RNA区域，基因内含子区域等。DNA百科全书项目（ENCODE）项目利用表观遗传特征和转录因子结合位点对这些区域进行了注释，是一件很有意义的工作。近年来人们发现这些区域存在着一些重要的调控元件：如启动子、增强子、绝缘子以及沉默子，而这些调控元件被证实在基因表达，生物表型以及疾病发生方面具有重要作用。但是目前对非编码序列的研究主要集中在启动子、增强子和绝缘子，还未有任何技术可以在全基因组水平筛选出沉默子，从而限制了对沉默子的研究和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种全基因组沉默子筛选系统（MAS-seq），通过该系统能够在全基因组水平筛选出沉默子，且该系统灵敏度高，可以用于任何物种的基因组沉默子筛选。MAS-seq的建立对于构建沉默子图谱，了解沉默子的特征以及作用机制具有极其重要的意义。
根据本发明的一个方面，提供一种全基因组沉默子筛选系统，该系统包括MAS-seq载体，该MAS-seq载体包括强启动子、同源臂、标记基因、poly A位点，该MAS-seq载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该MAS-seq载体在同源臂间插入沉默子序列时，可以大大降低标记基因mRNA的表达丰度，通过测序检测标记基因mRNA的表达量，表达量低的即表明插入序列为沉默子序列。由此可以用于大规模筛选基因组沉默子，该系统灵敏，且操作便捷，可大规模使用和广泛应用。
在某些实施方式中，该MAS-seq载体的强启动子包括hPGK、CMV、CAG、SV40、PMC1中的任一种。
在某些实施方式中，该MAS-seq载体的标记基因包括GFP、RFP、mChery、BFP中的任一种。
根据本发明的另一个方面，提供了一种全基因组沉默子筛选系统在筛选全基因组沉默子中的应用。由此，可以快速、高效，便捷的筛选出全基因组沉默子。
在某些实施方式中，全基因组沉默子筛选系统应用在筛选全基因组沉默子时的方法如下：
打断待测基因序列、将打断的基因片段与Illumina接头连接，并使用含有MAS-seq载体同源臂序列的引物进行PCR扩增；
将纯化后的PCR产物同源重组至MAS-seq载体，构建成MAS-seq筛选质粒；
将MAS-seq筛选质粒转染细胞，抽提RNA，并富集标记基因mRNA；
将标记基因mRNA进行反转录，获得cDNA，并将cDNA进行PCR扩增；
将纯化后的PCR扩增产物进行高通量测序，并对测序结果进行分析，筛选出标记基因表达量低的测序结果，对应沉默子插入位点的序列即为筛选出的沉默子序列。通过该方法，可以快速高效的筛选出基因组沉默子，且适用于任何类型的DNA序列筛选沉默子，具有广泛的适用性。
在某些实施方式中，含有MAS-seq载体同源臂序列的引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
根据本发明的再一个方面，提供了一种全基因组沉默子筛选系统在验证基因组沉默子中的应用。通过该全基因组沉默子筛选系统可以对待测序列是否为沉默子序列进行快速有效的验证。
在某些实施方式中，全基因组沉默子筛选系统在验证基因组沉默子时的方法如下：
将待验证序列插入沉默子筛选系统载体，构建验证质粒；
将验证质粒转让细胞；
收集细胞抽提RNA，并富集标记基因mRNA；
将富集的标记基因mRNA进行反转录荧光定量PCR检测；
将PCR检测结果与对照组进行比较，表达量显著低于对照组mRNA表达量，则待验证序列为沉默子；反之，为非沉默子。
附图说明
图1为MAS-seq载体主要基因序列图：其中hPGK为强启动子序列、GFP为标记基因GFP序列、left arm为左侧同源臂序列、right arm为右侧同源臂序列、pA site为poly(A)位点序列；
图2 为MAS-seq筛选质粒主要基因序列图：其中hPGK为强启动子序列、GFP为标记基因GFP序列、left arm为左侧同源臂序列、待测序列为插入的待检测序列、right arm为右侧同源臂序列、pA site为poly(A)位点序列；
图3为MAS-seq载体验证已知沉默子序列结果图：其中HPGG为对照组mRNA表达量、S1-S5为实验组mRNA表达量。
具体实施方式
一、全基因组沉默子筛选系统（MAS-seq）的构建
1、沉默子筛选MAS-seq载体的构建
MAS-seq载体构建过程：根据STARR-seq载体（addgene：#71509）进行改造合成，将STARR-seq载体上的SCP1启动子序列替换成hPGK启动子序列，同时删除酶切位点Age I和Sal I之间的CmR抗性基因序列和ccdB自杀基因序列，将合成的载体命名为MAS-seq载体，该载体的主要基因序列包括：hPGK-GFP-left arm-right arm-pA site，如图1所示，且该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
构建好的MAS-seq载体用于筛选沉默子。其中，沉默子不仅可以与启动子相互作用并抑制靶基因的表达，沉默子还可以独立于其位置发挥作用。我们将标记基因序列插入到强启动子hPGK启动子的下游，每个沉默子的抑制强度可以通过细胞中标记基因mRNA的丰度来反映，标记基因mRNA丰度与沉默子的强度直接偶联使得可以筛选任意来源的DNA序列中的沉默子序列。
二、利用全基因组沉默子筛选系统（MAS-seq）验证基因组沉默子及该系统灵敏度验证
