CN101421296B - 用于治疗过敏的属于欧蓍草（Parietaria judaica）脂质转移家族的低变应原的嵌合蛋白质 - Google Patents

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Abstract

用于治疗过敏的属于欧蓍草(Parietariajudaica)脂质转移家族的低变应原的嵌合蛋白质。本发明涉及对欧蓍草的不同变态反应原的嵌合多肽进行编码的重组DNA分子，其可用于预防和治疗过敏，尤其是花粉过敏。具体来说，描述了由具有低变应原特性的变态反应原Par j1和Par j2的片段构成的嵌合多肽。还描述了在异源表达系统中生产这些重组多肽的方法。还描述了对这些嵌合蛋白质进行纯化的有效方法。

Description

用于治疗过敏的属于欧蓍草(Parietaria judaica)脂质转移家族的低变应原的嵌合蛋白质
技术领域
本发明涉及用于预防和治疗过敏，尤其是花粉过敏，更尤其是由脂质转移家族的变应原引起的过敏，更为具体的是在墙草属(Parietaria)的花粉中发现的变应原。
背景技术
I型过敏在工业化国家中是重要的健康问题。这一类型的过敏是由于对空气中载有的抗原形成了IgE抗体而导致。这些IgE抗体与肥大细胞和嗜碱性粒细胞相互作用，释放出生物介体例如组胺，并在约20％的人群中导致过敏性鼻炎，结膜炎和支气管哮喘[(1)Miyamoto，T.(1992)。Increasedprevalence of pollen allergy in Japan.In Advances in Allergology and ClinicalImmunology.P.Godard，J.Bousquet，and F.B.Michel，eds.(Cornforth，UK：The Parthenon Publishing Group)，pp.343-347]。
特异性免疫疗法(SIT)是一种对由特定抗原引发的过敏性反应的有效治疗方法，它基本上是由通过定期给药来调节患者体内的免疫应答，增加产生过敏的蛋白质(变应原提取物)的浓度组成。以高剂量注射的变应原会诱导由抗原-递呈细胞合成大量的IL-12，例如树枝状细胞，这种细胞优先促进T细胞的发育，而这些T细胞是与TH1或TH0协同的处女型细胞(nTH)。这使得从与TH2细胞相关的过敏应答类型的免疫应答向TH1/TH0型的应答偏离，从而导致生成高水平的IFN-γ[(2)Akdis，C.A.andBlaser，K.(2000)。Mechanisms of allergen-specific immunotherapy.Allergy55，522-530]。在产生免疫抑制因子细胞因子IL-10和TGF-β的调节T细胞(TR1)的影响之下，通过诱导TH2记忆细胞的耐受(无反应性或克隆缺失)而使免疫偏离得以加强[(3)Akdis，C.A.，Joss，A.，Akdis，M.，and Blaser，K.(2001)。Mechanism of IL-10induced cell inactivation in allergicinflammation and normal response to allergens.Int.Arch Allergy Immunol.124；180-182]。TH2细胞的活化和增殖的减少伴随B细胞导致的IL-4以及IgE的减少。TH2细胞的活性和浸润进鼻和支气管粘液的减少引起IL-5合成的减少，从而减少了嗜伊红粒细胞的浸润，这导致了炎性介体如MBP和ECP蛋白的释放的更大的减少。优势表型抗原TH0的T细胞的新的特异性克隆产生了TH1和TH2型细胞因子的混合物，其促进B细胞产生大量的特异性IgG抗原抗体。另一方面，高水平的IL-10诱导了大量特异性IgG4抗原抗体的合成。这两种类型的特异性抗体可用作封闭抗体来提供IgE抗体与它们的受体在肥大细胞中的交叉，从而抑制组胺的脱粒和释放[(4)Moverate，R.(2003)。Immunological mechanisms of specificimmunotherapy with pollen vaccines：implications for diagnostics and thedevelopment of improved vaccination strategies.Expert Rev.Vacc.2，85-97；(5)Wachholz，P.A.，Soni，N.K.，Till，S.，and Durham，S.R.(2003).Inhibition ofallergen-IgE binding to B cells by IgG antibodies after grass pollenimmunotherapy.J.Allergy Clin.Immunol.112；915-922]。它们还通过含抗原的细胞来阻止IgE-介导的抗原的聚积，而这抑制了对抗原的免疫反应。
从天然源分离出的变态反应原提取物为蛋白质和其他分子的复杂混合物。它们的组成，进而变应原性取决于使用的材料，并随环境条件，花粉的成熟状态以及真菌类中螨类等的生长条件。一些提取物中甚至可含有浓度不足的主要变应原，且甚至可被一些对患者不过敏的不期望的成分污染，或者两种情况。目前的免疫疗法完全使用全变态反应原提取物，而这导致了许多问题，如：
-由于疫苗与效应物分子的IgE的反应所致的严重的不良反应。
-免疫疗法后在疫苗中出现对其他变应原的新的致敏作用。
-难以标准化变态反应原提取物。
所有的这些意味着免疫疗法不是期望的安全有效的治疗方法。对过敏的发病机理以及特异性免疫疗法的机理的更好的认识使得能够更进一步地解决上述提及的问题。对IgE-介导的抗原在特异性变态反应原应答TH2中的影响的认识增加了人们对产生不结合到IgE上的变应原的尝试。目前的特异性疗法的主要目标是对变态反应原进行改性，旨在使IgE表位失活，从而减少甚至消除对IgE的结合以及随之引起的不良反应[(6)Valenta，R.and Linhart，B.(2005)。Molecular design of allergy vaccines.Curr.Opin.Immunol.17，1-10]。这样，改性的变态反应原将通过吞噬/胞饮作用-介导的抗原收集机制而被引向T细胞，从而防止了IgE交叉和IgE-依赖的抗原的递呈。这诱导了通过T细胞的TH0或TH1细胞因子的产生的平衡，通过B细胞的IgE的产生减少而IgG的产生增加了；所有的这些将导致在无过敏性反应的危险之下诱导出TH2型T细胞耐受性。在获得变态反应原和变态反应原衍生物的重组方法中的进展使得研发新的用于治疗过敏的疫苗的能力大大增加。由于可能对IgE表位的重要氨基酸进行突变或缺失，以及对其进行分级分离和低聚作用，获得低变应原疫苗是可能的。这些分子具有较低的结合至IgE的能力但保持了它们对T细胞的反应性，可以较大剂量使用，能够用较少次数注射获得更快更安全的免疫疗法。此外，重组的变应原可在发酵罐中使用微生物表达体系来大规模生产，且其纯化比它们的天然等同物更为有效和廉价。低变应原的衍生物在免疫疗法中的使用先前已用Bet v1的三聚体片段[(7)Niederberger，V.，Horak，F.，Vrtala，S.，Spitzauer，S.，Krauth，M.T.，Valent，P.，Reisinger，J.，Pelzmann，M.，Hayek，B.，Kronqvist，M.，Gafvelin，G.，
Figure G2007800133849D0003172653QIETU
