CN116286991A - 全基因组增强子筛选系统、筛选方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种全基因组增强子筛选系统，该系统包括MAE‑seq增强子筛选载体、待筛选片段构成的质粒文库、转染质粒文库并抽提gDNA进行PCR扩增后测序获得的input文库、转染质粒文库经荧光分选后再抽提gDNA并进行PCR扩增后测序获得的output文库以及可过滤掉output文库中假阳性数据的统计学过滤模型。由此，可以通过仅对待筛选的基因片段构建质粒文库、荧光分选、高通量测序及过滤模型过滤即可实现高效稳定的全基因组增强子筛选。本系统适用于适合物种，且不用构建转录组文库，通过荧光表达富集直观高效，还没有覆盖范围不均匀、过度分散且被测序偏差混淆的问题，是相对于现有技术STARR‑seq操作更便捷，成本更低，且稳定、高效的增强子筛选系统。

Description

全基因组增强子筛选系统、筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种全基因组增强子筛选系统、筛选方法及应用。
背景技术
增强子是基因组重要的调控元件，对基因的转录表达调控具有重要作用。增强子通常与启动子互作并且作用方式不受距离和方向的影响，一个基因可能受一个或多个增强子调控，同一个增强子也可能与多个基因互作，正是由于增强子复杂的作用方式形成了基因组基因复杂的调控网络，并可以对生物体性状进行精细调控，要想更好的理解增强子的作用规律需要对全基因组增强子进行筛选，目前对增强子进行全基因组筛选的主流MPRAs(Massively parallel reporter assays大规模并行报告分析)的方法以STARR-seq(self-transcribing active reg-ulatory region sequencing，自转录活性调控区域测序)为主，但是STARR-seq需要进行复杂的转录基因组文库构建及深度测序，建库及深度测序成本高，流程复杂等问题，而且STARR-seq还存在容易导致覆盖范围不均匀、过度分散且经常被测序偏差(例如GC含量)混淆的问题。
为了解决这些问题，需要重新构建一种灵敏度高、可靠性好且流程简便，使用成本较低的筛选增强子的系统及方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种全基因组增强子筛选系统、构建方法及在筛选、验证增强子上的应用，以解决上述问题。
根据本发明的第一个方面，提供了一种全基因组增强子筛选系统，该系统包括MAE-seq增强子筛选载体、待筛选片段构成的质粒文库、转染质粒文库并抽提gDNA进行PCR扩增后测序获得的input文库、转染质粒文库经荧光分选后再抽提gDNA并进行PCR扩增后测序获得的output文库以及可过滤掉output文库中假阳性数据的统计学过滤模型；该MAE-seq增强子筛选载体包括弱启动子、荧光素酶报告基因，该弱启动子与荧光素酶报告基因连接，该MAE-seq增强子筛选载体核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。本系统设计了output文库可以通过荧光分选，对表达荧光的细胞进行富集，即是对增强子进行富集；同时还引入了统计学过滤模型，通过该过滤模型可以最大程度的过滤掉output文库中的假阳性。由此，可以通过仅对含有待筛选的基因片段构建质粒文库、荧光分选、质粒测序及过滤模型过滤即可实现高效稳定的全基因组增强子筛选。本系统适用于适合物种，且不用构建转录组文库，通过荧光表达富集直观高效，还没有覆盖范围不均匀、过度分散且被测序偏差(例如GC含量)混淆的问题，是相对于现有技术STARR-seq操作更便捷，成本更低，且稳定、高效的增强子筛选系统。
在某些实施方式中，该待筛选片段构成的质粒文库的是将待筛选片段两端增加与MAE-seq增强子筛选载体上可同源重组的特异性序列作为同源臂，然后将合成的含有待筛选片段及同源臂的新序列插入线性化的MAE-seq增强子筛选载体上，并进行转化，抽提质粒并将质粒合并组成质粒文库。
在某些实施方式中，该含有待筛选片段及同源臂的新序列如SEQ ID No:2所示，在SEQ ID No:2所示的序列中M表示待筛选片段插入的位置，M两端序列为可以与MAE-seq增强子筛选载体上进行同源重组的特异性序列。
在某些实施方式中，统计学过滤模型以input文库作为对照，对output文库进行过滤，可过滤掉output文库中假阳性数据，所述统计学过滤模型如下：