挑选5条已知的沉默子序列（表1）构建到MAS-seq载体，然后转染293T细胞，48小时后收集细胞进行RNA提取及mRNA的富集，并反转录mRNA以及进行荧光定量PCR（引物见表2），SPSS软件分析实验组（插入了沉默子序列的MAS-seq筛选质粒组）与HPGK-NC组(插入一段非沉默子的乱序序列的MAS-seq对照质粒组)GFP mRNA表达差异。结果如图3所示，实验组S1、S2、S3、S4和S5的GFP mRNA表达与对照组差异显著（p＜0.05），实验组GFP mRNA表达显著低于对照组。表明：当MAS-seq载体插入沉默子序列时，可以大大降低标记基因（GFP）mRNA的表达丰度，由此可以用于大规模筛选和验证基因组沉默子，该系统灵敏，且操作便捷，可大规模使用和广泛应用。
表1 实验组S1-S5沉默子序列
| 染色质 | 起始位置 | 终末位置 |
| chr22（实验组S1） | 40851734 | 40851957 |
| chr20（实验组S2） | 58677553 | 58677708 |
| chr15（实验组S3） | 76442422 | 76442685 |
| chr5（实验组S4） | 134509397 | 134509555 |
| chr16（实验组S5） | 25137470 | 25137712 |
表2荧光定量PCR引物序列
| 引物名称 | 序列 |
| QPCR-F（SEQ ID NO:5） | 5’—ACCCTGAAGTTCATCTGCAC—3’ |
| QPCR-R（SEQ ID NO:6） | 5’—CATGCCGTTTCATATGATCC—3’ |
三、利用全基因组沉默子筛选系统（MAS-seq）筛选基因组沉默子
1、筛选库的制备
抽提需要筛选沉默子的目标基因组DNA，将基因组DNA打断成合适的片段大小（例如200bp），使用DNA文库(购自NEB品牌，货号：cat. no. E6000L)构建试剂盒将5 ulIllumina接头 (购自Vazyme品牌，货号：cat. no. N805)与5μg的DNA片段进行连接。然后，使用PCR扩增酶进行PCR扩增反应，PCR引物序列含有MAS-seq载体上同源臂（同源臂所在位置如图1所示的left arm与right arm）序列，该引物序列具体如下：
fw（SEQ ID NO:2）:TAGAGCATGCACCGGACACTCTTTCCCTACACGA
CGCTCTTCCGATCT;
rev（SEQ ID NO:3）:GGCCGAATTCGTCGAGTGACTGGAGTTCAGACG
TGTGCTCTTCCGATCT。
按照设定的程序(98℃ 45S; 98℃ 15s, 60℃ 30s, 72℃ 30s ;10个循环)进行PCR扩增，然后进行PCR产物纯化。
用AgeI-HF和SalI-HF对MAS-seq载体进行双酶切，将纯化后的PCR产物与MAS-seq载体双酶切产物进行同源重组连接，构建MAS-seq筛选质粒（如图2所示）。
将构建的MAS-seq筛选质粒利用DH5a感受态细胞进行转化，将转化产物置于LB中在37℃，200rpm的摇床摇菌至OD值为0.8-1，收集菌液，提取质粒并进行质粒纯化，经纯化后获得的MAS-seq筛选质粒转染293T细胞，48小时后收集细胞。
2、高通量测序文库准备及测序分析
将转染了MAS-seq筛选质粒的293T细胞抽提总RNA，随后用Dynabeads Oligo (dT)试剂盒（Thermo Fisher Scientific品牌）分离带poly (A)尾的GFP mRNA。将分离得到的GFP mRNA用TURBOTM DNase（ThermoFisher Scientific品牌）除去DNA，然后用AgencourtRNAClean XP beads 试剂（Beckman Coulter品牌）进行纯化，获得纯化后的带poly (A)尾的GFP mRNA。将获得的GFP mRNA 反转录成cDNA ，反转录引物为（SEQ ID NO:4）：5’-CAAACTCATCAATGTATCTTATCATG-3’。将反转录产物经RNase A、RNaseH处理后获得纯化的cDNA。
将获得的cDNA进行PCR扩增， PCR扩增引物序列为：
上游引物：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTA
CACGACGCTCTTCCGATCT-3’；
下游引物：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-index-GTGACTGGA
GTTCAGACGTG-3’。
下游引物含有Illumina HiSeq 测序平台特异识别的index标签（采用Illumina高通量测序平台文库构建专用配套试剂盒“VAHTSTM DNA Adapters set3 - set6 forIllumina”及其中index标签）。该PCR反应设置10个循环反应，并将纯化后的PCR产物（该PCR产物库即为高通量测序时的输出文库）进行高通量测序。
将未插入任何筛选片段的MAS-seq载体进行AgeI-HF和SalI-HF双酶切后转染293T细胞，并抽提总RNA，分离、纯化获得带poly (A)尾的GFP mRNA，并进行反转录成cDNA。反转录引物为SEQ ID NO:4所示。将反转录产物经RNase A、RNaseH处理后获得纯化的cDNA。将获得的cDNA进行PCR扩增， PCR扩增引物序列为：SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示，该PCR反应设置10个循环反应，并将纯化后的PCR产物作为高通量测序分析时的输入文库。
