CN108064276A - Cmv的修饰病毒样颗粒 - Google Patents

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    • C12N2770/14011—Bromoviridae
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/14011—Bromoviridae
    • C12N2770/14023—Virus like particles [VLP]

Abstract

本发明涉及植物病毒黄瓜花叶病毒(CMV)的病毒样颗粒，并且具体地涉及包括Th细胞表位，具体地通用Th细胞表位的CMV的修饰VLP。此外，这些修饰VLP优选充当疫苗平台，用于针对连接至所述修饰VLP的抗原生成免疫应答，具体地抗体应答。Th细胞表位，具体地通用Th细胞表位的存在导致生成的免疫应答进一步增加。

Description

CMV的修饰病毒样颗粒
技术领域
本发明涉及植物病毒黄瓜花叶病毒(CMV)的病毒样颗粒，并且具体地涉及包括Th细胞表位(具体地，通用Th细胞表位)的CMV的修饰VLP。此外，这些修饰VLP优选充当疫苗平台，用于生成针对连接至所述修饰VLP的抗原的免疫应答，具体地抗体应答。Th细胞表位(具体地，通用Th细胞表位)的存在导致生成的免疫应答进一步增加。
背景技术
在过去三十年，病毒样颗粒(VLP)已发展成为被接受的技术，尤其是在疫苗研发领域(Zeltins A，Mol Biotechnol(2013)53：92-107)。乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原和人乳头状瘤病毒(HPV)衣壳蛋白L1分别作为针对乙型肝炎和HPV引起的宫颈癌的商品疫苗的成功研制和引进尤其激起了对这些VLP渐增的关注。此外，病毒样颗粒已被描述为能够针对缀合抗原引起强烈免疫应答的免疫学载体(Jennings GT和Bachmann MF，Annu Rev PharmacolToxicol(2009)49：303-26；Jennings GT和Bachmann MF，Biol Chem(2008)389：521-536；WO2002/056905；WO2003/024481)。后者导致若干VLP系候选疫苗的研制已经进入不同阶段的临床研究，目的是在不久的将来研发出医学和兽医学用途的VLP系疫苗(Liu F等，Research in Veterinary Science(2012)93：553–559；Roldao A.等，Expert Review ofVaccines(2010)9：1149–1176)。
目前为止研发的VLP来源于微生物、植物、昆虫或哺乳动物病毒。除上述VLP系统之外，衍生自植物病毒的VLP近来也吸引了注意，主要是因为植物基于其提供独特翻译后修饰、成本效益、生产速度和可扩展性(scalability)的能力而作为生产VLP疫苗的经济且迅速的可选平台的地位(Chen Q和Lai H，Human Vaccines&Immunotherapeutics(2013)9：26-49；Zeltins A，Mol Biotechnol(2013)53：92-107)。
黄瓜花叶病毒(CMV，布氏病毒科(Bromoviridae)，黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus))是宿主范围极宽的线性正义等径植物病毒。该病毒基因组由三个单链RNA(RNA1、RNA2和RNA3)组成，外壳蛋白(CP)基因存在于基因组RNA3(约2200nt)和亚基因组RNA4(约nt)中。衣壳包括180个拷贝的约26kDa的单一蛋白质种类。已知多种不同株系来自与宿主植物相关各种症状有关的CMV，如CMV-B株系，CMV-C株系、CMV-D株系、CMV-L株系、CMV-S株系、CMV-T株系、CMV-WL-株系、CMV-V株系、CMV-Fny株系、CMV-Ix株系、CMV-Q株系、CMV-R株系或类似株系(Carrère I等，Arch Virol(1999)144：1846-1857；Edwards MC等，Phytopathology81983)73：1117-1120；www.dpvweb.net)。
近来，CMV的嵌合体形式已被改造从而充当呈递系统和在其外表面上表达源自丙型肝炎病毒(HCV)的表位。具体而言，CMV假重组形式CMV-D/S已被改造以携带来自CMV-S株系的基因组RNA3和来自CMV-D株系的RNA1和RNA2。这种系统在接种后产生病毒症状，如Xanthi烟草植物的轻度花叶病和叶脉清除(vein clearing)。然后CP基因的不同位置被改造，以编码丙型肝炎病毒(HCV)表位。选择的肽是所谓R9模拟表位——衍生自HCV包膜蛋白E2的多个高变区1(HVR1)序列的合成肽。慢性丙型肝炎患者的血清样本对被选择的CMV改造假重组嵌合体形式的其中一种感染的粗植物提取物显示显著的免疫反应性。因此，表明这种系统可以是能够实现有希望的口服免疫策略的研发的适当载体。后者符合植物是所谓营养品的可能生物反应器的观点，因为其活跃地在植物中复制，并且因此可想到被用作可食用疫苗，因为芹菜、生菜、黄瓜、番茄、胡萝卜、胡椒和香蕉是CMV的宿主。(Natilla A等，ArchVirol(2004)149：137–154；Piazzolla G等，J Clin Immunol(2005)25：142-152；Nuzzaci M等，Arch Virol(2007)152：915-928；Nuzzaci M等，Journal of Virological Methods(2009)155：118–121；Nuzzaci M等，Journal of Virological Methods(2010)165：211–215；Piazzolla G等，J Clin Immunol(2012)32：866-876)。
R9模拟表位的插入已发生在CMV-S RNA3的CP基因内的不同位置(AF063610，www.dpvweb.net)。对于一个R9模拟表位在所述CP基因中的插入，R9模拟表位核苷酸序列在所述CP基因的253、475、529位被插入，而对于两个R9模拟表位的插入，R9模拟表位核苷酸序列在392和529位被插入。最终产物是CMV嵌合体颗粒，每个病毒颗粒其外表面上携带180或360个拷贝的R9模拟表位。(Natilla A等，Arch Virol(2004)149：137–154；Piazzolla G等，J Clin Immunol(2005)25：142-152；Nuzzaci M等，Arch Virol(2007)152：915-928；Nuzzaci M等，Journal of Virological Methods(2009)155：118–121；Nuzzaci M等，Journal of Virological Methods(2010)165：211–215；Piazzolla G等，J Clin Immunol(2012)32：866-876)。
已有陈述，R9模拟表位在CMV-S RNA3中插入点的选择基于考虑几个重要因素：i)需要保护蛋白质-RNA相互作用稳定化CMV涉及的CMV外壳蛋白的N端区域(包含高浓度的碱性氨基酸，被称为内部R结构域(Wikoff WR等，Virology(1997)232：91-97))，其特征在于在衣壳中具有另外稳定化作用的异常N端螺旋(Smith TJ等，J Virol(2000)74：7578–7686))；ii)外源表位增加其假定免疫原性能力可能性的表面位置；iii)能够生成修饰克隆的诱变途径的可获得性。基于这些考虑，已致力研究aa范围70–192和相应的核苷酸区域，如上所述。如此制备的嵌合体CMV保留其在宿主植物中全身性散布的能力，这在用于植物中外源基因表达的潜在植物病毒载体的构建中是不可取代的目标。ELISA和IEM测试证明，R9模拟表位按计划在正确的位置暴露(Natilla A等，Arch Virol(2004)149：137–154)。
此外，近来描述了基于黄瓜花叶病毒的表达系统，用于生产猪圆环病毒特异性疫苗(Gellert A等，PLoS ONE(2012)7(12)：e52688)。具体而言，猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白表位被整合到黄瓜花叶病毒(CMV)-R株系的植物病毒外壳蛋白中的氨基酸131位后。测试重组体对于不同烟草(Nicotiana)属的感染性和稳定性，并纯化稳定的重组体病毒颗粒。颗粒结合至PCV诱导的猪抗体能力被测试，并被用于在小鼠和猪中进行特异性抗体诱导。结果显示，CMV表面上表达的PCV表位被猪抗体识别，并且其也能够诱导PCV特异性抗体应答。在免疫的猪中进行的PCV2挑战实验显示部分抗感染保护。
PCV2衣壳蛋白表位在迄今报道的CMV的三个稳定表位插入点被整合到黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白中(Nuzzaci M等，Arch Virol(2007)152：915-928；Vitti A等，J VirolMethods(2010)169：332-340)。这些位点处的内置(built-in)表位不阻断CMV的繁殖和在植物中的长距离运动。其中两个呈现在病毒粒子的外表面上，而第三个朝向病毒粒子的内部伸出。表达面向病毒粒子内部的表位存在静电限制，因为只有不干扰CMV衣壳内表面的RNA结合的带正电表位的表达可被成功尝试。具体而言，第一插入点位于CMV CP的aa83–84位和βBβC环末端。该内置表位在CMV病毒粒子的表面上表达。第二插入点位于CMV CP的aa 131–132位和βE-αEF环中间。该内置表位也在CMV病毒粒子的表面上表达。第三插入点位于aa176–177位和βG-βH环中间。在此后者情况下，插入的表位在CMV病毒粒子的内表面上表达。
此外，基于CMV的嵌合体病毒样颗粒(VLP)的生成已被描述，并且其作为动物疫苗的应用已被提出(Natilla，A等，Arch Virol(2006)151：1373-1386；Natilla，A等，ProteinExpression and Purification(2008)59：117-121)。然而，通过广泛使用的传统大肠杆菌(E.coli)表达系统表达CMV的病毒衣壳蛋白(CP)仅产生不溶性包涵体或极少量的可溶性蛋白(Xu Y等，Chem Commun(2008)49-51)。另一方面，CMV-Fny的马铃薯病毒X(PVX)表达外壳蛋白(CP)形成VLP，其充当新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)(经济上重要的家禽病原)的不同中和表位的表面显示载体。为此，来自融合(F)、血凝素-神经氨酸酶(NH)蛋白和串联F-NH肽的表位被基因融合到Fny-CMV CP的内部βH–βI(基序5)环(相应于其氨基酸194–199)中，并通过本氏烟草(Nicotiana benthamiana)植物中的PVX载体表达。所得嵌合体CMV VLP在形态上与野生型CMV颗粒不能分辨。此外，用纯化NH-CMV VLP免疫的小鸡产生抗原特异性抗体应答，然而，如此免疫的小鸡无NDV实验挑战保护(Natilla，A等，ArchVirol(2006)151：1373-1386；Natilla，A等，Protein Expression and Purification(2008)59：117-121；Chen Q和Lai H，Human Vaccines&Immunotherapeutics(2013)9：26-49)。
如述，CMV的病毒衣壳蛋白(CP)在大肠杆菌中的表达仅产生不溶性包涵体或极少量的可溶性蛋白(Xu Y等，Chem Commun(2008)49-51)。另一方面，Xu等能够将CMV的基因重组CP在体外组装成由不同长度的双链DNA产生的生物学纳米管(Xu Y等，Chem Commun(2008)49-51)。然而，为此，Xu等必须制备纯的可溶性CMV CP。这在大肠杆菌中表达CP后通过重组程序来实现。该程序包括分离和纯化在218个氨基酸残基的全长CP基因(IDAB008777，www.dpvweb.net)表达后形成的包涵体，然后通过变性溶解包涵体，最后对变性蛋白施用再折叠程序。
即使VLP系疫苗的研发过程已经有所进展，仍需要更卓越的VLP系统。具体地，疫苗在免疫的对象和个体内诱导各种抗体应答，并且抗体应答通常跨越超过100倍变异的范围。另外，一些疫苗，如抗乙型肝炎疫苗，遭遇一定量的无应答。已知无应答与某些MHC II型分子有关，并且认为不能诱导很好的T辅助(Th)细胞应答造成了在这些个体中观察到的不良抗体应答(Goncalves L等，Virology(2004)326：20–28)。此外，较老和老年人群负有的总体上不良抗体应答和不良Th细胞应答也被认为是无效抗体应答的原因。因此，在基本上所有对象和个体内诱导良好Th细胞应答的疫苗是疫苗研发领域的重要目标。
发明内容
发明人惊讶地发现，黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白可被修饰以合并T辅助(Th)细胞表位，并且优选合并通用Th细胞表位。后者尤其惊人，因为已知这些强Th细胞表位导致聚集，因此预期会阻碍表达后的自组装，产生VLP。此外，不仅提供了本发明的包括Th细胞表位(优选地，通用Th细胞表位)的修饰CMV VLP，而且通过在大肠杆菌中表达获得了本发明的修饰CMV VLP以及野生型CMV VLP，这再次令人惊讶，因为此前在大肠杆菌中生产CMV VLP的尝试产生的是聚集物，而非VLP。另外，本发明的VLP充当载体平台，具体地疫苗平台，其中期望生成免疫应答的抗原被连接至本发明的VLP。合并在本发明的CMV修饰VLP内的引入的Th细胞表位进一步增加了VLP的免疫原性并导致本发明的组合物生成的整体免疫应答增加，具体地抗体应答增加。
因此，第一方面，本发明提供黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰病毒样颗粒(VLP)，其中所述CMV的修饰VLP包括至少一种修饰CMV多肽、主要由至少一种修饰CMV多肽组成、或可选地由至少一种修饰CMV多肽组成，其中所述修饰CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV多肽、和(b)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(i)CMV外壳蛋白的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述CMV外壳蛋白显示至少90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性。
另一方面，本发明提供黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰病毒样颗粒(VLP)，其中所述CMV的修饰VLP包括至少一种修饰CMV多肽、主要由至少一种修饰CMV多肽组成、或可选地由至少一种修饰CMV多肽组成，其中所述修饰CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV多肽、和(b)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(i)CMV外壳蛋白的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述CMV外壳蛋白显示至少90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性；其中所述T辅助细胞表位(i)融合至所述CMV多肽的N端；(ii)融合至所述CMV多肽的C端；(iii)置换所述CMV多肽的连续氨基酸区域，其中所述CMV多肽的所述置换的连续氨基酸区域和T辅助细胞表位之间的序列同一性为至少15％，优选至少20％；或(iv)置换所述CMV多肽的N端区域，并且其中所述CMV多肽的所述置换的N端区域由5至15个连续氨基酸组成。
另一方面，本发明提供黄瓜花叶病毒(CMV)的病毒样颗粒(VLP)，其中所述CMV的VLP包括至少一种CMV多肽、主要由至少一种CMV多肽组成、或可选地由至少一种CMV多肽组成，该CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(i)CMV外壳蛋白的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述CMV外壳蛋白显示至少90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性；并且其中所述CMV的VLP通过在大肠杆菌中表达所述CMV多肽而获得，并且其中优选地所述表达在10℃至25℃之间的温度，优选在20℃的温度，发生。
另一方面，本发明提供包括修饰病毒样颗粒的组合物。此外，这些修饰VLP优选充当用于生成针对连接至所述修饰VLP的抗原的免疫应答(具体地，抗体应答)的疫苗平台。Th细胞表位(具体地，通用Th细胞表位)的存在导致生成的免疫应答进一步增加。
其它方面和其优选实施方式在本文得到更详细的描述。
附图说明
图1 pET-CMVwt质粒图。示出了所有相关基因和限制酶位点的相对位置。
图2 CMVwt蛋白的表达和蔗糖梯度纯化的SDS/PAGE分析。M-蛋白质尺寸标记；S-超声处理后的可溶性蛋白；P-超声处理后的不溶性蛋白；Ps-硫酸铵沉淀(pellet)中的可溶性蛋白(蔗糖梯度超速离心的样本)；Pp-硫酸铵沉淀中的不溶性蛋白；1、2、3、4、5、6–自35ml梯度管底部起的蔗糖梯度分级。
图3A纯化CMVwt VLP的动态光散射。颗粒尺寸利用Zetasizer Nano ZS(MalvernInstruments Ltd.，英国)来检测。
图3B纯化CMVwt VLP的电子显微分析。关于VLP的形态分析，使用JEM-1230电子显微镜(Jeol Ltd.，东京，日本)。
图4纯化CMV衍生VLP的质谱分析。基质辅助激光解吸/电离(MALDI)-TOF MS分析在Autoflex MS(Bruker Daltonik，德国)上进行。蛋白质分子量(MM)校准标准品II(22.3–66.5kDa；Bruker Daltonik)用于质量确定。
图4A CMV野生型(“wt”)；理论MM＝24069；实测(found)MM＝24058
图4B CMV-Npadr；理论MM＝24161(不含第一个Met)；实测MM＝24160
图4C CMV-Ntt830；理论MM＝24483(不含第一个Met)；实测MM＝24477
图5A纯化CMV-Ntt830VLP的动态光散射。颗粒尺寸利用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd.，英国)来检测。
图5B纯化CMV-Ntt830VLP的电子显微分析。关于VLP的形态分析，使用JEM-1230电子显微镜(Jeol Ltd.，东京，日本)。
图6A纯化CMV-Npadr VLP的动态光散射。颗粒尺寸利用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd.，英国)来检测。
图6B纯化CMV-Npadr VLP的电子显微分析。关于VLP的形态分析，使用JEM-1230电子显微镜(Jeol Ltd.，东京，日本)。
图7A在CMV野生型VLP免疫后测量抗体应答。数组小鼠在第0和7天用10μg、1μg或0.1μg的CMV-wt VLP免疫。在第0(免疫前)、7、14和28天测量特异性IgG总滴定度。每组小鼠＝4。
图7B在CMV-Npadr VLP免疫后测量抗体应答。数组小鼠在第0和7天用10μg、1μg或0.1μg的CMV-Npadr VLP免疫。在第0(免疫前)、7、14和28天测量特异性IgG总滴定度。每组小鼠＝4。
图7C在CMV-Ntt830VLP免疫后测量抗体应答。数组小鼠在第0和7天用10μg、1μg或0.1μg的CMV-Ntt830VLP免疫。在第0(免疫前)、7、14和28天测量特异性IgG总滴定度。每组小鼠＝4。
图8A检测小鼠内针对过敏原Fel D1的体液应答。主要猫过敏原Fel D1偶联至CMVNpadr。小鼠在第0和7天用5μg的Fel D1-VLP免疫。在所示时间点测量Fel D1特异性抗体。每组小鼠＝5。
图8B检测小鼠内针对过敏原Fel D1的体液应答。主要猫过敏原Fel D1偶联至CMVNtt830。小鼠在第0和7天用5μg的Fel D1-VLP免疫。在所示时间点测量Fel D1特异性抗体。每组小鼠＝5
图9显示针对α-突触核蛋白衍生肽的体液应答。小鼠在第0和14天用20μg偶联至CMV Ntt830的α-突触核蛋白衍生肽免疫。在所示时间点测量肽特异性抗体滴定度。小鼠数量＝4。
图10检测小鼠内针对自体蛋白IL17的抗体应答。细胞因子IL17偶联至CMVNtt830。小鼠在第0和14天用20μg的IL17-CMV Ntt830免疫。在所示时间点测量IL17特异性抗体。小鼠数量＝3。
图11A利用PrepEase试剂盒(USB)进行来自大肠杆菌C2566细胞的F12H6GGC蛋白的表达和纯化的SDS/PAGE分析。M-蛋白质尺寸标记；S-可溶性蛋白部分；P-细胞碎片；F-通过Ni-IDA柱的流(未结合的蛋白质)；W1、W2-冲洗部分(2x2ml 1xLEW缓冲液)；W3、W4冲洗部分(2x2ml 1xLEW+10mM咪唑)；E1、E2–洗脱部分(2x1.5ml E缓冲液250mM咪唑)。
图11B纯化F12H6GGC的质谱分析。F12H6GGC的平均质量计算值对应于20089.8Da。20105.3质量观测值对应于其中甲硫氨酸的一个硫氧化成亚砜基的F12H6GGC。
图11C F12GGC纯化的考马斯蓝染色SDS-PAGE分析。(A)AmS–50％(NH4)2SO4后溶解的沉淀。来自DEAE柱程序和随后的MonoQ纯化的各个部分：FT–通过流，A4-A7-通过增加NaCl梯度而洗脱的部分；(B)丁基HP柱(HIC)的最终纯化。
图12显示Indoor Biotechnologies提供的夹心ELISA，其利用针对天然Fel d1产生的mAbs。mAbs对F12H6GGC和天然Fel d1的识别同样好。
图13A天然Fel d1的嗜碱细胞活化测试(BAT)。
图13B F12H6GGC的嗜碱细胞活化测试(BAT)。F12H6GGC和天然Fel d1诱导的猫过敏患者血液中的嗜碱细胞活化水平相似，其通过CCR3+嗜碱细胞上的CD63上调指示。
图14在第0天和第14天接受10μg Fel d1-CMV VLP(Fel d1-CMV-Ntt830-VLP或Feld1-CMV-Npadr-VLP)或只是与Fel d1融合蛋白F12H6GGC混合的CMV-VLP(CMV-Ntt830-VLP或CMV-Npadr-VLP)的小鼠的抗体应答。在第0、14和21天采集血清，并通过ELISA分析天然Feld1特异性IgG抗体。N＝3。
具体实施方式
除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域技术人员的普遍理解具有相同含义。
病毒样颗粒(VLP)：本文使用的术语“病毒样颗粒(VLP)”指代无复制性或无感染性，优选无复制性且无感染性的病毒颗粒，或指代无复制性或无感染性，优选无复制性且无感染性的类似病毒颗粒的结构，优选病毒衣壳。本文使用的术语“无复制性”指代不能复制VLP包括的基因组。本文使用的术语“无感染性”指代不能进入宿主细胞。根据本发明的病毒样颗粒无复制性和无感染性，因为其缺少全部或部分病毒基因组或基因组功能。根据本发明的病毒样颗粒可包含区别于其基因组的核酸。重组产生的病毒样颗粒一般包含宿主细胞源RNA。根据本发明的病毒样颗粒一般和优选的实施方式是由本发明的多肽构成的病毒衣壳。病毒样颗粒一般是由病毒外壳蛋白构成的大分子组装体，每个病毒样颗粒一般包括60、120、180、240、300、360、或多于360个蛋白质亚单位。一般和优选地，这些亚单位的相互作用导致具有固有重复架构的病毒衣壳或病毒衣壳样结构形成。病毒样颗粒的一个特征是其亚单位的高度有序并且重复的排列。
CMV的病毒样颗粒：术语“CMV的病毒样颗粒"或CMV VLP指代包括至少一种CMV多肽、或优选地主要由至少一种CMV多肽组成、或优选地由至少一种CMV多肽组成的病毒样颗粒。优选地，CMV的病毒样颗粒包括所述CMV多肽作为衣壳结构主要蛋白质组分，还更优选地作为衣壳结构唯一蛋白质组分。一般和优选地，CMV的病毒样颗粒类似于CMV衣壳结构。CMV的病毒样颗粒无复制性和/或无感染性，并且至少缺少编码CMV的复制机构的一个或多个基因，并且一般还缺少编码造成病毒附着或进入宿主的一种或多种蛋白质的一个或多个基因。此定义还包括其中上述一个或多个基因仍存在但失活的病毒样颗粒。优选的致使CMV病毒样颗粒无复制性和/或无感染性的方法是物理或化学灭活，如UV照射、甲醛处理。优选地，CMV VLP缺少编码CMV的复制机构的一个或多个基因，并且还缺少编码造成病毒附着或进入宿主的一种或多种蛋白质的一个或多个基因。还更优选地，无复制性和/或无感染性病毒样颗粒通过重组基因技术获得。根据本发明重组产生的CMV病毒样颗粒一般和优选地不包括病毒基因组。包含多于一种多肽的病毒样颗粒，常被称为花叶病VLP，也被包括在本发明内。因此，在一个实施方式中，根据本发明的病毒样颗粒包括至少两个不同种类的多肽，其中所述多肽种类中的至少一种是CMV多肽。优选地，CMV的VLP是由CMV外壳蛋白构成的大分子组装体，每个VLP一般包括180个外壳蛋白亚单位。一般和优选地，本文使用的CMV的VLP包括至少一种CMV多肽、主要由至少一种CMV多肽组成、或可选地由至少一种CMV多肽组成，该CMV多肽包括下列、或优选由下列组成:(i)CMV外壳蛋白的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待要突变的氨基酸序列显示至少90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性。
多肽：本文使用的术语“多肽”指代由通过肽键(也被称为酰胺键)线性连接的氨基酸单体构成的聚合物。术语多肽指代连续氨基酸链，并且指代具体长度的产物。因此，肽和蛋白质均被包括在多肽的定义内。
黄瓜花叶病毒(CMV)多肽：本文使用的术语“黄瓜花叶病毒(CMV)多肽”指代包括下列、或优选由下列组成的多肽：(i)黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白的氨基酸序列、或(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待要突变的氨基酸序列——即所述CMV外壳蛋白——显示至少90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性。一般和优选地，CMV多肽能够通过自组装在表达后形成CMV病毒样颗粒。
黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)：本文使用的术语“黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)”指代自然界中存在的黄瓜花叶病毒外壳蛋白。由于黄瓜花叶病毒的宿主范围极其宽泛，已知CMV的多种不同株系和分离物，并且所述株系和分离物的外壳蛋白序列已被确定并且因此也已被本领域技术人员已知。所述CMV外壳蛋白(CP)的序列被描述于并且可获自已知的数据库如Genbank，www.dpvweb.net、或www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/。所述CMV CP的实例为CAD92034.1、CDO33961.2、AHZ89404.1、CDO33963.1、ACN60036.1、CAC18660.1、CAC18661.1、CAC18658.1、CAC18657.1、CAC18659.1、AFS64321.1、AFS64320.1、ABG76792.1、CAI68015.1、AAQ22992.1、AEM36051.1、AEM36048.1、ADA77134.1、AIS22690.1、AGT15706.1、AFR44555.1、AHY22574.1、ACM89097.1、AAB07137.1、AAD17927.1、AAM81371.1、AAM81365.1、AAM81374.1、AAM81372.1、AAM81368.1、ABC18318.1、AAX70966.1、AAU14864.1、AHJ11230.1、AHJ11229.1、AHJ11228.1、O40980.1、CAB43510.1、Q66143.1、CAA77065.1、CAB77390.1、CAC18666.1、NP_040777.1、P16489.1、AGV39216.1、AGW51600.1、AGN56074.1、AGN56050.1、AGG16159.1、AGG16145.1、AGG16143.1、AFZ99011.1、1407131A、CAA71834.1、CAA07411.1、CAC18665.1、Q66135.1、1F15_A、O40983.1、Q00259.1、AER25350.1、AER25348.1、ADN84922.1、ABU95611.1、BAF93916.1、BAF93914.1、AAY46239.1、AAY46233.1、AAY46235.1、AAY46231.1、AAY46230.1、AAY46237.1、BAF45130.1、ABM46611.1、ABC00925.1、AAY42625.1、CAH25533.1、CAH25541.1、CAH25539.1、AAV63980.1、AAQ89596.1、AAQ89571.1、AAQ89570.1、AAQ83697.1、AAQ83689.1、AAK52423.1、CCN27449.1、CEF39516.1、CAE51926.1、CAC13146.1、BAM15840.1、AEK33396.1、ABY21417.1、ABM89156.1、CAI84629.1、AGA20617.1、AAO17725.1、CAD42338.1、ABO18585.1、CDF77337.1、CAG25710.1、CAG25430.1、CAE30336.1、BAF45378.1、AAD17925.1、AGV39211.1、BAA07858.1、Q66141.1、O40981.1、ACB87210.1、CAI77626.1、CAH25521.1、ABG89138.1、AGT15712.1、AGT15703.1、AII01134.1、AIC76579.1、AIC76576.1、AIC76574.1、AIC76573.1、AIB09173.1、AIB09172.1、ADF81043.1、ACQ99349.1、ACQ99348.1、CBF03403.1、CBF03405.1、CAX45872.1、CAX45871.1、ACH48048.1、AAG01451.1、AAA46409.1、AAD45249.1、AAG25053.1、AAA46410.1、AAA46411.1、AAA46412.1、ABB89052.1、AAY19285.1、AAW21981.1、AAW21983.1、AAA74483.1、AHL30195.1、BAA95601.1、Q00261.1、CAB89799.1、AGZ63887.1、BAN67666.1、AFZ62498.1、AFZ62495.1、AFZ62494.1、AGN56098.1、AGN56028.1、AGG16155.1、AGG16151.1、ACS83814.1、ACS83810.1、ACS83800.1、ACS83791.1、CCM80413.1、CCM80411.1、CCM80409.1、AFX68432.1、AFX68428.1、CAI39235.1、CAJ20021.1、CAE51924.1、AAS57946.1、Q66154.1、Q00260.1、CAA61802.1、P21368.1、BAB11693.1、AFV99523.1、AFV99515.1、AER25351.1、AFM56037.1、AFJ92022.1、AFH88687.1、AFC40207.1、BAL63166.1、AFA53169.1、AFA53167.1、BAL61194.1、AEU12505.1、AER35119.1、AEK86513.1、AEK69525.1、AEK69524.1、AEK33395.1、AEK33393.1、AEG79911.1、ADZ54767.1、ADZ54111.1、ADX86746.1、ADN84923.1、ACR14828.1、ACR14827.1、ABU62578.1、ACA13281.1、ABZ80826.1、ABY47903.1、ABY21424.1、ABY21420.1、ABY21419.1、ABY21418.1、ABY21413.1、ABX38992.1、ABV55389.1、ABV49618.1、ABO18588.1、ABO18589.1、ABN72590.1、ABN72591.1、ABN12319.1、ABN12316.1、BAF44939.1、ABM46612.1、CAJ15158.1、ABC00922.1、ABC00921.1、ABC00928.1、ABC00923.1、ABI94145.1、ABI94151.1、ABI94129.1、ABI94150.1、BAF33384.1、ABI93181.1、ABE68905.1、ABC00927.1、AAS48545.1、AAR89470.1、AAR23529.1、AAQ82698.1、AAM95241.1、AAM97677.1、AAK52977.1、AAW71967.1、ABJ55780.1、CAH17693.1、CAH17700.1、CAH17692.1、Q66140.1、ABM63376.1、AGT15704.1、CAB41491.1、AAR89478.1、CCJ09634.1、AEK69527.1、ACS83801.1、AIC76582.1、AHJ58884.1、AHJ11231.1、AGJ94707.1、ACS83798.1、ACS83793.1、ABK81652.1、AAS57945.1、AAN04483.1、ADO66659.1、AAN17777.1、ADG26754.1、AFV99520.1、ABD73006.1、ACE07024.1、ABD64220.1、ABD72575.1、ABP87978.1、ABN13961.1、AAY85627.1、AGG16139.1、ACS83811.1、CAH17699.1、CAH17694.1、AFV69240.1、ACB56602.1、ADJ10637.1、ABM46614.1、AAY45749.1、AAA74484.1、CAH17697.1、ADA63484.1、ADA63482.1、ADA63480.1、Q83251.1、AIC76584.1、AIC76583.1、AAK27169.1、ABC00924.1、ACD62520.1、ABO18591.1、AAO62575.1、AAL48223.1、AIA99525.1、CAH17698.1、AAZ38725.1、AAF09246.2、CAH17701.1、ACB58305.1、AGG16158.1、CAH17695.1、AHJ58883.1、AEZ03836.1、BAB63959.1、ACD62519.1、BAF93912.1、AAZ78354.1、ACN38326.1、AFV99522.1、ADZ54109.1、CAA46151.1、AGV39213.1。CMV外壳蛋白的进一步实例提供在SEQ ID NOs 1-3中。
值得注意，这些株系和分离物在不同蛋白质结构域处具有高度相似的外壳蛋白序列，包括外壳蛋白的N端。具体地，全部完全测序的CMV分离物中98.1％在其外壳蛋白序列前28个氨基酸内共享大于85％的序列同一性，而且全部完全测序的CMV分离物中79.5％在其外壳蛋白序列前28个氨基酸内共享大于90％的序列同一性。
一般和优选地，用于本发明的CMV外壳蛋白能够通过自组装在表达后形成CMV病毒样颗粒。优选地，用于本发明的CMV外壳蛋白能够在大肠杆菌中通过自组装在表达后形成CMV病毒样颗粒。
SEQ ID NO.1相应于从拉脱维亚里加的私人花园收集的CMV感染型百合叶分离和克隆的CP的氨基酸序列。因此，优选地，本文使用的术语“黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白”指代CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ IDNO：1组成；或与SEQ ID NO：1具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在进一步非常优选的实施方式中，所述CMV外壳蛋白是如下CMV外壳蛋白的氨基酸序列：其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：21，即SEQ ID NO：1的连续氨基酸2-27；或如下CMV外壳蛋白的氨基酸序列：包括氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO：21具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性。这是特别优选的，因为Th细胞表位优选置换本发明的CMV多肽的N端区域。CMV CP的N端与实施例中优选使用的CMV CP的高序列同一性现确保除了所述N端区域的一般通过聚集——导致Th细胞表位——进行的置换外还可发生CP在表达后的适当组装。
在再进一步非常优选的实施方式中，所述CMV外壳蛋白是(a)如下CMV外壳蛋白的氨基酸序列：其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ ID NO：1组成：或(b)与SEQ ID NO：1具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列；并且其中(a)或(b)限定的所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：21，即SEQ ID NO：1的连续氨基酸2-27；或其中(a)或(b)限定的所述氨基酸序列包括如下氨基酸序列区域：其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO：21具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性。
黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰病毒样颗粒(VLP)：本文使用的术语“黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰病毒样颗粒(VLP)”指代这样的CMV VLP：其是修饰后的CMV VLP,如其包括至少一种修饰CMV多肽、或优选地主要由至少一种修饰CMV多肽组成、或优选由至少一种修饰CMV多肽组成，其中所述修饰CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：CMV多肽和T辅助细胞表位。一般和优选地，所述T辅助细胞表位(i)融合至所述CMV多肽的N端；(ii)融合至所述CMV多肽的C端；(iii)置换所述CMV多肽的连续氨基酸区域，其中所述CMV多肽的所述置换的连续氨基酸区域和T辅助细胞表位之间序列同一性为至少15％，优选至少20％；或(iv)置换所述CMV多肽的N端区域，并且其中所述CMV多肽的所述置换的N端区域由5至15个连续氨基酸组成。优选地，所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域，并且其中所述CMV多肽的所述置换的N端区域由5至15个连续氨基酸，优选9至14个连续氨基酸，更优选11至13个连续氨基酸，最优选11、12或13个连续氨基酸组成。优选地，本发明CMV的所述修饰VLP是CMV的重组修饰VLP。
修饰CMV多肽：本文使用的术语“修饰CMV多肽”指代本文限定的CMV多肽修饰，即所述修饰CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：CMV多肽和T辅助细胞表位。一般，修饰CMV多肽能够通过自组装在表达后形成CMV病毒样颗粒。优选地，修饰CMV多肽是重组修饰CMV多肽，并且能够在大肠杆菌中通过自组装在表达后形成CMV病毒样颗粒。
CMV多肽的N端区域：本文使用的术语“CMV多肽的N端区域”指代所述CMV多肽的N端，具体地CMV外壳蛋白的N端、或所述CMV多肽或所述CMV外壳蛋白的N端但从所述CMV多肽或所述CMV外壳蛋白N端第二个氨基酸起始的区域(如果所述CMV多肽或所述外壳蛋白包括N端甲硫氨酸残基)。优选地，如果所述CMV多肽或所述外壳蛋白包括N端甲硫氨酸残基，从实际角度来看，编码甲硫氨酸的起始密码子通常将被删除和添加至Th细胞表位的N端。进一步优选地，以克隆为目的，1、2或3个额外氨基酸，优选1个氨基酸，可被任选地插入起始甲硫氨酸和Th细胞表位之间。本文使用的术语“CMV多肽或CMV外壳蛋白的突变氨基酸序列的N端区域”指代所述CMV多肽或所述CMV外壳蛋白的所述突变氨基酸序列的N端、或所述CMV多肽或所述CMV外壳蛋白的所述突变氨基酸序列的N端但从所述CMV多肽或所述CMV外壳蛋白的所述突变氨基酸序列的N端第二个氨基酸起始的区域(如果所述突变的氨基酸序列包括N端甲硫氨酸残基)。优选地，如果所述CMV多肽或所述外壳蛋白包括N端甲硫氨酸残基，从实际角度来看，编码甲硫氨酸的起始密码子通常将被删除和添加至Th细胞表位的N端。进一步优选地，以克隆为目的，1、2或3个额外氨基酸，优选地1个氨基酸，可被任选地插入起始甲硫氨酸和Th细胞表位之间。
重组多肽：在本发明的环境中，术语"重组多肽"指代通过包括至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的多肽。一般和优选地，在原核生物表达系统中生成重组多肽。对于技术人员显而易见的是，在原核生物表达系统如大肠杆菌中表达的重组生成的多肽可包括N端甲硫氨酸残基。N端甲硫氨酸残基一般在重组多肽成熟期间从表达宿主中的重组多肽被切除。然而，N端甲硫氨酸的切除可能是不完全的。因此，重组多肽制剂可包括除具有和不具有N端甲硫氨酸残基之外皆相同的多肽的混合物。一般和优选地，重组多肽制剂包括小于10％，更优选小于5％，还更优选小于1％的具有N端甲硫氨酸残基的重组多肽。
重组CMV多肽：术语“重组CMV多肽”指代通过包括至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的如上限定的CMV多肽。一般和优选地，重组CMV多肽制剂包括小于10％，更优选小于5％，还更优选小于1％的具有N端甲硫氨酸残基的重组CMV多肽。因此，本发明的重组病毒样颗粒可包括除具有和不具有N端甲硫氨酸残基之外皆相同的重组多肽。
重组修饰CMV多肽：术语“重组修饰CMV多肽”指代通过包括至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的如上限定的修饰CMV多肽。一般和优选地，重组修饰CMV多肽制剂包括小于10％，更优选小于5％，还更优选小于1％的具有N端甲硫氨酸残基的重组修饰CMV多肽。因此，本发明的重组病毒样颗粒可包括除具有和不具有N端甲硫氨酸残基之外皆相同的重组多肽。
重组病毒样颗粒：在本发明的环境中，术语"重组病毒样颗粒"指代通过包括至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的病毒样颗粒(VLP)。一般和优选地，重组病毒样颗粒包括至少一种重组多肽，优选地重组CMV多肽或重组修饰CMV多肽。最优选地，重组病毒样颗粒由重组CMV多肽或重组修饰CMV多肽构成，或由重组CMV多肽或重组修饰CMV多肽组成。因此，如果在本发明的环境中本发明重组VLP的定义参考包括N端甲硫氨酸残基的具体氨基酸序列做出，本发明这些重组VLP的范围包括由不具有所述N端甲硫氨酸残基的所述具体氨基酸序列形成的VLP，而且也包括(即使如本文所述一般数量较少)由具有所述N端甲硫氨酸的所述特异性氨基酸序列形成的VLP。此外，本发明的范围包括：如果本发明重组VLP的定义参考包括N端甲硫氨酸残基的具体氨基酸序列做出，包括的VLP包括仍包括所述N端甲硫氨酸残基的氨基酸序列、和缺少N端甲硫氨酸残基的氨基酸序列两者。
突变的氨基酸序列：术语"突变的氨基酸序列"指代通过在待要突变的氨基酸序列中引入限定组突变获得的氨基酸序列。在本发明的环境中，所述待要突变的氨基酸序列一般和优选是CMV外壳蛋白的氨基酸序列。因此，突变的氨基酸序列与CMV外壳蛋白的氨基酸序列的区别在于至少一个氨基酸残基，其中所述突变的氨基酸序列和所述待要突变的氨基酸序列显示至少90％的序列同一性。一般和优选地，所述突变的氨基酸序列和所述待要突变的氨基酸序列显示至少91％、92％、93％94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。优选地，所述突变的氨基酸序列和所述待要突变的序列的区别在于至多11、10、9、8、7、6、4、3、2、或1个氨基酸残基，其中进一步优选地所述区别选自插入、删除和氨基酸替换。优选地，突变的氨基酸序列与CMV外壳蛋白的氨基酸序列区别在于至少一个氨基酸，其中优选地所述区别是氨基酸替换。
相应于残基...的位置：氨基酸序列上相应于另一氨基酸序列的给定残基的位置可通过序列比对来鉴定，一般和优选地通过运用BLASTP算法，最优选利用标准设置。一般和优选的标准设置为：预期阈值：10；字长：3；查询范围内的最大匹配：0；矩阵：BLOSUM62；间隔代价(gap costs)：存在11，延伸1；组成调整：条件组成得分矩阵调整。
序列同一性：两个给定氨基酸序列的序列同一性基于两序列的比对来确定。确定序列同一性的算法是技术人员可获得的。优选地，两氨基酸序列的序列同一性利用公众可获得的计算机同源性程序如“BLAST”程序(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)或“CLUSTALW”(http：//www.genome.jp/tools/clustalw/)来确定，在此优选通过http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi的NCBI首页上提供的“BLAST”程序、采用其中提供的默认设置来确定。一般和优选的标准设置为：预期阈值：10；字长：3；查询范围内的最大匹配：0；矩阵：BLOSUM62；间隔代价：存在11，延伸1；组成调整：条件组成得分矩阵调整。
氨基酸替换：术语氨基酸替换指代氨基酸序列中给定氨基酸残基被具有不同化学结构的任意其它氨基酸残基(优选地，被其它蛋白原氨基酸残基)替换。因此，与氨基酸插入或删除相比，氨基酸替换不改变所述氨基酸序列的氨基酸总数。在本发明的环境中非常优选所述待要突变的氨基酸序列的氨基酸残基被赖氨酸残基或被半胱氨酸残基替换。
表位：术语表位指代抗原(优选地，多肽)的连续或间断部分，其中所述部分可被抗体或在MHC分子环境中被T细胞受体特异性地结合。关于抗体，特异性结合不包括非特异性结合，但不一定不包括交叉反应性。表位一般包括在对于抗原位点独特的空间构象中的5-20个氨基酸。
T辅助(Th)细胞表位：本文使用的术语“T辅助(Th)细胞表位”指代能够被辅助Th细胞识别的表位。
通用Th细胞表位：本文使用的术语“通用Th细胞表位”指代能够结合至少一种(优选多于一种)MHC II型分子的Th细胞表位。确定肽序列是否是通用Th细胞表位的最简单方式是测量肽结合个体MHC II型分子的能力。这可通过肽和已知Th细胞表位肽与MHC II型分子结合竞争的能力来测量。HLA-DR分子的代表性选择被描述于例如Alexander J等，Immunity(1994)1：751-761。Th细胞表位对MHC II型分子的亲和力应为至少10-5M。确定Th细胞表位的“通用性”的可选的、更繁琐但也更相关的方式是证明较大部分人(>30％)在免疫和用在IFA中配制的包含Th细胞表位的蛋白质在一个月后强化(boosting)后生成可测的T细胞应答。存在于不同个体中的MHC II型分子的代表性采集在Panina-Bordignon P等，EurJ Immunol(1989)19：2237-2242中被给出。因此，本文使用的术语“通用Th细胞表位”优选指代在多于30％的选定个体群中，在免疫和强化(在一个月后，利用在IFA中配制的包含Th细胞表位的蛋白质)后生成可测T细胞应答的Th细胞表位，如Panina-Bordignon P等，Eur JImmunol(1989)19：2237-2242所述。此外，并且再进一步优选，本文使用的术语“通用Th细胞表位”优选指代能够以至少500nM的亲和力结合至少一种，优选至少两种，还更优选至少三种DR等位基因的Th细胞表位，该DR等位基因选自DR1、DR2w2b、DR3、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DR52a、DRw53、DR2w2a；并且优选选自DR1、DR2w2b、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DRw53、DR2w2a(如Alexander J等，Immunity(1994)1：751-761和本文引用的参考文献所述)；评价所述亲和力的优选结合试验是Sette A等，J Immunol(1989)142：35-40描述的试验。以还更优选的方式，本文使用的术语“通用Th细胞表位”指代能够以至少500nM的亲和力结合选自DR1、DR2w2b、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DRw53、DR2w2a的至少一种，优选至少两种，还更优选至少三种DR等位基因的Th细胞表位(如Alexander J等，Immunity(1994)1：751-761和本文引用的参考文献所述)；评价所述亲和力的的优选结合试验是Sette A等，J Immunol(1989)142：35-40描述的试验。
通用Th细胞表位已被描述并且为本领域技术人员已知，如Alexander J等，Immunity(1994)1：751-761；Panina-Bordignon P等，Eur J Immunol(1989)19：2237-2242；Calvo-Calle JM等，J Immunol(1997)159：1362-1373；和Valmori D等，J Immunol(1992)149：717-721。
在本发明的优选实施方式中，Th细胞表位选自HA 307-319(SEQ ID NO：26)、HBVnc50-69(SEQ ID NO：27)、TT 830-843(SEQ ID NO：4)、CS 378-398(SEQ ID NO：28)、MT 17-31(SEQ ID NO：29)、TT 947-967(SEQ ID NO：30)和PADRE(SEQ ID NO：5)。在本发明的另一优选实施方式中，通用Th细胞表位选自HA 307-319(SEQ ID NO：26)、HBVnc 50-69(SEQ IDNO：27)、TT 830-843(SEQ ID NO：4)、CS 378-398(SEQ ID NO：28)、MT 17-31(SEQ ID NO：29)、TT 947-967(SEQ ID NO：30)和PADRE(SEQ ID NO：5)。在本发明的非常优选的实施方式中，Th细胞表位是TT 830-843(SEQ ID NO：4)或PADRE(SEQ ID NO：5)。在本发明的另一非常优选的实施方式中，通用Th细胞表位是TT 830-843(SEQ ID NO：4)或PADRE(SEQ ID NO：5)。因此，在非常优选的实施方式中，所述Th细胞表位是TT 830-843(SEQ ID NO：4)。在本发明的另一非常优选的实施方式中，所述Th细胞表位是PADRE(SEQ ID NO：5)。在另一非常优选的实施方式中，所述通用Th细胞表位是TT830-843(SEQ ID NO：4)。在本发明的另一非常优选的实施方式中，所述通用Th细胞表位是PADRE(SEQ ID NO：5)。SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的表位是已知的，并且甚至其应用已被描述(Alexander J等，Immunity(1994)1：751-761；Panina-Bordignon P等，Eur J Immunol(1989)19：2237-2242；Valmori D等，J Immunol(1992)149：717-721；Lanzavecchia A等，Eur J Immunol(1983)13：733-738；Jemon K等，PLoS ONE(2013)8(6)：e66866；Jagu S等，PLoS ONE(2012)8(1)：e55538。
偶联效率：带有特异性抗原的病毒样颗粒的偶联效率通过偶联反应的SDS-PAGE来确定。相应于偶联反应组分的考马斯蓝染色带的强度通过密度测定法确定，并且用于计算偶联效率。偶联效率被定义为偶联至所述抗原的VLP多肽与VLP多肽总量的比。
佐剂：本文使用的术语"佐剂"指代免疫应答的非特异性刺激剂或允许在宿主中生成储存物(depot)、与本发明的疫苗和药物组合物分别组合时可提供还更增强的免疫应答的物质。优选的佐剂是完全和不完全弗氏佐剂、含铝佐剂(优选地，氢氧化铝)、和修饰胞壁酰二肽。进一步优选的佐剂是矿物凝胶，如氢氧化铝、表面活性物质，如溶离卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、钉形贝血蓝蛋白、二硝基苯酚、和人佐剂，如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。这种佐剂在本领域也是公知的。可与本发明的组合物一起给予的进一步佐剂包括，但不限于，单磷酰基脂质免疫调节剂、AdjuVax100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐(Alum)、MF-59、OM-174、OM-197、OM-294、和病毒体佐剂技术。佐剂还可包括这些物质的混合物。病毒样颗粒已被一般描述为佐剂。然而，本申请的环境中使用的术语"佐剂"所指代的佐剂不是本发明的病毒样颗粒。相反，"佐剂"涉及本发明的组合物、疫苗或药物组合物的额外的明确的组分。