1)去除input文库与output文库的接头序列，然后将剩余的读数比对到相应的参考基因组上，保留唯一比对序列；
2)对步骤1)中处理后读数用如下函数进行均一化处理：
Figure BDA0004072069350000021
其中N是读的总数，p为PCR扩增效率，c为PCR循环次数，ω是缩放因子，该ω是缩放系数由如下公式进行计算：ω＝10([log10(MIN(x,y))]+1)，其中MIN函数是总的input文库和output文库计数的次要值，x,y分别是input文库和output文库的总读计数；
3)经上述筛选获得数据经验证服从泊松分布，该概率函数为：
Figure BDA0004072069350000031
λ＝n×p，其中k表示观测值的个数，N是读的总数，P是观测的概率；
4)对上述获得的数据进行Poisson检验计算显著性差异，用BenjaminiandHochberg检验选择Q值小于0.05的位点作为有效信号，筛选出来的有效信号位点的序列即为增强子序列。
根据本发明的第二个方面，提供了一种全基因组增强子筛选系统的构建方法，该方法包括如下步骤：
1)构建MAE-seq增强子筛选载体，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；
2)构建质粒文库：将待筛选片段两端增加与MAE-seq增强子筛选载体上可同源重组的特异性序列作为同源臂，然后将合成的含有待筛选片段及同源臂的新序列插入线性化的MAE-seq增强子筛选载体上，并进行转化，抽提质粒并将质粒合并组成质粒文库；
3)构建input文库:将质粒文库转染细胞，并抽提细胞中gDNA进行PCR扩增后测序，测序数据为input文库；
4)构建output文库：将质粒文库转染细胞，然后将转染后的细胞进行荧光表达分选，将可以表达荧光的细胞进行收集，并抽提细胞中gDNA进行PCR扩增后测序，测序数据为output文库；
5)将获得的input文库与output文库数据进行统计学过滤模型过滤，过滤掉output文库中假阳性数据，过滤后数据即为筛选获得的阳性增强子序列数据。
由此，通过本方法可以构建一套高效、稳定、操作便捷的全基因组增强子筛选系统。
在某些实施方式中，将获得的input文库与output文库数据进行统计学过滤模型过滤，过滤步骤如下：
1)去除input文库与output文库的接头序列，然后将剩余的读数比对到相应的参考基因组上，保留唯一比对序列；
2)对步骤1)中处理后读数用如下函数进行均一化处理：
Figure BDA0004072069350000041
其中N是读的总数，p为PCR扩增效率，c为PCR循环次数，ω是缩放因子，该ω是缩放系数由如下公式进行计算：ω＝10([log10(MIN(x,y))]+1)，其中MIN函数是总的input文库和output文库计数的次要值，x,y分别是input文库和output文库的总读计数；
3)经上述筛选获得数据经验证服从泊松分布，该概率函数为：
Figure BDA0004072069350000042
λ＝n×p，其中k表示观测值的个数，N是读的总数，P是观测的概率；
4)对上述获得的数据进行Poisson检验计算显著性差异，用BenjaminiandHochberg检验选择Q值小于0.05的位点作为有效信号，筛选出来的有效信号位点的序列即为增强子序列。
根据本发明的第三个方面，提供了全基因组增强子筛选系统在全基因组中筛选增强子的方法，该方法包括如下步骤：
1)将待筛选片段打断，将打断的片段两端加入能与MAE-seq增强子筛选载体上可同源重组的特异性序列作为同源臂，然后将合成的含有待筛选片段及同源臂的新序列插入线性化的MAE-seq增强子筛选载体上，并进行转化，抽提质粒并将质粒合并组成质粒文库；所述MAE-seq增强子筛选载体的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
2)将质粒文库转染细胞，并抽提细胞中gDNA进行PCR扩增后测序，测序数据为input文库；
3)将质粒文库转染细胞，然后将转染后的细胞进行荧光表达分选，将可以表达荧光的细胞进行收集，并抽提细胞中gDNA进行PCR扩增后测序，测序数据为output文库；
4)将获得的input文库与output文库数据进行统计学过滤模型过滤，过滤掉output文库中假阳性数据，即为筛选获得的阳性增强子序列数据。
由此，通过本方法，可以高效、稳定的实现各个物种全基因组增强子的筛选，本方法是基于荧光分选的高通量增强子筛选方法(MAE-seq)，没有筛选片段数量的限制，且相对于现有STARR-seq筛选方法，操作更便捷，成本更低。