对高通量测序结果进行分析，将输出文库与输入文库进行比较，将比输入文库GFPmRNA丰度低的序列筛选出来，与待测物种基因组进行比对确定这些序列在基因组中的具体位置，在基因组中确定位置的这些序列即为该物种的沉默子序列。
高通量测序分析方法：为了区分输出文库的每个PCR重复，用多种不同的index索引引物（如SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示）建立单独的最终PCR反应，并提交给Illumina测序。通过bowtie比对方法将 illumina Hiseq2000测序结果的末端配对的测序读数（2×100bp）与参照基因组数据进行比对，其中对可以定位到多个基因组位置的读数被删除。为了消除潜在的 PCR 扩增的偏差，利用 Picard (http://broad- institute.github.io/picard/) 将起始和终点位置相同的片段折叠成不同的片段。将来自多个索引文库的具有唯一性的定位片段进行混合，用于后续分析。我们通过结合两个生物学重复的数据，利用MACS2调取沉默子的峰（q-value < 0.05 ）去鉴定沉默子。基于 MACS2的泊松分布，当输入文库中来自一个区域的显著富集的片段比输出文库这个区域多时，沉默子峰被调取（FDR＜0.05）。将调取出来的沉默子序列与待测物种基因组进行比对，定位沉默子所在染色体位置及序列，即是该物种的沉默子序列。同时，还可以根据测序结果进一步分析所筛选出来的沉默子活性强度：将 MACS2得到的富集分数作为沉默子的活性强度，对于特定峰的沉默子活性的计算是：（输入文库中峰区域中不同片段的数目/输入文库总片段数）/（输出文库中峰区域中不同片段的数目/输出文库总片段数）。由此，不仅可以筛选出待测物种全基因组的沉默子，还可以计算出这些沉默子的活性强度，对于进一步构建该物种沉默子图谱，了解沉默子的特征以及作用机制具有极其重要的意义。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院农业基因组研究所
<120> 全基因组沉默子筛选系统及其应用
<130> 20210104
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5540
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
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agccctgggt ttgcgcaggg acgcggctgc tctgggcgtg gttccgggaa acgcagcggc 120
gccgaccctg ggtctcgcac attcttcacg tccgttcgca gcgtcacccg gatcttcgcc 180
gctacccttg tgggcccccc ggcgacgctt cctgctccgc ccctaagtcg ggaaggttcc 240
ttgcggttcg cggcgtgccg gacgtgacaa acggaagccg cacgtctcac tagtaccctc 300
gcagacggac agcgccaggg agcaatggca gcgcgccgac cgcgatgggc tgtggccaat 360
agcggctgct cagcagggcg cgccgagagc agcggccggg aaggggcggt gcgggaggcg 420
gggtgtgggg cggtagtgtg ggccctgttc ctgcccgcgc ggtgttccgc attctgcaag 480
cctccggagc gcacgtcggc agtcggctcc ctcgttgacc gaatcaccga cctctctccc 540
caggggcccg aattaattcg ctgtctgcga gggccagctg ttggggtgag tactccctct 600
caaaagcggg catgacttct gcgctaagat tgtcagtttc caaaaacgag gaggatttga 660
tattcacctg gcccgcggtg atgcctttga gggtggccgc gtccatctgg tcagaaaaga 720
caatcttttt gttgtcaagc ttgaggtgtg gcaggcttga gatctggcca tacacttgag 780
tgacaatgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagg tccaactgca 840
ggtcgcctgc aggcttaagc atggctagca aaggagaaga actcttcact ggagttgtcc 900
caattcttgt tgaattagat ggtgatgtta acggccacaa gttctctgtc agtggagagg 960
gtgaaggtga tgcaacatac ggaaaactta ccctgaagtt catctgcact actggcaaac 1020
tgcctgttcc ctggccaaca ctagtcacta ctctgtgcta tggtgttcaa tgcttttcaa 1080
gatacccgga tcatatgaaa cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg 1140
