JP6148088B2 - アレルギー治療に用いるカベイラクサ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａｊｕｄａｉｃａ）の脂質輸送タンパク質ファミリーに属する低アレルギー誘導性のキメラタンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、アレルギー、特に花粉症、最も詳細には脂質輸送タンパク質ファミリー由来のアレルゲン及びより具体的にはパリエタリア（Parietaria）種由来の花粉で見出されるアレルゲンによって引き起こされるアレルギーの予防及び治療のためのキメラタンパク質産生の分野に関する。

Ｉ型アレルギーは、先進国における深刻な健康問題である。この種のアレルギーは、空気によって運ばれる抗原に対するＩｇＥ抗体の形成によって引き起こされる。これらのＩｇＥ抗体は、肥満細胞及び好塩基球と相互作用し、ヒスタミン等の生物学的メディエータを放出し、集団の約２０％でアレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎及びアレルギー性気管支喘息を引き起こす［（１）Miyamoto, T.（1992）著「日本の花粉症有病率の増加（Increased prevalence of pollen allergy in Japan）」 In Advances in Allergology and Clinical Immunology. P. Godard, J. Bousquet及びF. B. Michel編（Cornforth, UK: The Parthenon Publishing Group）, pp. 343-347］。

特異的免疫療法（ＳＩＴ）は、特異的なアレルゲンによって誘発されるアレルギー反応に効果的な治療であり、基本的にはアレルギーを生じるタンパク質（アレルゲン抽出物）を高濃度で定期的に投与することによって患者における免疫反応を調節することから成る。高用量のアレルゲンを注入すると、抗原提示細胞、例えば樹状細胞（好ましくは、協働するバージン細胞（virgin cells）（ｎＴ_Ｈ）であるＴ細胞がＴ_Ｈ１又はＴ_Ｈ０に発達することを促進する）によってＩＬ−１２の高度合成が誘導される。このことが、Ｔ_Ｈ２細胞に関連するアレルギー応答型の免疫応答から、Ｔ_Ｈ１／Ｔ_Ｈ０型の応答への偏向（deviation）を可能にし、高レベルのＩＦＮ−γが産生される［（２）Akdis, CA.及びBlaser, K.（2000）著「アレルゲン特異的免疫療法のメカニズム（Mechanisms of allergen-specific immunotherapy）」 Allergy 55, 522-530］。免疫偏向は、免疫抑制サイトカインＩＬ−１０及びＴＧＦ−βを産生する制御性Ｔ細胞（Ｔ_Ｒ１）の影響下でＴ_Ｈ２記憶細胞の寛容（アンエネルギー（anenergy）又はクローン除去）の誘導によって強まる［（３）Akdis, C.A., Joss, A., Akdis, M.及びBlaser, K.（2001）著「アレルギー炎症におけるＩＬ−１０誘導性の細胞不活性化及びアレルゲンに対する正常な応答のメカニズム（Mechanism of IL-10 induced cell inactivation in allergic inflammation and normal response to allergens）」 Int. Arch Allergy Immunol. 124; 180-182］。Ｔ_Ｈ２細胞の活性化及び増殖の低減は、ＩＬ−４及びＢ細胞によるＩｇＥの産生の低減によって達成される。Ｔ_Ｈ２細胞の活性、並びに鼻粘液及び気管支粘液への浸潤の低減によって、ＩＬ−５合成が低減し、これによって好エオシン性浸潤が低減され、ＭＢＰタンパク質及びＥＣＰタンパク質等の炎症性メディエータの放出が大幅に低減する。優性表現型アレルゲンＴ_Ｈ０のＴ細胞の新規の特異的なクローンは、Ｂ細胞による、大量の特異的なＩｇＧアレルゲン抗体の産生を促進するＴ_Ｈ１型サイトカインとＴ_Ｈ２型サイトカインとの混合物を産生する。一方で、高レベルのＩＬ−１０によって、特異的なＩｇＧ４アレルゲン抗体の高度合成が誘導される。これらの２種類の特異的な抗体は、肥満細胞においてこれらの受容体と結合したＩｇＥ抗体の交差（intersection）を与え、このようにしてヒスタミンの脱顆粒及び放出を阻害する遮断抗体として作用することができる［（４）Moverate, R.（2003）著「花粉ワクチンによる特異的な免疫療法の免疫機構：診断法に関する示唆及び改善されたワクチン接種戦略の開発（Immunological mechanisms of specific immunotherapy with pollen vaccines: implications for diagnostics and the development of improved vaccination strategies）」 Expert Rev. Vacc. 2, 85-97、（５）Wachholz, P.A., Soni, N. K., Till, S.及びDurham, S. R.（2003）著「イネ科花粉の免疫療法後のＩｇＧ抗体によるＢ細胞とのアレルゲン−ＩｇＥ結合の阻害（Inhibition of allergen-IgE binding to B cells by IgG antibodies after grass pollen immunotherapy）」 J. Allergy Clin. Immunol. 112; 915-922］。これらは、抗原含有細胞によるＩｇＥ媒介性の抗原の回収も阻害し、このことはアレルゲンに対する免疫応答を抑制する。