，H.，Purohit，A.，Suck，R.，Fiebig，H.，Cromwell，O.，Pauli，G.，van Hage-Hamsten，M.，andValenta，R.(2004)。Vaccination with genetically engineered allergensprevents progression of allergic disease.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101，14677-14682]、蜂毒蛋白(Api m 1，2，3)的多变应原的杂合体[(8)Schmid-Grendelmeier，P.，Karamloo，F.，Müller，U.，Housley-Marcovic，Z.，Soldatova，L，Zumkehr，J.，Kemeny，D.M.，Kündig，T.，Reimers，A.，von Beust，B.R.，Salagianni，M.，Akdis，M.，Kussebi，F.，Spangfort，M.D.，Blaser，K.，andAkdis，C.A.(2005).Prevention of allergy by a recombinant multi-allergenvaccine with reduced IgE binding and preserved T cell epitopes.Eur.J.Immunol.35，3268-3276]和以消除其三级结构的Parj2和Parj1的突变融合体进行了描述。
一些作者提到，变应原疫苗不应用低变应原制备，这是由于对IgE的结合可助于专门的抗原递呈细胞的变应原的捕获和递呈，如表达具有高亲和力和低亲和力的IgE的表面受体的树突状细胞和活化的B淋巴细胞。该方法当在免疫疗法中使用舌下途径时具有特别的意义。高亲和性受体的交叉也可导致T细胞对变应原应答的减少[(9)Allam，J.P.，Novak，N.，Fuchs，C.，Asen，S.，Berge，S.，Appel，T.，et al.(2003)Characterization ofdendritic cells from human oral mucosa：a new Langerhans′cell type with highconstitutive FcεRI expression.J.Allergy Clin.Immunol.112，141-8.(10)vonBubnoff，D.，Matz，H.，Frahnert，C.，Rao，M.L.，Hanau，D.，de la Salle，H.，Bieber，T.(2003)FcεRI induces the triptophan degradation pathway involvedin regulating T cell responses.J.Immunol.169，1810-1816]。许多研究者仍在不引入缺失时制备这种类型的疫苗[(11)Batard，T.，Didierlaurent，A.，Chabre，H.，Mothes，N.，Bussieres，L，Bohle，B.，et al.(2005)Characterizationof wild-type recombinant Bet v la as a candidate vaccine against birch pollenallergy.Int.Arch.Allergy Immunol.136，239-249.(12)Jutel，M.，Jaeger，L，Suck，R.，Meyer，H.，Fiebig，H.，Cromwell，O.(2005)Allergen-specificimmunotherapy with recombinant grass pollen allergens.J.Allergy Clin.Immunol.116，608-13.(13)Niederberger，V.，Horak，F.，Vrtala，S.，Spitzauer，S.，Krauth，M.T.，Valent，P，etal.(2004)Vaccination with genetically engineeredallergens prevents progression of allergic disease.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101，14677-82.(14)Cromwell，O.，Fiebig，H.，Suck，R.，Kahlert，H.，Nandy，A.，Kettner，J.，et al.(2006)Strategies for recombinant allergen vaccines andfruitful results from first clinical studies.Immunol.Allergy Clin.N.Am.26，261-81]。
墙草属(Parietaria)是荨麻目荨麻科家族的双子叶杂草属，。墙草属中的很多种广泛和大量的分布在地中海海岸[(15)Colombo，P.，Duro，G.，Costa，M.A.，Izzo，V.，Mirisola，M.，Locorotondo，G.，Cocchiara，R.，andGeraci，D.(1998)。An update on allergens.Parietaria pollen allergens.Allergy53，917-921]。最常见的种为欧蓍草(P.judaica)和药用墙草(P.officinalis)，但其他的种P.lusitanica、P.mauritanica和P.cretica可在于一些地区有一些存在。然而，地中海区域并不是唯一可发现墙草属花粉的地方，因为有这种花粉存在于英格兰南部，奥地利，中欧和东欧的温带区域，澳大利亚和加利福尼亚的描述[(16)Colombo，P.，Bonura，A.，Costa，M.，Izzo，V.，Passantino，R.，Licorotondo，G.，Amoroso，S.，and Gerasi，D.(2003)。The allergens of Parietaria.Int.Arch.Allergy Immunol.130，173-179；(17)Carreira，J.and Polo，F.(1995).The allergens of Olea europaeaand Parietaria spp.and their relevance in the Mediterranean Area.Allergy Clin.Immunol.News7，79-84].墙草属的一个显著特征是持续长达数月的授粉期，从而导致在对墙草属过敏的患者中出现几乎常年性的症状，这些症状范围为从较轻的鼻结膜炎到严重的哮喘。应当注意的是，由于在墙草属的不同种之间表现出显著的交叉反应性，正常的对墙草属的轻微的单特异性致敏作用包括对该属中各种不同种的致敏作用。
已有对两种最常见的种欧蓍草(P.judaica)和药用墙草(P.officinalis)的变应原馏分纯化和表征的各种论文。这些馏分的分子量在10-14kDa的范围，并实际上涉及它们的提取物的全部变应原力。The allergens ofParietaria.Int.Arch.Allergy Immunol.130，173-179；(18)Ayuso，R.，Carreira，J.，Lombardero，M.，Duffort，O.，Peris，A.，Basomba，A.，and Polo，F.(1993).Isolation by mAb based affinity chromatography of two Par j isoallergens.Comparison of their physicochemical，immunochemical and allergenicproperties.Mol.Immunol.30，1347-1354；(19)Polo，F.，Ayuso，R.，andCarreira，J.(1990).HPLC purification of the main allergen of Parietariajudaica pollen.Mol.Immunol.27，151-157；(20)Polo，F.，Ayuso，R.，andCarreira，J.