tacaggaaag gaccatcttc ttcaaagatg acggcaacta caagacacgt gctgaagtca 1200
agtttgaagg tgataccctt gttaatagaa tcgagttaaa aggtattgac ttcaaggaag 1260
atggcaacat tctgggacac aaattggaat acaactataa ctcacacaat gtatacatca 1320
tggcagacaa acaaaagaat ggaatcaaag cgaacttcaa gacccgccac aacattgaag 1380
atggaagcgt tcaactagca gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg 1440
tccttttacc agacaaccat tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg 1500
aaaagagaga ccacatggtc cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca 1560
tggatgaact gtacaactga tctagagcat gcaccggtga tatcgcggcc gcattaggca 1620
ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtataatgt gtggattttg agttaggatc 1680
cgtcgagatt ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa aaaaatcact ggatatacca 1740
ccgttgatat atcccaatgg catcgtaaag aacattttga ggcatttcag tcagttgctc 1800
aatgtaccta taaccagacc gttcagctgg atattacggc ctttttaaag accgtaaaga 1860
aaaataagca caagttttat ccggccttta ttcacattct tgcccgcctg atgaatgctc 1920
atccggaatt ccgtatggca atgaaagacg gtgagctggt gatatgggat agtgttcacc 1980
cttgttacac cgttttccat gagcaaactg aaacgttttc atcgctctgg agtgaatacc 2040
acgacgattt ccggcagttt ctacacatat attcgcaaga tgtggcgtgt tacggtgaaa 2100
acctggccta tttccctaaa gggtttattg agaatatgtt tttcgtctca gccaatccct 2160
gggtgagttt caccagtttt gatttaaacg tggccaatat ggacaacttc ttcgcccccg 2220
ttttcaccat gggcaaatat tatacgcaag gcgacaaggt gctgatgccg ctggcgattc 2280
aggttcatca tgccgtttgt gatggcttcc atgtcggcag aatgcttaat gaattacaac 2340
agtactgcga tgagtggcag ggcggggcgt aaacgcgtgg atccggctta ctaaaagcca 2400
gataacagta tgcgtatttg cgcgctgatt tttgcggtat aagaatatat actgatatgt 2460
atacccgaag tatgtcaaaa agaggtatgc tatgaagcag cgtattacag tgacagttga 2520
cagcgacagc tatcagttgc tcaaggcata tatgatgtca atatctccgg tctggtaagc 2580
acaaccatgc agaatgaagc ccgtcgtctg cgtgccgaac gctggaaagc ggaaaatcag 2640
gaagggatgg ctgaggtcgc ccggtttatt gaaatgaacg gctcttttgc tgacgagaac 2700
aggggctggt gaaatgcagt ttaaggttta cacctataaa agagagagcc gttatcgtct 2760
gtttgtggat gtacagagtg atattattga cacgcccggg cgacggatgg tgatccccct 2820
ggccagtgca cgtctgctgt cagataaagt ctcccgtgaa ctttacccgg tggtgcatat 2880
cggggatgaa agctggcgca tgatgaccac cgatatggcc agtgtgccgg tctccgttat 2940
cggggaagaa gtggctgatc tcagccaccg cgaaaatgac atcaaaaacg ccattaacct 3000
gatgttctgg ggaatataaa tgtcaggctc ccttatacac agccagtctg caggatatcg 3060