天然源から単離されたアレルゲン抽出物は、タンパク質と他の分子との複雑な混合物である。これらの組成、ひいてはアレルギー誘発性は用いられる物質に依存し、周囲条件、花粉の場合の成熟状態、及び菌類等の場合のダニ等の成長条件によって変わる。幾つかの抽出物は主要なアレルゲンを不十分な濃度でしか含有することができず、また患者がアレルギーではない望ましくない成分で汚染される可能性があるか、又はその両方である。現行の免疫療法は、完全なアレルゲン抽出物を排他的に用い、このことによって、
−ワクチンとエフェクター細胞のＩｇＥとの反応性による深刻な拒絶反応、
−免疫療法後のワクチンに存在する他のアレルゲンに対する新たな感作の発生、
−アレルゲン抽出物の標準化の困難性等の多くの問題が生じる。

これは全て、免疫療法が、要望どおりの安全且つ効率的な治療ではないことを意味する。アレルギーの病因及び特異的な免疫療法のメカニズムのより良好な知識によって、上記問題の解決に近づくことができるようになった。特異的なアレルゲン応答性Ｔ_Ｈ２におけるＩｇＥ媒介性抗原の影響を知ることで、ＩｇＥと結合しないアレルゲンを作製することがますます試みられている。現行の特異的な免疫療法の主な目的は、ＩｇＥエピトープを不活性化し、このようにしてＩｇＥとの結合、及びその結果として拒絶反応を低減及びさらには除去するという目的でアレルゲンを修飾することである［（６）Valenta, R.及びLinhart, B.（2005）著「アレルギーワクチンの分子設計（Molecular design of allergy vaccines）」 Curr. Opin. Immunol. 17, 1-10］。このように、修飾アレルゲンは、食作用／飲作用媒介性の抗原回収機構によってＴ細胞に向けられ、ＩｇＥの交差及びＩｇＥ依存性抗原の提示を防ぐ。このことは、Ｔ細胞によるＴ_Ｈ０又はＴ_Ｈ１サイトカインの産生と、ＩｇＥの産生減少と、Ｂ細胞によるＩｇＧの産生増大との平衡化を誘導する。このこと全てによって、アナフィラキシーの危険性なく、Ｔ_Ｈ２型のＴ細胞寛容が誘導される。アレルゲン及びアレルゲン誘導体を得る組み換え方法の進歩によって、アレルギー治療のために新規のワクチンを開発する能力が大きく増大している。このことは、ＩｇＥエピトープの有意なアミノ酸を突然変異又は欠失する可能性、並びに低アレルギー誘発性ワクチンを得るためのこれらの分別及びオリゴマー化により可能になった。ＩｇＥと結合する能力が低減したが、Ｔ細胞との反応性を維持するこれらの分子は、より大用量で投与することができ、注入回数を少なくして、免疫療法をより迅速に且つ安全にすることができる。さらに、組み換えアレルゲンは、微生物発現系を用いて、発酵タンクで大規模に製造することができ、その精製は、天然の等価物よりも効率的で且つ安価である。免疫療法における低アレルギー誘発性誘導体の使用は、三量体のＢｅｔ ｖ １断片［（７）Niederberger, V., Horak, F., Vrtala, S., Spitzauer, S., Krauth, M. T., Valent, P., Reisinger, J., Pelzmann, M., Hayek, B., Kronqvist, M., Gafvelin, G., Groenlund, H., Purohit, A., Suck, R., Fiebig, H., Cromwell, O., Pauli, G., van Hage-Hamsten, M.及びValenta, R.（2004）著「遺伝子操作したアレルゲンによるワクチン接種はアレルギー疾患の進行を防ぐ（Vaccination with genetically engineered allergens prevents progression of allergic disease）」 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14677-14682］、ハチ毒（bee venon）タンパク質の多アレルギー性ハイブリッド（Ａｐｉ ｍ １、２、３）［（８）Schmid-Grendelmeier, P., Karamloo, F., Mueller, U., Housley-Marcovic, Z., Soldatova, L., Zumkehr, J., Kemeny, D.M., Kuendig, T., Reimers, A., von Beust, B.R., Salagianni, M., Akdis, M., Kussebi, F., Spangfort, M. D., Blaser, K.及びAkdis, C.A.（2005）著「ＩｇＥ結合を低減し、Ｔ細胞エピトープを保存した、組み換え型の多アレルゲンワクチンによるアレルギーの予防（Prevention of allergy by a recombinant multi-allergen vaccine with reduced IgE binding and preserved T cell epitopes）」 Eur. J. Immunol. 35, 3268-3276］、及びそれらの三次構造を除去するためのＰａｒ ｊ ２とＰａｒ ｊ １との突然変異融合物を用いてこれまでに記載されている。