(1991).Studies on the relationship between structure andIgE-binding ability of Parietaria judaica allergen I.Mol.Immunol.28，169-175].重组DNA技术的发展使得能够对墙草属花粉变应原的分子表征得以完成：欧蓍草花粉的两种主要变应原Parj1和Parj2已被克隆和测序[(21)Duro，G.，Colombo，P.，Costa，M.A.，Izzo，V.，Porcasi，R.，DiFiore，R.，Locorotondo，G.，Mirisola，M.G.，Cocchiara，R.，and Geraci，D.(1996).cDNAcloning，sequence analysis and allergological characterization of Par j2.0101，anew major allergen of the Parietaria judaica pollen.FEBS Lett.399，295-298；(22)Costa，M.A.，Colombo，P.，Izzo，V.，Kennedy，H.，Venturella，S.，Cocchiara，R.，Mistrello，G.，Falagiani，P.，and Geraci，D.(1994).cDNAcloning expression and primary structure of Par j I，a major allergen ofParietaria judaica pollen.FEBS Lett.341，182-186；(23)Amoresano，A.，Pucci，P.，Duro，G.，Colombo，P.，Costa，M.A.，Izzo，V.，Lambda，D.，andGeraci，D.(2003).Assignment of disulphide bridges in Par j2.0101，a majorallergen of Parietaria judaica pollen.Biol.Chem.384，1165-1172]。两种变应原均属于非特异性脂质转移蛋白(ns-LTP)家族，并在它们的末端区域具有信号肽，加工后产生分子量分别为14,726和11,344Da的蛋白质并具有约45％的相同残基。已描述了在两种抗原中可能的可能位于结构相关区域内的IgE-结合线性表位[(24)Asturias，J.A.，Gómez-Bayón，N.，Eseverri，J.L.，and Martinez，A.(2003).Par j1and Par j2，the major allergens fromParietaria judaica pollen，have similar immunoglobulin E epitopes.Clinicaland Experimental Allergy33，518-524]。这些区域是为能获得最佳低变应原分子来治疗对欧蓍草花粉过敏而被作用的靶。
ns-LTP因能够离体完成膜间交换和/或传递极性脂质而著称。[(25)vanRee，R.(2002).Clinical importance of non-specific lipid transfer proteins asfood allergens.Biochem.Soc.Trans30，910-913]。在植物中已表征了两个主要的家族，它们是分子量约为9kDa的LTP1和分子量约为7kDa的LTP2。属于LTP家族的变应原已在除食物外的植物中被鉴定，在这些植物中对它们已进行了广泛的研究。因此，来自巴西橡胶树(hevea brasiliensis)乳胶的Hev b12为9.3kDa的碱性蛋白质，其显示出与蔷薇科果实中的变应原LTP约65％的序列同一性[(26)Beezhold，D.H.，Hickey，V.L.，Kostyal，D.A.，and etal.(2003).Lipid transfer protein from Hevea brasiliesis(Hev b12)，across-reactive latex protein.Ann Allergy Asthma Immunol439-445]。此外，一些花粉变应原被描述为LTP，例如北艾蒿(Artemisia vulgaris)的Art v3[(27)Diaz-Perales，A.，Lombardero，M.，Sanchez-Monge，R.，and et al.(2000).Lipid-transfer proteins as potential plant panallergens：cross-reactivity amongproteins of Artemisia pollen，Castanea nut and Rosaceae fruits，with differentIgE-binding capacities.Clin Exp Allergy1403-1410]以及油橄榄(Oleaeuropaea)的Ole e7[(28)Tejera，M.L.，Villalba，M.，Batanero，E.，andRodriguez，R.(1999).Identification，isolation，and characterization of Ole e7，a new allergen of olive tree pollen.J.Allergy Clin.Immunol.797-802；(29)Rodriguez，R.，Villalba，M.，Batanero，E.，and et al.(2002)。Allergenicdiversity of the olive pollen.Allergy6-16]，其为9-10kDa且与食物的变应原的LTP具有30-55％的序列同一性。欧蓍草的主要变应原Parj1和Parj2，一方面相互之间具有约45％的序列同一性的，另一方面具有比LTP家族中的正常值高的分子量，分别为14.7和11.3kDa[(16)Colombo，P，Bonura，A.，Costa，M.，Izzo，V.，Passantino，R.，Licorotondo，G.，Amoroso，S.，andGerasi，D.(2003).The allergens of Parietaria.Int.Arch.Allergy Immunol.130，173-179]。然而，尽管两变应原具有与LTP类似的结构，它们却在共有的序列区域具有与食物LTP的中等水平的同一性(在Parj1和桃LTP之间为28％)。
WO2005/085278公开了含欧蓍草的两种主要变态反应原的融合蛋白的构建物，其中融合蛋白的三维结构通过取代每种抗原的一级序列中的一些半胱氨酸残基(更具体的是涉及形成二硫键中的半胱氨酸)被破坏，从而使变应原的序列维持在几乎相同的长度。根据后来的实验，这将得到比天然变应原的变应原性低1000倍的蛋白质。
本发明的发明者们已发现，不仅通过破坏变态反应原的三维结构，而且通过使一些IgE-结合位点(已知为B表位)发生缺失可惊人的大大减少变应原性，最令人吃惊的是，这不会导致免疫原性的降低。
本发明首次公开了通过将含少量IgE-结合表位的欧蓍草的两种变应原的片段(Parj1和Parj2)结合获得的不同的嵌合蛋白质，以及获得它们的不同的方法和中间体。不仅本发明的嵌合蛋白质的三维结构被打断，而且一些B表位被缺失。根据本发明的嵌合蛋白质可称为低变应原的嵌合蛋白质，其变应原性降低了99.99％，这是由于它们具有更低的结合IgE抗体的能力，这一结论基于：i)离体的ELISA，使用对欧蓍草过敏的患者的血清混合物进行ELISA抑制和免疫检测测试；ii)在对欧蓍草过敏的患者体内进行皮肤反应性的活体内测试；以及iii)使用对欧蓍草过敏的患者的单一血清进行离体EAST抑制测试。根据本发明的嵌合蛋白质在另一方面保持了它们的免疫原的能力，这通过对13名对欧蓍草过敏的患者的外周血单核细胞(CMSP)的淋巴细胞增殖测试得以证实。