在某些实施方式中，将获得的input文库与output文库数据进行统计学过滤模型过滤，过滤步骤如下：
1)去除input文库与output文库的接头序列，然后将剩余的读数比对到相应的参考基因组上，保留唯一比对序列；
2)对步骤1)中处理后读数用如下函数进行均一化处理：
Figure BDA0004072069350000051
其中N是读的总数，p为PCR扩增效率，c为PCR循环次数，ω是缩放因子，该ω是缩放系数由如下公式进行计算：ω＝10([log10(MIN(x,y))]+1)，其中MIN函数是总的input文库和output文库计数的次要值，x,y分别是input文库和output文库的总读计数；
3)经上述筛选获得数据经验证服从泊松分布，该概率函数为：
Figure BDA0004072069350000052
λ＝n×p，其中k表示观测值的个数，N是读的总数，P是观测的概率；
4)对上述获得的数据进行Poisson检验计算显著性差异，用BenjaminiandHochberg检验选择Q值小于0.05的位点作为有效信号，利用权利要求1-4任一项所述的全基因组增强子筛选系统在全基因组中筛选增强子的方法。
根据本发明的第四个方面，提供了一种全基因组增强子筛选系统在筛选基因组增强子中的应用。由此，通过本应用，可以实现对各个物种全基因组增强子的筛选，筛选过程更加便捷，筛选高效且稳定，筛选成本更低。
在某些实施方式中，该应用如下：
1)将待筛选片段打断，将打断的片段两端加入能与MAE-seq增强子筛选载体上可同源重组的特异性序列作为同源臂，然后将合成的含有待筛选片段及同源臂的新序列插入线性化的MAE-seq增强子筛选载体上，并进行转化，抽提质粒并将质粒合并组成质粒文库；
2)将质粒文库转染细胞，并抽提细胞中gDNA进行PCR扩增后测序，测序数据为input文库；
3)将质粒文库转染细胞，然后将转染后的细胞进行荧光表达分选，将可以表达荧光的细胞进行收集，并抽提细胞中gDNA进行PCR扩增后测序，测序数据为output文库；
4)将获得的input文库与output文库数据进行统计学过滤模型过滤，过滤掉output文库中假阳性数据，即为筛选获得的阳性增强子序列数据。
根据本发明的第五个方面，提供了一种增强子筛选载体在验证增强子序列上的应用。本应用中，将待验证片段插入MAE-seq增强子筛选载体中，通过转染该载体并观察红色荧光的表达情况，即可直观的验证该片段是否为增强子，无需测序，更简便，易操作。
在某些实施方式中，该应用如下：将待验证基因片段两端加入能与MAE-seq增强子筛选载体上可同源重组的特异性序列作为同源臂，然后将合成的含有同源臂的待验证序列插入线性化的MAE-seq增强子筛选载体上，然后将该质粒转染细胞，根据该质粒在细胞中荧光表达情况来判断待验证序列是否为增强子序列，表达荧光则为增强子序列，反之则不是。
本发明的有益效果：
1、公开了一种新的全基因组增强子筛选系统，本系统设计了output文库可以通过荧光分选，对表达荧光的细胞进行富集，即是对增强子进行富集；同时还引入了统计学过滤模型，通过该过滤模型可以最大程度的过滤掉output文库中的假阳性。由此，可以通过仅对含有待筛选的基因片段构建质粒文库、荧光分选、质粒测序及过滤模型过滤即可实现高效稳定的全基因组增强子筛选。本系统适用于适合物种，且不用构建转录组文库，通过荧光表达富集直观高效，还没有覆盖范围不均匀、过度分散且被测序偏差(例如GC含量)混淆的问题，是相对于现有技术STARR-seq操作更便捷，成本更低，且稳定、高效的增强子筛选系统。
2、公开了一种新的全基因组增强子筛选系统的构建方法，通过本方法可以构建一套高效、稳定、操作便捷的全基因组增强子筛选系统。
3、公开了一种利用全基因组增强子筛选系统在全基因组中筛选增强子的方法，通过本方法，可以高效、稳定的实现各个物种全基因组增强子的筛选，本方法是基于荧光分选的高通量增强子筛选方法(MAE-seq)，没有筛选片段数量的限制，且相对于现有STARR-seq筛选方法，操作更便捷，成本更低。
4、公开了一种全基因组增强子筛选系统在筛选基因组增强子中的应用，通过本应用，可以实现对各个物种全基因组增强子的筛选，筛选过程更加便捷，筛选高效且稳定，筛选成本更低。
5、公开了一种增强子筛选载体在验证增强子序列上的应用。本应用中，将待验证片段插入MAE-seq增强子筛选载体中，通过转染该载体并根据该载体的荧光表达情况，即可判断该待验证序列是否为增强子序列，表达荧光则为增强子序列，反之为非增强子序列。