何人かの著者は、ＩｇＥとの結合が、高親和性及び低親和性の両方のＩｇＥに対する表面受容体を発現する、樹状細胞及び活性化Ｂリンパ球細胞としてのプロフェッショナル抗原提示細胞によって、アレルゲンの捕捉及び提示を容易にし得るので、アレルギーワクチンは低アレルギー誘発性のアレルゲン（hypoallergens）では構成されていないはずであることを言及してる。このプローチは、免疫療法において舌下経路を用いる場合に特別な意味がある。また、高親和性の受容体の交差によって、アレルゲンに対するＴ細胞の応答が低減され得る［（９）Allam, J.P., Novak, N., Fuchs, C., Asen, S., Berge, S., Appel, T., et al.（2003）著「ヒトの口腔粘膜由来の樹状細胞の特徴付け：構成的なＦｃεＲＩの発現が高い、新規のランゲルハンス細胞型（Characterization of dendritic cells from human oral mucosa: a new Langerhans' cell type with high constitutive FcεRI expression）」 J. Allergy Clin. Immunol. 112, 141-8、（１０）von Bubnoff, D., Matz, H., Frahnert, C., Rao, M. L., Hanau, D., de la Salle, H., Bieber, T.（2003）著「ＦｃεＲＩはＴ細胞応答の調節に関与するトリプトファン分解経路を誘導する（FcεRI induces the triptophan degradation pathway involved in regulating T cell responses）」 J. Immunol. 169, 1810-1816］。多くの研究者らは未だに、欠失を導入することなくこの種のワクチンを製造している［（１１）Batard, T., Didierlaurent, A., Chabre, H., Mothes, N., Bussieres, L., Bohle, B., et al.（2005）著「カバノキ花粉症に対する候補ワクチンとしての野生型の組み換えＢｅｔ ｖ １ａの特徴付け（Characterization of wild-type recombinant Bet v 1a as a candidate vaccine against birch pollen allergy）」 Int. Arch. Allergy Immunol. 136, 239-249、（１２）Jutel, M., Jaeger, L., Suck, R., Meyer, H., Fiebig, H., Cromwell, O.（2005）著「組み換えイネ科花粉アレルゲンによるアレルゲン特異的な免疫療法（Allergen-specific immunotherapy with recombinant grass pollen allergens）」 J. Allergy Clin. Immunol. 116, 608-13、（１３）Niederberger, V., Horak, F., Vrtala, S., Spitzauer, S., Krauth, M.T., Valent, P., et al.（2004）著「遺伝子操作したアレルゲンによるワクチン接種はアレルギー疾患の進行を防ぐ（Vaccination with genetically engineered allergens prevents progression of allergic disease）」 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14677-82、（１４）Cromwell, O., Fiebig, H., Suck, R., Kahlert, H., Nandy, A., Kettner, J., et al.（2006）著「組み換えアレルゲンワクチンの戦略及び最初の臨床研究の有益な結果（Strategies for recombinant allergen vaccines and fruitful results from first clinical studies）」 Immunol. Allergy Clin. N. Am. 26, 261-81］。

パリエタリアは、草本性双子葉植物綱（genus）イラクサ科イラクサ目である。パリエタリア属の様々な種が地中海沿岸に幅広く豊富に分布している［（１５）Colombo, P., Duro, G., Costa, M.A., Izzo, V., Mirisola, M., Locorotondo, G., Cocchiara, R.及びGeraci, D.（1998）著「アレルゲンの最新情報。パリエタリア花粉のアレルゲン（An update on allergens. Parietaria pollen allergens）」 Allergy 53, 917-921］。最も一般的な種は、カベイラクサ及びパリエタリア・オフィキナリス（P. officinalis）であるが、パリエタリア・ルシタニカ（P. lusitanica）、パリエタリア・マウリタニカ（P. mauritanica）、及びパリエタリア・クレティカ（P. cretica）等の他の種が幾つかの地域で幾らか存在し得る。それにもかかわらず、パリエタリア花粉の存在がイングランド南部、オーストリア、中東欧の温帯地方、オーストラリア及びカリフォルニアで示されたので、地中海地域は、パリエタリア花粉が見出された唯一の場所というわけではない［（１６）Colombo, P., Bonura, A., Costa, M., Izzo, V., Passantino, R., Licorotondo, G., Amoroso, S.及びGerasi, D.（2003）著「パリエタリアのアレルゲン（The allergens of Parietaria）」 Int. Arch. Allergy Immunol. 130, 173-179、（１７）Carreira, J.及びPolo, F.（1995）著「オリーブ及びパリエタリア種のアレルゲン並びに地中海地方におけるこれらの関連性（The allergens of Olea europaea and Parietaria spp. and their relevance in the Mediterranean Area）」 Allergy Clin. Immunol. News 7, 79-84］。パリエタリアの顕著な特徴は、数ヶ月間続く長い受粉期間であり、パリエタリアに対してアレルギーである患者において、軽度の鼻結膜炎から重症喘息までに及ぶ、ほとんど永続的な症状が現れる。顕著な交差反応性が様々な種のパリエタリア間で示されたので、パリエタリアに対する通常の軽い単一特異的な感作は、この属の様々な種に対する感作を伴う。