变应原提取物为蛋白质和非蛋白质分子的复杂混合物。用于检测对提取物中的组份特异的IgE水平的技术，其使用的增多使得能够证实过敏患者通常对多种组份产生反应。仅对单一变态反应原反应的过敏患者的例子非常稀少。由于变应原提取物在免疫疗法中存在显著的问题，一种解决方法是尽可能地将多种治疗性能组合在单个分子中。
发明内容
本发明人成功地将两种变应原结合在一个分子中，这不仅从工业化生产和治疗上受益，并且在不改变免疫原性之下还显示出明显降低的变应原性。
出于这些原因，本发明涉及嵌合蛋白质(后面称作Q1，Q2，和Q3)，其由变应原Parj1和Parj2的片段组成，由于它们失去了一些IgE-结合B表位，因而它们的过敏应答性被降低，但未失去免疫原的能力。这样，所得的嵌合多肽就具有比两个单独的蛋白质的总和低的分子量。
本发明还涉及包含对前述嵌合多肽进行编码的DNA的核苷酸序列，表达体系包含具有表达和控制所需的序列的所述序列，以及由所述表达体系转化的受体细胞。
本发明还涉及该嵌合多肽的临床应用，用于治疗过敏的特异性免疫疗法，以及含有该嵌合多肽的可能的组合物，及其不同的施用方法。
允许用于免疫治疗的本发明的嵌合蛋白质的低变应原的性能已经被广泛证实。由发明者们进行的免疫学实验表明，嵌合体Q2在不识别对欧蓍草过敏的患者血清中的IgE，这在图10和11中示出。如图12所示，Q2具有的IgE结合能力低于两种天然蛋白质混合物10,000倍。
这一低变应原性数据限制在通过在30名患者的皮肤点刺测试的活体实验进行。嵌合体Q1的变应原性比由两种分离的天然蛋白质获得的变应原性低3.5倍(图13)。在另一方面，由Parj1和Parj2片段形成的Q2，其不含有任何描述的B表位，变应原性比两种分离的天然蛋白质获得的变应原性低的112倍。
嵌合体Q2的低变应原性(IgE-结合能力)通过测量该分子与30名对欧蓍草过敏的患者的血清的反应性而得以确证。这种在变应原性上的降低出乎意料地伴随着嵌合体Q2的免疫原能力的保持，这与单个天然蛋白质的总和的免疫原能力没有区别(图16)。
免疫原性的保持将使得该嵌合体用作完全提取物的替代品，但其安全性却高的多(较低的变应原性)。
菌株的保藏
根据国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约，对应于本发明的微生物的菌株保藏于巴伦西亚大学(University of Valencia)(Universidad de Valencia，Edificio de Investigación，Campus de Burjasot，46100BURJASOT，Valencia)的西班牙典型培养物保藏中心(CECT)，并具有以下参考：
大肠杆菌(Escherichia coli)，CECT7141，，保藏于2006年3月7日。
附图说明
图1是Q1的构建图。
图2示出了Q1的氨基酸和核苷酸序列。对应于载体pQE-32的亲和性尾部的残基用下划线表示。通过EcoRI(EF)部分引入的残基用阴影表示。半胱氨酸残基用双下划线表示。
图3示出了Parj1和Parj2的IgE表位(方框)和T表位(下划线)的对比，指出了位于粗方框内的Q2缺失的表位。对相同的残基(：)和类似的残基(.)进行了标记。
图4是Q2的构建图。
图5示出了Q2的氨基酸和核苷酸序列。对应于载体pQE-32的亲和性尾部的残基用下划线表示。通过EcoRI(EF)Pstl(LQ)和EcorRV(DI)部分引入的残基用阴影表示。半胱氨酸残基用双下划线表示。
图6示出了Parj1和Parj2的IgE表位(方框)和T表位(下划线)的对比，表明了位于双线方框内的Q3缺失的表位。对相同的残基(：)和类似的残基(.)进行了标记。
图7是Q3的构建图。
图8示出了Q3的氨基酸和核苷酸序列。对应于载体pQE-32的亲和性尾部的残基用下划线表示。通过EcoRI(EF)Pstl(LQ)和EcorRV(DI)，Bg1II(RS)，以及Kpnl(GT)部分引入的残基用阴影表示。半胱氨酸残基用双下划线表示。
图9示出了在电泳后用考马斯蓝对聚酰胺凝胶进行染色的结果。Q1(带1)，Q2(带2)，Q3(带3)。
图10示出了对纯化的蛋白质nParj1-nParj2，Q1，Q2，和Q3的圆二色性分析结果。
图11示出了用对欧蓍草过敏的患者的血清混合物的IgE抗体进行的免疫检测，包括：nParj1-nParj2(泳道1)，rParj1(泳道2)，rParj2(泳道3)，Q1(泳道4)，Q2(泳道5)，Q3(泳道6)。
图12示出了使用15种对欧蓍草过敏的患者的血清(稀释1/10)进行的IgE抗体对Q1，Q2，和Q3的结合。示出了三次实验的值和它们的偏差。
图13示出了ELISA抑制测试结果，用固相中的欧蓍草提取物以及nParj1-Parj2，Q1，Q2，和Q3作为抑制剂，用对欧蓍草过敏的患者的血清混合物。每个值均对应于三次实验的平均值，标准偏差小于10％。
图14示出了用欧蓍草提取物，nParj1-Parj2以及Q1(50μg/ml)，和Q3(250μg/ml)进行的皮肤测试结果。示出的数值是斑点的面积，单位为mm2。
图15示出了用欧蓍草提取物，nParj1-Parj2以及Q1(50μg/ml)，和Q3(250μg/ml)进行的特异性IgE的确定。
图16示出了用于研究在对欧蓍草过敏的患者中的T淋巴细胞增殖的的最佳浓度的确定。刺激指数(IE)。
图17示出了用欧蓍草提取物和0，5μg/ml三种嵌合蛋白质以及Parj1和Parj2的天然的和重组的形式获得的T淋巴细胞的增殖。显示的数值是刺激指数(％)的数值。无显著性差异(ns)。
具体实施方式
根据本发明的一个方面，提供了一种具有低变应原性的嵌合蛋白质或肽，其通过缺失任何B表位或IgE-结合表位或通过合成出无任何B表位或IgE-结合表位得到而得到。缺失优选针对Parj1和Parj2的28-53处的B表位进行。
这里使用的术语“低变应原性”及其类似变体为相对的术语，涉及与野生型免疫原的相同能力相比，本发明的蛋白质或肽的活体内和离体刺激过敏应答的能力的降低。
优选的嵌合蛋白质包含示于SEQ ID No.：2，4或6中的氨基酸序列，最优选的嵌合蛋白质包含示于SEQ ID No.：4中的氨基酸序列。
嵌合蛋白质可选地或可额外包含与示于SEQ ID No.：2，4或6中的氨基酸序列同源的序列。优选的同源的序列与示于SEQ ID No.：2，4或6中的氨基酸序列，最优选为与示于SEQ ID No.：4中的氨基酸序列具有至少为70％，更优选为至少80％，更优选为至少90％，最优选为100％的同源性。
另一种优选的实施方式包括与示于SEQ ID No.：2，4或6中的氨基酸序列中具有至少为70％，优选为至少80％，更优选为至少90％，最优选为100％的同源性的氨基酸序列的嵌合蛋白质或肽。
嵌合蛋白质也可包含有助于其纯化的肽序列。这种肽是本技术领域公知的，例如聚组氨酸尾。
构成嵌合蛋白质的片段可由合格培训的人员按照已知的方案通过聚合酶链式反应(PCR)扩增合成。所述片段，在被合适的限制性酶消化后，可通过连接至表达载体而进行整合。该表达载体(如商用载体pQE32)可具有将嵌合蛋白质与辅助纯化的序列如位于末端氨基酸端的一系列组氨酸进行融合的能力。在构建嵌合蛋白质期间，由不同的限制性酶识别的序列形成的接头将不同的DNA片段结合在一起，而在天然变态反应原的原始序列中不存在的残基将出现在最终的嵌合分子中。这些不干涉正确读取蛋白质的新的残基在图2，5，和8中的序列中被标记，并在相关的实施例中进行了适当的描述。类似地，嵌合体在氨基端的区域具有14个原始序列未出现的残基，它们对应于富含组氨酸的区域，其允许通过与结合至固体支持物的二价金属相互作用而可实现快速纯化。
根据本发明的第二个方面，提供了对本发明的蛋白质或肽进行编码的多核苷酸。
优选地，多核苷酸含有示于SEQ ID No.：1，3或5中的核苷酸序列，最优选地，多核苷酸含有示于SEQ ID No.：3中的核苷酸序列。