tcgacgaatt cggccggccg cttcgagcag acatgataag atacattgat gagtttggac 3120
aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg 3180
ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt 3240
ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca 3300
aatgtggtaa aatcgataag gatccgaccg atgcccttga gagccttcaa cccagtcagc 3360
tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac ttatgactgt cttctttatc 3420
atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 3480
gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 3540
atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 3600
caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 3660
gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 3720
ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 3780
cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 3840
taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 3900
cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 3960
acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 4020
aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 4080
atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 4140
atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 4200
gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 4260
gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 4320
ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 4380
ttggtctgac agcggccgca aatgctaaac cactgcagtg gttaccagtg cttgatcagt 4440
gaggcaccga tctcagcgat ctgcctattt cgttcgtcca tagtggcctg actccccgtc 4500
gtgtagatca ctacgattcg tgagggctta ccatcaggcc ccagcgcagc aatgatgccg 4560
cgagagccgc gttcaccggc ccccgatttg tcagcaatga accagccagc agggagggcc 4620
gagcgaagaa gtggtcctgc tactttgtcc gcctccatcc agtctatgag ctgctgtcgt 4680
gatgctagag taagaagttc gccagtgagt agtttccgaa gagttgtggc cattgctact 4740
ggcatcgtgg tatcacgctc gtcgttcggt atggcttcgt tcaactctgg ttcccagcgg 4800
tcaagccggg tcacatgatc acccatatta tgaagaaatg cagtcagctc cttagggcct 4860
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgcg gtgttgtcgc tcatggtaat ggcagcacta 4920
cacaattctc ttaccgtcat gccatccgta agatgctttt ccgtgaccgg cgagtactca 4980
accaagtcgt tttgtgagta gtgtatacgg cgaccaagct gctcttgccc ggcgtctata 5040
cgggacaaca ccgcgccaca tagcagtact ttgaaagtgc tcatcatcgg gaatcgttct 5100
tcggggcgga aagactcaag gatcttgccg ctattgagat ccagttcgat atagcccact 5160
cttgcaccca gttgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttcggg gtgtgcaaaa 5220