２つの最も一般的な種であるカベイラクサ及びパリエタリア・オフィキナリスのアレルギー誘発性画分の精製及び特徴付けに関して様々な文献が提示されている。これらの画分の分子量は、１０ｋＤａ〜１４ｋＤａの範囲であり、これらの抽出物のアレルギー誘発力全体に実質的に関与している［（１６）Colombo, P., Bonura, A., Costa, M., Izzo, V., Passantino, R., Licorotondo, G., Amoroso, S.及びGerasi, D.（2003）著「パリエタリアのアレルゲン（The allergens of Parietaria）」 Int. Arch. Allergy Immunol. 130, 173-179、（１８）Ayuso, R., Carreira, J., Lombardero, M., Duffort, O., Peris, A., Basomba, A.及びPolo, F.（1993）著「２つのＰａｒ ｊイソアレルゲンの、ｍＡｂに基づいたアフィニティクロマトグラフィによる単離。これらの物理化学、免疫化学及びアレルギー誘発性の特性の比較（Isolation by mAb based affinity chromatography of two Par j isoallergens. Comparison of their physicochemical, immunochemical and allergenic properties）」 Mol. Immunol. 30, 1347-1354、（１９）Polo, F., Ayuso, R.及びCarreira, J.（1990）著「カベイラクサ花粉の主要なアレルゲンのＨＰＬＣ精製（HPLC purification of the main allergen of Parietaria judaica pollen）」 Mol. Immunol. 27, 151-157、（２０）Polo, F., Ayuso, R.及びCarreira, J.（1991）著「カベイラクサのアレルゲンＩの構造と、ＩｇＥ結合能との間の関係に対する研究（Studies on the relationship between structure and IgE-binding ability of Parietaria judaica allergen I）」 Mol. Immunol. 28, 169-175］。組み換えＤＮＡ技術の発展によって、パリエタリア花粉のアレルゲンの分子の特徴付けを完了させることができた。Ｐａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２として知られるカベイラクサ花粉の２つの主要なアレルゲンをクローニング及びシーケンシングした［（２１）Duro, G., Colombo, P., Costa, M.A., Izzo, V., Porcasi, R., DiFiore, R., Locorotondo, G., Mirisola, M.G., Cocchiara, R.及びGeraci, D.（1996）著「カベイラクサ花粉の新たな主要なアレルゲンであるＰａｒ ｊ ２．０１０１のｃＤＮＡクローニング、配列解析及びアレルギー学的特徴付け（cDNA cloning, sequence analysis and allergological characterization of Par j 2.0101, a new major allergen of the Parietaria judaica pollen）」 FEBS Lett. 399, 295-298、（２２）Costa, M.A., Colombo, P., Izzo, V., Kennedy, H., Venturella, S., Cocchiara, R., Mistrello, G., Falagiani, P.及びGeraci, D.（1994）著「カベイラクサ花粉の主要なアレルゲンであるＰａｒ ｊ ＩのｃＤＮＡクローニング発現及び一次構造（cDNA cloning expression and primary structure of Par j I, a major allergen of Parietaria judaica pollen）」 FEBS Lett. 341, 182-186、（２３）Amoresano, A., Pucci, P., Duro, G., Colombo, P., Costa, M.A., Izzo, V., Lambda, D.及びGeraci, D.（2003）著「カベイラクサ花粉の主要なアレルゲンであるＰａｒ ｊ ２．０１０１のジスルフィド架橋の評価（Assignment of disulphide bridges in Par j 2.0101, a major allergen of Parietaria judaica pollen）」 Biol. Chem. 384, 1165-1172］。両方のアレルゲンが非特異的脂質輸送タンパク質（ｎｓ−ＬＴＰ）のファミリーに属し、これらの末端領域でシグナルペプチドを保有しており、プロセシング後に、分子量がそれぞれ１４７２６Ｄａ及び１１３４４Ｄａであり、約４５％の同一残基を有するタンパク質を生じる。両方のアレルゲンにおいて構造的関連域に位置する可能性があるＩｇＥ結合直線状エピトープが記載されている［（２４）Asturias, J.A., Gomez-Bayon, N., Eseverri, J.L.及びMartinez, A.（2003）著「カベイラクサ花粉の主要なアレルゲンであるＰａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２は、同様の免疫グロブリンＥエピトープを有する（Par j 1 and Par j 2, the major allergens from Parietaria judaica pollen, have similar immunoglobulin E epitopes）」 Clinical and Experimental Allergy 33, 518-524］。カベイラクサ花粉に対するアレルギーの治療に最適な低アレルギー誘発性の分子を得ることができるために、これらの領域は作用性の標的である。