多核苷酸可可选地或附加地包含与示于SEQ ID No.：1，3或5中的多核苷酸序列同源的序列。优选的同源的序列具有的与示于SEQ ID No.：1，3或5中的氨基酸序列至少为70％，更优选为至少80％，更优选为至少90％，最优选为95％的同源性。
另一种优选的实施方式包括与示于SEQ ID No.：1，3或5中的核苷酸序列具有至少为70％，优选为至少80％，更优选为至少90％，最优选为100％的同源性的核苷酸序列的多核苷酸。
多核苷酸可进一步包含一对信号肽进行编码的序列。信号肽为一种引发蛋白质跨内质网膜传输的氨基酸序列。适合的信号肽为本领域技术人员所知。
本发明还包括由本发明的多核苷酸序列编码的肽。
根据本发明的其他方面，提供了一种表达系统，其包含本发明的多核苷酸序列，以及被所述表达系统转化宿主细胞，其能够表达本发明的蛋白质或肽。
本发明还包括制备本发明的肽或蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)制备能够在宿主细胞中表达对本发明的蛋白质或肽进行编码的核苷酸序列的可复制的表达系统；
(ii)用所述表达系统转化宿主细胞；
(iii)在允许表达所述蛋白质或肽的条件下培养所述转化的宿主细胞；以及
(iv)任选地，回收所述的蛋白质或肽。
本发明还包括能够产生本发明的蛋白质或肽的转基因动物，例如在它们的奶中或蛋中产生。
根据本发明的另一个方面，提供了本发明的蛋白质或肽在治疗免疫疾病，特别是超敏性疾病如过敏中的应用。
根据本发明的再一个方面，提供了本发明的蛋白质或肽在制备治疗免疫疾病，特别是超敏性疾病如过敏的药物中的应用。优选的药物为疫苗。
优选地，超敏性疾病为对墙草属花粉的过敏，更优选的是对欧蓍草花粉的过敏。
这里使用的术语治疗以及其变体如“治疗”或“治疗的”是指可使人类或非人类动物受益的疗法。治疗可以是针对现存症状的，或可以是预防疾病的(预防性治疗)。治疗可包括治愈，缓和或预防疾病的效果。优选地，治疗为预防治疗。
根据本发明的又一个方面，提供了一种药物组合物，其包含有效量的本发明的蛋白质或肽以及药学上可接受的赋形剂。优选的药物组合物为疫苗组合物。
根据本发明的又一方面，提供了一种治疗免疫疾病，特别是超敏性疾病如过敏的方法，所述方法包括向有需要的研究对象施用有效量的本发明的蛋白质或肽。
根据本发明的另一个方面，提供了本发明的蛋白质或肽在治疗免疫疾病，特别是超敏性疾病如过敏中的应用。
对个体患者的合适的施用和剂量形式的选择对本领域技术人员而言是显而易见的。
本发明覆盖了本发明的嵌合体，优选为嵌合体Q2，或尤其衍生的合成的肽在哺乳动物中进行脱敏治疗中的应用。脱敏的方法涉及通过肠胃外途径(皮下的，静脉内的，或肌肉的)，或口腔，鼻或直肠途径重复施用所述的变态反应原。这些(多)肽可单独施用或与其他稀释剂组合，所依据的是当前的法规和盖伦制剂使用规程。
在发明中描述的嵌合体蛋白Q2和Q3是低变应原的因为它们对欧蓍草过敏的患者的血清的反应性比全提取物或组合的天然蛋白质低，如图10，11，12和14所示，且这种低变应原性在活体内的皮肤测试中也有发现(图13)。
嵌合分子Q1和Q2也具有与组合的天然蛋白质类似的免疫原能力(图16)。这两种特性(低变应原性和免疫原性)使得嵌合体Q2成为对欧蓍草花粉过敏进行预防和治愈的优异的候选对象，这些过敏表现为如鼻炎，结膜炎，哮喘，荨麻疹，血管性水肿，湿疹，皮炎，或者甚至为过敏性休克。
对本发明的嵌合蛋白质的免疫学特性的描述将在后面给出。图10示出的免疫检测，表明在患过敏症的患者中，嵌合体Q2和Q3(泳道5和泳道6)具有比两种天然蛋白质(泳道1)，分离的重组蛋白质(泳道2和泳道3)或显示为两种完全且含有所有B表位的蛋白质的重组融合嵌合体(带4)大大降低的IgE-接合能力。应当指明的是，包括在残基29和52之间的B表位(嵌合体Q2)缺失贡献变应原性的降低。当对15种不同血清与嵌合蛋白质的反应性进行调查时获得了类似的结果(图11)。嵌合蛋白质Q2和Q3具有比Q1中观察到的在两种完整变态反应原(Parj1-Parj2)的结合性低得多的反应性。该变应原性的降低通过ELISA抑制采用来自对欧蓍草过敏患者的血清混合物来进行定量(图12)。需要比两种天然蛋白质混合物多10,000倍的蛋白质Q2来达到60％提取物的抑制。因此，可以推断，其比天然蛋白质的变应原性低10,000倍，且比嵌合蛋白质Q1的变应原性低约20倍。
对嵌合体Q2的低变应原性的更为直接的测量可通过直接对30名对欧蓍草花粉过敏的患者的皮肤反应性测量来获得。图13中给出的数据表明，嵌合体Q2在皮肤反应性上有显著降低。对各分布的描述进行的比较表明，嵌合体Q2具有的平均斑点大小比两种天然蛋白质中观察到的小112倍，这意味着致敏性活性降低了超过99％。
IgE与嵌合蛋白质Q2的低结合能力也通过进一步的30名对欧蓍草花粉过敏患者的单血清的EAST测量得以证实(图14)。在所有的患者中，与天然蛋白质的混合物相比，嵌合体Q2中的IgE-结合均大大降低。
这种在IgE-结合能力上的大大降低以及因此由于B表位缺失而诱发不良反应的能力却伴随着免疫原能力的维持。蛋白质Q2表现出的淋巴增殖指数与天然提取物以及两种纯天然蛋白质组合的混合物引起的淋巴增殖指数类似，这在图16中示出。所有的这些都显示出用片段Parj1和Parj2构建的嵌合蛋白质Q2含有更少的IgE表位，但仍保持了足够以激发保护性免疫应答的T表位。
通过以下与本发明的制备和其性质展示的实验阶段相关的实施例，将对本发明有更好的理解。这些实施例仅为示例性的，并不对本发明构成限制。
实施例1：Q1，Q2，和Q3融合体的构建
嵌合蛋白质是通过聚合酶的链式扩增反应(PCR)，使用含有对Parj1.0103和Parj2.0101编码的序列的质粒作为基质以及在每个例子中的具体引发剂构建的，其中Parj1.0103和Parj2.0101描述于González-Rioja等人的“Expression and purification of the recombinant allergens Par j1and Par j2”XXIII Congreso EAACI，Abstracts Book(2004)，181-182中。引发剂各种不同限制性内切核酸酶(下划线)的切断位点的杂交区，以及一些锚定核苷酸组成。PCR-引起的扩增反应在50μl的反应体积内具有以下组分：扩增缓冲液x10，5μl；200μM的dNTPs；100皮摩尔的各种引发寡核苷酸：2.5单位的聚合酶Taq(Pfx DNA聚合酶，Invitrogen)；1ng DNA基质和使体积达到50μl的无菌蒸馏水.扩增反应在RoboCycler热循环仪(Stratagene)中进行，反应进行具体条件将在每个情况中在下面描述。将反应产物在琼脂糖凝胶(2％)中进行电泳，用Geneclean(Bio101)按厂商描述的方法从凝胶中分离出目的带。分离出的片段用合适的限制性酶进行消化，并连接到用相同的酶消化过的pBluescript载体上。连接混合物被用于对大肠杆菌DH5α的感受态细胞(来自Invitrogen，Paisley，UK)进行转化。使所得菌落进行生长以分离出它们的质粒DNA，其用适合的酶来消化以释放出目的片段。选择阳性克隆对之进行测序。插入到pBluescript中的DNA的测序是通过使用荧光二脱氧核苷酸的改进Sanger’s法[(30)Hanahan，D.(1983).Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.J.Mol.Biol.166，557-580]，在热循环仪中用PRISM Ready Reaction DiDeoxyTermination Cycle Sequencing Kit(Perkin Elmer)按厂商说明进行的。
A)嵌合蛋白质Q1