acaggcaagc aaaatgccgc aaagaaggga atgagtgcga cacgaaaatg ttggatgctc 5280
atactcgtcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttactagta cgtctctcaa 5340
ggataagtaa gtaatattaa ggtacgggag gtattggaca ggccgcaata aaatatcttt 5400
attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagtactaa catacgctct 5460
ccatcaaaac aaaacgaaac aaaacaaact agcaaaatag gctgtcccca gtgcaagtgc 5520
aggtgccaga acatttctct 5540
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
tagagcatgc accggacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 48
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
ggccgaattc gtcgagtgac tggagttcag acgtgtgctc ttccgatct 49
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
caaactcatc aatgtatctt atcatg 26
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
accctgaagt tcatctgcac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
catgccgttt catatgatcc 20
Claims (7)
1.全基因组沉默子筛选系统，其中，所述系统包括MAS-seq载体，所述的MAS-seq载体包括强启动子、同源臂、标记基因、poly A位点，所述MAS-seq载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的全基因组沉默子筛选系统，其中，所述MAS-seq载体的强启动子包括hPGK、CMV、CAG、SV40、PMC1中的任一种。
3.根据权利要求1所述的全基因组沉默子筛选系统，其中，所述MAS-seq载体的标记基因包括GFP、RFP、mCherry、BFP中的任一种。
4.权利要求1-3任一项所述全基因组沉默子筛选系统在筛选基因组沉默子中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述应用在筛选基因组沉默子时的方法如下：
打断待测基因序列、将打断的基因片段与Illumina接头连接，并使用含有MAS-seq载体同源臂序列的引物进行PCR扩增；
将纯化后的PCR产物同源重组至MAS-seq载体，构建成MAS-seq筛选质粒；
将MAS-seq筛选质粒转染细胞，抽提RNA，并富集标记基因mRNA；
将标记基因mRNA进行反转录，获得cDNA，并将cDNA进行PCR扩增；
将纯化后的PCR扩增产物进行高通量测序，并对测序结果进行分析，筛选出标记基因表达量低的测序结果，对应沉默子插入位点的序列即为筛选出的沉默子序列。
6.权利要求1-3任一项所述的全基因组沉默子筛选系统在验证基因组沉默子中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述应用在验证基因组沉默子时的方法如下：
将待验证序列插入沉默子筛选系统载体，构建验证质粒；
将验证质粒转染细胞；
收集细胞抽提RNA，并富集标记基因mRNA；
将富集的标记基因mRNA进行反转录荧光定量PCR检测；
将PCR检测结果与对照组进行比较，表达量显著低于对照组mRNA表达量，则待验证序列为沉默子；反之，为非沉默子。
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|---|---|---|---|---|
| CN116286991A (zh) * | 2023-02-10 | 2023-06-23 | 中国农业科学院农业基因组研究所 | 全基因组增强子筛选系统、筛选方法及应用 |
Citations (2)
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| CN110885845A (zh) * | 2019-06-19 | 2020-03-17 | 中国农业科学院农业基因组研究所 | 一种基于随机序列利用载体筛选活性增强子的方法 |
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2021
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| CN116286991B (zh) * | 2023-02-10 | 2023-10-13 | 中国农业科学院农业基因组研究所 | 全基因组增强子筛选系统、筛选方法及应用 |
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