ｎｓ−ＬＴＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの極性脂質の膜間の交換及び／又は移動を完了させることができることが知られている［（２５）van Ree, R.（2002）著「食物アレルゲンとしての非特異的な脂質輸送タンパク質の臨床的重要性（Clinical importance of non-specific lipid transfer proteins as food allergens）」 Biochem. Soc. Trans 30, 910-913］。分子質量が約９ｋＤａであるＬＴＰ１及び分子質量が約７ｋＤａであるＬＴＰ２の２つの主要なファミリーが植物で特徴付けられている。ＬＴＰファミリーに属するアレルゲンが、幅広く研究された、食物以外の植物で同定されている。したがって、パラゴムノキ（Hevea brasiliensis）のラテックス由来のＨｅｖ ｂ １２は、バラ科の果実のアレルギー誘発性ＬＴＰと約６５％の配列同一性を示す９．３ｋＤａの塩基性タンパク質である［（２６）Beezhold, D.H., Hickey, V.L., Kostyal, D.A., and et al.（2003）著「パラゴムノキ由来の脂質輸送タンパク質（Ｈｅｖ ｂ １２）、交差反応性ラテックスタンパク質（Lipid transfer protein from Hevea brasiliensis (Hev b 12), a cross-reactive latex protein）」 Ann Allergy Asthma Immunol 439-445］。さらに、オウショウヨモギ（Artemisia vulgaris）のＡｒｔ ｖ ３［（２７）Diaz-Perales, A., Lombardero, M., Sanchez-Monge, R., and et al.（2000）著「潜在的な植物パンアレルゲンとしての脂質輸送タンパク質：ＩｇＥ結合能が異なる、ヨモギ属の花粉、クリ属の実、バラ科の果実のタンパク質間の交差反応性（Lipid-transfer proteins as potential plant panallergens: cross-reactivity among proteins of Artemisia pollen, Castanea nut and Rosaceae fruits, with different IgE-binding capacities）」 Clin Exp Allergy 1403-1410］及びオリーブのＯｌｅ ｅ ７［（２８）Tejera, M.L., Villalba, M., Batanero, E.及びRodriguez, R.（1999）著「オリーブの木の花粉の新規のアレルゲンであるＯｌｅ ｅ ７の同定、単離及び特徴付け（Identification, isolation, and characterization of Ole e 7, a new allergen of olive tree pollen）」 J. Allergy Clin. Immunol. 797-802、（２９）Rodriguez, R., Villalba, M., Batanero, E., and et al.（2002）著「オリーブ花粉のアレルギー誘発性の多様性（Allergenic diversity of the olive pollen）」 Allergy 6-16］等の幾つかの花粉アレルゲンがＬＴＰとして記載されており、９ｋＤａ〜１０ｋＤａであり、食物のアレルギー誘発性ＬＴＰと３０％〜５５％の配列同一性を有する。一方で、互いに約４５％の配列同一性を有する、カベイラクサの主要なアレルゲンであるＰａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２はそれぞれ１４．７ｋＤａ及び１１．３ｋＤａと、ＬＴＰファミリーにおける通常のものよりも分子量が高い［（１６）Colombo, P., Bonura, A., Costa, M., Izzo, V., Passantino, R., Licorotondo, G., Amoroso, S.及びGerasi, D.（2003）著「パリエタリアのアレルゲン（The allergens of Parietaria）」 Int. Arch. Allergy Immunol. 130, 173-179］。しかし、両方のアレルゲンがＬＴＰと同様の構造を有するが、これらは共通の配列領域で食物ＬＴＰとの適度なレベルの同一性を有する（Ｐａｒ ｊ １とモモのＬＴＰとの間で２８％）。

国際公開特許第ＷＯ２００５／０８５２７８号は、カベイラクサの２つの主要なアレルゲンを含む融合タンパク質の構築物を開示しており、アレルゲン配列が本質的に同じ長さを維持するように、この融合タンパク質の三次元構造が、それぞれのアレルゲンの一次配列における或る特定のシステイン残基（より具体的には、ジスルフィド架橋の形成を伴うシステイン残基）の置換によって破壊される。後の実験によると、このことが、天然のアレルゲンよりもアレルギー誘発性が１０００倍低いタンパク質をもたらすと考えられる。

本発明者らは、アレルギー誘発性の驚くほど大きな低減は、アレルゲンの三次元構造を破壊するだけでなく、幾つかのＩｇＥ結合部位（Ｂエピトープとして知られる）の欠失によっても得ることができること、及び最も驚くべきことは、これによって免疫原性が低減されないことを発見している。

本発明は、より少数のＩｇＥ結合エピトープを含有するカベイラクサの２つのアレルゲン（Ｐａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２）の断片を結合させることによって得られた様々なキメラタンパク質、並びにそれらを得るための様々な方法及び中間物を初めて開示する。本発明のキメラタンパク質の三次元構造を破壊するだけでなく、或る特定のＢエピトープが欠失されてもいる。本発明によるキメラタンパク質は、ｉ）カベイラクサに対してアレルギーの患者由来の血清混合物を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＡ阻害試験及び免疫検出試験、ｉｉ）カベイラクサに対してアレルギーの患者における皮膚反応性のｉｎ ｖｉｖｏ試験、ｉｉｉ）カベイラクサに対してアレルギーの患者由来の個々の血清によるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＡＳＴ阻害試験に基づき、ＩｇＥ抗体との結合能が低いので、アレルギー誘発性が９９．９９％低減した低アレルギー誘発性と呼ぶことができる。一方で、カベイラクサに対してアレルギーの１３人の患者由来の末梢血単核球（ＣＭＳＰ）のリンパ球増殖試験によって示されるように、本発明によるキメラタンパク質は、免疫原性能を維持する。

アレルギー誘発性抽出物は、タンパク質と非タンパク質分子との複雑な混合物である。抽出物成分に対する特定のＩｇＥのレベルを検出する技法の使用を増やすことで、アレルギー患者が通常、様々な成分に対して反応性があることを実証することが可能になっている。単一のアレルゲンにのみ反応するアレルギー患者の症例は珍しい。アレルギー誘発性抽出物には、免疫療法において明らかな問題があるので、単一の分子でできる限り多くの治療的特性をグループ分けすることが１つの解決策である。

本発明者らは、１つの分子中に２つのアレルゲンを混合させることに成功し、このことによって、産業上の製造及び治療の観点から利益を受けるだけではなく、免疫原性を変えない、アレルギー誘発性の有意な低減も示される。

これらの理由で、本発明は、アレルゲンＰａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２の断片から構成されたキメラタンパク質（以下、Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３と呼ばれる）に関し、これは、幾つかのＩｇＥ結合Ｂエピトープが欠失しているので、免疫原性能を損なうことなく、アレルギー反応性を低減させる。このように、得られたキメラポリペプチドは、２つの個々のタンパク質の合計よりも分子量が小さい。