附图说明
图1为MAE-seq增强子筛选载体的结构图；
图2为MAE-seq增强子筛选系统筛选增强子的流程图；
图3为MAE-seq增强子筛选系统验证筛选出来的阳性序列的验证结果图：其中，图中最右侧为对照组PGL4.53，其余9条为检测组，其中仅有第3条与对照组差异不显著；
图4为MAE-seq增强子筛选系统验证筛选出来的阴性序列的验证结果图：其中，图中最右侧为对照组PGL4.53，其余20条为检测组，其中仅有第5条与对照组差异显著。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对发明作进一步详细的说明。
实施例1 MAE-seq增强子筛选载体的构建
本申请中增强子筛选载体是基于pMX-GFP逆转录病毒载体(Cell Biolabs,USA)进行改造获得的。首先从pGL4.23荧光素酶报告载体(Promega,USA)中获得mini-promoter(弱启动子)(该mini-promoter来源于pGL4.23荧光素酶报告载体，且该mini-promoter是含有TATA-box的一段不完整启动子序列，其必须与增强子相互作用才能进行转录)基因片段与mCherry基因片段(该基因片段为基因合成获得)合成新的miniP-mCherry片段(该miniP-mCherry片段的启动子为mini-promoter弱启动子，在无增强子的前提下，该mCherry基因无法表达红色荧光)，获得方法如下：然后用XbaⅠ/NcoⅠ限制性内切酶酶切pGL4.23，去除luc2报告基因的原始编码序列，并用mCherry基因片段(该mCherry基因片段为基因合成获得)进行替换，即可获得miniP-mCherry片段；再用含有NcoⅠ或NotⅠ酶切位点的引物扩增该miniP-mCherry片段；将扩增获得的含有miniP-mCherry的DNA片段连接克隆到NcoⅠ和NotⅠ双酶切的pMX-GFP载体中，即得到增强子筛选载体MAE-seq(该MAE-seq增强子筛选载体的结构图如图1所示)，用HindⅢ和xhoⅠ双酶切该MAE-seq载体，即形成可用于文库生成的线性化增强子筛选载体。
该MAE-seq增强子筛选载体，由于mCherry基因片段是连接的弱启动子(mini-promoter)，因此该载体中若通过同源重组插入的不是增强子，则mCherry基因将无法表达红色荧光蛋白；而若通过同源重组，在该载体中插入了增强子序列，则该增强子可以与弱启动子(mini-promoter)互作来使mCherry基因表达红色荧光，进而可以通过红色荧光表达情况，来初步判断该插入片段是否为增强子。
该MAE-seq增强子筛选载体的核苷酸序列(SEQ ID No:1)为：
Figure BDA0004072069350000081
Figure BDA0004072069350000091
Figure BDA0004072069350000101
实施例2 MAE-seq增强子筛选系统的构建
2.1质粒文库的构建
将待筛选的DNA片段打断成合适大小的待筛选片段fragments(如200-600bp)，通过人工合成或引物扩增的方式使待筛选片段fragments两端加上MAE-seq增强子筛选载体上的特异性序列作为同源重组的同源臂，形成新的待筛选片段，该新的待筛选片段的核苷酸序列组成如下所示：CTAACTGGCCGGTACCTGAGCTCGCTAGCCTCGAGTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-fragments-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACAAGCTTAGACACTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCG(该序列在序列表中记为SEQ ID No:2序列，在SEQ ID No:2序列中用M表示待筛选片段fragments插入位置，M两端序列为可与MAE-seq增强子筛选载体进行同源重组的特异性序列，该特异性序列相当于同源臂)，利用同源重组酶(Vazyme；Cat.No.C112)将这些新的待筛选片段(含有同源臂的)与已经用xhoI和Hind III进行双酶切的MAE-seq线性载体进行同源重组。将重组产物利用AMP XP磁珠进行纯化，纯化后的产物根据电击感受态(ThermoFisher Scientific；Cat.No.C6400)使用说明进行操作。将电击转化后的混合物转移到至少10L的LB培养基中在37℃，200rpm的摇床中进行培养过夜，第二天用无内毒素质粒提取试剂盒(QIAGEN；Cat.No 12362)进行质粒抽提。抽提出来的质粒合并在一起即为质粒文库。
