CN114437211A - 基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法，猫过敏原Fel d1的氨基酸序列如SEQ ID.NO.1所示，方法包括以下步骤：将猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂混合得到混合物；将混合物颈部皮下注射给产蛋高峰期的蛋鸡，收集鸡蛋；鸡蛋的卵黄中富集有对猫过敏原Fel d1特异的卵黄抗体。将猫过敏原Fel d1，通过注射禽类，产生的的特异性抗体高效的富集在卵黄中，是一种非侵入性的方法，既减少和完善了动物的使用，又安全高效且经济实惠。
Description
技术领域
本发明涉及生物抗体技术领域，具体涉及一种基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法。
背景技术
接触来自其他物种的蛋白质，无论是通过空气传播还是通过食物或注射，都会导致人类的免疫反应，这可能导致过敏化，可能会诱发鼻炎甚至是危及生命的哮喘性炎症疾病。空气中来自家猫的过敏原是全世界最常见和最有力的过敏原因之一，而猫的主要过敏原Fel d1与90％以上的猫过敏患者会产生免疫反应。Fel d1产于皮脂腺、唾液、泪腺和肛腺，存在于唾液、眼泪、皮肤和皮毛中，它通过空气中的头皮屑从猫流到环境中。目前对于猫过敏有如下解决办法：建议移除家庭内所有可能含有过敏原或受污染的物件，例如枕头、毛毯、地毯、地毯等，以避免接触过敏原；建议做好环境清洁和使用空气加湿器和HEPA过滤器，也有助于缓解症状；建议移除产生过敏原的猫。然而，主人和他们的猫之间的联系往往十分紧密，以至于他们更有可能接受过敏对他们的健康的威胁，而不是放弃他们的宠物。另一种解决猫过敏问题的方法是降低猫科动物自身的Fel d1，这一方法不涉及猫与其主人的分离。可以采取的办法之一是让猫主动免疫，目的是在动物体内诱导抗fel d1抗体，但宠物每年都要忍受注射疫苗的痛苦且生产猫Fel d1疫苗成本高，效果不稳定。
如果可以从猫粮中加入从鸡蛋中提取的抗Fel d1 IgY，可使猫唾液和皮毛中的Fel d1活性降低。且从蛋黄中获得抗体是一种非侵入性的方法，不需要采血；而哺乳动物抗体的产生还包括对动物造成痛苦和痛苦的程序，故卵黄抗体的应用既减少和完善了动物的使用，又安全高效且经济实惠，为解决猫过敏这一难题提供了新的思路。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法，所述猫过敏原Fel d1的氨基酸序列如SEQ ID.NO.1所示，所述方法包括以下步骤：
S1、将猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂混合得到混合物；
S2、将所述混合物颈部皮下注射给产蛋高峰期的蛋鸡，收集鸡蛋；鸡蛋的卵黄中富集有对猫过敏原Fel d1特异的卵黄抗体。
上述的制备方法，进一步的，所述一次免疫佐剂为弗氏完全佐剂；或，氢氧化铝、CpG-ODN 和BSF-1按照质量比为1～3:2～4:4～7混合的混合物。
上述的制备方法，进一步的，每次疫苗注射的Fel d1重组蛋白的量为100～300μg/只。
上述的制备方法，进一步的，所述猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂按照体积比为1:1混合。
上述的制备方法，进一步的，所述制备方法还包括以下步骤：
S3、三周后进行加强免疫，加强免疫时，猫过敏原Fel d1重组抗原与加强免疫佐剂混合；
S4、之后每间隔两周，按照所述S3的方法进行加强免疫。
上述的制备方法，进一步的，所述一次免疫佐剂和加强免疫佐剂为以下A或B中的一种：
A：一次免疫佐剂为弗氏完全佐剂，加强免疫佐剂为弗氏不完全佐剂；
B：一次免疫佐剂为氢氧化铝、CpG-ODN和BSF-1按照质量比为1～3:2～4:4～7混合的混合物，加强免疫佐剂为氢氧化铝、CpG-ODN和BSF-1按照质量比为1～3:2～4:4～7混合的混合物。
上述的制备方法，进一步的，所述猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂按照体积比为1:1混合；所述猫过敏原Fel d1重组抗原与加强免疫佐剂按照体积比为1:1混合。
上述的制备方法，进一步的，所述S1中，所述猫过敏原Fel d1重组抗原采用以下方法制备得到：
S1-1、以SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为上游引物，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为下游引物进行PCR扩增获得PCR扩增产物；
S1-2、将所述PCR扩增产物PET-30a(+)连接构建重组质粒；
S1-3、将所述重组质粒转化至Top10感受态细胞中获得转化子；
S1-4、提取所述转化子中的蛋白即为猫过敏原Fel d1重组抗原。
上述的制备方法，进一步的，所述S1-4具体包括以下步骤：
(1)挑取所述转化子中的阳性单菌落至含卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD值达到0.6～0.8，加入IPTG诱导；