本発明は、上記のキメラポリペプチドをコードするＤＮＡを含むヌクレオチド配列にも関し、発現系は発現及び制御に必要な配列を伴う当該配列を含み、受容体細胞は当該発現系によって形質転換される。

本発明は、このキメラポリペプチドの臨床使用に、アレルギーの治療に特異的な免疫療法に、並びにこのキメラポリペプチドが生じる可能性がある組成物及びその様々な投与方法にも関する。

免疫療法において用いられることが可能な本発明のキメラタンパク質の低アレルギー特性が広く実証されている。本発明者らによって行われた免疫検査によって、図１０及び図１１で示されるように、キメラＱ２は、カベイラクサに対してアレルギーの患者の血清中でＩｇＥを認識しないことが示される。図１２で示されるように、Ｑ２のＩｇＥ結合能は、２つの天然タンパク質の混合物のものの１００００倍低い。

この低いアレルギー誘発性のデータは、皮膚プリックテストでの３０人の患者におけるｉｎ ｖｉｖｏ実験によって制限を受けた。キメラＱ１のアレルギー誘発性は、２つの単離された天然タンパク質で得られたものよりも３．５倍低かった（図１３）。他方では、記載のＢエピトープを全く含有せず、Ｐａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２の断片によって形成された、Ｑ２のアレルギー誘発性は、２つの単離された天然タンパク質で得られたものよりも１１２倍低かった。

キメラＱ２の低アレルギー誘発性（ＩｇＥ結合能）は、カベイラクサに対してアレルギーの３０人の患者の血清で、この分子の反応性を測定することによって確認された（図１４）。驚くべきことに、このアレルギー誘発性の低減は、個々の天然タンパク質を合計したものとは異ならない、キメラＱ２の免疫原性能の維持を伴っていた（図１６）。

免疫原性の維持によって、このキメラを、完全ではあるが、はるかに安全な（アレルギー誘発性が低い）抽出物に対する代替物として用いることが可能になる。

株の寄託
本発明に対応する微生物株は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブタペスト条約に従って、バレンシア大学（Universidad de Valencia, Edificio de Investigacion, Campus de Burjasot, 46100 BURJASOT, Valencia）にあるスペインの基準菌株コレクション（Spanish collection of type cultures）（ＣＥＣＴ）で２００６年３月７日に寄託され、大腸菌株ＣＥＣＴ７１４１の参照番号を有する。

Ｑ１の構造図である。 Ｑ１のアミノ酸及びヌクレオチドの配列を示す図である。ベクターｐＱＥ−３２の親和性末端に対応する残基には下線が引かれている。ＥｃｏＲＩ（ＥＦ）セクションによって導入された残基は陰影を付けている。システイン残基は二重下線が引かれている。 Ｐａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２のＩｇＥエプトープ（囲み線）と、Ｔエピトープ（下線）との比較を示す図であり、太線の囲み線はＱ２欠失エピトープを示す。同一の残基（：）及び同様の残基（．）が標識されている。 Ｑ２の構造図である。 Ｑ２のアミノ酸及びヌクレオチドの配列を示す図である。ベクターｐＱＥ−３２の親和性末端に対応する残基は下線が引かれている。ＥｃｏＲＩ（ＥＦ）、ＰｓｔＩ（ＬＱ）、及びＥｃｏｒＲＶ（ＤＩ）セクションによって導入された残基は陰影を付けている。システイン残基は二重下線が引かれている。 Ｐａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２のＩｇＥエプトープ（囲み線）と、Ｔエピトープ（下線）との比較を示す図であり、太線の囲み線はＱ３欠失エピトープを示す。同一の残基（：）及び同様の残基（．）が標識されている。 Ｑ３の構造図である。 Ｑ３のアミノ酸及びヌクレオチドの配列を示す図である。ベクターｐＱＥ−３２の親和性末端に対応する残基は下線が引かれている。ＥｃｏＲＩ（ＥＦ）、ＰｓｔＩ（ＬＱ）、ＥｃｏｒＲＶ（ＤＩ）、Ｂｇ１ＩＩ（ＲＳ）及びＫｐｎＩ（ＧＴ）セクションによって導入された残基は陰影を付けている。システイン残基は二重下線が引かれている。 電気泳動後のポリアクリルアミドゲルのクマシーブルーによる染色を示す図である：Ｑ１（レーン１）、Ｑ２（レーン２）、Ｑ３（レーン３）。 精製タンパク質ｎＰａｒ ｊ １−ｎＰａｒ ｊ ２、Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３の円偏光二色性分析の結果を示す図である。 カベイラクサに対してアレルギーである患者の血清混合物のＩｇＥ抗体による免疫検出を示す図であり、この図は、ｎＰａｒ ｊ １−ｎＰａｒ ｊ ２（レーン１）、ｒＰａｒ ｊ １（レーン２）、ｒＰａｒ ｊ ２（レーン３）、Ｑ１（レーン４）、Ｑ２（レーン５）、Ｑ３（レーン６）から成る。 カベイラクサに対してアレルギーである患者由来の１５個の血清（１０倍希釈）を用いて、Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３に対するＩｇＥ抗体の結合を示す図である。３つの実験値は偏差で示される。 固相中のカベイラクサ抽出物、並びにカベイラクサに対してアレルギーである患者の血清混合物を用いて、阻害剤としてｎＰａｒ ｊ １−Ｐａｒ ｊ ２、Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３を用いたＥＬＩＳＡ阻害試験の結果を示す図である。それぞれの値は、標準偏差が１０％未満の３つの実験の平均に対応している。 カベイラクサ抽出物、ｎＰａｒ ｊ １−Ｐａｒ ｊ ２及びＱ１（５０μｇ／ｍｌ）、並びにＱ３（２５０μｇ／ｍｌ）によって行われた皮膚試験の結果を示す図である。示された値は、パッチ面積（ｍｍ^２）である。 カベイラクサ抽出物、ｎＰａｒ ｊ １−Ｐａｒ ｊ ２及びＱ１（５０μｇ／ｍｌ）、並びにＱ２及びＱ３（２５０μｇ／ｍｌ）によって行われた特異的なＩｇＥの測定の結果を示す図である。 カベイラクサに対してアレルギーである患者におけるＴリンパ球の増殖を研究するのに最適な濃度の測定を示す図である。刺激指数（ＩＥ）。 カベイラクサ抽出物及び０．５μｇ／ｍｌの３つのキメラタンパク質、天然型及び組み換え型のＰａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２により得られたＴリンパ球の増殖を示す図である。示された値は、刺激指数（％）のものである。有意差なし（ｎｓ）。