序列表中SEQ ID No:2序列为：
CTAACTGGCCGGTACCTGAGCTCGCTAGCCTCGAGTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGMCTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACAAGCTTAGACACTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCG；
其中一端同源重组特异性序列为SEQ ID No:3：
CTAACTGGCCGGTACCTGAGCTCGCTAGCCTCGAGTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG；
另一端同源重组特异性序列为SEQ ID No:4：
CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACAAGCTTAGACACTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCG。
2.2 input和output文库构建
对需要转染的细胞进行培养，等细胞汇合度在70％-90％时候用jetOPTIMUS试剂将2.1步骤中获得的质粒文库中的质粒进行转染，48小时后收集细胞并抽提gDNA，以100nggDNA为模板进行扩增(95℃45s；followedby 15cycles of98℃for 15s,60℃for 30s,72℃for 3min)，共扩增20个反应并合并，产物经2％琼脂糖凝胶电泳50min(120v,130mA)回收后送样进行高通量测序，测序的数据为input文库。
同样，将与构建input文库时使用的相同的目的细胞进行同样的质粒文库转染，所不同的是细胞转染48小时后进行流式荧光分选，因为MAE-seq载体中含有mCherry报告基因，如果插入的待筛选片段fragment具有增强子效应，那么就会与弱启动子mini-promoter作用(互作)从而使mCherry报告基因发出红色荧光，通过流式细胞仪富集这些具有红色荧光的细胞，并提取gDNA，以100ng gDNA为模板进行扩增(95℃45s；followedby 15cyclesof98℃for 15s,60℃for 30s,72℃for 3min)，共扩增20个反应并合并，产物经2％琼脂糖凝胶电泳50min(120v,130mA)回收后送样进行高通量测序，测序的数据为output文库。
2.3统计学过滤模型的建立
因为一个细胞中可能会有多个质粒进入，从而导致在output文库中有一些假阳性。比如一个阳性质粒A和一个阴性质粒B同时进入同一个细胞X，那么这个细胞X会因为阳性质粒A的进入而表达红色荧光，从而这个细胞X会被收集，也导致这个细胞里面的阴性质粒B也会被收集起来进入output文库，所以output文库会有一些假阳性数据。当然，这个阳性质粒A除了进入这个细胞X，还会进入其他细胞，这个阳性质粒A进入的所有细胞都会表达红色荧光，都会被富集起来，那么在output文库中阳性质粒A中增强子序列富集比例要远远大于阴性质粒B中非增强子序列。再者，与input文库相比，由于output文库经过了荧光富集，所以增强子序列在output文库中会富集并且比例要高于input文库。
基于上述原理，本申请中设计了一个算法过滤模型，以input为对照，对output文库进行过滤。首先通过cut-adaptive(v1.16)对fastq格式的input和output原始数据(rawreads)进行裁剪，去除接头序列。然后，使用bwa(version 0.7.5a-r405)将剩余的reads(读数)比对到相应的参考基因组上。保留了待筛选片段fragments不超过两个bwa错配的唯一比对序列。然后将这些reads的基因组起始和结束坐标用于下游处理。设计了一个量化函数对这些数据进行均一化处理，该函数如下：
Figure BDA0004072069350000121
其中N是读的总数。p为PCR扩增效率(默认＝1)。c为PCR循环次数，ω是缩放因子。
在波松检验中参数值越小，显著性越低，因此设置了缩放因子作为补偿来拟合检验。缩放系数由下式计算:ω＝10([log10(MIN(x,y))]+1)，其中MIN函数是总的input和output计数的次要值；x,y分别是input和output的总读计数。