(2)离心收集沉淀，加入Buffer A进行超声、离心得到沉淀一；
(3)沉淀一用Buffer B重悬，搅拌、离心得到沉淀二；
(4)沉淀二再用Buffer C重悬，搅拌、离心得到沉淀三；
(5)沉淀三再用2M尿素重悬，搅拌、离心得到沉淀四；
(6)沉淀四用Buffer D重悬，搅拌、离心，留上清，即为蛋白提取液。
上述的制备方法，进一步的，所述Buffer A的成分包括：20mM Tris-HCl，150mMNaCl；
所述BufferB的成分包括：20mM Tris-HCl，0.3％Triten X-100；
所述Buffer C的成分包括：20mM Tris-HCl，1M NaCl；
所述Buffer D的成分包括：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，20％甘油，6M尿素。
上述的制备方法，进一步的，所述(1)中，所述诱导具体为：37℃下诱导4h；
所述(2)，所述超声、离心具体为：以超声功率为35％～45％超声50min，每超声5s，间隔5s；超声结束后10000r/min，4℃离心40min；
所述(3)，所述搅拌、离心具体为：4℃搅拌40min，以10000r/min转速4℃离心30min；
所述(4)，所述搅拌、离心具体为：4℃搅拌40min，以10000r/min转速4℃离心30min；
所述(5)，所述搅拌、离心具体为：4℃搅拌60min，以10000r/min转速4℃离心30min；
所述(6)，所述搅拌、离心具体为：4℃搅拌过夜，以10000r/min转速20℃离心30min。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法，将猫过敏原Fel d1，通过注射禽类，产生的的特异性抗体高效的富集在卵黄中，是一种非侵入性的方法，既减少和完善了动物的使用，又安全高效且经济实惠。
(2)本发明提供了一种基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法，将猫过敏原Fel d1 与佐剂混合使用，可以显著提高卵黄抗体的效价，检测卵黄抗体效价达到1:65536以上。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中SDS-PAGE凝胶电泳分析结果。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1
一种猫Fel d1重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID.NO.1所示，具体为： MHHHHHHEICPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPVVLENARILKNCVDAKMTEE DKENALSVLDKIYTSPLCGSGSSGSGVKMAETCPIFYDVFFAVANGNELLLDLSLTKVNAT EPERTAMKKIQDCYVENGLISRVLDGLVMTTISSSKDCMGEAVQNTVEDLKLNTLGR。
本实施例的猫Fel d1重组蛋白，根据Uniprot数据库猫Fel d1蛋白氨基酸序列(Fel d1肽链Ⅰ和肽链Ⅱ的登录号分别为P30438和P30440)，拼接形成完整蛋白序列。
猫Fel d1利用重组蛋白原核表达的方法制备抗原，具体步骤为：
(1)PCR扩增：利用分子生物学引物设计软件DNAMANV6设计了一对PCR引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：catatgcatcaccaccaccaccac；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：taccctgggccgttaatgaaagctt。
PCR反应体系(20μL)为：dd H2O 9μL，LA Taq 0.5μL，cDNA 3μL，上、下游引物(10 μL/L)各1μL，Buffer 2μL，d NTP 3.5μL。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34 个循环；72℃延伸10min。
通过PCR扩增获得PCR产物，将PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定(恒压80V电泳约40min，紫外灯观察结果，自动凝胶成像扫描仪拍照)并回收目的片段。
(2)目的片段的克隆：
将目的片段与PET-30a(+)连接构建重组质粒，经Ndel和HindⅢ双酶切鉴定连接产物，连接产物转化至Top10感受态细胞，37℃恒温培养10h后，挑取挑取单克隆菌落经PCR和双酶切鉴定后，再转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中得到转化子。
(3)Fel d1的原核表达和纯化：
3.1、将转化子进行培养获得菌液。