抗原：本文使用的术语"抗原"指代能够被抗体或T-细胞受体(TCR)(若被MHC分子呈递)结合的分子。本文使用的术语"抗原"还指代T-细胞表位。抗原另外还能够被免疫系统识别和/或能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B-和/或T-淋巴细胞活化。然而，这可需要，至少在某些情况下，抗原包含或连接至Th细胞表位并且在佐剂中被提供。抗原可具有一个或多个表位(B-和T-表位)。上述特异性反应意指抗原优选与其相应的抗体或TCR反应(一般以高度选择性方式)，而不与众多可被其它抗原引起的其它抗体或TCR反应。本文使用的抗原也可以是数种个体抗原的混合物。形成本发明病毒样颗粒的本发明多肽可包括抗原。具体地，本发明的多肽可以是包括抗原的融合产物。然而，术语抗原不包括所述多肽包括的所述突变氨基酸序列。一般和优选地，本文使用的术语"抗原"不包括根据本发明的病毒样颗粒。而一般和优选地，术语"抗原"指代本发明的组合物、疫苗和药物组合物的具有抗原性的额外组分，其中抗原可通过本文描述的任何手段与病毒样颗粒缔合、结合、混合或连接。
缔合：本文使用的术语"缔合(associate)"或"缔合(association)"指代将两分子连接在一起的所有可能的方式，优选化学相互作用。化学相互作用包括共价和非共价相互作用。非共价相互作用的一般实例是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共价相互作用例如基于共价键如酯、醚、磷酸酯、碳-磷键、碳-硫键如硫醚、或酰亚胺键。
第一附着位点：本文使用的短语"第一附着位点(first attachment site)"指代与病毒样颗粒天然存在或人工添加至病毒样颗粒并且可连接第二附着位点的元件。第一附着位点优选是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯基甲基磺酰氟)、或化学反应基团如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酸基(histidinyl)、或其组合。作为第一附着位点的化学反应基团的优选实施方式是氨基酸残基(优选地，赖氨酸残基)的氨基。第一附着位点一般位于表面上，优选地在VLP外表面上。多个第一附着位点存在于表面上，优选地在VLP的外表面上，一般处于重复构型。在优选的实施方式中，第一附着位点通过至少一个共价键与VLP缔合，优选通过至少一个肽键。在进一步优选的实施方式中，第一附着位点与VLP天然存在。可选地，在优选的实施方式中，第一附着位点被人工添加至VLP。在非常优选的实施方式中，所述第一附着位点是所述VLP多肽的氨基酸序列的赖氨酸残基的氨基。
第二附着位点：本文使用的短语"第二附着位点(second attachment site)"指代与抗原天然存在或人工添加至抗原并且可连接第一附着位点的元件。抗原的第二附着位点优选是蛋白质、多肽、肽、氨基酸、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯基甲基磺酰氟)、或化学反应基团如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酸基、或其组合。作为第二附着位点的化学反应基团的优选实施方式是巯基，优选氨基酸半胱氨酸的巯基，最优选半胱氨酸残基的巯基。术语"具有至少一个第二附着位点的抗原"因此指代包括抗原和至少一个第二附着位点的构建物。然而，具体地关于非天然存在于抗原中的第二附着位点，这种构建物一般和优选地进一步包括"接头"。在另一优选的实施方式中，第二附着位点通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键，与抗原缔合。在进一步实施方式中，第二附着位点天然存在于抗原中。在另一进一步优选的实施方式中，第二附着位点通过接头被人工添加至抗原，其中所述接头包括半胱氨酸或可选地由半胱氨酸组成。优选地，接头通过肽键融合至抗原。
连接：本文使用的术语"连接(linked)"或"连接(linkage)"指代将至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点连接在一起的所有可能的方式，优选化学相互作用。化学相互作用包括共价和非共价相互作用。非共价相互作用的一般实例是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共价相互作用例如基于共价键如酯、醚、磷酸酯、碳-磷键、碳-硫键如硫醚、或酰亚胺键。在某些优选实施方式中，第一附着位点和第二附着位点通过至少一个共价键连接，优选通过至少一个非肽键，还更优选仅通过非肽键(一个或多个)。然而，本文使用的术语"连接"将不仅仅指代至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点的直接连接，而且可选地和优选地指代至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点通过中间分子(一个或多个)间接连接，在此一般和优选通过利用至少一个(优选地，一个)异双官能交联剂。在其它优选的实施方式中，第一附着位点和第二附着位点通过至少一个共价键连接，优选通过至少一个肽键，还更优选地仅通过肽键(一个或多个)。
接头：本文使用的"接头"将第二附着位点与抗原缔合，或已包含第二附着位点，主要由第二附着位点组成、或由第二附着位点组成。优选地，本文使用的"接头"已包含第二附着位点，一般和优选地——但不一定——是一个氨基酸残基，优选地是半胱氨酸残基。优选的接头是氨基酸接头，即包含至少一个氨基酸残基的接头。术语氨基酸接头不意味着这种接头仅由氨基酸残基组成。然而，由氨基酸残基组成的接头是本发明的优选实施方式。接头的氨基酸残基优选由天然存在的氨基酸或本领域已知的非天然氨基酸(全L或全D或其混合物)构成。根据本发明的接头的进一步优选的实施方式是包括巯基或半胱氨酸残基的分子，因此这种分子也被包括在本发明内。可用于本发明的进一步接头是包括C1-C6烷基、环烷基如环戊基或环己基、环烯基、芳基或杂芳基部分的分子。此外，接头——优选包括C1-C6烷基、环烷基(C5、C6)、芳基或杂芳基部分和另外的氨基酸(一个或多个)——也可用作本发明的接头，并且将被包括在本发明范围内。接头与抗原的缔合优选通过至少一个共价键进行，更优选通过至少一个肽键。
有序且重复的抗原阵列：本文使用的术语"有序且重复的抗原阵列"指代抗原的重复格局(pattern)，其特征一般和优选在于相对于VLP的抗原空间排列的高度均匀性。在本发明的一个实施方式中，重复格局可以是几何格局。本发明的某些实施方式，如偶联至本发明VLP的抗原，是适当的有序且重复抗原阵列的一般和优选实例，其此外还具有抗原的严格重复的类结晶顺序，优选具有1至30纳米，优选2至15纳米，还更优选2至10纳米，甚至还更优选2至8纳米，进一步更优选1.6至7纳米的间距。
Fel d1蛋白：本文使用的术语“Fel d1蛋白”指代包括Fel d1的链1和Fel d1的链2或可选地由Fel d1的链1和Fel d1的链2组成的蛋白质。优选地，Fel d1的链1和Fel d1的链2共价连接。在一个优选实施方式中，Fel d1的链1和Fel d1的链2通过至少一个二硫键连接。在另一优选实施方式中，链1和链2直接或经由间隔体融合，在这种情况下，所述Fel d1蛋白进一步包括间隔体或可选地由间隔体组成。优选地，本文限定的Fel d1蛋白由总共至多300个，还更优选至多200个氨基酸组成。一般和优选地，根据本发明的Fel d1蛋白能够诱导体内生成特异性结合天然存在的Fel d1或重组Fel d1的抗体，如根据本发明的实施例8所生成。
Fel d1的链1：本文使用的术语“Fel d1的链1”指代包括SEQ ID NO：37或其同源序列的氨基酸序列或可选地由SEQ ID NO：37或其同源序列的氨基酸序列组成的多肽。本文使用的术语“SEQ ID NO：37的同源序列”指代与SEQ ID NO：37具有大于80％，更优选大于90％，还更优选大于95％的同一性的多肽。本文使用的术语“Fel d1的链1”还将指代包括至少一个翻译后修饰的多肽，该至少一个翻译后修饰包括但不限于本文限定的Fel d1的链1的至少一处糖基化。优选地，本文限定的Fel d1的链1由总共至多130个，还更优选至多100个氨基酸组成。
Fel d1的链2：本文使用的术语“Fel d1的链2”指代包括下列或可选地由下列组成的多肽：SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40、或其同源序列的氨基酸序列。本文使用的术语“SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40的同源序列”指代与SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40具有大于80％，更优选大于90％，还更优选大于95％的同一性的多肽。本文使用的术语“Fel d1的链2”将还指代包括至少一个翻译后修饰的多肽，该至少一个翻译后修饰包括但不限于本文限定的Fel d1的链2的至少一处糖基化。优选地，本文限定的Fel d1的链2由总共至多150个，还更优选至多130个，还更优选至多100个氨基酸组成。
免疫刺激物：本文使用的，术语"免疫刺激物"指代能够诱导和/或增强免疫应答的物质。本文使用的免疫刺激物包括但不限于，toll样受体活化物和诱导细胞因子分泌的物质。Toll样受体活化物包括但不限于，免疫刺激核酸、肽聚糖、脂多糖、脂磷壁酸、咪唑并喹啉化合物、鞭毛蛋白、脂蛋白、和免疫刺激有机物质如紫杉醇。
免疫刺激核酸：本文使用的术语免疫刺激核酸指代能够诱导和/或增强免疫应答的核酸。免疫刺激核酸包括核糖核酸和具体地脱氧核糖核酸，其中核糖核酸和脱氧核糖核酸均可以是双链或单链的。优选的ISS-NA是脱氧核糖核酸，其中进一步优选所述脱氧核糖核酸是单链的。优选地，免疫刺激核酸包含至少一个包括未甲基化的C的CpG基序。非常优选的免疫刺激核酸包括至少一个CpG基序，其中所述至少一个CpG基序包括下列或优选由下列组成：至少一个(优选一个)CG二核苷酸，其中C是未甲基化的。优选，但不一定，所述CG二核苷酸是部分回文序列。术语免疫刺激核酸还指代包含修饰碱基，优选4-溴-胞嘧啶的核酸。在本发明的环境中特别优选能够刺激树枝状细胞中IFN-α产生的ISS-NA。可用于本发明目的的免疫刺激核酸被描述于例如WO2007/068747A1。
寡核苷酸：本文使用的术语"寡核苷酸"指代包括2个或更多个核苷酸，优选约6至约200个核苷酸，更优选20至约100个核苷酸，最优选20至40个核苷酸的核酸序列。非常优选地，寡核苷酸包括约30个核苷酸，更优选包括精确30个核苷酸的寡核苷酸，最优选由精确30个核苷酸组成的寡核苷酸。寡核苷酸是多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，并且优选选自(a)未修饰RNA或DNA，和(b)修饰RNA或DNA。修饰可包括骨架或核苷酸类似物。寡核苷酸优选选自(a)单链和双链DNA，(b)单链和双链区域混合DNA，(c)单链和双链RNA，(d)单链和双链区域混合RNA，和(e)包括单链或更优选地双链或单链和双链区域混合的DNA和RNA的混杂分子。优选的核苷酸修饰/类似物选自(a)肽核酸，(b)肌酐，(c)三苯甲基化碱基，(d)硫代磷酸酯，(e)烷基硫代磷酸酯，(f)5-硝基吲哚脱氧核糖fliranosyl，(g)5-甲基脱氧胞嘧啶，和(h)5,6-二氢-5,6-二羟基脱氧胸苷。硫代磷酸化核苷酸被保护免于在细胞或生物体中降解，因此是优选的核苷酸修饰。仅由磷酸二酯结合的核苷酸组成的未修饰寡核苷酸一般比修饰核苷酸更具活性，因此在本发明的环境中总体上优选。最优选仅由磷酸二酯结合的脱氧核苷酸组成的寡核苷酸，其中进一步优选所述寡核苷酸是单链的。进一步优选能够刺激细胞，优选树枝状细胞中IFN-α产生的寡核苷酸。能够刺激细胞中IFN-α产生的非常优选的寡核苷酸选自A型CpGs和C型CpGs。进一步优选无Cap的RNA分子。
CpG基序：本文使用的术语“CpG基序”指代如下核苷酸格局：包括未甲基化的中心CpG，即未甲基化的CpG二核苷酸，其中C是未甲基化的，其被至少一个碱基，优选一个或两个核苷酸包围，侧接中心CpG(的3'和5'侧)。一般和优选地，本文使用的CpG基序包括未甲基化的CpG二核苷酸和其5'和3'端的两个核苷酸，或可选地由未甲基化的CpG二核苷酸和其5'和3'端的两个核苷酸组成。不受理论约束，侧接CpG的碱基向CpG寡核苷酸赋予大部分活性。
未甲基化的含CpG寡核苷酸：本文使用的术语"未甲基化的含CpG寡核苷酸"或"CpG"指代包含至少一个CpG基序的寡核苷酸，优选寡脱氧核苷酸。因此，CpG包含至少一个未甲基化的胞嘧啶，鸟嘌呤二核苷酸。优选的CpG刺激/活化脊椎动物骨髓源细胞，例如对脊椎动物骨髓源细胞具有促有丝分裂效果，或通过脊椎动物骨髓源细胞诱导或增加细胞因子表达。例如，CpG可用于活化B细胞、NK细胞和抗原呈递细胞，如树枝状细胞、单核细胞和巨噬细胞。优选地，CpG涉及包含3'后接鸟苷的未甲基化的胞嘧啶的寡脱氧核苷酸，优选单链寡脱氧核苷酸，其中所述未甲基化的胞嘧啶和所述鸟苷通过磷酸酯键连接，其中优选所述磷酸酯键是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键，并且其中进一步优选所述磷酸酯键是磷酸二酯键。CpG可包括核苷酸类似物，如包含硫代磷酸酯键的类似物，并且可以是双链或单链的。总体上，双链分子在体内更稳定，而单链分子具有增加的免疫活性。优选地，本文使用的CpG是长度为至少约10个核苷酸并且包括至少一个CpG基序的寡核苷酸，其中进一步优选所述CpG的长度是10至60，更优选15至50，还更优选20至40，还更优选约30，最优选地精确30个核苷酸。CpG可由甲基化的和/或未甲基化的核苷酸组成，其中所述至少一个CpG基序包括至少一个CG二核苷酸，其中C是未甲基化的。CpG还可包括甲基化的和未甲基化的序列段，其中所述至少一个CpG基序包括至少一个CG二核苷酸，其中C是未甲基化的。非常优选地，CpG涉及包含3'后接鸟苷的未甲基化的胞嘧啶的单链寡脱氧核苷酸，其中所述未甲基化的胞嘧啶和所述鸟苷通过磷酸二酯键连接。CpG可包括核苷酸类似物，如包含硫代磷酸酯键的类似物，并且可以是双链或单链的。总体上，磷酸二酯CpG是下述A型CpG，而硫代磷酸酯稳定化的CpG是B型CpG。在本发明的环境中优选的CpG寡核苷酸是A型CpG。
A型CpG：本文使用的术语"A型CpG"或"D型CpG"指代包括至少一个CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)。A型CpG优先刺激T细胞的活化和树枝状细胞的成熟，并且能够刺激IFN-α产生。在A型CpG中，至少一个CpG基序的核苷酸通过至少一个磷酸二酯键连接。A型CpG包括至少一个磷酸二酯键CpG基序，该磷酸二酯键CpG基序可在其5'端和/或优选地并且在其3'端侧接硫代磷酸酯结合的核苷酸。优选地，CpG基序和在此优选地CG二核苷酸和其直接侧接的包括至少一个(优选地，两个)核苷酸的区域由磷酸二酯核苷酸构成。优选的A型CpG仅由磷酸二酯(PO)键核苷酸组成。一般和优选地，多G基序包括至少一个，优选至少三个，至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个G(鸟苷)，最优选至少10个G，或可选地由至少一个，优选至少三个，至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个G(鸟苷)，最优选至少10个G组成。优选地，本发明的A型CpG包括回文序列或可选地由回文序列组成。
病毒样颗粒(VLP)：本文使用的术语病毒样颗粒指代无复制性或无感染性、优选无复制性并且无感染性的病毒颗粒，或指代无复制性或无感染性、优选无复制性并且无感染性的类似于病毒颗粒的结构，优选病毒衣壳。本文使用的术语"非复制性"指代不能复制VLP包括的基因组。本文使用的术语"无感染性"指代不能进入宿主细胞。根据本发明的病毒样颗粒无复制性并且无感染性，因为其缺少全部或部分病毒基因组或基因组功能。根据本发明的病毒样颗粒可包含区别于其基因组的核酸。重组生成的病毒样颗粒一般包含宿主细胞源RNA。根据本发明的病毒样颗粒的一般和优选的实施方式是由本发明的多肽构成的病毒衣壳。病毒样颗粒是由病毒外壳蛋白构成的大分子组装体，每个病毒样颗粒一般包括60、120、180、240、300、360、或多于360个蛋白质亚单位。一般和优选地，这些亚单位的相互作用导致具有固有重复架构的病毒衣壳或病毒衣壳样结构形成。病毒样颗粒的一个特征是其高度有序和重复的亚单位排列。通常称为花叶病VLP的包括多于一种多肽的病毒样颗粒也被本发明包括在内。因此，在一个实施方式中，根据本发明的病毒样颗粒包括至少两个不同种类的多肽，其中所述多肽种类中的至少一种是包含VLP多肽的泛(pan)Th细胞表位。
装配：本文使用的术语“装配(packaged)”指代VLP相关的聚阴离子大分子或免疫刺激物的状态。本文使用的术语“装配”包括结合，该结合可以是共价的，例如，通过化学偶联；或非共价的，例如，通过离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。该术语还包括聚阴离子大分子的封装或部分封装。因此，聚阴离子大分子或免疫刺激物可在不存在实际结合，具体地共价结合的情况下被VLP封装。在优选的实施方式中，至少一个聚阴离子大分子或免疫刺激物被装配在VLP中，最优选以非共价方式。在所述免疫刺激物是核酸，优选DNA的情况下，术语装配意味着所述核酸对核酸酶水解不可及，优选对DNA酶水解不可及(例如DNaseI或Benzonase)，其中优选所述可及性按照WO2003/024481A2的实施例11-17所述分析。
本发明提供植物病毒黄瓜花叶病毒(CMV)的病毒样颗粒，和具体地包括Th细胞表位(具体地，通用Th细胞表位)的CMV的修饰VLP。
因此，第一方面，本发明提供黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰病毒样颗粒(VLP)，其中所述CMV的修饰VLP包括至少一种修饰CMV多肽、主要由至少一种修饰CMV多肽组成、或可选地由至少一种修饰CMV多肽组成，其中所述修饰CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV多肽、和(b)T辅助细胞表位；并且其中所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(i)CMV外壳蛋白的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述CMV外壳蛋白显示至少90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性。
在优选的实施方式中，所述CMV多肽包括CMV外壳蛋白的氨基酸序列，优选由CMV外壳蛋白的氨基酸序列组成。在可选的实施方式中，所述CMV多肽包括突变的氨基酸序列，优选由突变的氨基酸序列组成，其中待要突变的氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述CMV外壳蛋白显示至少90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性；其中优选所述突变的氨基酸序列和所述待要突变的氨基酸序列的区别在于至少一个并且至多11、10、9、8、7、6、5、4、3、或2个氨基酸残基，并且其中进一步优选这些区别选自(i)插入、(ii)删除、(iii)氨基酸替换、和(iv)(i)至(iii)的任意组合。突变可被引入待要突变的氨基酸序列以改善病毒样颗粒的某些特征，如稳定性和/或偶联效率。引入半胱氨酸残基可增强亚单位之间形成的半胱氨酸桥的稳定性，并且在VLP表面中引入赖氨酸可增强偶联效率。
在另一优选实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(i)(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ ID NO：1组成：或(b)与SEQ ID NO：1具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的所述氨基酸序列是本权利要求的(i)中所限定的所述氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待要突变的氨基酸序列显示至少95％，优选至少98％，更优选至少99％的序列同一性。
在非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ ID NO：1组成：或(b)与SEQ ID NO：1具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
在另一优选实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(i)(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：21；或(b)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，该氨基酸序列包括氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO：21具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的所述氨基酸序列是本权利要求的(i)中所限定的所述氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待要突变的氨基酸序列显示至少95％，优选至少98％，和更优选至少99％的序列同一性。
在另一非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：21；或(b)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，该氨基酸序列包括氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO：21具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性。
在再另一优选实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(i)(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ ID NO：1组成；或(b)与SEQ ID NO：1具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列；并且其中本权利要求的(a)或(b)中所限定的所述氨基序列包括SEQ IDNO：21；或其中本权利要求的(a)或(b)中所限定的所述氨基序列包括氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO：21具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的所述氨基酸序列是本权利要求的(i)中所限定的所述氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待要突变的氨基酸序列显示至少98％，优选至少99％的序列同一性。
在再另一非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ ID NO：1组成；或(b)与SEQ ID NO：1具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；并且其中本权利要求的(a)或(b)中所限定的所述氨基序列包括SEQ ID NO：21；或其中本权利要求的(a)或(b)中所限定的所述氨基序列包括氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO：21具有至少90％的序列同一性。
一般和优选地，所述T辅助细胞表位(i)融合至所述CMV多肽的N端；(ii)融合至所述CMV多肽的C端；(iii)置换所述CMV多肽的连续氨基酸区域，其中所述CMV多肽的所述置换的连续氨基酸区域和T辅助细胞表位之间的序列同一性为至少15％，优选至少20％；或(iv)置换所述CMV多肽的N端区域，并且其中所述CMV多肽的所述置换的N端区域由5至15个连续氨基酸组成。
在优选的实施方式中，所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域，其中优选地所述N端区域的氨基酸置换数量等于或低于组成所述T辅助细胞表位的氨基酸数量。换句话说，所述CMV多肽的所述N端区域由第一数量的氨基酸组成，并且Th细胞表位由第二数量的氨基酸组成，并且在优选的实施方式中，所述第一氨基酸数量等于或低于第二氨基酸数量。
在进一步优选的实施方式中，所述CMV多肽的所述置换的N端区域由5至15个连续氨基酸，优选9至14个连续氨基酸，更优选11至13个连续氨基酸组成。在非常优选的实施方式中，所述CMV多肽的所述N端区域相应于SEQ ID NO：1的氨基酸2-12。
因此，在非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(i)(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ IDNO：1组成；或(b)与SEQ ID NO：1具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的所述氨基酸序列是本权利要求的(i)中所限定的所述氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待要突变的氨基酸序列显示至少95％，优选至少98％，和更优选至少99％的序列同一性，并且其中所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域，其中优选所述N端区域的氨基酸置换数量等于或低于组成所述T辅助细胞表位的氨基酸数量。
因此，在非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(i)(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ IDNO：1组成；或(b)与SEQ ID NO：1具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的所述氨基酸序列是本权利要求的(i)中所限定的所述氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待要突变的氨基酸序列显示至少95％，优选至少98％，和更优选至少99％的序列同一性，其中所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域，并且其中所述CMV多肽的所述置换的N端区域由5至15个连续氨基酸，优选9至14个连续氨基酸，更优选11至13个连续氨基酸组成。
因此，在非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(i)(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ IDNO：1组成；或(b)与SEQ ID NO：1具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的所述氨基酸序列是本权利要求的(i)中所限定的所述氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待要突变的氨基酸序列显示至少95％，优选至少98％，和更优选至少99％的序列同一性，其中所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域，并且其中所述CMV多肽的所述N端区域相应于SEQ ID NO：1的氨基酸2-12。