本発明の一態様によれば、任意のＢエピトープ若しくはＩｇＥ結合エピトープ（epitode）の欠失、又は任意のＢエピトープ若しくはＩｇＥ結合エピトープを用いない合成によって得られた低アレルギー誘発性のキメラタンパク質又はペプチドが提供される。好ましくは、欠失はＰａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２の２８位〜５３位でＢエピトープに適用される。

本明細書で用いられるような「低アレルギー誘発性」という用語及び類似の変化形は相対的な用語であり、アレルギー応答性を刺激する本発明のタンパク質及びペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの能力が、野生型の免疫原の同じ能力に比べて低減していることに関する。

好ましくは、キメラタンパク質は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、キメラタンパク質は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む。

代替的に又は付加的に、キメラタンパク質は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で示されるアミノ酸配列と相同な配列を含む。好ましくは、相同配列は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で示されるアミノ酸配列、最も好ましくは配列番号４で示されるアミノ酸配列に対する相同性が少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％である。

別の好ましい実施形態には、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で示されるアミノ酸配列に対する相同性が少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％であるアミノ酸配列を有するキメラタンパク質又はペプチドが含まれる。

キメラタンパク質は、精製を容易にするペプチド配列を含んでいてもよい。このようなペプチドは、当該技術分野で一般的に知られており、例えばポリヒスチジンテイル（polyhistidine tail）である。

キメラタンパク質を構成する断片は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における増幅による既知のスキームに従って、資格があり訓練を受けた人によって合成することができる。当該断片は、適切な制限酵素で消化した後に、ライゲーションによって発現ベクターに統合することができる。この発現ベクター（市販のベクターｐＱＥ３２等）は、キメラタンパク質を、精製を助ける配列（例えばアミノ末端に位置する一連のヒスチジン）と融合させる能力を有し得る。キメラタンパク質の構築中に、異なるＤＮＡ断片が、異なる制限酵素によって認識配列で形成されたリンカーを介して結合され、したがって天然アレルゲンの元の配列には存在しなかった残基は最終キメラ分子に現れる。タンパク質を正しく読み取るのを妨げなかったこれらの新規の残基は、図２、図５及び図８における配列で標識され、関連の実施例で適切に記載される。同様に、キメラは、元の配列に存在しない１４個の残基をアミノ末端域に有し、固体支持体と結合した二価金属との相互作用によって迅速に精製されることができる高ヒスチジン領域に対応する。

本発明の第２の態様によれば、本発明のタンパク質又はペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。

好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で示されるヌクレオチド配列を含み、最も好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を含む。

代替的に又は付加的に、ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で示されるヌクレオチド配列と相同な配列を含み得る。好ましくは、相同配列は、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で示されるヌクレオチド配列に対する相同性が少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である。

別の好ましい実施形態には、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で示されるヌクレオチド配列に対する相同性が少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。

ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。シグナルペプチドは、小胞体の膜を通るタンパク質輸送を開始させるアミノ酸配列である。好適なシグナルペプチドは、本発明の分野における当業者に既知である。

本発明には、本発明のポリヌクレオチド配列によってコードされたペプチドも含まれる。

本発明の他の態様によれば、本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現系、及び本発明のタンパク質又はペプチドを発現することができる当該発現系によって形質転換された宿主細胞が提供される。

本発明は、本発明のペプチド又はタンパク質を製造する方法も含み、当該方法は、
（ｉ）宿主細胞において、本発明のタンパク質又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現することができる複製可能な発現系を調製する工程と、
（ｉｉ）宿主細胞を上記発現系で形質転換する工程と、
（ｉｉｉ）上記タンパク質又は上記ペプチドを発現させる条件下で上記形質転換した宿主細胞を培養する工程と、
（ｉｖ）任意で、上記タンパク質又は上記ペプチドを回収する工程と、
を含む。