在此例中，两种蛋白质(Parj1和Parj2)的完全序列被融合，以获得具有去稳定的三级结构但保持了其完整的连续IgE表位的蛋白质。为了获得称为Q1的构建物，使用克隆进载体KS-Bluescript中的Parj1和Parj2的cDNA作为基质。为了融合两个序列，需要具有接头，在EcoRI靶的情况，为在Parj1序列的C-末端和在Parj2序列的N-末端，来完成片段的随后连接。所述靶被添加到相应的合成寡核苷酸(F1R1和F1F2)，并整合到PCR过程中扩增的片段中。
使用的合成寡核苷酸：
片段1：F1F1，CG GGATCC TGCAAGAAACCTGCGG(BamHI)和F1R1，CG GAATTC GGCTTTTTCCGGTGCGG(EcoRI)。条件：94℃，4min(1次循环)；94℃，30s-53℃，30s-72℃，90s(5次循环)；94℃，30s-60℃，30s-72℃，90s(35次循环)；72℃，10min(1次循环)。
片段2：F1F2，CG GAATTC GAGGAGGCTTGCGGGA(EcoRI)和F1R2，CG AAGCTT CTAATAGTAACCTCTGA(HindIII)。条件：94℃，4min(1次循环)；94℃，30s-51℃，30s-72℃，90s(5次循环)；94℃，30s-59℃，30s-72℃，90s(35次循环)；72℃，10min(1次循环)。
产生了分别对应于Parj1和Parj2的两种PCR产物。对它们中的第一种(Parj1)，合成的寡核苷酸F1F1和F1R1分别用于N和C末端，获得了大约420个碱基对(pb)的大小。经扩增的片段克隆在pKS-Bluescript载体中，且证实了它的序列。对与Parj2相对应的第二种片段，采用相同的程序，分别使用寡核苷酸F1F2和F1R3作为N和C末端。这种情况下，获得了大约为300pb的片段，将其克隆在pKS-Bluescript载体中，且证实了它的序列。通过EcoRI靶经连接将该第二个片段接合到第一个片段上，Parj1在N-末端，Parj2在C-末端，所得片段随后亚克隆在商用表达载体pQE-32(Qiagen)中，该pQE-32在N-末端含有额外的相当于亲和尾的13个氨基酸序列(图2)。所述序列编码具有256个氨基酸且表观分子量为28070Da的多肽。
A)嵌合蛋白质Q2
当获得该嵌合体时，两种蛋白质的片段都被结合但不包括任何描述的连续的IgE表位[(18)Asturias，J.A，Gómez-Bayón，N.，Eseverri，J.L.，andMartínez，A.(2003).Par j1and Par j2，the major allergens from Parietariajudaica pollen，have similar immunoglobulin E epitopes.Clinical andExperimental Allergy33，518-524].设计出了包括以下片段的一些合成寡核苷酸：Parj1(残基1-28和53-139的片段)和Parj2(残基1-28和53-103的片段)(图3和图4)。这样，就消除了含IgE表位的序列部分。
四种片段(每种变态反应原各两种)被扩增用于该构建物，且克隆在pKS Bluescript载体中的Parj1和Par j2的cDNA被用作基质。新的蛋白质的构建机制是使用限制性酶(在此种情况为PstI，EcoRi和EcoRV)来进行不同扩增片段的连续接合。
使用的合成寡核苷酸：
片段1：F1F1，CG GGATCC TGCAAGAAACCTGCGG(BamHI)和F2R1，CG CTGCAG CCCCTTTGACGGCTCTT(PstI)。条件：min(1次循环)；94℃，30s-54℃，30s-72℃，90s(35次循环)；72℃，10min(1次循环)。
片段2：F2F2，CG CTGCAG ATCCAGACCGCCATGAA(PstI)和F2R2，CG GAATTC GGCTTTTTCCGGTGCGGG(EcoRI)。
片段3：F2F3，CG GAATTC GAGGAGGCTTGCGGGAA(EcoRI)和F2R3，CG GATATC CTCCTTCGACGGC TCCTT(EcoRV)。
片段4：F2F4，CG GATATC ATAGTGCGCGCCACGAA(EcoRV)和F1R2，CG AAGCTT CTAATAGTAACCTCTGA(HindIII)。三种片段的条件是：94℃，4min(1次循环)；94℃，30s-54℃，30s-72℃，90s(5次循环)；94℃，30s-62℃，30s-72℃，90s(35次循环)；72℃，10min(1次循环)。
这些中的的第一个，其对应于Parj1(片段1)，合成寡核苷酸F1F1和F2R1被分别用作N和C末端，获得了大约为90个碱基对大小的片段并克隆在pKS-Bluescript载体中。对与Parj1相对应的第二个片段，采用相同的步骤分别使用寡核苷酸F2F2和F2F2作为N和C末端。在这种情况下，获得了大约为260pb的片段并克隆在pKS-Bluescript载体中。该最后一个片段由PstI携带的靶的接头通过连接而结合到第一个片段上，且它的序列得到了证实。
就由Parj2(片段3和4)扩增出的两种片段而言，采用片段1和2中描述的程序。分别用于N和C末端的寡核苷酸F2F3/F2R3和F2F4/F1R4被用于它们的扩增，片段3和4的PCR产物的大小约为90和150pb。片段4由EcoRV携带的靶的接头通过连接而结合到片段3上，且它的序列得到了验证。
在最后一步中，产生的两个新片段(各自用于一种变态反应原)由EcoRI携带的靶的接头通过连接而结合到一起，Parj1在N-末端而Parj2在C-末端。所述片段随后亚克隆在商业表达载体pQE-32中，该pQE-32在N-末端含有对应于亲和尾的额外13个氨基酸的序列(图5)。所述序列对具有212个氨基酸且表观分子量为23336Da的多肽进行编码。
B)嵌合蛋白质Q3
最后的这个构建物除了在这种情况以及试图消除任何可能存在的IgE表位之外，基本上与Q2相同，存在于序列Parj1(残基71-80)和Parj1(残基72-81)(图6和图7)中的另外的额外的8个氨基酸序列被消除。
使用的合成寡核苷酸：
片段1：F1F1，CG GGATCC TGCAAGAAACCTGCGG(BamHI)和F3R1，CG AGATCT GACCTCGCTGACGAG(BglII)。
片段2：F3F2，CG AGATCT AGCAAGCTCCCGCCC(BglII)和F3R2，CG GGTACC GGGGACCTCGGCGAC(KpnI)。2种片段的条件是：94℃，4min(1次循环)；94℃，30s-54℃，30s-72℃，90s(5次循环)；94℃，30s-63℃，30s-72℃，90s(35次循环)；72℃，10min(1次循环)。
片段3：F3F3，CG GGTACC CTCCCGCCCATCACC(KpnI)和F3R3，TTTAAAAAGGCCGTAATATCC。条件：94℃，4min(1次循环)；94℃，30s-56℃，30s-72℃，90s(35次循环)；72℃，10min(1次循环)。
在本例中，构建物Q2-pQE-32被用作基质，对片段1，2和3分别获得了大小约150，370和290pb的产物。使用的寡核苷酸是，对片段1为F3F1和F3R1，对片段2为F3F2和F3R2，以及对片段3为F3F3和F3R3。再次重复先前所述的序列连接步骤。使用的新的限制性酶是BglII和KpnI。在第三种即最后一种片段中，由于它很小只有66pb，因此决定对载体pQE-32-Q2序列的一部分进行扩增以获得较大的片段，从而能够更方便地进行后续的纯化过程。在各步骤中，通过PCR获得的片段克隆在载体pKS-Bluescript中并且验证了它的序列。通过脯氨酸(P)在第一种片段产生了对应于第一个谷酰胺氨基酸(Q)的自发突变。
最后，所得片段在商业表达载体pQE-32中进行亚克隆，该pQE-32在N-末端含有额外的对应于亲和尾的13个氨基酸的序列(图8)所述序列对具有200个氨基酸且表观分子量为21938Da的多肽进行编码。
实施例2：嵌合蛋白质Q1，Q2，和Q3的表达和纯化