因此，在非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ ID NO：1组成；或(b)与SEQ ID NO：1具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域，其中优选所述N端区域的氨基酸置换数量等于或低于组成所述T辅助细胞表位的氨基酸数量。
因此，在非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ ID NO：1组成；或(b)与SEQ ID NO：1具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域，并且其中所述CMV多肽的所述置换的N端区域由5至15个连续氨基酸，优选9至14个连续氨基酸，更优选11至13个连续氨基酸组成。
因此，在非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ ID NO：1组成；或(b)与SEQ ID NO：1具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域，并且其中所述CMV多肽的所述N端区域相应于SEQ ID NO：1的氨基酸2-12。
因此，在非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：21；或(b)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，该氨基酸序列包括氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO：21具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性，并且其中所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域，其中优选所述N端区域的氨基酸置换数量等于或低于组成所述T辅助细胞表位的氨基酸数量。
因此，在非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：21；或(b)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，该氨基酸序列包括氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO：21具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性，其中所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域，并且其中所述CMV多肽的所述置换的N端区域由5至15个连续氨基酸，优选9至14个连续氨基酸，更优选11至13个连续氨基酸组成。
因此，在非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：21；或(b)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，该氨基酸序列包括氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO：21具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性，其中所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域，并且其中所述CMV多肽的所述N端区域相应于SEQ IDNO：1的氨基酸2-12。
因此，在非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ ID NO：1组成；或(b)与SEQ ID NO：1具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；并且其中本权利要求的(a)或(b)中所限定的所述氨基序列包括SEQ ID NO：21；或其中本权利要求的(a)或(b)中所限定的所述氨基序列包括氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO：21具有至少90％的序列同一性，并且其中所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域，其中优选所述N端区域的氨基酸置换数量等于或低于组成所述T辅助细胞表位的氨基酸数量。
因此，在非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ ID NO：1组成；或(b)与SEQ ID NO：1具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；并且其中本权利要求的(a)或(b)中所限定的所述氨基序列包括SEQ ID NO：21；或其中本权利要求的(a)或(b)中所限定的所述氨基序列包括氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO：21具有至少90％的序列同一性，其中所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域，并且其中所述CMV多肽的所述置换的N端区域由5至15个连续氨基酸，优选9至14个连续氨基酸，更优选11至13个连续氨基酸组成。
因此，在非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ ID NO：1组成；或(b)与SEQ ID NO：1具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；并且其中本权利要求的(a)或(b)中所限定的所述氨基序列包括SEQ ID NO：21；或其中本权利要求的(a)或(b)中所限定的所述氨基序列包括氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO：21具有至少90％的序列同一性，其中所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域，并且其中所述CMV多肽的所述N端区域相应于SEQ ID NO：1的氨基酸2-12。
非常优选地，所述T辅助细胞表位是通用T辅助细胞表位，其中优选所述T辅助细胞表位由至多20个氨基酸组成。
在进一步优选的实施方式中，所述Th细胞表位是PADRE序列。在再进一步优选的实施方式中，所述Th细胞表位包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成。
在另一优选实施方式中，所述T辅助细胞表位源自人疫苗。优选所述Th细胞表位源自破伤风毒素。再优选地，所述Th细胞表位具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列，优选由SEQ IDNO：4的氨基酸序列组成。
在本发明的非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包括CMV外壳蛋白的氨基酸序列、或优选由CMV外壳蛋白的氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列、或优选由SEQ ID NO：1或与SEQ IDNO：1具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列组成；并且其中所述氨基序列包括SEQ IDNO：21，并且其中所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域，并且其中所述CMV多肽的所述置换的N端区域由11至13个连续氨基酸，优选11个连续氨基酸组成，并且其中进一步优选所述CMV多肽的所述N端区域相应于SEQ ID NO：1的氨基酸2-12。
在另一非常优选的实施方式中，所述修饰CMV多肽包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成。在进一步非常优选的实施方式中，所述修饰CMV多肽包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成。
本发明的VLP可在原核或真核表达系统中表达。优选的系统是大肠杆菌、酵母、昆虫细胞以及哺乳动物细胞系。非常优选的所述CMV的修饰VLP或所述CMV的VLP通过在大肠杆菌中表达所述修饰CMV多肽或所述CMV多肽而获得，并且其中优选所述表达在10℃至25℃之间的温度，优选地在20℃温度下发生。如上所述，重组生成的多肽可包括N端甲硫氨酸残基。在一个实施方式中，所述CMV多肽或修饰CMV多肽因此包括N端甲硫氨酸残基。然而，一般和优选地，所述N端甲硫氨酸残基从所述CMV多肽或所述修饰CMV多肽被切除。
因此，另一方面，本发明提供黄瓜花叶病毒(CMV)的病毒样颗粒(VLP)，其中所述CMV的VLP包括至少一种CMV多肽、主要由至少一种CMV多肽组成、或可选地由至少一种CMV多肽组成，该CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(i)CMV外壳蛋白的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述CMV外壳蛋白显示至少90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性；并且其中所述CMV的VLP通过在大肠杆菌中表达所述CMV多肽而获得，并且其中优选所述表达在10℃至25℃之间的温度，优选20℃温度下发生。
本发明包括组合物，其中所述本发明的VLP包括本文描述的技术特征中的任一个——单独或以任何可能的组合。
在进一步方面，本发明提供包括修饰病毒样颗粒的组合物。此外，这些修饰VLP优选充当疫苗平台，用于针对连接至所述修饰VLP的抗原生成免疫应答，具体地抗体应答。Th细胞表位(具体地，通用Th细胞表位)的存在导致生成的免疫应答进一步增加。
因此，在进一步优选的实施方式中，所述组合物包括(a)至少一种本发明的修饰病毒样颗粒，其中所述修饰病毒样颗粒包括至少一个第一附着位点；和(b)至少一种抗原，其中所述抗原包括至少一个第二附着位点；其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。通过所述第一附着位点和所述第二附着位点连接所述修饰病毒样颗粒和所述抗原的方法被描述于例如WO2002/056905A2和WO2004/084940A1。
在进一步优选的实施方式中，所述第一附着位点通过至少一个共价键连接至所述第二附着位点。在进一步优选的实施方式中，所述第一附着位点和所述第二附着位点通过至少一个共价肽键连接。在进一步优选的实施方式中，所述共价键是非肽键。因此，在再另一优选实施方式中，所述第一附着位点和所述第二附着位点通过至少一个共价非肽键连接。在进一步优选的实施方式中，所述第一附着位点是氨基，优选赖氨酸的氨基。
修饰病毒样颗粒和抗原之间通过二硫键的附着是不稳定的——具体地对于包含巯基部分的分子，而且在血清中的稳定性低于例如硫醚附着(Martin FJ.和Papahadjopoulos D.(1982)J.Biol.Chem.257：286-288)。因此，在本发明的进一步非常优选的实施方式中，修饰VLP和至少一种抗原的缔合或连接不包括二硫键。在此进一步优选，至少一个第二附着包括或优选是巯基。此外，修饰VLP和至少一种抗原的缔合或连接优选不包括硫-硫键。在此进一步优选，至少一个第二附着包括或优选是巯基。在进一步非常优选的实施方式中，所述至少一个第一附着位点不是或不包括巯基。在再进一步非常优选的实施方式中，所述至少一个第一附着位点不是或不包括半胱氨酸的巯基。在进一步优选的实施方式中，所述第二附着位点是巯基，优选半胱氨酸的巯基。
在非常优选的实施方式中，至少一个第一附着位点是氨基，优选赖氨酸残基的氨基，并且至少一个第二附着位点是巯基，优选半胱氨酸残基的巯基或已化学附着至抗原的巯基。在进一步优选的实施方式中，所述第二附着位点中仅一个与所述第一附着位点通过至少一个非肽共价键缔合，导致所述抗原与所述修饰病毒样颗粒的结合类型单一和一致，其中所述仅一个与所述第一附着位点缔合的第二附着位点是巯基，并且其中所述抗原和所述修饰病毒样颗粒通过所述缔合相互作用，形成有序且重复的抗原阵列。
在本发明的一个优选实施方式中，抗原通过化学交联连接至修饰VLP，一般和优选地通过利用异双官能交联剂。在优选的实施方式中，异双官能交联剂包含可与修饰VLP的优选第一附着位点，优选与氨基，更优选与赖氨酸残基(一个或多个)的氨基反应的官能团，和可与固有或人工添加至抗原的优选第二附着位点，即巯基，优选半胱氨酸(一个或多个)残基反应并且任选地还可通过还原被反应利用的另一官能团。几种异双官能交联剂在本领域是已知的。这些包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、Sulfo-KMUS SVSB、SIA、和可获自例如PierceChemical Company并且具有一个对氨基具有反应性的官能团和一个对巯基具有反应性的官能团的其它交联剂。上述交联剂在与氨基和通过巯基的硫醚连接进行反应后全部导致酰胺键形成。适于本发明实践的另一类交联剂的特征在于在抗原和修饰VLP之间在偶联后引入二硫连接。属于这类的优选交联剂包括，例如，SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。
根据上述优选方法抗原与修饰VLP通过利用异双官能交联剂的连接允许抗原以定向方式偶联至修饰VLP。其它连接抗原至修饰VLP的方法包括如下方法：其中利用碳二酰亚胺EDC和NHS，将抗原交联至修饰VLP。抗原也可先通过反应——例如与SATA、SATP或亚氨基硫代坊(iminothiolane)——被硫醇化。然后抗原，在去保护后——如需，可如下被偶联至修饰VLP。在分离过量硫醇化试剂后，使抗原与修饰VLP反应，该修饰VLP之前用包括半胱氨酸反应性部分的异双官能交联剂活化，因此显示硫醇化抗原可与之反应的至少一种或几种对半胱氨酸残基具有反应性的官能团，如上所述。任选地，反应混合物包括低量还原剂。在进一步方法中，使抗原附着至修饰VLP——利用同双官能交联剂，如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce)或带有对修饰VLP的胺基团或羧基具有反应性的官能团的其它已知同双官能交联剂。
在本发明的非常优选的实施方式中，抗原通过已添加至抗原N端或C端的半胱氨酸残基或抗原内的天然半胱氨酸残基被连接至修饰病毒样颗粒的赖氨酸残基。在优选的实施方式中，本发明的组合物进一步包括接头，其中所述接头将所述抗原与所述第二附着位点缔合，并且其中优选所述接头包括所述第二附着位点或可选地由所述第二附着位点组成。
第二附着位点在抗原上的改造工程通过接头(优选地，包含根据本发明公开适合作为第二附着位点的至少一种氨基酸)的缔合实现。因此，在本发明的优选实施方式中，接头通过至少一个共价键(优选地，通过至少一个肽键，优选地一个肽键)被缔合至抗原。优选地，接头包括第二附着位点或可选地由第二附着位点组成。在进一步优选的实施方式中，接头包括巯基，优选半胱氨酸残基。在另一优选实施方式中，氨基酸接头是半胱氨酸残基。
接头的选择将取决于抗原的本质、其生物化学性质如pi、电荷分布和糖基化。总体上，优选挠性氨基酸接头。在本发明的进一步优选的实施方式中，接头由氨基酸组成，其中进一步优选接头由至少一个并且至多25个，优选至多20个、更优选至多15个氨基酸组成。在本发明的再优选的实施方式中，氨基酸接头包含1至10个氨基酸。在进一步优选的实施方式中，所述接头包括所述第二附着位点或可选地由所述第二附着位点组成。
在进一步优选的实施方式中，所述接头是氨基酸接头，并且其中优选所述氨基酸接头选自：(a)CGG；(b)N-端γ1-接头；(c)N端γ3-接头；(d)Ig铰接区；(e)N端甘氨酸接头；(f)(G)kC(G)n，其中n＝0-12和k＝0-5；(g)N端甘氨酸-丝氨酸接头；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10、1＝0-2；(i)GGC；(j)GGC-NH2；(k)C端γ1-接头；(1)C端γ3-接头；(m)C端甘氨酸接头；(n)(G)nC(G)k，其中n＝0-12和k＝0-5；(o)C端甘氨酸-丝氨酸接头；和(p)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10、1＝0-2，和o＝0-8。总体上，甘氨酸残基将被插入本体(bulky)氨基酸和即将用作第二附着位点的半胱氨酸之间，以避免本体氨基酸在偶联反应中可能的空间位阻。
在进一步优选的实施方式中，接头被添加至抗原的N端。在本发明的另一优选实施方式中，接头被添加至抗原的C端。
在本发明的其它实施方式中，组合物包括通过化学相互作用连接至抗原的病毒样颗粒，或可选地主要由通过化学相互作用连接至抗原的病毒样颗粒组成，其中这些相互作用中的至少一种不是共价键。修饰VLP与抗原的连接可通过生物素基化修饰VLP和以抗生蛋白链菌素-融合蛋白表达抗原而发生。在本发明的其它实施方式中，用于化学偶联至赖氨酸的巯基通过化学修饰被附着至修饰VLP或抗原。
在进一步优选的实施方式中，所述组合物进一步包括至少一种免疫刺激物。在非常优选的实施方式中，所述免疫刺激物装配在本发明的修饰VLP中。在另一优选实施方式中，免疫刺激物与本发明的修饰VLP混合。可用于本发明的免疫刺激物在本领域是公知的，并且被描述于WO2003/024481A2等。
在本发明的另一实施方式中，所述免疫刺激物由非真核来源的DNA或RNA组成。在进一步优选的实施方式中，所述免疫刺激物选自：(a)免疫刺激核酸；(b)肽聚糖；(c)脂多糖；(d)脂磷壁酸；(e)咪唑并喹啉化合物；(f)鞭毛蛋白；(g)脂蛋白；和(h)(a)至(g)的至少一种物质的任意混合物。在进一步优选的实施方式中，所述免疫刺激物是免疫刺激核酸，其中所述免疫刺激核酸选自：(a)核糖核酸；(b)脱氧核糖核酸；(c)嵌合体核酸；和(d)(a)、(b)和/或(c)的任意混合物。在进一步优选的实施方式中，所述免疫刺激核酸是核糖核酸，并且其中所述核糖核酸是细菌源RNA。在进一步优选的实施方式中所述免疫刺激核酸是多(LC)或其衍生物。在进一步优选的实施方式中，所述免疫刺激核酸是脱氧核糖核酸，其中所述脱氧核糖核酸是未甲基化的含CpG寡核苷酸。
在非常优选的实施方式中，所述免疫刺激物是未甲基化的含CpG寡核苷酸。在进一步优选的实施方式中，所述未甲基化的含CpG寡核苷酸是A型CpG。在进一步优选的实施方式中，所述A型CpG包括序列GACGATCGTC(SEQ ID NO：31)。在进一步优选的实施方式中，所述回文序列在其5'端和在其3'端侧接鸟苷实体。在进一步优选的实施方式中，所述回文序列在其5'端侧接至少3个并且至多15个鸟苷实体，并且其中，所述回文序列在其3'端侧接至少3个并且至多15个鸟苷实体。
在另一优选实施方式中，所述免疫刺激物是未甲基化的含CpG寡核苷酸，并且其中优选所述未甲基化的含CpG寡核苷酸包括回文序列，并且其中进一步优选所述未甲基化的含CpG寡核苷酸的CpG基序是部分回文序列，并且其中再进一步优选所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO：31)。
在进一步优选的实施方式中，所述免疫刺激核酸是由序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO：36)组成的未甲基化的含CpG寡核苷酸，其中，所述未甲基化的含CpG寡核苷酸仅由磷酸二酯结合的核苷酸组成。
可用于本发明目的的抗原被例如公开于WO2002/056905A2、WO2004/007538A2、WO2006/037787A2、WO2004/084940A1、和WO2006/032674A1。在一个实施方式中，所述抗原源自选自下列的来源：(a)病毒；(b)细菌；(c)寄生虫；(d)肿瘤；(e)自体分子；(f)非肽半抗原分子；(g)过敏原；(h)激素；(i)细胞因子；(k)趋化因子；(l)生物活性肽。在另一优选实施方式中，所述抗原是肿瘤抗原、自体抗原，病原多肽、过敏原或半抗原。在进一步非常优选的实施方式中，所述抗原是降钙素基因相关肽(CGRP)。
在进一步优选的实施方式中，所述抗原是肿瘤抗原，其中优选所述肿瘤抗原选自：(a)乳腺癌细胞的多肽；(b)肾癌细胞的多肽；(c)前列腺癌细胞的多肽；(d)皮肤癌细胞的多肽；(e)脑癌细胞的多肽；和(f)白血病细胞的多肽。
在进一步优选的实施方式中，所述抗原是选自下列的肿瘤抗原：(a)Her2；(b)神经节苷脂(gangliosid)GD2；(c)EGF-R；(d)癌胚胎抗原(CEA)；(e)CD52；(f)CD21；(g)人黑素瘤gplOO；(h)人黑素瘤melanA/MART-1；(i)人黑素瘤melanA/MART-1类似物；(j)酪氨酸酶；(k)NA17-A nt；(1)MAGE3；(m)p53蛋白；和(n)(a)至(m)的肿瘤抗原中任一种的抗原片段。
在进一步优选的实施方式中，所述抗原是选自下列的多肽：(a)IgE；(b)IL-6；(c)核因子kB配体的受体活化剂(RANKL)；(d)血管内皮生长因子(VEGF)；(e)血管内皮生长因子受体(VEGF-R)；肝细胞生长因子(HGF)；(f)白介素-1α；(g)白介素-1β；(h)白介素-5；(i)白介素-8；(j)白介素-13；(k)白介素-15；(1)白介素-17(IL-17)；(m)IL-23；(n)Ghrelin；(o)血管紧张素；(p)趋化因子(C-C基序)(CCL21)；(q)趋化因子(C-X基序)(CXCL 12)；(r)间质细胞衍生因子1(SDF-I)；(s)巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；(t)单核细胞趋化蛋白1(MCP-I)；(u)内皮糖蛋白；(v)抵抗素；(w)促性腺激素释放激素(GnRH)；(x)生长激素释放(GHRH)；(y)促黄体激素释放激素(LHRH)；(z)促甲状腺素激素(thyreotropin)释放激素(TRH)；(aa)巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)；(bb)葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)；(cc)嗜酸细胞活化趋化因子；(dd)缓激肽；(ee)Des-Arg缓激肽；(ff)B-淋巴细胞化学引诱物(BLC)；(gg)巨噬细胞集落刺激因子M-CSF；(hh)肿瘤坏死因子α(TNFα)；(ii)淀粉样β肽(Aβl-42)；(jj)淀粉样β肽(Aβl-6)；(kk)人IgE；(ii)CCR5胞外结构域；(mm)CXCR4胞外结构域；(nn)胃泌素；(oo)CETP；(pp)C5a；(qq)表皮生长因子受体(EGF-R)；(rr)CGRP；(ss)α-突触核蛋白；(tt)降钙素基因相关肽(CGRP)(uu)支链淀粉或(vv)多肽(a)至(uu)中任一种的片段；和(xx)多肽(a)至(uu)中任一种的抗原突变体或片段。
在进一步优选的实施方式中，所述抗原是自体抗原，其中，所述自体抗原是选自下列的多肽：(a)IgE；(b)IL-6；(c)核因子kB配体的受体活化剂(RANKL)；(d)血管内皮生长因子(VEGF)；(e)血管内皮生长因子受体(VEGF-R)；肝细胞生长因子(HGF)(f)白介素-1α；(g)白介素-1β；(h)白介素-5；(i)白介素-8；(j)白介素-13；(k)白介素-15；(1)白介素-17(IL-17)；(m)IL-23；(n)Ghrelin；(o)血管紧张素；(p)趋化因子(C-C基序)(CCL21)；(q)趋化因子(C-X基序)(CXCL 12)；(r)间质细胞衍生因子1(SDF-I)；(s)巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；(t)单核细胞趋化蛋白1(MCP-I)；(u)内皮糖蛋白；(v)抵抗素；(w)促性腺激素释放激素(GnRH)；(x)生长激素释放(GHRH)；(y)促黄体激素释放激素(LHRH)；(z)促甲状腺素释放激素(TRH)；(aa)巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)；(bb)葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)；(cc)嗜酸细胞活化趋化因子；(dd)缓激肽；(ee)Des-Arg缓激肽；(ff)B-淋巴细胞化学引诱物(BLC)；(gg)巨噬细胞集落刺激因子M-CSF；(hh)肿瘤坏死因子α(TNFα)；(ii)淀粉样β肽(Aβl-42)；(jj)淀粉样β肽(Aβl-6)；(kk)人IgE；(ii)CCR5胞外结构域；(mm)CXCR4胞外结构域；(nn)胃泌素；(oo)CETP；(pp)C5a；(qq)表皮生长因子受体(EGF-R)；(rr)CGRP；(ss)α-突触核蛋白；(tt)降钙素基因相关肽(CGRP)(uu)支链淀粉或(vv)多肽(a)至(uu)中任一种的片段；和(xx)多肽(a)至(uu)中任一种的抗原突变体或片段。
在非常优选的实施方式中，所述抗原是白介素17(IL-17)。白介素17是在宽范围细胞类型中诱导促炎性介质释放的T细胞源细胞因子。IL-17的异常Th17应答和过表达涉及了多种自身免疫障碍，包括类风湿性关节炎和多发性硬化症。阻断IL-17的分子，如IL-17特异性单克隆抗体，已被证实在动物模型中有效缓解疾病。此外，靶向IL-17的活性免疫近来已被提出，其利用与重组体IL-17缀合的病毒样颗粒(TA等，Eur J Immunol(2006)36：1-11)。IL-17-VLP免疫诱导高水平的抗IL-17抗体，从而克服天然耐受性——即使是在不存在添加佐剂的情况下。IL-17-VLP免疫的小鼠在胶原蛋白诱导性关节炎和实验自身免疫脑脊髓炎中均具有较低的疾病发生率，较慢的疾病进展、和降低的疾病严重程度评分。
因此，在进一步非常优选的实施方式中，所述抗原包括SEQ ID NO：42、或优选由SEQ ID NO：42组成。此外，本发明的包括修饰VLP的组合物被用于治疗动物或人的炎性疾病，优选慢性炎性疾病的方法。优选地，所述炎性疾病选自RA、MS、牛皮癣、哮喘、克罗恩病、结肠炎、COPD、糖尿病、神经性皮炎(过敏性皮炎)，再优选地，其中所述炎性疾病MS。进一步优选地，所述本发明组合物的所述抗原包括SEQ ID NO：42、或优选由SEQ ID NO：42组成。
在另一非常优选的实施方式中，所述抗原是IL-5。在再进一步非常优选的实施方式中，所述抗原包括SEQ ID NO：41、或优选由SEQ ID NO：41组成。此外，本发明的包括修饰VLP的组合物被用于治疗动物或人的炎性疾病，优选慢性炎性疾病的方法。优选地，所述炎性疾病选自RA、MS、牛皮癣、哮喘、克罗恩病、结肠炎、COPD、糖尿病、神经性皮炎(过敏性皮炎)。进一步优选地，所述本发明组合物的所述抗原包括SEQ ID NO：41、或优选由SEQ IDNO：41组成。