MAE-seq增强子筛选系统筛选出来的数据经验证服从泊松分布，概率函数为：
Figure BDA0004072069350000131
λ＝n×p：其中，k表示观测值的个数，N是读的总数，P是观测的概率。然后用Poisson检验计算显著性差异，用Benjaminiand Hochberg检验选择Q值小于0.05的位点作为有效信号，筛选出来的有效信号位点的序列即为增强子序列。
综述所述，为MAE-seq增强子筛选系统筛选增强子的全部流程，整个流程的示意图如图2所示。
实施例3MAE-seq增强子筛选系统的验证
利用MAE-seq增强子筛选系统，在小鼠胚胎干细胞中鉴定出了626,879条增强子序列，为了验证MAE-seq增强子筛选系统的准确性，随机挑选了9条阳性序列(如表1)进行双荧光素酶验证(该双荧光素酶验证系统为pGL4.53[luc2/PGK]Vector(promega,E5011)，验证步骤可参考该试剂盒说明书)(如果该序列是增强子，则该序列所在的细胞的荧光表达值要显著高于对照组；反之则为非增强子)，结果显示其中8条显示出了很强的增强子活性(如图3中，有8条荧光表达值要显著高于对照组，仅有第3条荧光表达值与对照组差异不显著)。然后又选择了MAE-seq增强子筛选系统没有筛选到的20条阴性序列(如表2)进行验证，结果显示其中19条没有显示出增强子活性(如图4中，仅有第5条荧光表达值要显著高于对照组，其余19条的荧光表达值与对照组差异不显著)。以上结果均验证了MAE-seq增强子筛选系统的准确性和稳定性。
表1：
Figure BDA0004072069350000132
Figure BDA0004072069350000141
表2：
染色体 起始位置 终末位置
chr10 122109641 122109665
chr10 21744354 21744378
chr1 101755127 101755151
chr11 104634897 104634921
chr12 115622243 115622267
chr13 11329090 11329114
chr14 90997574 90997598
chr15 40394402 40394426
chr16 26131527 26131551
chr1 67723813 67723837
chr16 84437252 84437276
chr17 58864852 58864876
chr18 16003828 16003852
chr18 75250265 75250289
chr1 9023409 9023433
chr19 19940515 19940539
chr2 105619788 105619812
chr2 48634640 48634664
chr3 11773411 11773435
chr4 20587915 20587939
实施例4利用MAE-seq增强子筛选系统在全基因组中筛选增强子
1)将待筛选片段打断，将打断的片段两端加入能与MAE-seq增强子筛选载体上可同源重组的特异性序列作为同源臂，然后将合成的含有待筛选片段及同源臂的新序列插入线性化的MAE-seq增强子筛选载体上，并进行转化，抽提质粒并将质粒合并组成质粒文库；
2)将质粒文库转染细胞，并抽提细胞中gDNA进行PCR扩增后测序，测序数据为input文库；
3)将质粒文库转染细胞，然后将转染后的细胞进行荧光表达分选，将可以表达荧光的细胞进行收集，并抽提细胞中gDNA进行PCR扩增后测序，测序数据为output文库；
4)将获得的input文库与output文库数据进行统计学过滤模型过滤，过滤掉output文库中假阳性数据，即为筛选获得的阳性增强子序列数据。
该统计学过滤模型以input文库作为对照，对output文库进行过滤，可过滤掉output文库中假阳性数据，步骤如下：
1)去除input文库与output文库的接头序列，然后将剩余的读数比对到相应的参考基因组上，保留不超过两个bwa错配的唯一比对序列；
2)对步骤1)中处理后读数用如下函数进行均一化处理：
Figure BDA0004072069350000151
其中N是读的总数，p为PCR扩增效率，c为PCR循环次数，ω是缩放因子，该ω是缩放系数由如下公式进行计算：ω＝10([log10(MIN(x,y))]+1)，其中MIN函数是总的input文库和output文库计数的次要值，x,y分别是input文库和output文库的总读计数；