从LB平板(分别补充了100和25μg/ml的氨比西林和卡那霉素)上分离菌落开始，产生了50ml的相同培养基的预接种体，并在搅拌下(260rpm)于37℃隔夜培养。用所述预接种体对1升到相同培养基进行接种，从0.2的光学密度(600nm)开始。混合物在37℃下搅拌培养1小时30分钟，然后用IPTG(1mM的终浓度)在相同的培养条件下对其进行诱导3小时。
在Q2的情况下，细胞在4℃，10,000rpm的条件下离心15分钟，再重新悬浮于50ml的裂解缓冲液(磷酸盐20mM，pH7.4；50mM咪唑；0.5M NaCl)中。37℃搅拌下用溶菌酶(终浓度0.1mg/ml)处理重新悬浮的物质30分钟。然后进行超声处理(20秒5脉冲)，并将混合物在4℃，15000rpm下离心15分钟。上清液通过0.45μm(Millex HV，Millipore)过滤，并注入(2.5ml/min)适用于
Figure G2007800133849D0021181321QIETU
KTA Prime system(GE-Healthcare)的5ml Hi-Trap螯合HP柱(GE-Healthcare)。该柱用镍进行螯合，并事先用10体积的裂解缓冲液进行了平衡。用15体积的裂解缓冲液洗涤柱后，用洗脱缓冲液(磷酸盐20mM pH7.4；0.5M咪唑)对结合到柱上的蛋白质洗脱至100％。洗脱物经过5ml Hi-Trap脱盐柱(GE-Healthcare)以除去盐并改变20mM pH7磷酸盐缓冲液样品。将蛋白质保存在-40℃。
在Q1和Q3的情况下，需要额外的纯化步骤。在细胞的诱导之后，将之在4℃，10,000rpm下离心15分钟，并重新悬浮于补充了尿素的50ml的裂解缓冲液中，并采用在前面段落中描述的步骤。在第二步纯化步骤中，将获得的洗脱物注入(1ml/min)事先用PBS平衡了的Hi-Load16/60Superdex-200柱(GE-Healthcare)；在前面段落中描述的缓冲液中进行蛋白质的洗脱。将蛋白质保存在-40℃。
在含SDS的聚酰胺凝胶(SDS-PAGE)中进行电泳。基本上按照Laemmli描述的方法[(31)Laemmli，U.K.(1970).Cleavage of structuralproteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature277，680-685]，采用MINI-PROTEAN电泳装置(Bio-Rad)进行。测量为10x10cm的且具有12.5％的聚丙烯酰胺浓度的凝胶，在tris-甘氨酸缓冲液中，进行200伏特电流45分钟的电泳。用作参照物的蛋白质是用于低分子量的来自Bio-Rad的试剂盒的参照物。分子量的计算和凝胶的光密度分析使用图像分析仪(Diversity，BioRad)进行。
杂化蛋白质Q1表达为32kDa的His-标签的融合蛋白质(图9)，其产生了终浓度2mg/L的细菌培养物。Q2和Q3蛋白质表达为28kDa的His-标签的融合蛋白质，终产量分别为5mg/L和7mg/L的细菌培养物(图9)。
实施例3：纯化的杂化分子的圆二色性分析
用配备了20℃恒温槽的Jasco PTC-423S温度控制器的JascoJ-810旋光分光计记录pH7.0和20℃时的Far-UV(190-250nm)CD图谱。在0.2cm槽中的20mM磷酸钠缓冲液中的蛋白质的浓度为0.035mg/ml，累计进行40次扫描。所有的图谱均减去适当的背景，并转化为平均残基椭圆率。
用天然墙草属变态反应原混合物(Parj1和Parj2)和杂化蛋白质通过CD图谱分析二级结构元素(图10)。它们当中的杂化蛋白质的图谱几乎完全相同，但与天然的变态反应原的CD图谱完全不同。NPA图谱在208nm出现最小值，在222nm出现清晰的肩峰，并在190nm出现最大值，而杂化蛋白质的图谱向几乎达到完全非折叠状态的无规卷曲构象移动。
实施例4：免疫学试验，以显示嵌合蛋白质对对欧蓍草过敏的患者的血清混合物具有低的IgE-固定反应活性
(A)免疫检测
对融合体1，2和3的IgE-接合活性的首次评价是通过免疫转移法采用对欧蓍草过敏的患者的血清混合物进行的。蛋白质提取物和纯化的蛋白质被载入聚丙烯酰胺凝胶后，按照Towbin等人的方法进行电转移[(32)Towbin，H.，Staehelin，I.，and Gordon，J.(1979).Electrophoretic transfer ofproteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:Procedure and someapplications.Proc.Natl.Acad.Sci.USA76，4350-4354]。为此，由SDS-PAGE分离的蛋白质被电刺穿到PVDF Hybond-P膜(GE-Healthcare)。膜在环境温度下阻断1小时后，立即将它们用第一抗体在4℃隔夜温育，并且在用相同洗涤缓冲液洗涤数次后，将膜在环境温度下用过氧化物酶偶联第二抗体温育1小时。采用ECL化学发光法(GE-Healthcare)，按照厂商描述，将膜暴露于胶片(Hyperfilm.ECL，GE-Healthcare)，检测到了带。
免疫检测试验显示在三种融合体之间不同的IgE-接合能力；仅在Q1的情况下出现对IgE抗体的识别(图11)。在Q2的情况下，对IgE抗体的识别出现急剧的下降，而在Q3的情况下，对IgE抗体的识别为0。
B)直接ELISA
IgE对三种融合体的反应性用ELISA法用来自对欧蓍草过敏的患者的单个血清分析。在环境温度下用在PBS缓冲液(磷酸盐10mM pH7.2；137mM NaCl2.7mM KCl)中的每杯1μg欧蓍草提取蛋白质或0.1μg纯蛋白质隔夜温育聚苯乙烯盘(Greiner)。它们用200μl/杯的补充了1％BSA-0.05％Tween20的PBS进行封闭，并且保存在37℃1小时。加入100μl/杯的来自过敏患者的血清(稀释1/10)，并在37℃温育90分钟。经3次用200μl/杯的PBS-T(PBS+0.05％Tween20)洗涤后，加入100μl/杯的对偶联过氧化物酶的人类IgE免疫球蛋白(Dako)的抗血清(稀释1:1000)，并在37℃温育90分钟。经3次用PBS-T洗涤后，加入按厂商说明配制的200μl/杯的邻苯二胺(Sigma-Fast Tablet Sets，Sigma)溶液，并将盘保存在黑暗中30分钟。用50μl/杯的3M H2SO4终止反应，并在ELISAEasy ReaderEAR-400AT(SLT-Lab Instruments)酶表仪中测量492nm处的吸收。
仅在Q1的情况中显示出对IgE的反应性，而在Q2和Q3两种情况下均显示基本上没有对IgE抗体的识别(图12)。
C)ELISA抑制
对于ELISA抑制实验，将对欧蓍草过敏的患者的血清混合物在抑制蛋白质的给定浓度下(1-1000ng/ml)在4℃隔夜预温育。后面的进行步骤与ELISA直接测试中描述的相同。
在用欧蓍草过敏的患者的血清混合物进行的ELISA抑制实验中，Q1表现出的对欧蓍草花粉的IgE-结合活性的抑制程度约为50％，这比nParj1-Parj2的抑制程度(92％)低一些，从而有必要加入多500倍的蛋白质(图13)。嵌合体Q2和Q3达到约为60％的最大抑制程度，但要达到相同程度的抑制，它们需要的蛋白质浓度比nParj1-Parj2需要的要高出10,000倍，这说明了这些嵌合体的变应原性降低了约99.99％。
实施例5：显示嵌合蛋白质Q1，Q2，和Q3的低皮肤反应性的活体内实 验
进行活体内皮肤反应(点刺)实验来评价嵌合体1，2和3的低变应原性，只在确定候选低变应原分子，以能够研发满意的针对对欧蓍草花粉过敏的免疫疗法。
使用欧蓍草提取物，在大肠杆菌中表达的nParj1-Parj2，rParj1和rParj2，以及嵌合体1，2和3进行皮肤试验。纯化的蛋白质在含有0.5％苯酚和50％甘油的盐水中稀释。在天然Parj，Parj2，Q1的情况下使用的浓度为0.5，5，和50μg/ml；而在Q2或Q3的情况下使用的浓度为5，50和250μg/ml。分别使用0.9％NaCl和盐酸组胺(10mg/ml)作为阴性和阳性对照。