在另一非常优选的实施方式中，所述抗原是犬IL-5。在再进一步非常优选的实施方式中，所述抗原包括下列、或优选由下列组成：SEQ ID NO：61或与SEQ ID NO：61具有至少90％，优选至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原包括SEQ ID NO：61、或优选由SEQ ID NO：61组成。在另一优选实施方式中，所述本发明组合物的所述抗原包括SEQID NO：61、或优选由SEQ ID NO：61组成。进一步优选地，本发明的组合物包括(i)具有至少一个第一附着位点的黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰病毒样颗粒(VLP)，其中，所述CMV的修饰VLP包括至少一种修饰CMV多肽、主要由至少一种修饰CMV多肽组成、或可选地由至少一种修饰CMV多肽组成，其中，所述修饰CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV多肽、和(b)T辅助细胞表位；并且其中，所述修饰CMV多肽包括SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成；(ii)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，并且其中，所述抗原是犬IL-5；并且其中，所述CMV的VLP和所述犬IL-5通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点来连接，并且其中，所述犬IL-5包括下列、或优选由下列组成：SEQ ID NO：61或与SEQ ID NO：61具有至少90％，优选至少95％的序列同一性的氨基酸序列，并且再优选地，其中，所述犬IL-5包括SEQ ID NO：61、或优选由SEQ ID NO：61组成。
在另一非常优选的实施方式中，所述抗原是IL-4。在再进一步非常优选的实施方式中，所述抗原包括SEQ ID NO：45、或优选由SEQ ID NO：45组成。
在另一非常优选的实施方式中，所述抗原是犬IL-4。在再进一步非常优选的实施方式中，所述抗原包括下列、或优选由下列组成：SEQ ID NO：62或与SEQ ID NO：62具有至少90％，优选至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原包括SEQ ID NO：62、或优选由SEQ ID NO：62组成。在另一优选实施方式中，所述本发明组合物的所述抗原包括SEQID NO：62、或优选由SEQ ID NO：62组成。进一步优选地，本发明的组合物包括(i)具有至少一个第一附着位点的黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰病毒样颗粒(VLP)，其中，所述CMV的修饰VLP包括至少一种修饰CMV多肽、主要由至少一种修饰CMV多肽组成、或可选地由至少一种修饰CMV多肽组成，其中，所述修饰CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV多肽、和(b)T辅助细胞表位；并且其中，所述修饰CMV多肽包括SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成；(ii)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，并且其中，所述抗原是犬IL-4；并且其中，所述CMV的VLP和所述犬IL-4通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点来连接，并且其中，所述犬IL-4包括下列、或优选由下列组成：SEQ ID NO：62或与SEQ ID NO：62具有至少90％，优选至少95％的序列同一性的氨基酸序列，并且再优选地，其中，所述犬IL-4包括SEQ ID NO：62、或优选由SEQ ID NO：62组成。
在另一非常优选的实施方式中，所述抗原是IL-13。在再进一步非常优选的实施方式中，所述抗原包括SEQ ID NO：46、或优选由SEQ ID NO：46组成。
在另一非常优选的实施方式中，所述抗原是犬IL-13。在再进一步非常优选的实施方式中，所述抗原包括下列、或优选由下列组成：SEQ ID NO：63或与SEQ ID NO：63具有至少90％，优选至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原包括SEQ ID NO：63、或优选由SEQ ID NO：63组成。在另一优选实施方式中，所述本发明组合物的所述抗原包括SEQID NO：63、或优选由SEQ ID NO：63组成。进一步优选地，本发明的组合物包括(i)具有至少一个第一附着位点的黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰病毒样颗粒(VLP)其中，所述CMV的修饰VLP包括至少一种修饰CMV多肽、主要由至少一种修饰CMV多肽组成、或可选地由至少一种修饰CMV多肽组成，其中，所述修饰CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV多肽、和(b)T辅助细胞表位；并且其中，所述修饰CMV多肽包括SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成；(ii)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，并且其中，所述抗原是犬IL-13；并且其中，所述CMV的VLP和所述犬IL-13通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点来连接，并且其中，所述犬IL-13包括下列、或优选由下列组成：SEQ ID NO：63或与SEQ ID NO：63具有至少90％，优选至少95％的序列同一性的氨基酸序列，并且再优选地，其中，所述犬IL-13包括SEQ ID NO：63、或优选由SEQ ID NO：63组成。
在进一步非常优选的实施方式中，所述抗原是TNFα。在进一步非常优选的实施方式中，所述抗原是IL-1α。
在进一步非常优选的实施方式中，所述抗原是IL-1β。在再进一步非常优选的实施方式中，所述抗原包括SEQ ID NO：60、或优选由SEQ ID NO：60组成。
在再进一步非常优选的实施方式中，所述抗原是衍生自Aβ-1-42的肽。在再进一步非常优选的实施方式中，所述抗原是IgE、或IgE中包括的肽或结构域。
在还另一非常优选的实施方式中，所述抗原是人、猫或犬的IL-31。在另一非常优选的实施方式中，所述抗原包括SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44、或优选由SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44组成。在另一非常优选的实施方式中，所述抗原是犬IL-31。在再进一步非常优选的实施方式中，所述抗原包括下列、或优选由下列组成：SEQ ID NO：43或与SEQ ID NO：43具有至少90％，优选至少95％的序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗原包括SEQ IDNO：43、或优选由SEQ ID NO：43组成。在另一优选实施方式中，所述本发明组合物的所述抗原包括SEQ ID NO：43、或优选由SEQ ID NO：43组成。进一步优选地，本发明的组合物包括(i)具有至少一个第一附着位点的黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰病毒样颗粒(VLP)，其中，所述CMV的修饰VLP包括至少一种修饰CMV多肽、主要由至少一种修饰CMV多肽组成、或可选地由至少一种修饰CMV多肽组成，其中，所述修饰CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV多肽、和(b)T辅助细胞表位；并且其中，所述修饰CMV多肽包括SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成；(ii)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，并且其中，所述抗原是犬IL-31；并且其中，所述CMV的VLP和所述犬IL-31通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点来连接，并且其中，所述犬IL-31包括下列、或优选由下列组成：SEQ ID NO：43或与SEQ ID NO：43具有至少90％，优选至少95％的序列同一性的氨基酸序列，并且再优选地，其中，所述犬IL-31包括SEQ ID NO：43、或优选由SEQ ID NO：43组成。
在另一非常优选的实施方式中，所述抗原是α-突触核蛋白或衍生自α-突触核蛋白的肽，并且其中优选地所述肽由6至14个氨基酸组成，并且其中进一步优选地所述抗原是衍生自α-突触核蛋白的肽，选自SEQ D NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34中任一种。进一步优选的衍生自α-突触核蛋白的肽被公开于WO 2011/020133，其通过引用并入本文中。
α-突触核蛋白(α-Syn)——具有多种生理学和病理学功能的小型蛋白质——是在Lewy体中发现的主要蛋白质之一、包括帕金森病(PD)在内的Lewy体障碍的病理学标志。再近来，α-Syn已在体液(包括血液和脑脊髓液)中被发现，并且可能由外周组织和中枢神经系统两者产生。更换脑和外周组织之间的α-Syn可具有重要的病理生理学和医疗学意义(Gardai SJ等，PLoS ONE(2013)8(8)：e71634)。α-突触核蛋白(a-syn)牵涉在帕金森病(PD)发病中的证据是压倒性的。然而，对于a-syn引起PD病理和其它突触核蛋白病的方式没有明确共识。
α-突触核蛋白是Lewy体(LB)的主要组分，和a-syn过表达导致聚集的描述有很多。人遗传数据已证明，a-syn基因的错义突变和倍增引起家族性PD。在基因倍增的情况下，推定a-syn蛋白的水平增加导致引起病理的功能增益显著。虽然a-syn水平增加可导致聚集和毒性，但过去几年的研究也表明a-syn升高可干扰囊泡池(vesicle pools)的产生、局部化和/或保持(Gardai SJ等，PLoS ONE(2013)8(8)：e71634；和其中引用的参考文献)。
在再进一步非常优选的实施方式中，所述抗原是支链淀粉。在非常优选的实施方式中，所述抗原是血管紧张素I或衍生自血管紧张素I的肽。在另一非常优选的实施方式中，所述抗原血管紧张素II或衍生自血管紧张素II的肽。在进一步非常优选的实施方式中，所述抗原是GnRH。在进一步非常优选的实施方式中，所述抗原是嗜酸细胞活化趋化因子。
在进一步优选的实施方式中，所述抗原是寄生虫的多肽，其中优选地所述病原选自：(a)弓形虫属(Toxoplasma spp.)；(b)镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)；(c)间日疟原虫(Plasmodium vivax)；(d)卵巢疟原虫(Plasmodium ovale)；(e)三日疟原虫(Plasmodium malariae)；(f)利什曼原虫(Leishmania)；(g)血吸虫(Schistosoma)和(h)线虫(Nematodes)。优选地，所述抗原抗原源自镰状疟原虫或间日疟原虫。
在进一步优选的实施方式中，所述抗原是细菌的多肽，其中优选地所述细菌选自：(a)衣原体(Chlamydia)；(b)链球菌(Streptococccus)；(c)肺炎球菌(Pneumococcus)；(d)葡萄球菌(Staphylococcus)；(e)沙门氏菌(Salmonella)；(f)分枝杆菌(Mycobacteria)；(g)梭菌(Clostridia)；(h)弧菌(Vibrio)；(i)耶尔森氏菌(Yersinia)；(k)脑膜炎球菌(Meningococcus)；(l)疏螺旋体(Borelia)。
在进一步优选的实施方式中，所述抗原是病毒抗原，其中优选地所述病毒抗原是选自下列的多肽：(a)HIV和其它逆转录病毒；(b)流感病毒，优选流感A M2胞外结构域或HA或HA球状结构域；(c)乙型肝炎病毒的多肽，优选preSl；(d)丙型肝炎病毒；(e)HPV，优选HPV16E7；(f)RSV；(g)SARS和其它冠状病毒；(h)登革热和其它黄病毒，如西尼罗病毒和手足口病病毒；(i)基孔肯雅和其它α病毒；(k)CMV和其它疱疹病毒；(l)轮状病毒。在进一步非常优选的实施方式中，所述抗原源自RSV。
在优选的实施方式中，所述抗原是流感A病毒M2蛋白的胞外结构域、或其抗原片段。在非常优选的实施方式中，所述抗原包括流感A病毒M2蛋白的胞外结构域、或优选由流感A病毒M2蛋白的胞外结构域组成，其中优选地所述流感A病毒M2蛋白的胞外结构域是SEQID NO：24。在另一优选实施方式中，所述抗原是流感病毒的球状结构域。
在进一步优选的实施方式中，所述抗原是过敏原，其中优选地所述过敏原源自：(a)花粉提取物；(b)尘埃提取物；(c)尘螨提取物；(d)真菌提取物；(e)哺乳动物表皮提取物；(f)羽毛提取物；(g)昆虫提取物；(h)食物提取物；(i)毛发提取物；(j)唾液提取物；和(k)血清提取物。在进一步优选的实施方式中，所述抗原是过敏原，其中，所述过敏原选自：(a)树；(b)草；(c)室内尘埃；(d)室内尘螨；(e)曲霉；(f)动物毛发；(g)动物羽毛；(h)蜂毒；(i)动物产物；(j)植物产物；(k)动物皮屑；(l)花生过敏原。
在进一步优选的实施方式中，所述抗原是重组过敏原，其中，所述过敏原选自：(a)蜂毒磷脂酶A2；(b)豕草花粉Amb a 1；(c)桦树花粉Bet v I；(d)白脸马蜂毒5DoI m V(white faced hornet venom5DoI m V)；(e)室内尘螨Der p 1；(f)室内尘螨Der f 2；(g)室内尘螨Der p 2；(h)尘螨Lep d；(i)真菌过敏原Alt a 1；(j)真菌过敏原Asp f 1；(k)真菌过敏原Asp f 16；(l)花生过敏原；(m)猫过敏原Fel d1；(n)犬过敏原Can f1、Can f2；(o)花生源过敏原；或(p)日本雪松过敏原Cry J2。在本发明的另一非常优选的实施方式中，所述抗原是犬过敏原Can f1或Can f2。
在进一步非常优选的实施方式中，所述抗原是花生过敏原。优选地，所述抗原是花生过敏原，其包括选自SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65的氨基酸序列。
在进一步非常优选的实施方式中，所述抗原是源自日本雪松Cry J2的过敏原。优选地，所述抗原源自日本雪松Cry J 2并且包括SEQ ID NO：55的氨基酸序列。
在进一步非常优选的实施方式中，所述抗原是源自豕草花粉Amb a 1的过敏原。优选地，所述抗原源自豕草花粉Amb a 1并且包括SEQ ID NO：54的氨基酸序列。
在本发明的非常优选的实施方式中，所述抗原是猫过敏原Fel d1。家猫(Felisdomesticus)是重要的室内过敏原来源(Lau，S.等，(2000)Lancet 356，1392-1397)。实际上，在西方国家约25％的家庭中发现有猫，并且在大部分人群中发现对猫过敏。症状的严重程度覆盖相对轻度的鼻炎和结膜炎至可能威胁生命的哮喘加重的范围。虽然患者有时会对猫皮屑和毛皮的数种不同分子过敏，但主要过敏原是Fel d1。这种过敏原的重要性已在大量研究中被强调。事实上多于80％的猫过敏患者呈现针对这种烈性过敏原的IgE抗体(vanRee，R.等，(1999)J.Allergy Clin Immunol 104，1223-1230)。
Fel d1是包含10-20％N接碳水化合物的35-39kDa酸性糖蛋白，被发现于猫的毛皮、唾液和泪腺中。其由两个非共价连接的异源二聚体形成。每个异源二聚体由单独基因编码的一个70个残基的肽(称为“链1”)和一个78、85、90或92个残基的肽(称为“链2”)组成(参见Duffort，O。A.等，(1991)Mol Immunol 28，301-309；Morgenstern，J.P.等；(1991)ProcNatl Acad Sci USA 88，9690-9694和Griffith，I.J.等，(1992)Gene 113，263-268)。
Fel d1的几种重组构建物已被描述(Vailes LD等，J Allergy Clin Immunol(2002)110：757-762；H等，J Biol Chem(2003)278：40144–40151；2003SchmitzN等，J Exp Med(2009)206：1941-1955；WO2006/097530)。
因此，在进一步非常优选的实施方式中，所述抗原是rFel d1。在进一步非常优选的实施方式中，所述抗原是Fel d1蛋白，其中，所述Fel d1蛋白是包括Fel d1的链1和Feld1的链2的融合蛋白，其中，所述Fel d1的链2通过其C端融合至所述Fel d1的链1的N端——直接通过一个肽键或通过间隔体，其中，所述间隔体由具有1-20个氨基酸残基的氨基酸序列组成，其中优选地所述间隔体由具有10-20个氨基酸残基的氨基酸序列组成。非常优选地，所述间隔体由15个氨基酸残基的氨基酸序列组成，和进一步优选地所述间隔体具有SEQID NO：47的氨基酸序列。在进一步非常优选的实施方式中，所述抗原是Fel d1蛋白，其中，所述Fel d1蛋白是包括Fel d1的链1和Fel d1的链2的融合蛋白，其中，所述Fel d1的链1通过其C端融合至所述Fel d1的链2的N端——直接通过一个肽键或通过间隔体，其中，所述间隔体由具有1-20个氨基酸残基的氨基酸序列组成，其中优选地所述间隔体由具有10-20个氨基酸残基的氨基酸序列组成。优选地，所述Fel d 1的链1包括SEQ ID NO：37的序列或其同源序列，其中，所述同源序列与SEQ ID NO：37具有大于90％或还更优选地大于95％的同一性。进一步优选地，所述Fel d 1的链2包括SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40的序列、或其同源序列，其中，所述同源序列与SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40具有大于90％，还更优选大于95％的同一性。
在非常优选的实施方式中，所述抗原包括SEQ ID NO：17，优选由SEQ ID NO：17组成。在另一非常优选的实施方式中，所述抗原包括SEQ ID NO：18，优选由SEQ ID NO：18组成。在另一非常优选的实施方式中，所述抗原包括SEQ ID NO：52，优选由SEQ ID NO：52组成。在非常优选的实施方式中，所述抗原是包括选自下列的氨基酸序列的Fel d1蛋白：(a)SEQ ID NO：17；(b)SEQ ID NO：18；(c)SEQ ID NO：50；(d)SEQ ID NO：56；(e)SEQ ID NO：59；或SEQ ID NO：52。
在进一步非常优选的实施方式中，所述Fel d1蛋白包括选自下列的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：50；(b)SEQ ID NO：56(c)SEQ ID NO：59；或(d)SEQ ID NO：52。在进一步非常优选的实施方式中，所述Fel d1蛋白包括选自下列的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：50；(b)SEQ ID NO：56；或(c)SEQ ID NO：59。
在另一非常优选的实施方式中，所述Fel d1蛋白包括SEQ ID NO：52的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：52的氨基酸序列组成。在另一非常优选的实施方式中，所述Fel d1蛋白包括SEQ ID NO：59的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：59的氨基酸序列组成。在另一非常优选的实施方式中，所述Fel d1蛋白包括SEQ ID NO：50的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：50的氨基酸序列组成。在另一非常优选的实施方式中，所述Fel d1蛋白包括SEQ ID NO：56的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：56的氨基酸序列组成。
在非常优选的实施方式中，本发明的组合物包括(i)具有至少一个第一附着位点的黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰病毒样颗粒(VLP)，其中所述CMV的修饰VLP包括至少一种修饰CMV多肽、主要由至少一种修饰CMV多肽组成、或可选地由至少一种修饰CMV多肽组成，其中，所述修饰CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV多肽、和(b)T辅助细胞表位；并且其中，所述修饰CMV多肽包括SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成；(ii)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，并且其中，所述抗原是Fel d1蛋白；并且其中，所述CMV的VLP和所述Fel d1蛋白通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点来连接，并且其中，所述Fel d1蛋白包括选自下列的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：50；(b)SEQ ID NO：56(c)SEQ ID NO：59；或(d)SEQ IDNO：52，并且其中优选地所述Fel d1蛋白包括选自下列的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：50；(b)SEQ ID NO：56；或(c)SEQ ID NO：59。
在进一步优选的实施方式中，所述抗原是动物毒。在优选的实施方式中，抗原是失活蛇毒。在进一步优选的实施方式中，所述抗原是半抗原。在进一步优选的实施方式中，所述半抗原是药物，其中优选地所述药物选自：(a)可待因；(b)芬太尼；(c)海洛因；(d)吗啡；(e)苯异丙胺；(f)可卡因；(g)亚甲二氧基甲基苯异丙胺；(h)甲基苯异丙胺；(i)哌酸甲酯；(j)尼古丁；(k)LSD；(1)麦斯卡林；(m)赛洛西宾；(n)四氢大麻酚；和(o)尼古丁
在进一步优选的实施方式中，所述半抗原是激素，其中优选地所述激素选自：(a)孕酮；(b)雌激素；(c)睾酮；(d)卵泡刺激激素；(e)黑色素刺激激素；(f)肾上腺素；和(g)去甲肾上腺素。在进一步优选的实施方式中，所述半抗原是毒素，其中优选地所述毒素选自：(a)黄曲霉毒素；(b)雪卡毒素；(c)河豚毒素；和(d)抗生素。在进一步优选的实施方式中，所述半抗原是病原源碳水化合物。
在进一步方面，本发明提供疫苗，其包括本发明的修饰病毒样颗粒或本发明的组合物、或可选地由本发明的修饰病毒样颗粒或本发明的组合物组成。包括如下疫苗：其中，所述修饰VLP和/或所述组合物包括本文公开的技术特征中的任一个——单独或以任何可能的组合。在一个实施方式中，疫苗进一步包括佐剂。在进一步实施方式中，疫苗不含佐剂。在优选的实施方式中，所述疫苗包括有效量的本发明组合物。"有效量"指代为实现可检测的生理学效果而需要给予对象的量。
在进一步方面，本发明涉及药物组合物，其包括：(a)本发明的修饰VLP、本发明的组合物、或本发明的疫苗；和(b)药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。所述稀释剂包括无菌水性(例如，生理学盐水)或非水性溶液和悬浮液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和可注射有机酯如油酸乙酯。载体或封闭性敷料可用于增加皮肤渗透性和增强抗原吸收。本发明的药物组合物可以是包含盐、缓冲液、佐剂、或提高缀合物效力所期望的其它物质的形式。适用于药物组合物制剂的材料的实例被提供在大量来源中，包括Remington's Pharmaceutical Sciences(Osol，A，ed.，Mack Publishing Co.，(1990))。在一个实施方式中，所述药物组合物包括有效量的本发明疫苗。"有效量"指代为实现可检测的生理学效果而需要给予对象的量。
本发明的进一步方面是免疫方法，包括向动物或人给予本发明的修饰VLP、本发明的组合物、本发明的疫苗、或本发明的药物组合物。在优选的实施方式中，所述方法包括向动物或人给予本发明的组合物、本发明的疫苗、或本发明的药物组合物。
本发明的进一步方面是治疗或预防动物的疾病、障碍或生理学状况的方法，所述方法包括向所述动物给予本发明的修饰VLP、本发明的组合物、本发明的疫苗、或本发明的药物组合物，其中优选地所述动物可以是人。在进一步优选的实施方式中，所述修饰VLP、所述组合物、所述疫苗、或所述药物组合物被皮下、静脉内、皮内、鼻内、口服、结内或经皮给予所述动物。
实施例
实施例1
黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)的分离和克隆
按照生产商的建议，利用TRI试剂(Sigma，圣路易，USA)分离从拉脱维亚里加的私人花园收集的CMV感染的百合叶的全部RNA。关于cDNA合成，使用一步RT-PCR试剂盒(Qiagen，Venlo，荷兰)。关于CMV CP基因的扩增，按照来自GenBank的CMV序列的分析选择引物序列：CMcpF(CACCATGGACAAATCTGAA TCAACCAGTGCTGGT)(SEQ ID NO：8)和CMcpR(CAAAGCTTATCAAACTGGGAGCA CCCCAGATGTGGGA)(SEQ ID NO：9)；NcoI和HindIII位点标注下划线。相应的PCR产物被克隆到pTZ57R/T载体(Fermentas，维尔纽斯，立陶宛)中。大肠杆菌XL1-蓝细胞用作克隆和质粒扩增的宿主。为避免RT-PCR误差，利用BigDye循环测序试剂盒和ABI Prism 3100基因分析仪(Applied Biosystems，Carlsbad，USA)对几种包含CP基因的pTZ57质粒克隆进行测序。在测序后，编码SEQ ID NO：1的CMV外壳蛋白的无序列误差CMV CP基因的cDNA(SEQ ID NO：10)被亚克隆到pET28a(+)表达载体(Novagen，San Diego，USA)的NcoI/HindIII位点中，产生表达质粒pET-CMVwt(图1)。
实施例2
SEQ ID NO：1的CP在大肠杆菌中的表达导致CMV VLP