3)经上述筛选获得数据还需要服从泊松分布，该概率函数为：
Figure BDA0004072069350000152
λ＝n×p，其中k表示观测值的个数，N是读的总数，P是观测的概率；
4)对上述获得的数据进行Poisson检验计算显著性差异，用BenjaminiandHochberg检验选择Q值小于0.05的位点作为有效信号，筛选出来的有效信号位点的序列即为增强子序列。
实施例5利用MAE-seq增强子筛选载体验证基因组增强子
将待验证基因片段两端加入能与MAE-seq增强子筛选载体上可同源重组的特异性序列作为同源臂，然后将合成的含有同源臂的待验证序列插入线性化的MAE-seq增强子筛选载体上，然后对该质粒载体荧光表达情况进行检测，来判断插入的待验证序列是否为增强子，检测方法如下：
第一种方法：将获得的质粒载体与MAE-seq空载体(没有插入待验证序列)转染细胞，以MAE-seq空载体作为对照组。最后收集实验组和对照组细胞并用酶标仪器测定荧光值，若实验组的荧光值高于对照组则说明实验组中待验证的序列为增强子序列，反之不是。
第二种方法：通过流式细胞仪检测转染了该质粒的细胞是否表达荧光，表达荧光则为增强子，反正不是(可用转染了空载体的细胞作为对照)。
第三种方法：通过显微镜观察转染了该质粒的细胞是否表达荧光，表达荧光则为增强子，反正不是(可用转染了空载体的细胞作为对照)。
将实施例3中的待验证序列用上述方法进行验证，获得与实施例3中一致的结果，说明本MAE-seq增强子筛选载体可用于增强子序列的验证，且与现有双荧光素酶系统验证效率一致。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。

Claims (10)

1.全基因组增强子筛选系统，其中，所述系统包括MAE-seq增强子筛选载体、待筛选片段构成的质粒文库、转染质粒文库并抽提gDNA进行PCR扩增后测序获得的input文库、转染质粒文库经荧光分选后再抽提gDNA并进行PCR扩增后测序获得的output文库以及可过滤掉output文库中假阳性数据的统计学过滤模型；所述MAE-seq增强子筛选载体包括弱启动子、荧光素酶报告基因，所述弱启动子与荧光素酶报告基因连接，所述MAE-seq增强子筛选载体核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.根据权利要求1所述的筛选系统，其中，所述待筛选片段构成的质粒文库是将待筛选片段两端增加与MAE-seq增强子筛选载体上可同源重组的特异性序列作为同源臂，然后将合成的含有待筛选片段及同源臂的新序列插入线性化的MAE-seq增强子筛选载体上，并进行转化，抽提质粒并将质粒合并组成质粒文库。
3.根据权利要求2所述的筛选系统，其中，所述含有待筛选片段及同源臂的新序列如SEQ ID No:2所示，在SEQ ID No:2所示的序列中M表示待筛选片段插入的位置，M两端序列为可以与MAE-seq增强子筛选载体上进行同源重组的特异性序列。
4.根据权利要求1所述的筛选系统，其中，所述统计学过滤模型以input文库作为对照，对output文库进行过滤，可过滤掉output文库中假阳性数据，所述统计学过滤模型如下：
1)去除input文库与output文库的接头序列，然后将剩余的读数比对到相应的参考基因组上，保留唯一比对序列；
2)对步骤1)中处理后读数用如下函数进行均一化处理：
Figure FDA0004072069340000011
其中N是读的总数，p为PCR扩增效率，c为PCR循环次数，ω是缩放因子，该ω是缩放系数由如下公式进行计算：ω＝10([log10(MIN(x,y))]+1)，其中MIN函数是总的input文库和output文库计数的次要值，x,y分别是input文库和output文库的总读计数；
3)经上述筛选获得数据经验证服从泊松分布，该概率函数为：
Figure FDA0004072069340000021
λ＝n×p，其中k表示观测值的个数，N是读的总数，P是观测的概率；
4)对上述获得的数据进行Poisson检验计算显著性差异，用Benjaminiand Hochberg检验选择Q值小于0.05的位点作为有效信号，筛选出来的有效信号位点的序列即为增强子序列。
5.一种全基因组增强子筛选系统的构建方法，其中，所述方法包括如下步骤：
1)构建MAE-seq增强子筛选载体，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；