3.2、将得到的菌液接种到筛选培养基中过夜，挑取阳性单菌落至含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃恒温200r/min培养至OD值达到0.6～0.8时，加入IPTG(IPTG的终浓度为0.5～1mM)，37℃下诱导4h，使蛋白高丰度表达。
3.3、8000r/min，4℃离心5min收集沉淀，沉淀中含有表达Fel d1蛋白的大肠杆菌菌体。将沉淀加入Buffer A(20mM Tris-HCl；150mM NaCl；pH 8.0)进行超声(超声工作时间为 50min，超声5s，间隔5s，超声功率为35％～45％)，超声结束后10000r/min，4℃离心40min，弃上清，留沉淀。
3.4、将上述沉淀用Buffer B(20mM Tris-HCl；0.3％Triten X-100；pH 8.0)重悬，4℃搅拌40min，10000r/min，4℃离心30min，弃上清，留沉淀。
3.5、将上述沉淀再用Buffer C(20mM Tris-HCl；1M NaCl；pH 8.0)重悬，4℃搅拌40min， 10000r/min，4℃离心30min，弃上清，留沉淀。
3.6、将上述沉淀再用2M尿素重悬，4℃搅拌60min，10000r/min，4℃离心30min，弃上清，留沉淀。
3.7、最后沉淀用Buffer D(50mM Tris-HCl；150mM NaCl；20％甘油；6M尿素；pH8.0) 重悬，4℃搅拌过夜，过夜后于10000r/min，20℃离心30min，弃沉淀，留上清。上清即为蛋白提取液，储存于-80℃。
将上清液用Ni-NTA柱进行纯化，通过15％SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯度。鉴定结果参见图1。
图1为SDS-PAGE凝胶电泳分析结果，M1和M2为蛋白Marker，1号泳道为纯化前样品，2号泳道为Ni-NTA柱流穿样品，3号泳道为Ni-NTA柱洗杂样品，4号泳道为Ni-NTA 柱纯化浓缩后样品。从图中可以看出：猫Fel d1利用重组蛋白原核表达的方法制备抗原，经Ni-NTA柱纯化后，经15％SDS-PAGE电泳分析，提纯后重组蛋白在15kDa～20kDa之间有一个清晰的单一条带，纯度高，杂蛋白少。
实施例2：
一种用实施例1的抗原免疫鸡产生蛋黄抗体的方法，其具体步骤为：
将实施例1的纯化后的Fel d1重组蛋白用高压灭菌的PBS稀释后，通过颈部皮下注射给产蛋高峰期的蛋鸡的方法，按照100μg/羽、200μg/羽及300μg/羽免疫蛋鸡。一免时，Feld1 重组蛋白与弗氏完全佐剂1:1混合。三周后进行二次免疫，再间隔两周后进行三次免疫。二次和三次加强免疫时，Fel d1重组蛋白与弗氏不完全佐剂1:1混合，定期收集免疫蛋鸡所产鸡蛋，提取卵黄抗体。
实验一：考察不同剂量抗原免疫蛋鸡生产卵黄抗体的效价。不同剂量抗原免疫蛋鸡生产卵黄抗体效价比较结果见表1。
表1：猫重组蛋白Fel d1抗原不同免疫剂量产生特异卵黄抗体效价的变化(Log2X)(n＝4)
从表1的结果可知：在首免后第一周，各剂量组卵黄抗体效价差异较小，在首免后第2～8 周，100μg/羽与200μg/羽、300μg/羽剂量组的抗体效价水平差异增大，而200μg/羽和300 μg/羽剂量组卵黄抗体效价之间无显著性差异。收集鸡蛋，检测卵黄抗体效价达到1:65536 以上。
实施例3：
一种用实施例1的抗原免疫鸡产生蛋黄抗体的方法，其具体步骤为：
将实施例1的纯化后的Fel d1重组蛋白按照200μg/羽免疫蛋鸡，一免时，Fel d1重组蛋白与佐剂B(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(1:2:7))按照体积比为1:1混合，加强免疫时Feld1 重组蛋白与佐剂B(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(1:2:7))按照体积比为1:1混合，定期收集免疫蛋鸡所产鸡蛋，提取卵黄抗体。其余参数与实施例2一致。
实施例4：
一种用实施例1的抗原免疫鸡产生蛋黄抗体的方法，其具体步骤为：
将实施例1的纯化后的Fel d1重组蛋白按照200μg/羽免疫蛋鸡，一免时，Fel d1重组蛋白与佐剂C(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(2:4:4))按照体积比为1:1混合，加强免疫时Feld1 重组蛋白与佐剂B(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(2:4:4))按照体积比为1:1混合，定期收集免疫蛋鸡所产鸡蛋，提取卵黄抗体。其余参数与实施例2一致。
实施例5：
一种用实施例1的抗原免疫鸡产生蛋黄抗体的方法，其具体步骤为：
将实施例1的纯化后的Fel d1重组蛋白按照200μg/羽免疫蛋鸡，一免时，Fel d1重组蛋白与佐剂D(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(3:3:4))按照体积比为1:1混合，加强免疫时Feld1 重组蛋白与佐剂D(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(3:3:4))按照体积比为1:1混合，定期收集免疫蛋鸡所产鸡蛋，提取卵黄抗体。其余参数与实施例2一致。