为获得CMV VLP，用包含CMV CP基因的质粒pET-CMVwt转化大肠杆菌C2566细胞(New England Biolabs，Ipswich，USA)。在选择目标蛋白表达水平最高的克隆后，使大肠杆菌培养物在30℃下、在旋转振荡器(200rev/min；Infors，Bottmingen，Switzerland)上、在包含卡那霉素(25mg/l)的2xTY培养基中生长至OD600为0.8–1.0。然后，用0.2mM IPTG诱导细胞，并以5mM MgCl2补充培养基。在旋转振荡器上在20℃下继续温育18h。通过低速离心收集所得生物质，并在-20℃下冷冻。在冰上解冻后，将细胞悬浮于包含50mM柠檬酸钠、5mM硼酸钠、5mM EDTA、5mM巯基乙醇(pH 9.0，缓冲液A)的缓冲液中，并通过超声处理裂解。通过离心(13,000rpm，30min，5℃)去除不溶性蛋白和细胞碎片。利用饱和硫酸铵(1：1，vol/vol)使净化的溶解产物中的可溶性CMV CP蛋白在+4℃下沉淀过夜。将沉淀的蛋白质在+4℃下在相同的缓冲液A(无巯基乙醇)中增溶4h。通过低速离心(13,000rpm，15min，4℃)去除不溶性蛋白。在蔗糖梯度(20–60％蔗糖在缓冲液A中，无巯基乙醇，补充0.5％Triton X-100)下，通过超速离心(SW28转子，Beckman，Palo Alto，USA；25,000rpm，6h，5℃)，从细胞蛋白分离可溶性含CMV CP蛋白溶液。该梯度分成六个部分，始于梯度最低点，并且通过SDS-PAGE分析各部分(图2)。将包含重组CMV CP的部分No.2和No.3组合，并相对于200体积的缓冲液(5mM硼酸钠，2mM EDTA，pH 9.0)透析，以去除蔗糖和Triton X-100。透析后，通过经0.2μ过滤器过滤将CMV CP溶液灭菌。然后，在无菌条件(50 000rpm，4h，+5℃)下，通过20％蔗糖“垫(cushion)”，利用70型转子(Beckman，Palo Alto，USA)超速离心，将CMV CP浓缩。按照生产商的建议(Invitrogen，Eugene，USA)，利用QuBit荧光计，估测纯化的CMVwt的浓度。将浓缩的VLP溶液(约3mg/ml)在+4℃下储存在5mM硼酸钠、2mM EDTA、缓冲液(pH 9.0)中。VLP表达和纯化涉及的所有步骤均利用12.5％凝胶通过SDS-PAGE来监测。
如图2所示，CMV外壳蛋白可在大肠杆菌细胞中成功表达，并且获得的大部分(significant part)可以在可溶性部分(soluble fraction)中。此外，这些蛋白质在大肠杆菌细胞提取物中以异构VLP形式被直接发现，如蔗糖梯度分析(图3A)、动态光散射和电子显微分析(图3B)所证。
实施例3
包含破伤风类毒素表位的修饰CMV外壳蛋白的克隆
(CMV-Ntt830)
为以外源表位序列置换SEQ ID NO：1的CMV CP的N端的原氨基酸，利用pET-CMVwt质粒作为PCR扩增和诱变的模板。利用位于CMVwt基因内部的SalI位点(图1)克隆相应的PCR产物。
为在CMVwt基因中引入破伤风类毒素表位编码序列，需要两步PCR诱变。关于第一步扩增，下列引物用于PCR：pET-220(agcaccgccgccgcaaggaa(SEQ ID NO：11)——在多聚接头上游，扩增区域包括BglII位点)和CMV-tt83-1R(ATTTGGAGTTGGCCTTAATATACTGGCCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGT)(SEQ ID NO：12)。关于第二轮，将第一轮的PCR产物稀释1：50，并利用引物pET-220(SEQ ID NO：11)和CMV-tt83Sal-R2(GACGTCGACGCTCGGTAATCCCGATAAATTTGGAGTTGGCCTTAATATACTG)(SEQ ID NO：13)再扩增。将所得PCR产物(SEQ ID NO：14的cDNA，编码SEQ ID NO：6的CMV-Ntt830)亚克隆到pET-CMVwt的BglII/SaLI位点。通过测序鉴定正确的克隆，并命名为pET-CMV-Ntt830。
实施例4
CMV-Ntt830在大肠杆菌中的表达导致CMV的修饰VLP
CMV-Ntt830的表达和纯化程序与CMVwt基本上相同，并且在实施例2中已被描述。为证明破伤风表位在CMV VLP中存在，采用纯化的CMV-Ntt830VLP的质谱分析。如图4C所示，获得的主峰对应于该蛋白质的理论分子量——如果第一甲硫氨酸在大肠杆菌细胞中蛋白质合成期间被去除。动态光散射和电子显微分析确认异构颗粒形态与CMVwt VLP相似(图5)。
实施例5
包含PADRE表位的修饰CMV外壳蛋白的克隆
(CMV-Npadr)
为在CMVwt基因中引入PADRE表位编码序列，利用pET-CMVwt质粒(也参见实施例3)扩增和亚克隆模板进行PCR诱变。关于扩增，使用下列引物：pET-220(SEQ ID NO：11)和CMV-padrSal-R(GACGTCGACGCGCGGCCGCCTTGAGGGTCCACGCGGCCACAAATTT CGCCATGGT)(SEQ IDNO：15)。将所得PCR产物(SEQ ID NO：16的cDNA，编码SEQ ID NO：7的CMV-Npadr)再次亚克隆到pET-CMVwt的BglII/SalI位点。通过测序鉴定正确的克隆，并命名为pET-CMV-Npadr。
实施例6
CMV-Npadr在大肠杆菌中的表达导致CMV的修饰VLP
CMV-Npadr的表达和纯化程序与CMVwt基本上相同，并且在实施例2中已被描述。为证明PADRE表位在CMV VLP中存在，采用纯化的CMV-Npadr VLP的质谱分析。如图4B所示，获得的主峰对应于该蛋白质的理论分子量——如果第一甲硫氨酸在大肠杆菌细胞中蛋白质合成期间被去除。动态光散射和电子显微分析确认异构颗粒形态，其与CMVwt和CMV-Nt830VLP略有不同(图6)。
实施例7
用CMVwt、CMV-Ntt830和CMV-Npadr免疫小鼠
将四只雌性Balb/c小鼠的小组用CMVwt、CMV-Npadr VLP和CMV-Ntt830VLP免疫。VLP配制在150mM PBS，pH 7.4中，并且在第0天和第7天i.v.注射150μl。CMVwt、CMV-NpadrVLP和CMV-Ntt830VLP以三种量注射：10、1或0.1μg。将小鼠在第0天(免疫前)、第7天、第14天、和第25天放血，并利用CMVwt VLP、CMV-Npadr VLP和CMV-Ntt830VLP特异性ELISA分析血清。针对用于免疫的各VLP测试全部免疫血清。
ELISA
分析所示时间的小鼠血清的抗体应答。关于CMVwt、CMV-Npadr VLP和CMV-Ntt830VLP特异性抗体滴定度的确定，将ELISA板(Nunc Immuno MaxiSorp，Rochester，NY)在4℃下用100μl涂覆缓冲液(0.1M碳酸氢钠缓冲液，pH 9.6)中相应的VLP(1μg/ml)涂覆过夜。为避免非特异性结合，将ELISA板用200μl PBST中的2％BSA阻断并在RT下温育2小时。在2％BSA/PBST中稀释血清样本。将预稀释的血清转移到涂覆板上，并进一步连续稀释以基于OD50计算获得抗体滴定度。RT下2小时温育后，将ELISA板用200μl PBST洗涤5次。通过辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)检测血清抗体的结合。将检测抗体在2％BSA/PBST中稀释1：1000，并且每个样本转移100μl体积。将板在RT下温育1小时。将ELISA板如前述洗涤。在洗涤前制备底物溶液。为此，将1片(10mg)OPD(1,2-苯二胺二盐酸盐)和9μl 30％H2O2溶解在25ml柠檬酸缓冲液(0.066M Na2HPO4，0.035M柠檬酸，pH5.0)中。将100μl体积的底物溶液移液到板上，并在RT下精确地温育7分钟。为终止反应，将50μl终止液(5％H2SO4，在H2O中)直接移液到板上。分析1,2-苯二胺二盐酸盐颜色反应在450nm下的吸光度读数。图7显示CMVwt(图7A)、CMV-Npadr(图7B)和CMV-Ntt880(图7C)的剂量依赖性方式的特异性抗体。
实施例8
重组Fel d1构建物与VLP CMV-Npadr和VLP CMV-Ntt830的偶联
和免疫应答的诱导
按照此前的描述(Schmitz N等，J Exp Med(2009)206：1941-1955)，生成rFel d1(SEQ ID NO：17)的共价融合。简而言之，利用重叠DNA-引物组，通过PCR扩增，获得编码链2和链1的共价二聚体的互补DNA，其中Fel d1的链2经由其C端以15aa接头(GGGGS)3相隔融合至Fel d1的链1的N端(该构建物命名为“rFel-2-G3-1-构建物”)。将这种互补DNA在框中(inframe)克隆到pET-42a(+)的修饰形式(EMD)中，导致rFel-2-G3-1-构建物的C端增加LEHHHHHHGGC的编码序列(SEQ ID NO：35)。增加序列包含用于纯化的His标签，然后是用于这种Fel d1融合蛋白与CMV-Npadr和CMV-Ntt830偶联的GGC接头。
类似地，按照此前的描述(WO2006/097530)，生成rFel d1(SEQ ID NO：18)的另一种共价融合，相应于包括Fel d1的链1和Fel d1的链2的rFel d1融合蛋白，其中Fel d1的链1通过15aa-接头(GGGGS)3经由其C端融合至Fel d1的链2的N端。
2.5ml体积、2mg/ml(71μM)浓度的病毒样颗粒VLP CMV-Npadr和VLP CMV-Ntt830与27μl的50mM异双官能化学交联剂琥珀酰亚胺基-6-(b-马来酰亚胺丙酰胺)己酸酯(SMPH)在室温(RT)下反应1小时。接头包含NHS酯，其与VLP表面上的赖氨酸反应。SMPH量指代关于一个VLP单体，即一个CMV多肽，7.5x摩尔过量。通过相对于150mM PBS，pH 7.4透析，去除未反应的交联剂。为生成rFel d1-CMV-Npadr和rFel d1-CMV-Ntt830组合物，将2.7mg/ml浓度(表示在200μl体积中150μM)的rFel d1蛋白溶液与5x摩尔过量的还原剂Tris-2-羧基乙基-膦(TCEP)混合，并在RT下温育5min。摩尔过量相对于蛋白Fel d1的量。TCEP使两个蛋白质分子的两个半胱氨酸残基之间的二硫桥还原，以确保其可用于与衍生化VLP的偶联反应。使预处理的蛋白质Fel d1以1：1的摩尔比与7.5x SMPH衍生化的VLP CMV-Npadr和VLP CMV-Ntt830在RT和振荡下反应3小时。蛋白质的还原的半胱氨酸与结合至VLP的交联剂SMPH的马来酰亚胺反应。在共价偶联后，通过在150mM PBS，pH 7.4中凝胶过滤去除未偶联的rFeld1。通过SDS-PAGE和免疫印记分析组成，以观察和确认偶联带。为此，将SMPH衍生化的VLPCMV-Npadr和CMV-Ntt830、组合物rFel d1-CMV-Npadr和rFel d1-CMV-Ntt830和Fel d1蛋白的样本平行加载到凝胶上。利用结合至蛋白Fel d1的His标签的抗5His抗体，通过免疫印记观察偶联。可视带表示Fel d1蛋白以及SMPH衍生化的VLP CMV-Npadr、VLP CMV-Ntt830、和组合物rFel d1-CMV-Npadr和rFel d1-CMV-Ntt830，其全部容易通过其尺寸区分。另外，将SDS-PAGE凝胶用考马斯蓝染色，并观察和确认偶联。
对小鼠用偶联至CMV-Npadr和CMV-Ntt830的rFel d1免疫
将五只雌性Balb/c小鼠的小组用通过SMPH偶联至rFel d1的CMV-Npadr VLP和CMV-Ntt830VLP免疫。将5μg量的rFel d1-CMV-Npadr和rFel d1-CMV-Ntt830分别在150mMPBS，pH 7.4中稀释至150μl，并在第0天和第7天静脉内注射。将小鼠在第0天(免疫前)、第7天、第14天、和第25天放血，并利用Fel d1特异性ELISA分析血清。
ELISA
分析所示时间的小鼠血清的抗体应答。通过在4℃下在PBS中以1μg/ml浓度、100μl体积(pH 7.2)涂覆ELISA板过夜来分析Fel d1特异性抗体。将ELISA板用包含0.05％吐温20(pH 7.2，PBST)的200μl PBS洗涤5次。为避免非特异性结合，将ELISA板用200μl PBST中的2％BSA阻断，并在RT下温育2小时。将血清样本在2％BSA/PBST中稀释。将预稀释的血清转移到涂覆板上，并进一步连续稀释以基于OD50计算获得抗体滴定度。在RT下2小时温育后，将ELISA板用200μl PBST洗涤5次。通过辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch)检测血清抗体的结合。将检测抗体在2％BSA/PBST中1：1000稀释，并且每个样本转移100μl体积。将板在RT下温育1小时。如前述洗涤ELISA板。在洗涤前，制备底物溶液。为此，将1片(10mg)OPD(1,2-苯二胺二盐酸盐)和9μl 30％H2O2溶解在25ml柠檬酸缓冲液(0.066M Na2HPO4，0.035M柠檬酸，pH 5.0)中。将100μl体积的底物溶液移液到板上，并在RT下精确温育7分钟。为终止反应，将50μl终止液(5％H2SO4，在H2O中)直接移液到板上。分析1,2-苯二胺二盐酸盐颜色反应在450nm下的吸光度读数。图8显示用本发明的组合物rFeld1-CMV-Npadr(图8A)和rFel d1-CMV-Ntt830(图8B)在小鼠中诱导了Fel d1特异性抗体。
实施例9
α-突触核蛋白肽与CMV-Ntt830的偶联和免疫应答的诱导
SEQ ID 22的α-突触核蛋白肽与由CMV-Ntt830(SEQ ID NO：6)形成的VLP的偶联如下进行。使1ml的1mg/ml CMV-Ntt830在20mM HEPES，50mM NaCl，pH 7.3中的溶液与79.3μlSMPH溶液(10mM，在DMSO中)在室温下反应60min。而且，使1ml的1mg/ml CMV-Ntt830在20mMHEPES，50mM NaCl，pH 7.3中的溶液与79.3μl磺基-KMUS溶液(10mM，在20mM HEPES中，pH7.4)在室温下反应60min。反应在4℃下在Slide-A-Lyzer透析盒中相对于2L的20mM HEPES，50mM NaCl，pH 7.3透析2h、14h和2h三次，其中MWCO为10kDa。将800μl衍生化且透析的CMV-Ntt830溶液与21.5μl的α-突触核蛋白肽(22.32mg/ml)混合，并在500rpm下在振动Eppendorf热混合器中在RT下温育3h以化学交联。通过在4℃在20000x g下离心10min清除偶联反应。通过在4-12％Bis-Tris凝胶上在还原条件下进行SDS-PAGE分析，分析衍生化的CMV-Ntt830外壳蛋白和偶联产物。随后，进行考马斯染色凝胶的密度测定分析。可见显示相对于CMV-Ntt830涂覆单体分子量增加的若干带，清楚证明α-突触核蛋白肽与CMV-Ntt830成功交联(考马斯染色未显示)。偶联密度在1.0以上，并且偶联效率在60％左右。为证明CMV-Ntt830VLP在衍生化和偶联后的完整性，通过在1x TAE中的1％琼脂糖凝胶电泳，然后考马斯和溴化乙锭染色，分析衍生化的CMV-Ntt830和偶联产物。衍生化和偶联的CMV-Ntt830VLP的蛋白质和核酸带分别共同迁移和与非衍生化和非偶联CMV-Ntt830呈现相似的迁移表现。外壳蛋白和核酸之间的共同迁移清楚证明，CMV-Ntt830VLP仍然是完整的，没有核酸从CMV-Ntt830VLP释放。
对小鼠用偶联至CMV-Ntt830外壳蛋白的α-突触核蛋白衍生肽免疫
将四只雌性C57B/6小鼠的小组用通过SMPH偶联至α-突触核蛋白肽(SEQ ID NO：22)的CMV-Ntt830VLP免疫。将250μg量的总蛋白在150mM PBS，pH 7.4中稀释至150μl，并在第0天和第14天i.v.注射。将小鼠在第0天(免疫前)、第7天、第14天、第21天、第28天和第34天放血，并利用α-突触核蛋白特异性ELISA分析血清。
ELISA
利用化学交联剂磺基-SPDP将α-突触核蛋白肽偶联至牛RNA酶A。将ELISA板用5μg/ml浓度的α-突触核蛋白肽偶联RNA酶制剂涂覆。将板阻断，然后与连续稀释的小鼠血清温育。利用酶标记的抗小鼠IgG检测结合的抗体。作为对照，还测试相同小鼠的免疫前血清。所有小鼠针对α-突触核蛋白衍生肽做出明确且强烈的IgG应答，如图9所示。
实施例10
IL-17A肽与CMV-Ntt830的偶联和免疫应答的诱导
进行小鼠IL17A蛋白(SEQ ID NO：20)与CMV-Ntt830外壳蛋白(SEQ ID NO：6)的偶联。通过两步程序将mIL-17蛋白共价缀合至CMV-Ntt830。第一，使CMV-Ntt830VLP(2mg/ml在50mM NaH2PO4，10％甘油中，pH 7.4)与等摩尔量的异双官能化学交联剂琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺)己酸酯(SMPH)在RT下反应60min。通过利用相同缓冲液(50mMNaH2PO4，10％甘油，pH 7.4)，用PD-10脱盐柱凝胶过滤，去除未反应的交联剂。在缀合步骤前，将纯化的mIL-17蛋白与10倍过量的盐酸三(2-羧基乙基)膦(TCEP-HCl)一起在RT下温育5min，以还原接头中的任何半胱氨酸残基。然后，通过使等摩尔量的mIL-17蛋白和VLP在RT下反应3h，使mIL-17蛋白共价连接至衍生化的VLP。通过SDS-PAGE，然后考马斯染色和用抗His抗体免疫印记，分析疫苗。通过密度测定法确定相应于偶联反应不同组分的考马斯蓝染色带强度，并用于计算偶联效率。单体的衍生化的CMV-Ntt830作为离散的28kDa带迁移，而CMV-Ntt830-mIL-17缀合物以45kDa(28kDa CMV-Ntt830单体+17kDa mIL-17蛋白)迁移。通过SDS-PAGE和考马斯染色的分析显示相对于CMV-Ntt830外壳蛋白分子量增加的若干带，表明IL-17蛋白质与CMV-Ntt830VLP成功交联。偶联效率定义为偶联至mIL-17的CMV-Ntt830单体(45kDa带)与总CMV-Ntt830单体(28和45kDa带之和)的摩尔比。确定偶联效率为至少15.3％，等同于每6.5分子CMV-Ntt830有一分子mIL-17。以这种方式计算的偶联效率是偶联程度的最低估测值，因为其没有考虑偶联至多于一个mIL-17分子的CMV-Ntt830单体。因此，目标蛋白如IL-17A可有效偶联至CMV-Ntt830VLPs。
对小鼠用偶联至CMV-Ntt830VLP的小鼠IL17A蛋白免疫
将3只雌性BALB/c小鼠的小组用偶联至小鼠IL17A蛋白的CMV-Ntt830外壳蛋白免疫。将20μg的总蛋白质在PBS，pH 7.4中稀释至150μl，并在第0天、第14天静脉内注射。将小鼠在第0天(免疫前)、第7天、第14天、第21天和第34天放血，并利用小鼠IL17A特异性ELISA分析血清。
ELISA
用1μg/ml浓度的小鼠IL17A涂覆ELISA板。将板阻断，然后从第0、4、14、21和34天与连续稀释的小鼠血清温育。利用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。计算小鼠血清的抗体滴定度，即450nm下导致半最大光密度的那些稀释液的平均值。偶联至IL17A的CMV-Ntt830VLP免疫的小鼠显示针对IL17蛋白的强免疫应答(图10)。
中和抗体的检测
测试如上所述用偶联至CMV-Ntt830的小鼠IL17免疫的小鼠的血清其抑制小鼠IL17A蛋白质与IL-17受体结合的能力。因此用1μg/ml浓度的小鼠IL-17受体A蛋白涂覆ELISA板。将第35天小鼠的小鼠血清连续稀释液与10ng/ml生物素基化的小鼠IL-17A预温育1小时，然后添加至IL-17受体A涂覆板。利用缀合至抗生蛋白链菌素的辣根过氧化物酶检测IL 17与涂覆受体的结合。计算中和抗体滴定度，即在450nm下导致半最大光密度的那些血清稀释液的平均值。
CMV-Ntt830-mIL17A缓解多发性硬化症小鼠模型的实验性自身免疫脑炎的效力
对雌性SJL小鼠如上所述免疫，并在最后一次免疫后一周皮下注射100μg与完全弗氏佐剂混合的PLP肽。同一天，对全部小鼠腹膜内注射400ng百日咳菌毒素。在每日基础上，按照下列方案对小鼠进行神经系统症状产生的评分：0，无临床疾病；0.5，尾巴末端无力；1，尾巴完全无力；1.5，尾巴无力和后肢虚弱(步态不稳和后腿握力弱)；2，单侧部分后肢瘫痪；2.5，双侧部分后肢瘫痪；3，完全双侧后肢瘫痪；3.5，完全双侧后肢瘫痪和单侧前肢瘫痪；4，后肢和前肢全部瘫痪。如上所述评估用CMV-Ntt830-mIL17A或CMV-Ntt830免疫的小鼠的平均临床评分。与CMV-Ntt830免疫的小鼠相比，CMV-Ntt830-mIL 17A-免疫的小鼠显示在第53和61天之间临床症状显著减少。这证明通过免疫CMV-Ntt830-mIL17A而生成的抗IL-17抗体能够改善多发性硬化症小鼠模型的临床症状。
实施例11
小鼠IL-5与CMV-Ntt830的偶联和免疫应答的诱导
如述(Zou Y等，疫苗28(2010)3192–3200)表达和纯化IL-5。mIL-5(SEQ ID NO：23)与具有SEQ ID NO：6的修饰CP VLP CMV-Ntt830的偶联如下进行。为偶联至IL-5，首先将CMV-Ntt830VLP用30倍过量的异双官能化学交联剂琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺)己酸酯(SMPH)衍生化。通过相对于PBS透析去除未结合的SMPH。将rIL-5用PBS(pH 8.0)中等摩尔量的盐酸三(2-羧基乙基)膦(TCEP)还原1h。将还原的rIL-5(80μM)在22℃下与40μM的SMPH衍生化CMV-Ntt830一起温育4h。将反应相对于PBS pH8.0透析12h。
对小鼠用偶联至CMV-Ntt830修饰外壳蛋白的VLP的IL-5衍生肽免疫
将四只雌性Balb/c小鼠的小组免疫通过SMPH偶联至IL-5(SEQ ID NO：23)的CMV-Ntt830VLP。将50μg总蛋白质在20mM HEPES，50mM NaCl，pH 7.3中稀释至200μl，并在第0天和第14天皮下注射(100μl，在两腹侧)。将小鼠在第0天(免疫前)、第14天、和第21天放血，并利用IL-5和CMV-Ntt830特异性ELISA分析血清。
ELISA
用10μg/ml浓度的IL-5或2μg/ml浓度的CMV-Ntt830VLP涂覆ELISA板。将板阻断，然后与连续稀释的小鼠血清温育。用酶标记的抗小鼠IgG检测结合的抗体。作为对照，还测试相同小鼠的免疫前血清(数据未显示)。所有小鼠均针对该肽以及CMV-Ntt830做出明确并且强烈的IgG应答。
过敏性气道炎症的OVA系模型
为诱导过敏性气道炎症，将雌性BALB/c小鼠(每组5只)注射(i.p.)以与2mg明矾(氢氧化铝凝胶佐剂，Brenntag Biosector，丹麦)混合的10μg OVA(V级，Sigma–Aldrich)。10天后，通过鼻内给药对小鼠每日挑战100μg OVA 4天。最后一次条获赠后24小时，对BAL和肺进行组织学分析。i.p.注射OVA和明矾但没有鼻内挑战OVA的小鼠在这些实验中充当疾病诱导的阴性对照。
利用该模型，对小鼠(d-0、d-14)用100μg CMV-Ntt830VLP或偶联至IL-5的CMV-Ntt830VLP免疫两次。将小鼠在第21天用OVA致敏，并在第31天鼻内挑战OVA。IL-5免疫的小鼠具有急剧减少的嗜酸性细胞计数的支气管肺泡液。
实施例12
M2肽与CMV-Ntt830病毒样颗粒的偶联
使2ml的1mg/ml具有SEQ ID NO：6的修饰CP的CMV-Ntt830VLP在PBS/10％甘油pH7.2中的溶液与42.6μl的SMPH溶液(150mM，在DMSO中)在室温下反应60min。将反应溶液在4℃下经12和4小时相对于两次2 1更换的20mM HEPES/10％甘油pH 7.2透析。将0.6ml衍生化和透析的CMV-Ntt830溶液与21.45μl的10mM流感肽M2(SEQ ID NO：24)的DMSO溶液混合，并在室温下温育4h以化学交联，产生CMV-Ntt830-M2缀合体疫苗。通过相对于20mM HEPES/10％甘油pH 7.2透析12h和4h，去除未偶联的肽。在还原条件下在12％Bis-Tris-聚丙烯酰胺凝胶上分析偶联产物。可见相对于CMV-Ntt830衣壳单体分子量增加的若干带，清楚证明流感M2肽与CMV-Ntt830衣壳成功交联。
对小鼠用偶联至CMV-Ntt830衣壳的M2肽免疫
(CMV-Ntt830-M2)
将每组四只雌性Balb/c小鼠免疫40μg在200μl PBS中配制的CMV-Ntt830-M2疫苗，并在第0天和第20天皮下注射。将小鼠在第34天放血，并利用M2特异性和CMV-Ntt830特异性ELISA分析血清。
通过ELISA检测抗M2抗体
用10μg/ml浓度的M2肽(SEQ ID NO：24)或10μg/ml浓度的CMV-Ntt830病毒样颗粒涂覆ELISA板。将板阻断，然后与连续稀释的小鼠血清温育。用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。小鼠血清的抗体滴定度定义为导致饱和时测量OD的50％(OD50)的稀释度(dilutions)的倒数。小鼠第34天的平均抗M2抗体滴定度和抗CMV-Ntt830滴定度>1：10000。该数据证明，M2肽与CMV-Ntt830衣壳的偶联强烈增强M2肽的免疫原性，而单独M2肽不具有免疫原性。
测试流感感染小鼠模型中CMV-Ntt830-M2免疫的效力。对小鼠用致死剂量的小鼠适应的流感A/PR/8/34病毒的4xLD50挑战。将该病毒在PBS中稀释，并在经异呋喃轻麻醉下经鼻给予(2x 50μl)。将流失多于30％体重或显示体温等于或低于30℃的小鼠处以安乐死。两组小鼠的存活率如下：用CMV-Ntt830–M2免疫的小鼠全部存活，而用CMV-Ntt830单独免疫的小鼠全部死亡。结果证明，小鼠的偶联至CMV-Ntt830的M2肽的免疫诱导了M2特异性抗体，其保护小鼠免于流感A/PR/8/34病毒的致死性感染。
实施例13
Aβ1-6肽与CMV-Ntt830病毒样颗粒的偶联
使2ml的1mg/ml具有SEQ ID NO：6的修饰CP CMV-Ntt830VLP在PBS/10％甘油pH7.2中的溶液与42.6μl SMPH溶液(150mM，在DMSO中)在室温下反应60min。将反应溶液在4℃下经12和4小时相对于两次2 1更换的20mM HEPES/10％甘油pH 7.2透析。将0.6ml衍生化和透析的CMV-Ntt830溶液与21.45μl的Aβ1-6(SEQ ID NO：25)的10mM DMSO溶液混合，并在室温下温育4h以化学交联，产生CMV-Ntt830-Aβ1-6缀合体疫苗。通过相对于20mM HEPES/10％甘油pH 7.2透析12h和4h，去除未偶联的肽。在还原条件下在12％Bis-Tris-聚丙烯酰胺凝胶上分析偶联产物。可见相对于CMV-Ntt830衣壳单体分子量增加的若干带，清楚证明成功交联Aβ1-6肽CMV-Ntt830。
对小鼠用偶联至CMV-Ntt830衣壳的Aβ1-6肽免疫
(CMV-Ntt830-Aβ1-6)
将每组四只雌性Balb/c小鼠用在200μl PBS中配制的40μg CMV-tt830-Aβ1-6疫苗免疫，并在第0天和第20天皮下注射。将小鼠在第34天放血，并利用Aβ1-6特异性和CMV-Ntt830特异性ELISA分析血清。
通过ELISA检测抗Aβ1-6抗体