2)构建质粒文库：将待筛选片段两端增加与MAE-seq增强子筛选载体上可同源重组的特异性序列作为同源臂，然后将合成的含有待筛选片段及同源臂的新序列插入线性化的MAE-seq增强子筛选载体上，并进行转化，抽提质粒并将质粒合并组成质粒文库；
3)构建input文库:将质粒文库转染细胞，并抽提细胞中gDNA进行PCR扩增后测序，测序数据为input文库；
4)构建output文库：将质粒文库转染细胞，然后将转染后的细胞进行荧光表达分选，将可以表达荧光的细胞进行收集，并抽提细胞中gDNA进行PCR扩增后测序，测序数据为output文库；
5)将获得的input文库与output文库数据进行统计学过滤模型过滤，过滤掉output文库中假阳性数据，过滤后数据即为筛选获得的阳性增强子序列数据。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其中，所述方法步骤5)中统计学过滤模型以input文库作为对照，对output文库进行过滤，可过滤掉output文库中假阳性数据，步骤如下：
1)去除input文库与output文库的接头序列，然后将剩余的读数比对到相应的参考基因组上，保留唯一比对序列；
2)对步骤1)中处理后读数用如下函数进行均一化处理：
Figure FDA0004072069340000022
其中N是读的总数，p为PCR扩增效率，c为PCR循环次数，ω是缩放因子，该ω是缩放系数由如下公式进行计算：ω＝10([log10(MIN(x,y))]+1)，其中MIN函数是总的input文库和output文库计数的次要值，x,y分别是input文库和output文库的总读计数；
3)经上述筛选获得数据经验证服从泊松分布，该概率函数为：
Figure FDA0004072069340000031
λ＝n×p，其中k表示观测值的个数，N是读的总数，P是观测的概率；
4)对上述获得的数据进行Poisson检验计算显著性差异，用Benjaminiand Hochberg检验选择Q值小于0.05的位点作为有效信号，筛选出来的有效信号位点的序列即为增强子序列。
7.利用权利要求1-4任一项所述的全基因组增强子筛选系统在全基因组中筛选增强子的方法，其中，所述方法包括如下步骤：
1)将待筛选片段打断，将打断的片段两端加入能与MAE-seq增强子筛选载体上可同源重组的特异性序列作为同源臂，然后将合成的含有待筛选片段及同源臂的新序列插入线性化的如权利要求1中所述的MAE-seq增强子筛选载体上，并进行转化，抽提质粒并将质粒合并组成质粒文库；
2)将质粒文库转染细胞，并抽提细胞中gDNA进行PCR扩增后测序，测序数据为input文库；
3)将质粒文库转染细胞，然后将转染后的细胞进行荧光表达分选，将可以表达荧光的细胞进行收集，并抽提细胞中gDNA进行PCR扩增后测序，测序数据为output文库；
4)将获得的input文库与output文库数据进行统计学过滤模型过滤，过滤掉output文库中假阳性数据，即为筛选获得的阳性增强子序列数据。
8.权利要求1-4中任一项所述的全基因组增强子筛选系统在筛选基因组增强子中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其中，所述应用如下：
1)将待筛选片段打断，将打断的片段两端加入能与MAE-seq增强子筛选载体上可同源重组的特异性序列作为同源臂，然后将合成的含有待筛选片段及同源臂的新序列插入线性化的MAE-seq增强子筛选载体上，并进行转化，抽提质粒并将质粒合并组成质粒文库；
2)将质粒文库转染细胞，并抽提细胞中gDNA进行PCR扩增后测序，测序数据为input文库；
3)将质粒文库转染细胞，然后将转染后的细胞进行荧光表达分选，将可以表达荧光的细胞进行收集，并抽提细胞中gDNA进行PCR扩增后测序，测序数据为output文库；
4)将获得的input文库与output文库数据进行统计学过滤模型过滤，过滤掉output文库中假阳性数据，即为筛选获得的阳性增强子序列数据。
10.一种增强子筛选载体在验证增强子序列上的应用，其中，所述增强子筛选载体为权利要求1中所述的MAE-seq增强子筛选载体，所述应用如下：将待验证基因片段两端加入能与MAE-seq增强子筛选载体上可同源重组的特异性序列作为同源臂，然后将合成的含有同源臂的待验证序列插入线性化的MAE-seq增强子筛选载体上，然后将该质粒转染细胞，根据该质粒在细胞中荧光表达情况来判断待验证序列是否为增强子序列，表达荧光则为增强子序列，反之则不是。
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