在实验中，将每种待检测的变态反应原液滴沉积在前臂的手掌区，然后用柳叶刀通过液滴穿刺。每个测试进行两次，分别沿浓度增加和减小的相反方向进行。15分钟后，用尖端细的黑色记号笔勾画出斑点的轮廓。将低变应原的胶带置于斑点上，并轻微按压使墨水痕迹印到带上；并将之转移到斑点记录板上。斑点面积通过用Summasketch数字化图形输入板扫描记录以及计算机辅助的设计程序(Autocad v.11)而测定。
所得的结果通过进行统计分析将结果描绘在方块图中并用Wilcoxon检验相关变量进行说明(图14)。这些图解表明对应皮肤反应的值的分布(以斑点面积mm2测定)与关于提取物(平均值为65.25mm2-置信区间95％:54.98-75.53)和nParj1-Parj2(平均值为106.80mm2-置信区间95％:91.90-121.70)的三种嵌合体的情况显著不同(P<0.001)。嵌合体2和3的值几乎为0：Q2(平均值为0.95mm2-置信区间95％:0-2.89)以及Q3(平均值为0.15mm2-置信区间95％:0-0.47)。
实施例6：显示嵌合蛋白质O1，O2，和O3低的IgE抗体结合能力的 实验
作为对活体内实验的补充，使用EAST-直接法通过确定特异的IgE来再次进行离体实验。
根据Ceska等人的方法[(33)Ceska，M.and Lundkvist，U.(1972).A newand simple radioimmunoassay method for the determination ofIgE.Immunochemistry9，1021-1030]，通过将天然的和重组的蛋白质(50μg/ml)以及欧蓍草提取物(2mg/ml)偶联至用溴化氰活化过的盘来确定特异的IgE。随后加入50μl患者的血清，并在环境温度下温育1小时。洗涤后，将盘在37℃下用接合到碱性磷酸酯酶上的人抗IgE抗体温育30分钟，然后按照厂商(Hycor Biomedical Inc.)用提供的IgE特异性Hytec试剂盒EIA进行定量。
获得的结果再次验证了在活体内实验中的结果；在三种嵌合体中，Q1保持了它相对于nParj1-Parj2的免疫能力，而Q2和Q3在所述能力上产生了显著下降(P<0.001)(图15)。
实施例7：诱导的淋巴增殖实验，以显示嵌合蛋白质O1，O2和O3 的免疫能力
在免疫疗法中使用低变应原分子的一个基本要求是保持它的抗原性(T表位)。因此，为验证除了不结合IgE抗体外，我们的蛋白质是否保持抗原性，在由在实验中使用的各种蛋白质刺激的单核外周血细胞(CMSP)上进行了淋巴增殖试验。试验通过比色法进行，其原理是用活细胞的线粒体脱氢酶对四唑盐WST-1进行消化而形成通过比色法测量的甲臜化合物。
通过重力梯度离心使用淋巴细胞分离溶液(Lymphoprep，Nycomed)对来自13名对欧蓍草过敏的患者的CMSP进行分离。然后将CMSP以1x106活细胞/ml重新悬浮于培养基中(无血清的培养基AIM V，Gibco)，并用0.25％的PBS中的台盼蓝(Sigma Chemical Co.)测定它们的生存力。制备出的生存力大于90％的CMSP按照厂商的描述(细胞增殖试剂WST-1，Roche Diagnostics)被立即用于离体增殖测试。它们被沉积在平底的微盘(Nunclon，NUNC)中，200μl最终体积的培养基中有2x105CMSP，并在37℃和5％CO2湿润的空气中用纯化至终浓度为0.0005-0.005-0.05-0.5-5μg/ml的欧蓍草提取物和各种蛋白质进行测量，取三次测量值。在所有的情况下均包括了未受刺激的培养物的三组对照。3天后，将20μl的细胞增殖试剂WST-1加入到所有的杯中，并温育4小时。由新陈代谢活跃的细胞产生的甲臜化合物通过在450nm的吸收进行定量。用于实验中的重组蛋白质为三种嵌合体以及在大肠杆菌中表达的rParj1和rParj2。
在第一步中，对免疫性蛋白质进行扫描以确定用于后面实验部分的最佳浓度。在所有情况下均发现表现出最大增殖(IE％)的蛋白质浓度为0.5μg/ml(图16)。
用13名对欧蓍草过敏的患者进行的增殖结果通过方块图统计分析以及用于两组成对样品的非参数检验来确定。统计分析表明，用作对照的欧蓍草提取物具有与nParj1-Parj2(P＝0.142)相差不大的抗原刺激能力，并且Q1和Q2表现出的数值分布与提取物(分别为P＝0.152和P＝0.294)和nParj1-Parj2(分别为P＝0.484和P＝0.182)无显著不同(图17)。然而Q3对提取物(P＝0.002)和nParj1-Parj2(P＝0.004)几乎没有刺激能力。另一方面，需要指出的是rParj2和rParj1对提取物(分别为P＝0.142和P＝0.003)和nParj1-Parj2(分别为P＝0.041和P＝0.002)的较强的抗原能力。
所得结果说明Q2仍保留了所述性能，而Q3则完全丧失。由以上所述的为获得不同低变应原的分子来治疗对欧蓍草过敏的步骤可以总结出，Q2应当为候选低变应原的分子，其产生满意的对欧蓍草过敏免疫治疗效果。
施用方法
本发明涉及所述的低变应原嵌合体或由其衍生出的合成肽，以用于哺乳动物中的脱敏治疗。脱敏的方法涉及通过肠胃外途径(皮下的，静脉内的，或肌肉的)，或口腔，舌下，鼻或直肠途径重复施用所述的变态反应原。这些(多)肽可单独施用或与其他药学上可接受的稀释剂和赋形剂组合，根据当前的法规和盖伦制剂使用规程。
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Figure IYZ000004630850400011
Figure IYZ000004630850400021
Figure IYZ000004630850400031
Figure IYZ000004630850400041
Figure IYZ000004630850400051

Claims (14)

1.嵌合蛋白质，其特征在于它由下述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列衍生于对应于称为Par j 1和Par j 2的欧蓍草花粉的主要变态反应原，其中所述衍生于Par j 1和Par j 2的氨基酸序列是通过缺失位于Par j 1和Par j 2的第28-53位的氨基酸序列得到的。
2.权利要求1的嵌合蛋白质，其特征在于它由氨基酸序列SEQ IDNo.：4组成。
3.多核苷酸，由编码权利要求1或2所述的蛋白质的核苷酸序列组成。
4.权利要求3的多核苷酸，由核苷酸序列SEQ ID No.：3组成。
5.在转化的宿主生物内的微生物表达载体，其为自我复制的，并被用于表达权利要求3或4所述的多核苷酸。
6.宿主细胞，其用权利要求5的表达载体进行转化。
7.权利要求6的宿主细胞，该细胞为原核细胞。
8.权利要求7的宿主细胞，该原核细胞属于大肠杆菌(E.coli)属。
9.权利要求6的宿主细胞，该细胞为真核细胞。
10.产生由权利要求1或2中任一项所述的嵌合蛋白质组成的多肽的方法，其特征在于该方法包括培养含有微生物表达载体的宿主生物，其中的微生物表达载体在上述生物中进行自复制，并被用于表达权利要求1或2所述的嵌合蛋白质。
11.纯化权利要求1或2所述的嵌合蛋白质的方法，该方法包括从培养物、细胞或两者分离嵌合蛋白质。
12.权利要求1或2所述的蛋白质在制备治疗免疫病症的药物中的应用，其中免疫病症为对墙草属(Parietaria)花粉的过敏。
13.药物组合物，含有有效量的权利要求1或2所述的蛋白质和药学上可接受的赋形剂。
14.权利要求13所述的药物组合物，其中组合物为疫苗组合物。
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