用10μg/ml浓度的偶联至RNA酶的Aβ1-6或2μg/ml浓度的CMV-Ntt830病毒样颗粒涂覆ELISA板。将板阻断，然后与连续稀释的小鼠血清温育。用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。小鼠血清的抗体滴定度定义为导致饱和时测量OD的50％(OD50)的稀释度的倒数。小鼠第34天的平均抗Aβ1-6抗体滴定度和抗CMV-Ntt830滴定度为>1：10000。该数据证明，Aβ1-6肽与CMV-Ntt830衣壳的偶联强烈增强Aβ1-6肽的免疫原性，而单独Aβ1-6肽不具有免疫原性。将人阿尔茨海默症患者的脑切片用小鼠血清染色，血小板变得清楚可见。
实施例14
Fel d 1融合蛋白的克隆
通过寡核苷酸定向基因合成生成Fel d1融合蛋白(命名为F12H6GGC)，其由通过15个氨基酸的序列(GGGGS)3(SEQ ID NO：47)融合至Fel d1的链2的N端的Fel d1的链1组成并且包括融合至Fel d1的链2的C端的HHHHHHGGC序列(SEQ ID NO：48)。相应的寡核苷酸序列具有SEQ ID NO：49的序列，其中F12H6GGC的蛋白质序列具有SEQ ID NO：50的序列：
meicpavkrdvdlfltgtpdeyveqvaqykalpvvlenarilkncvdakmteedkenalsvldkiytsplcggggsggggsggggsvkmaetcpifydvffavangnellldlsltkvnatepertamkkiqdcyvenglisrvldglvmttissskdcmgeavqntvedlklntlgrhhhhhhggc。
在基因合成后，将其从其辅助质粒切除，并在框中亚克隆到质粒pET42a(+)(Novagen，USA)的NdeI/XhoI位点，产生表达载体pET42-F12H6GGC。
利用质粒pET42-F12H6GGC作为模板，通过PCR诱变生成无6组氨酸序列的Fel d1融合蛋白(命名为F12GGC)。生成这些融合蛋白的PCR中使用的寡核苷酸引物是：
关于F12GGC，正向引物是Fel_BglF(SEQ ID NO：51)，并且反向引物是Feld-dHR(SEQ ID NO：53)。
将所有PCR产物经限制酶BglII/XhoI切割，并在相同切除位点亚克隆回载体pET42-F126HGGC。在分离质粒DNA后，利用BigDye循环测序试剂盒和ABI Prism 3100基因分析仪(Applied Biosystems，Carlsbad，USA)确认引入的变化。所得表达载体被命名为pET42-F12GGC。其相应地编码Fel d1融合蛋白F12GGC(SEQ ID NO：56)。
meicpavkrdvdlfltgtpdeyveqvaqykalpvvlenarilkncvdakmteedkenalsvldkiytsplcggggsggggsggggsvkmaetcpifydvffavangnellldlsltkvnatepertamkkiqdcyvenglisrvldglvmttissskdcmgeavqntvedlklntlgrggc(SEQ ID NO：56)
6组氨酸序列能够通过金属螯合物亲和色谱纯化，并且包括GGC或GGCG(SEQ IDNO：58)的C端序列能够将Fel d1融合蛋白偶联至CMV-Ntt830和CMV-Npadr。
实施例15
Fel d 1融合蛋白的表达和纯化。
Fel d1融合蛋白在大肠杆菌中的表达。将Fel d1表达载体pET42-F12H6GGC和pET42-F12GGC转化到大肠杆菌C2566细胞(New England Biolabs，Ipswich，USA)中。选择表达最高水平目标蛋白质的克隆，并用于进一步实验。各种重组Fel d1融合蛋白的表达以如下方式进行。使具有表达质粒的大肠杆菌的培养物在30℃下、在旋转振荡器(200rev/min；Infors，Bottmingen，瑞士)上、在包含卡那霉素(25mg/l)的2xTY培养基中生长至OD600为0.8–1.0。然后通过添加0.2mM IPTG诱导Fel d1融合蛋白基因的表达。对培养基补充5mMMgCl2。温育在20℃下在旋转振荡器上持续18h。通过低速离心收集所得生物质，并在-20℃下冷冻，直到纯化。
6组氨酸标记的Fel d1融合蛋白的纯化。关于F12H6GGC融合蛋白的纯化，按照生产商的说明书使用USB PrepEase试剂盒(Affymetrix，High Wycombe，UK)。在冰上解冻后，将来自100ml培养物(约0.75g)的大肠杆菌细胞悬浮于包含5mM DTT的1x LEW缓冲液中，然后通过声波处理裂解。通过离心(13,000rpm，30min，5℃)去除不溶性蛋白和细胞碎片。将净化的溶解产物施加于Ni-IDA柱，用相同缓冲液(无DTT)洗涤两次，并用2x 1.5ml包含1x E缓冲液的咪唑洗脱。通过SDS/PAGE(图11A)鉴定包含Fel d1的部分，并相对于200体积的缓冲液(20mM磷酸钠，2mM EDTA，pH 7.0)透析两次。透析后，按照生产商的说明书(Invitrogen，Eugene，USA)利用QuBit荧光计或通过280nm下的UV分光光度测量估测蛋白质浓度。通过质谱分析(图11B)和通过利用抗His-tag抗体(Novagen，Cat.No。71840-3；数据未显示)的蛋白质印迹确认纯化蛋白的同一性。
无6组氨酸标记的Fel d1融合蛋白的纯化。关于F12GGC融合蛋白的纯化，采用阴离子交换和疏水相互作用层析。在20ml溶解缓冲液LB(20mM Tris/HCl pH 8.0、50mM NaCl、5mM DTT)中通过声波处理裂解3克IPTG诱导的大肠杆菌。声波处理后，将溶液在15000g下离心15min，并收集上清液。添加硫酸铵，伴以恒定搅拌，直到达到30％饱和，然后在RT下温育5min。离心后，添加固体硫酸铵至回收的上清液，直到50％饱和。离心后，将蛋白质沉淀收集并溶解于2ml LB，并利用以LB平衡的5ml HiTrapTM脱盐柱(GE Healthcare Life Sciences)去除过量盐。将脱盐蛋白洗脱物加载到以LB平衡的1ml HiTrapTMCaptoTM DEAE柱上。利用递增NaCl梯度洗脱结合的F12GGC。收集和合并包含Fel d1融合蛋白的部分。将所得溶液用4体积的20mM Tris/HCl pH 8.0、5mM DTT稀释，并加载到LB中的MonoQ 5/50GL柱，并利用递增NaCl梯度洗脱。收集和合并包含Fel d1融合蛋白的部分。添加5M NaCl直到达到2.5M浓度，并将DTT添加至溶液以维持5mM的浓度。然后将含Fel d1溶液加载到2.5M NaCl、5mM DTT中的1ml HiTrapTM Butyl HP柱上，并利用连续递减的NaCl浓度洗脱。收集和合并包含Fel d1融合蛋白的部分。通过考马斯染色SDS/PAGE凝胶(图11C)监测所有纯化步骤。利用针对重组Fel d1产生的多克隆抗体，通过蛋白质印迹，确认纯化蛋白的同一性(数据未显示)。
实施例16
重组Fel d1融合蛋白的真实性
Fel d1融合蛋白相似地被Fel d1特异性单克隆抗体识别。利用Indoorbiotechnologies(Cardiff，UK)的夹心ELISA Fel d1ELISA试剂盒(6F9/3E4)，比较Fel d1融合蛋白F12H6GGC和天然Fel d1(nFel d1)与Fel d1-特异性单克隆抗体(mAb)的结合。为此，在4℃下用抗Fel d1mAb 6F9(1微克/ml)涂覆Nunc ELISA板过夜。将板用包含0.05％吐温20的PBS(PBST)洗涤，并在室温(RT)下用Superblock(Invitrogen)阻断2h。将天然Fel d1以及F12H6GGC(1μg/ml)连续1：3稀释，并在RT下温育2h。将板用PBST洗涤，并添加生物素基化的抗Fel d1mAb 3E4(1μg/ml)，并在RT下温育1h。检测使用缀合至辣根过氧化物酶(HRPO)的抗生蛋白链菌素。为此，将板用PBST洗涤，然后在RT下将抗生蛋白链菌素-过氧化物酶(Sigma，1：1000稀释)添加至板30min。利用OPD底物溶液和5％H2SO4作为终止液进行检测。利用ELISA读取器(BioRad)测量450nm下的吸光度。
天然Fel d1和F12H6GGC在ELISA中给出相似的滴定度，这证明其被Fel d1特异性mAbs相似地识别，因此确认了重组Fel d1F12H6GGC的真实性(图12)。
重组Fel d1融合蛋白活化猫过敏患者的全血中的嗜碱细胞。猫过敏患者的血液包含嗜碱细胞，该嗜碱细胞在其表面上携带Fel d1特异性IgE抗体，该Fel d1特异性IgE抗体在过敏原暴露后使FcεRI交联并引起脱粒(degranulation)。为考察重组Fel d1引起脱粒的能力，收集Fel d1过敏患者的全血，并与重组Fel d1融合蛋白F12H6GGC组合用于BühlmannLaboratories的嗜碱细胞活化测试试剂盒(FlowFK CCR)中。此试验测量CCR3+嗜碱细胞上专有脱粒标记物CD63的上调。简而言之，将100μl刺激缓冲液与50μl EDTA处理的全血混合。另外，添加天然Fel d1或重组Fel d1融合蛋白F12H6GGC的50μl各种稀释液。试验中还测试包括抗FcεRI的mAb以及非特异性细胞活化剂(fMLP)的阳性对照溶液。添加包含标记到PE的抗CCR3Ab和标记到FITC的抗CD63Ab的染色染料(20μl/样本)，并在37℃下温育25min。随后通过添加溶解缓冲液溶解红细胞。10min温育后，将样本在500x g下离心5min，并用洗涤缓冲液(包含2％FCS的PBS)洗涤。在第二离心步骤后，将细胞沉淀悬浮于200μl洗涤缓冲液中，并利用流式细胞仪(FACS Calibur)获得。利用Cell Quest Pro软件分析样本。分析CCR3+嗜碱细胞上的CD63表达的百分比。
发现重组Fel d1融合蛋白容易引发猫过敏患者的嗜碱细胞脱粒。此外，与天然Feld1相比时，实现了相似脱粒水平，因此证明重组生成的Fel d1融合蛋白的真实性。(图13A/图13B)。
实施例17
Fel d1融合蛋白与CMV-Ntt830和CMV-VLP的偶联
以如下方式，利用异双官能化学交联剂琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺丙酰胺)己酸酯](SMPH)，将Fel d1融合蛋白F12H6GGC共价连接至CMV-Ntt830和CMV-Npadr VLP。
利用PD10柱(GE Healthcare)，对储存在5mM硼酸钠、2mM EDTA缓冲液、pH 9.0中的CMV-Ntt830和CMV-Npadr病毒样颗粒以包含30％蔗糖和2mM EDTA的20mM磷酸钠进行缓冲液更换。使CMV-Npadr或CMV-Ntt830VLP溶液与7.5x摩尔过量的异双官能交联剂SMPH在RT下反应60min。在包含30％蔗糖和2mM EDTA的20mM磷酸钠中利用PD10柱去除未反应的SMPH。
用10x摩尔过量的TCEP(Thermo Fisher)处理Fel d1融合蛋白F12H6GGC。使衍生化的CMV-Ntt830和CMV-Npadr-VLP与1x或2x摩尔过量的重组Fel d1融合蛋白F12H6GGC在23℃下反应3h。通过还原考马斯蓝染色的SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris凝胶)分析偶联反应。在化学缀合反应后质量约44.5kDa和69kDa的蛋白质带显著(数据未显示)。这些带相应于与Fel d1融合蛋白F12H6GGC(20kDa)共价连接的CMV外壳蛋白(24.5kDa)和与一个Fel d1融合蛋白F12H6GGC共价连接的两个CMV外壳蛋白分子(49kDa)，分别表明Fel d1-CMVVLP形成。
实施例18
小鼠中对Fel d1-CMV VLP的免疫应答
将三只雌性Balb/c小鼠的小组免疫如实施例10所述制备的Fel d1-CMV-Ntt830-VLP或只是与Fel d1融合蛋白F12H6GGC混合的CMV-Ntt830-VLP。两种组合物均包含等量的Fel d1融合蛋白。10μg各组合物在150mM PBS，pH 7.4中制备，并在第0天和第14天以150μl体积被静脉内注射。将小鼠在第0天(免疫前)、第14天和第21天放血，并针对天然Fel d1特异性IgG-抗体通过ELISA分析血清。
在4℃下用PBS中1μg/ml浓度的的天然Fel d1(Indoor Biotechnologies)涂覆NUNC ELISA板过夜。将板用Superblock(Invitrogen)阻断。进行血清的连续稀释，以检测OD50。OD50描述达到最大OD值一半的稀释的倒数。利用直接标记到至辣根过氧化物酶(HRPO)(Jackson)的抗小鼠IgG抗体检测Fel d1的特异性IgG抗体。以450nm的颜色反应测量通过HRPO进行的邻苯二胺二盐酸盐(OPD)转化，该颜色反应通过在7分钟温育后添加5％硫酸(H2SO4)而终止。
仅仅在单次免疫后，检测小鼠的Fel d1特异性IgG抗体(在第14天)。通过第二次注射增强应答。与混合组合物相比，Fel d1-CMV VLP显著增加Fel d1特异性IgG抗体的诱导，证明了Fel d1融合蛋白与VLP的化学缀合的免疫增强效果(图14)。
实施例19
人IL-1β与CMV-Ntt830和CMV-VLP的偶联
以如下方式，利用异双官能化学交联剂琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺丙酰胺)己酸酯](SMPH)，将人IL-1β成熟蛋白(SEQ ID NO：60)共价连接至CMV-Ntt830和CMV-NpadrVLP。
利用PD10柱(GE Healthcare)，对储存在5mM硼酸钠、2mM EDTA缓冲液、pH 9.0中的CMV-Ntt830和CMV-Npadr病毒样颗粒以包含30％蔗糖和2mM EDTA的20mM磷酸钠进行缓冲液更换。使CMV-Npadr或CMV-Ntt830VLP溶液与7.5x摩尔过量的异双官能交联剂SMPH在RT下反应60min。利用PD10柱在包含30％蔗糖和2mM EDTA的20mM磷酸钠中去除未反应的SMPH。
用5x摩尔过量TCEP(Thermo Fisher)处理IL-1β蛋白。使衍生化的CMV-Ntt830和CMV-Npadr-VLP与1x或2x摩尔过量的人IL1β在23℃下反应3h。通过还原考马斯蓝染色的SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris凝胶)分析偶联反应。在化学缀合反应后质量约41.5kDa和66kDa的蛋白质带显著(数据未显示)。这些带相应于与IL1β蛋白(17kDa)共价连接的CMV外壳蛋白(24.5kDa)和与一个IL1β蛋白共价连接的两个CMV外壳蛋白分子(49kDa)，分别表明IL1β-CMV VLP形成。
实施例20
犬IL-5与CMV-Ntt830的偶联和免疫应答的诱导
修饰犬IL-5(cIL-5)(SEQ ID NO：61)以包含自由Cys，如Zou Y等，Vaccine 28(2010)3192–3200中关于小鼠IL-5所述类似地表达。如此修饰的cIL-5与VLP CMV-Ntt830的偶联如下进行。为偶联至cIL-5，首先将CMV-Ntt830VLP用30倍过量的异双官能化学交联剂琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺)己酸酯(SMPH)衍生化。通过相对于PBS透析，去除未结合的SMPH。将cIL-5用PBS(pH8.0)中等摩尔量的盐酸三(2-羧基乙基)膦(TCEP)还原1h。将还原的cIL-5(80μM)与40μM的SMPH衍生化CMV-Ntt830一起在22℃下温育4h。将反应相对于PBS pH 8.0透析12h。
对犬用偶联至CMV-Ntt830的VLP的cIL-5免疫
将四只雌性远系繁殖犬的小组免疫如上所述通过SMPH偶联至cIL-5的CMV-Ntt830VLP。50μg组合物在20mM HEPES，50mM NaCl，pH 7.3中稀释至500μl，并在第0天和第14天被皮下注射。将犬在第0天(免疫前)、第14天、和第21天放血，并利用cIL-5和CMV-Ntt830特异性ELISA分析血清。
ELISA
用10μg/ml浓度的cIL-5或2μg/ml浓度的CMV-Ntt830VLP涂覆ELISA板。将板阻断，然后与连续稀释的小鼠血清温育。利用酶标记的抗犬IgG检测结合的抗体。作为对照，还测试相同犬的免疫前血清(数据未显示)。所有犬均针对cIL-5以及CMV-Ntt830做出明确和强烈的IgG应答。
实施例21
犬IL-4与CMV-Ntt830的偶联和免疫应答的诱导
修饰犬IL-4(cIL-4)(SEQ ID NO：62)以包含自由的Cys，如Zou Y等，Vaccine 28(2010)3192–3200中关于小鼠IL-5所述类似地表达。如此修饰的cIL-4与VLP CMV-Ntt830的偶联如下进行。为偶联至cIL-4，首先将CMV-Ntt830VLP用30倍过量的异双官能化学交联剂琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺)己酸酯(SMPH)衍生化。通过相对于PBS透析，去除未结合的SMPH。将cIL-4用PBS(pH8.0)中等摩尔量的盐酸三(2-羧基乙基)膦(TCEP)还原1h。将还原的cIL-4(80μM)与40μM的SMPH衍生化CMV-Ntt830一起在22℃下温育4h。将反应相对于PBS pH 8.0透析12h。
对犬用偶联至CMV-Ntt830的VLP的cIL-4免疫
将四只雌性远系繁殖犬的小组免疫如上所述通过SMPH偶联至cIL-4的CMV-Ntt830VLP。50μg组合物在20mM HEPES，50mM NaCl，pH 7.3中稀释至500μl，并在第0天和第14天被皮下注射。将犬在第0天(免疫前)、第14天、和第21天放血，并利用cIL-4和CMV-Ntt830特异性ELISA分析血清。
ELISA
用10μg/ml浓度的cIL-4或2μg/ml浓度的CMV-Ntt830VLP涂覆ELISA板。将板阻断，然后与连续稀释的犬血清温育。利用酶标记的抗犬IgG检测结合的抗体。作为对照，还测试相同犬的免疫前血清(数据未显示)。所有犬均针对cIL-4以及CMV-Ntt830做出明确和强烈的IgG应答。
实施例22
犬IL-13与CMV-Ntt830的偶联和免疫应答的诱导
修饰犬IL-13(cIL-13)(SEQ ID NO：63)以包含自由的Cys，并且如Zou Y等，Vaccine 28(2010)3192–3200中关于小鼠IL-5所述类似地表达。如此修饰的cIL-13与VLPCMV-Ntt830的偶联如下进行。为偶联至cIL-13，首先将CMV-Ntt830VLP用30倍过量的异双官能化学交联剂琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺)己酸酯(SMPH)衍生化。通过相对于PBS透析，去除未结合的SMPH。将cIL-13用PBS(pH 8.0)中等摩尔量的盐酸三(2-羧基乙基)膦(TCEP)还原1h。将还原的cIL-13(80μM)与40μM的SMPH衍生化CMV-Ntt830一起在22℃下温育4h。将反应相对于PBS pH 8.0透析12h。
对犬用偶联至CMV-Ntt830的VLP的cIL-13免疫
将四只雌性远系繁殖犬的小组免疫如上所述通过SMPH偶联至cIL-13的CMV-Ntt830VLP。50μg组合物在20mM HEPES，50mM NaCl，pH 7.3中稀释至500μl，并在第0天和第113天被皮下注射。将犬在第0天(免疫前)、第14天、和第21天放血，并利用cIL-13和CMV-Ntt830特异性ELISA分析血清。
ELISA
用10μg/ml浓度的cIL-13或2μg/ml浓度的CMV-Ntt830VLP涂覆ELISA板。将板阻断，然后与连续稀释的犬血清温育。利用酶标记的抗犬IgG检测结合的抗体。作为对照，还测试相同犬的免疫前血清(数据未显示)。所有犬均针对cIL-13以及CMV-Ntt830做出明确和强烈的IgG应答。
实施例23
人IL-31与CMV-Ntt830的偶联和免疫应答的诱导
修饰人IL-31(hIL-31)(SEQ ID NO：43)以包含自由的Cys，并且如Zou Y等，Vaccine 28(2010)3192–3200中关于小鼠IL-5所述类似地表达。如此修饰的hIL-31与VLPCMV-Ntt830的偶联如下进行。为偶联至hIL-31，首先将CMV-Ntt830VLP用30倍过量的异双官能化学交联剂琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺)己酸酯(SMPH)衍生化。通过相对于PBS透析，去除未结合的SMPH。将hIL-31用PBS(pH 8.0)中等摩尔量的盐酸三(2-羧基乙基)膦(TCEP)还原1h。将还原的hIL-31(80μM)与40μM的SMPH衍生化CMV-Ntt830一起在22℃下温育4h。将反应相对于PBS pH 8.0透析12h。
对小鼠用偶联至CMV-Ntt830的VLP的hIL-31免疫
将四只雌性BALB/c小鼠的小组免疫如上所述通过SMPH偶联至IL-31的CMV-Ntt830VLP。50μg组合物在20mM HEPES，50mM NaCl，pH 7.3中稀释至500μl，并在第0天和第113天被皮下注射。将犬在第0天(免疫前)、第14天、和第21天放血，并利用hIL-31和CMV-Ntt830特异性ELISA分析血清。
ELISA
用10μg/ml浓度的hIL-31或2μg/ml浓度的CMV-Ntt830VLP涂覆ELISA板。将板阻断，然后与连续稀释的小鼠血清温育。利用酶标记的抗小鼠IgG检测结合的抗体。作为对照，还测试相同小鼠的免疫前血清(数据未显示)。所有小鼠均针对hIL-31以及CMV-Ntt830做出明确和强烈的IgG应答。

Claims (78)

1.黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰病毒样颗粒(VLP)，其中所述CMV的修饰VLP包括至少一种修饰CMV多肽，主要由至少一种修饰CMV多肽组成，或可选地由至少一种修饰CMV多肽组成，其中所述修饰CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：
(a)CMV多肽，和
(b)T辅助细胞表位；并且
其中所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：
(i)CMV外壳蛋白的氨基酸序列；或
(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的所述氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述CMV外壳蛋白显示至少90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性。
2.根据权利要求1所述的CMV的修饰VLP，其中所述CMV多肽包括CMV外壳蛋白的氨基酸序列，优选由CMV外壳蛋白的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1所述的CMV的修饰VLP，其中所述CMV多肽包括突变的氨基酸序列，优选由突变的氨基酸序列组成，其中待要突变的所述氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述CMV外壳蛋白显示至少90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性。
4.根据权利要求3所述的CMV的修饰VLP，其中所述突变的氨基酸序列和所述待要突变的氨基酸测序的区别在于至少一个并且至多11、10、9、8、7、6、5、4、3、或2个氨基酸残基，并且其中优选地这些区别选自(i)插入、(ii)删除、(iii)氨基酸替换、和(iv)(i)至(iii)的任意组合。
5.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：
(i)(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ ID NO：1组成；或(b)与SEQ ID NO：1具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列；或
(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的所述氨基酸序列是本权利要求的(i)中所限定的所述氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待要突变的氨基酸序列显示至少95％，优选至少98％，和更优选至少99％的序列同一性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ ID NO：1组成；或(b)与SEQ ID NO：1具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
7.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：
(i)(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：21、或(b)包括氨基酸序列区域的CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO：21具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性；或
(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的所述氨基酸序列是本权利要求的(i)中所限定的所述氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待要突变的氨基酸序列显示至少95％，优选至少98％，和更优选至少99％的序列同一性。
8.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：21、或(b)包括氨基酸序列区域的CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列区域与SEQ IDNO：21具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性。
9.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成：
(i)(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQ ID NO：1组成；或(b)与SEQ ID NO：1具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列；和
其中本权利要求的(a)或(b)中所限定的所述氨基序列包括SEQ ID NO：21；或其中本权利要求的(a)或(b)中所限定的所述氨基序列包括氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO：21具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，再进一步优选至少90％，还更优选至少95％，还进一步优选至少98％，还再进一步更优选至少99％的序列同一性；或