实验二：考察实施例2至5中不同免疫佐剂组合免疫蛋鸡生产卵黄抗体效价比较
猫Fel d1重组蛋白纯化后，与不同佐剂组合按照1:1比例(体积比)充分混匀后，按照 200μg/羽剂量(按免疫原量计算)，根据相同免疫程序免疫蛋鸡，定期收集免疫蛋鸡所产鸡蛋，提取卵黄抗体，检测抗体效价。表2为不同试验分组使用免疫佐剂组合；表3为猫重组蛋白Fel d1抗原不同免疫佐剂组合产生特异卵黄抗体效价的变化。
表2：不同试验分组使用免疫佐剂组合
| 组别 | 首次免疫 | 2～3次加强免疫 |
| A组 | 弗氏完全佐剂 | 弗氏不完全佐剂 |
| B组 | 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(1:2:7) | 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(1:2:7) |
| C组 | 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(2:4:4) | 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(2:4:4) |
| D组 | 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(3:3:4) | 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(3:3:4) |
表3：猫重组蛋白Fel d1抗原不同免疫佐剂组合产生特异卵黄抗体效价的变化(Log2X)(n＝4)
从表3中不同免疫佐剂组合免疫蛋鸡后产生卵黄抗体效价结果可以看出：在首免后第一周，各免疫佐剂组卵黄抗体效价差异较小，三周后，随着增强免疫的注射，D组的抗体效价明显高于A组、B组与C组，且这种效价的优势一直持续到第8周。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 南京麦西崴克生物科技有限公司
<120> 基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met His His His His His His Glu Ile Cys Pro Ala Val Lys Arg Asp
1 5 10 15
Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Val Glu Gln Val
20 25 30
Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro Val Val Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu
35 40 45
Lys Asn Cys Val Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala
50 55 60
Leu Ser Val Leu Asp Lys Ile Tyr Thr Ser Pro Leu Cys Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Ser Gly Ser Gly Val Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe Tyr
85 90 95
Asp Val Phe Phe Ala Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu
100 105 110
Ser Leu Thr Lys Val Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys
115 120 125
Lys Ile Gln Asp Cys Tyr Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val Leu
130 135 140
Asp Gly Leu Val Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly
145 150 155 160
Glu Ala Val Gln Asn Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly
165 170 175
Arg
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catatgcatc accaccacca ccac 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taccctgggc cgttaatgaa agctt 25
Claims (10)
1.一种基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述猫过敏原Feld1的氨基酸序列如SEQ ID.NO.1所示，所述方法包括以下步骤：