(ii)突变的氨基酸序列，其中待要突变的所述氨基酸序列是本权利要求的(i)中所限定的所述氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待要突变的氨基酸序列显示至少98％，优选至少99％序列同一性。
10.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述CMV多肽包括下列、或优选由下列组成,
(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1、或优选由SEQID NO：1组成；或
(b)与SEQ ID NO：1具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；和
其中本权利要求的(a)或(b)中所限定的所述氨基序列包括SEQ ID NO：21；或
其中本权利要求的(a)或(b)中所限定的所述氨基序列包括氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO：21具有至少90％的序列同一性。
11.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域。
12.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述N端区域的氨基酸置换数量等于或低于组成所述T辅助细胞表位的氨基酸数量。
13.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述CMV多肽的所述置换的N端区域由5至15个连续氨基酸，优选9至14个连续氨基酸，更优选11至13个连续氨基酸组成。
14.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述CMV多肽的所述N端区域相应于SEQ ID NO：1的氨基酸2-12。
15.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述T辅助细胞表位是通用T辅助细胞表位。
16.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述T辅助细胞表位由至多20个氨基酸组成。
17.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述Th细胞表位是PADRE序列。
18.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述Th细胞表位包括SEQID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成。
19.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述T辅助细胞表位源自人疫苗。
20.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述Th细胞表位源自破伤风毒素。
21.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述Th细胞表位具有SEQID NO：4的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。
22.根据前述权利要求中任一项所述的CMV的修饰VLP，其中所述CMV多肽包括CMV外壳蛋白的氨基酸序列、或优选由CMV外壳蛋白的氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列、或优选由SEQ IDNO：1或与SEQ ID NO：1具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列组成；并且其中所述氨基序列包括SEQ ID NO：21，并且其中所述T辅助细胞表位置换所述CMV多肽的N端区域，并且其中所述CMV多肽的所述置换的N端区域由11至13个连续氨基酸，优选11个连续氨基酸组成，并且其中进一步优选地所述CMV多肽的所述N端区域相应于SEQ ID NO：1的氨基酸2-12。
23.根据权利要求1所述的CMV的修饰VLP，其中所述修饰CMV多肽包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成。
24.根据权利要求1所述的CMV的修饰VLP，其中所述修饰CMV多肽包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成。
25.组合物，其包括根据权利要求1至24中任一项所述的修饰病毒样颗粒。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述组合物包括：
(a)根据权利要求1至24中任一项所述的修饰病毒样颗粒，并且其中所述修饰病毒样颗粒包括至少一个第一附着位点；和
(b)至少一种抗原，其中所述抗原包括至少一个第二附着位点；
其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述第一附着位点和所述第二附着位点通过至少一个共价肽键连接。
28.根据权利要求26所述的组合物，其中所述第一附着位点和所述第二附着位点通过至少一个共价非肽键连接。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的组合物，其中所述第一附着位点是氨基，优选赖氨酸残基的氨基。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的组合物，其中所述第二附着位点是巯基，优选半胱氨酸残基的巯基。
31.根据权利要求26至30中任一项所述的组合物，其中所述第一附着位点不是巯基。
32.根据权利要求26至31中任一项所述的组合物，其中仅一个所述第二附着位点与所述第一附着位点通过至少一个非肽共价键缔合，生成所述抗原与所述修饰病毒样颗粒的单一和一致类型的结合，其中与所述第一附着位点缔合的所述仅一个第二附着位点是巯基，并且其中所述抗原和所述修饰病毒样颗粒通过所述缔合相互作用，以形成有序且重复的抗原阵列。
33.根据权利要求26至32中任一项所述的组合物，其中所述第二附着位点是通过化学偶联附着的巯基。
34.根据权利要求26至33中任一项所述的组合物，进一步包括接头，其中所述接头将所述抗原与所述第二附着位点缔合，并且其中优选所述接头包括所述第二附着位点或可选地由所述第二附着位点组成。
35.根据权利要求25至34中任一项所述的组合物，进一步包括至少一种免疫刺激物，其中优选地所述免疫刺激物结合至所述病毒样，与所述病毒样混合或装配到所述病毒样中，并且其中优选地所述免疫刺激物装配到所述修饰病毒样颗粒中。
36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述免疫刺激物由非真核来源的DNA或RNA组成。
37.根据权利要求35或权利要求36所述的组合物，其中所述免疫刺激物是未甲基化的含CpG寡核苷酸，并且其中优选地所述未甲基化的含CpG寡核苷酸包括回文序列，并且其中进一步优选地所述未甲基化的含CpG寡核苷酸的CpG基序是部分回文序列，并且其中再进一步优选地所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO：31)。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述回文序列在其5'端侧接至少3个并且至多15个鸟苷实体，并且其中所述回文序列在其3'端侧接至少3个并且至多15个鸟苷实体。
39.根据权利要求26至38中任一项所述的组合物，其中所述抗原是肿瘤抗原、自体抗原、病原多肽、过敏原或半抗原。
40.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原是IL-17，并且其中优选地所述抗原包括SEQ ID NO：42、或优选由SEQ ID NO：42组成。
41.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原是IL-5，并且其中优选地所述抗原包括SEQ ID NO：41、或优选由SEQ ID NO：41组成。
42.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原是TNFα。
43.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原是IL-1α。
44.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原是IL-13，并且其中优选地所述抗原包括SEQ ID NO：46、或优选由SEQ ID NO：46组成。
45.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原是衍生自Aβ-1-42的肽。
46.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原是IgE、或IgE中包括的肽或结构域。
47.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原是α-突触核蛋白或衍生自α-突触核蛋白的肽，并且其中优选地所述肽由6至14个氨基酸组成，并且其中进一步优选地所述抗原是选自SEQ D NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34中任一种的衍生自α-突触核蛋白的肽。
48.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原是IL-4，并且其中优选地所述抗原包括SEQ ID NO：45、或优选由SEQ ID NO：45组成。
49.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原是GnRH。
50.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原是嗜酸细胞活化趋化因子。
51.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原是流感A病毒M2蛋白的胞外结构域、或其抗原片段。
52.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原是IL-31，其中优选地所述抗原包括SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44、或优选由SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44组成。
53.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原源自镰状疟原虫或间日疟原虫，或其中所述抗原源自RSV。
54.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原是猫过敏原Fel d1或重组Fel d1(rFel d1)，其中优选地所述抗原是重组Fel d1(rFel d1)。
55.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原包括SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18、或优选由SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18组成，并且其中优选地所述抗原包括SEQ ID NO：18、或优选由SEQ ID NO：18组成。
56.根据权利要求26至39中任一项所述的组合物，其中所述抗原是犬过敏原Cab f1或Can f2。
57.根据权利要求26至39中的一项所述的组合物，其中所述抗原是降钙素基因相关肽(CGRP)。
58.根据权利要求26至39中的一项所述的组合物，其中所述抗原是支链淀粉。
59.疫苗，其包括下列、或可选地由下列组成：根据权利要求1至24中任一项所述的修饰病毒样颗粒或根据权利要求25至58中任一项所述的组合物。
60.药物组合物，其包括：
(a)根据权利要求1至24中任一项所述的修饰病毒样颗粒，根据权利要求25至58中任一项所述的组合物、或根据权利要求59所述的疫苗；和
(b)药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
61.免疫方法，包括向动物或人给予根据权利要求1至24中任一项所述的修饰病毒样颗粒、根据权利要求25至58中任一项所述的组合物、根据权利要求59所述的疫苗、或根据权利要求60所述的药物组合物。
62.根据权利要求61所述的方法，其中向所述动物或所述人皮下、静脉内、皮内、鼻内、口服、结内或经皮给予所述修饰病毒样颗粒、病毒样颗粒、所述组合物、所述疫苗、或所述药物组合物。
63.用作药物的根据权利要求1至24中任一项所述的修饰病毒样颗粒、根据权利要求25至58中任一项所述的组合物、根据权利要求59所述的疫苗、或根据权利要求60所述的药物组合物，其作为药物应用。
64.根据权利要求1至24中任一项所述的修饰病毒样颗粒、根据权利要求25至58中任一项所述的组合物、根据权利要求59所述的疫苗、或根据权利要求60所述的药物组合物在制备用于治疗动物或人的疾病、障碍或状况的药物中的应用。
65.根据权利要求1至24中任一项所述的修饰病毒样颗粒、根据权利要求25至58中任一项所述的组合物、根据权利要求59所述的疫苗、或根据权利要求60所述的药物组合物，其用于动物或人的疾病、障碍或状况的治疗方法中。
66.根据权利要求40至44和48中任一项所述的组合物，其用于动物或人的炎性疾病的治疗方法中。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述炎性疾病选自RA、MS、牛皮癣、哮喘、克罗恩病、结肠炎、COPD、糖尿病、神经性皮炎(过敏性皮炎)。
68.根据权利要求45所述的组合物，其用于动物或人的阿尔茨海默病的治疗方法中。
69.根据权利要求46所述的组合物，其用于动物或人的过敏的治疗方法中。
70.根据权利要求47所述的组合物，其用于动物或人的帕金森病的治疗方法中。
71.根据权利要求49所述的组合物，其降低动物或人的睾酮水平。
72.根据权利要求51或权利要求52所述的组合物，其用于动物或人的流感A病毒感染的治疗或预防方法中。
73.根据权利要求53所述的组合物，其用于疟疾的预防或治疗方法中。
74.根据权利要求54所述的组合物，其用于RSV感染的预防或治疗方法中。
75.根据权利要求55所述的组合物，其用于人的猫过敏的预防或治疗方法中。
76.根据权利要求56所述的组合物，其用于人的犬过敏的预防或治疗方法中。
77.根据权利要求57所述的组合物，其用于动物或人的偏头痛的治疗方法中。
78.根据权利要求58所述的组合物，其用于动物或人的II型糖尿病的治疗方法中。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109562156A (zh) * 2016-04-27 2019-04-02 标杆动物健康有限公司 犬特应性皮炎的治疗
CN112724204A (zh) * 2020-12-15 2021-04-30 深圳赫兹生命科学技术有限公司 一种用于生产vlp重组疫苗的cmv病毒样颗粒及其制备方法
CN114437211A (zh) * 2022-01-26 2022-05-06 南京麦西崴克生物科技有限公司 基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017179025A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Alk-Abelló A/S Epitope polypeptides of ragweed pollen allergens
EP3448418A1 (en) * 2016-04-27 2019-03-06 Allergy Therapeutics (UK) Limited Treatment of peanut allergy
EP3592378A1 (en) 2017-03-07 2020-01-15 Universität Zürich Treatment of pruritus in horses
JP7250032B2 (ja) * 2017-12-11 2023-03-31 ユービーアイ アイピー ホールディングス アトピー性皮膚炎の治療及び／または予防のためのｉｌ－３１のペプチド免疫原ならびにその製剤
CA3093709C (en) * 2018-03-16 2024-03-26 Zoetis Services Llc Peptide vaccines against interleukin-31
AU2019278596A1 (en) 2018-05-28 2020-12-24 Evax Ag Treatment of urticaria
US20220073946A1 (en) * 2018-12-20 2022-03-10 Saiba AG Virus-like particles of cmv modified by fusion
MX2021008035A (es) * 2018-12-31 2021-12-10 United Neuroscience Ltd Inmunógenos peptídicos dirigidos al péptido relacionado con el gen de la calcitonina (cgrp) y sus formulaciones para la prevención y el tratamiento de la migraña.
WO2021083766A1 (en) 2019-10-29 2021-05-06 Evax Ag Treatment of pruritus in horses
WO2021108202A1 (en) * 2019-11-25 2021-06-03 The Regents Of The University Of California Modified viral therapeutics and uses thereof
WO2021260131A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 Saiba AG Virus-like particles of cmv modified by fusion
AU2021383841A1 (en) * 2020-11-23 2023-06-22 Scout Bio, Inc. Antigen-binding molecules and uses thereof
WO2023139103A1 (en) 2022-01-19 2023-07-27 Universität Bern Compositions of virus-like particles and microcrystalline tyrosine
WO2023161528A1 (en) 2022-02-28 2023-08-31 Tridem Bioscience Gmbh & Co Kg A CONJUGATE COMPRISING AT LEAST A ß-GLUCAN
WO2023161527A1 (en) 2022-02-28 2023-08-31 Tridem Bioscience Gmbh & Co Kg A CONJUGATE CONSISTING OF OR COMPRISING AT LEAST A ß-GLUCAN OR A MANNAN
WO2024047091A2 (en) 2022-08-30 2024-03-07 Saiba Animal Health Ag Veterinary compositions of modified virus-like particles of cmv and ngf antigens

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1311688A (zh) * 1998-06-20 2001-09-05 美国联合生物医学公司 用于促进畜牧场动物生长的合成的促生长素抑制素免疫原
WO2004052395A1 (en) * 2002-12-09 2004-06-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa L2-peptide of the human papillomavirus associated with virus-like particles
CN102943087A (zh) * 2012-11-26 2013-02-27 中国农业科学院上海兽医研究所 兔出血症病毒新型亚单位疫苗及其制备方法
WO2013030608A1 (en) * 2011-08-30 2013-03-07 Szent István Egyetem Nanoparticle-based veterinary vaccine

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1278542A2 (en) * 2000-05-05 2003-01-29 Cytos Biotechnology AG Molecular antigen arrays and vaccines
BR0213950A (pt) 2001-11-07 2004-08-24 Cytos Biotechnology Ag Arranjos de antìgenos para o tratamento de doenças eosinofólicas alérgicas
RU2319503C2 (ru) 2001-11-07 2008-03-20 Цитос Байотекнолоджи Аг Композиция для иммунизации (варианты), способ ее получения и применение для лечения аллергических эозинофильных заболеваний
AU2003237528A1 (en) 2002-06-07 2003-12-22 Kentucky Bioprocessing, Llc Flexible vaccine assembly and vaccine delivery platform
WO2005091753A2 (en) 2004-03-25 2005-10-06 Large Scale Biology Corporation Flexible vaccine assembly and vaccine delivery platform
JP2008513035A (ja) * 2004-09-21 2008-05-01 サイトス バイオテクノロジー アーゲー Ａｐ２０５のコートタンパク質と抗原性ポリペプチドとの融合タンパク質を含んでなるウイルス粒子
ES2424229T3 (es) * 2005-03-18 2013-09-30 Cytos Biotechnology Ag Proteínas de fusión de alérgenos de gato y utilización de las mismas
US20070184068A1 (en) * 2005-12-14 2007-08-09 Cytos Biotechnology Ag Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity
WO2015065322A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 Hitachi, Ltd. De-duplication and host based qos in tiered storage
JP6987744B2 (ja) * 2015-09-08 2022-01-05 ウニヴェルズィテート チューリッヒ 虫刺され過敏症の治療
RU2018105007A (ru) * 2015-09-08 2019-10-10 Университет Цюрих Композиции против аллергии на кошек

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1311688A (zh) * 1998-06-20 2001-09-05 美国联合生物医学公司 用于促进畜牧场动物生长的合成的促生长素抑制素免疫原
WO2004052395A1 (en) * 2002-12-09 2004-06-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa L2-peptide of the human papillomavirus associated with virus-like particles
WO2013030608A1 (en) * 2011-08-30 2013-03-07 Szent István Egyetem Nanoparticle-based veterinary vaccine
CN102943087A (zh) * 2012-11-26 2013-02-27 中国农业科学院上海兽医研究所 兔出血症病毒新型亚单位疫苗及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK登录号: AAQ82699.1: "coat protein [Cucumber mosaic virus]", 《GENBANK数据库》 *
JEMON K等: "An Enhanced Heterologous Virus-Like Particle for Human Papillomavirus Type 16 Tumour Immunotherapy", 《PLOS ONE》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109562156A (zh) * 2016-04-27 2019-04-02 标杆动物健康有限公司 犬特应性皮炎的治疗
CN109562156B (zh) * 2016-04-27 2023-03-10 标杆动物健康有限公司 犬特应性皮炎的治疗
CN112724204A (zh) * 2020-12-15 2021-04-30 深圳赫兹生命科学技术有限公司 一种用于生产vlp重组疫苗的cmv病毒样颗粒及其制备方法
CN112724204B (zh) * 2020-12-15 2023-12-19 深圳赫兹生命科学技术有限公司 一种用于生产vlp重组疫苗的cmv病毒样颗粒及其制备方法
CN114437211A (zh) * 2022-01-26 2022-05-06 南京麦西崴克生物科技有限公司 基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法
CN114437211B (zh) * 2022-01-26 2024-03-12 南京麦西崴克生物科技有限公司 基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法

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