S1、将猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂混合得到混合物；
S2、将所述混合物颈部皮下注射给产蛋高峰期的蛋鸡，收集鸡蛋；鸡蛋的卵黄中富集有对猫过敏原Fel d1特异的卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述一次免疫佐剂为弗氏完全佐剂；或，氢氧化铝、CpG-ODN和BSF-1按照质量比为1～3:2～4:4～7混合的混合物。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂按照体积比为1:1混合。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：
S3、三周后进行加强免疫，加强免疫时，猫过敏原Fel d1重组抗原与加强免疫佐剂混合；
S4、之后每间隔两周，按照所述S3的方法进行加强免疫。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述一次免疫佐剂和加强免疫佐剂为以下A或B中的一种：
A：一次免疫佐剂为弗氏完全佐剂，加强免疫佐剂为弗氏不完全佐剂；
B：一次免疫佐剂为氢氧化铝、CpG-ODN和BSF-1按照质量比为1～3:2～4:4～7混合的混合物，加强免疫佐剂为氢氧化铝、CpG-ODN和BSF-1按照质量比为1～3:2～4:4～7混合的混合物。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂按照体积比为1:1混合；所述猫过敏原Fel d1重组抗原与加强免疫佐剂按照体积比为1:1混合。
7.根据1至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述S1中，所述猫过敏原Fel d1重组抗原采用以下方法制备得到：
S1-1、以SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为上游引物，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为下游引物进行PCR扩增获得PCR扩增产物；
S1-2、将所述PCR扩增产物PET-30a(+)连接构建重组质粒；
S1-3、将所述重组质粒转化至Top10感受态细胞中获得转化子；
S1-4、提取所述转化子中的蛋白即为猫过敏原Fel d1重组抗原。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述S1-4具体包括以下步骤：
(1)挑取所述转化子中的阳性单菌落至含卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD值达到0.6～0.8，加入IPTG诱导；
(2)离心收集沉淀，加入Buffer A进行超声、离心得到沉淀一；
(3)沉淀一用Buffer B重悬，搅拌、离心得到沉淀二；
(4)沉淀二再用Buffer C重悬，搅拌、离心得到沉淀三；
(5)沉淀三再用2M尿素重悬，搅拌、离心得到沉淀四；
(6)沉淀四用Buffer D重悬，搅拌、离心，留上清，即为蛋白提取液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述Buffer A的成分包括：20mMTris-HCl，150mM NaCl；
所述Buffer B的成分包括：20mM Tris-HCl，0.3％Triten X-100；
所述Buffer C的成分包括：20mM Tris-HCl，1M NaCl；
所述Buffer D的成分包括：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，20％甘油，6M尿素。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述(1)中，所述诱导具体为：37℃下诱导4h；
所述(2)，所述超声、离心具体为：以超声功率为35％～45％超声50min，每超声5s，间隔5s；超声结束后10000r/min，4℃离心40min；
所述(3)，所述搅拌、离心具体为：4℃搅拌40min，以10000r/min转速4℃离心30min；
所述(4)，所述搅拌、离心具体为：4℃搅拌40min，以10000r/min转速4℃离心30min；
所述(5)，所述搅拌、离心具体为：4℃搅拌60min，以10000r/min转速4℃离心30min；
所述(6)，所述搅拌、离心具体为：4℃搅拌过夜，以10000r/min转速20℃离心30min。
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2022
- 2022-01-26 CN CN202210095763.3A patent/CN114437211B/zh active Active
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