本発明は、例えば牛乳又は卵白中に本発明のタンパク質又はペプチドを産生することができるトランスジェニック動物も含む。

本発明の別の態様によれば、免疫障害、特にアレルギー等の過敏性障害の治療のための本発明のタンパク質又はペプチドの使用が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、免疫障害、特にアレルギー等の過敏性障害の治療用の薬物調製のための本発明のタンパク質又はペプチドの使用が提供される。好ましくは薬物はワクチンである。

好ましくは、過敏性障害は、パリエタリアの花粉、より好ましくはカベイラクサの花粉に対するアレルギーである。

本明細書で用いられるように、治療という用語、及び「治療する（treat）」又は「治療すること（treating）」等の変化形は、ヒト又は非ヒト動物で有益であり得る任意のレジーム（regime）を表す。治療は、現状に対するものであり得るか、又は予防的なものであり得る（予防的治療）。治療には、治癒効果、軽減効果又は予防効果が含まれ得る。好ましくは、治療は予防的治療である。

本発明のまたさらなる態様によれば、効果的な量の本発明のタンパク質又はペプチドと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む薬学的組成物が提供される。好ましくは、薬学的組成物はワクチン組成物である。

本発明のまたさらなる態様によれば、免疫障害、特にアレルギー等の過敏性障害を治療する方法が提供され、当該方法は、治療が必要な被験者に、効果的な量の本発明のタンパク質又はペプチドを投与する工程を含む。

本発明の別の態様によれば、免疫障害、特にアレルギー等の過敏性障害の治療に用いられる本発明のタンパク質又はペプチドが提供される。

個々の患者に適切な投与形態及び剤形の選択は当業者には明らかである。

本発明は、本発明に従ったキメラ、好ましくはキメラＱ２、又は哺乳動物における脱感作治療ためにそれから誘導された合成ペプチドの使用に及ぶ。脱感作方法は、非経口経路（皮下、静脈内、又は筋肉内）、又は経口、経鼻若しくは直腸経路による対象のアレルゲンの反復投与を伴う。これらの（ポリ）ペプチドは、使用に関する現在の（prevailing）法律及びガレノス製剤手順に従って、単独又は他の希釈剤と併用して投与することができる。

本発明で記載されるキメラタンパク質Ｑ２及びキメラタンパク質Ｑ３は、図１０、図１１、図１２及び図１４で示されるように、完全抽出物又は複合天然タンパク質よりもカベイラクサに対してアレルギーである患者の血清に対する反応性が低く、その上ｉｎ ｖｉｖｏでの皮膚試験（図１３）でもこの低アレルギー誘発性が見られることから、低アレルギー誘発性である。

キメラ分子Ｑ１及びキメラ分子Ｑ２は、複合天然タンパク質と同程度の免疫原性能も有している（図１６）。両方の特性（低アレルギー誘発性及び免疫原性）のために、キメラＱ２は、鼻炎、結膜炎、喘息、蕁麻疹、血管浮腫、湿疹、皮膚炎、又はさらにアナフィラキシーショックとして現れ得るカベイラクサの花粉に対するアレルギーの予防的及び治癒的な治療に対する優れた候補になる。

本発明によるキメラタンパク質の免疫学的特徴が以下に記載される。図１０は免疫検出試験を示しており、キメラＱ２及びキメラＱ３（レーン５及びレーン６）が、２つの天然タンパク質（レーン１）、単離した組み換えタンパク質（レーン２及びレーン３）又はキメラ（レーン４）の反応性と比べた場合に、アレルギー患者におけるＩｇＥ結合能が大きく低減していることを示し、このことは、完全ではあるが、これらのＢエピトープを全て含有する２つのタンパク質の組み換え融合を示す。このことは、２９番目の残基と、５２番目の残基との間に含まれるＢエプトープの欠如（キメラＱ２）がアレルギー誘発性の低減に寄与することを示していると考えられる。同様の結果が、キメラタンパク質に対する１５個の異なる血清の反応性を研究した際に得られた（図１１）。キメラタンパク質Ｑ２及びキメラタンパク質Ｑ３の反応性は、２つの完全なアレルゲンの結合体（Ｐａｒ ｊ １−Ｐａｒ ｊ ２）であるＱ１で見られたものよりもはるかに小さい。このアレルギー誘発性の低減は、カベイラクサに対してアレルギーである患者由来の血清混合物によるＥＬＩＳＡ阻害によって定量された（図１２）。２つの天然タンパク質の混合物（than of）抽出物の６０％阻害に達するのに、１００００倍以上のタンパク質Ｑ２が必要であった。したがって、アレルギー誘発性が天然タンパク質よりも１００００倍低く、アレルギー誘発性がキメラタンパク質Ｑ１よりも約２０倍低いことが推測され得た。

キメラＱ２の低アレルギー誘発性のより直接的な測定は、カベイラクサの花粉に対してアレルギーである３０人の患者における皮膚反応性の直接的な測定によって得られた。図１３で与えられたデータは、キメラＱ２の皮膚反応性が顕著に低減したことを示している。記載されたそれぞれの分布の比較は、キメラＱ２の平均パッチサイズが２つの天然タンパク質で見られたものよりも１１２倍小さいことを示し、このことはアレルギー活性の９９％超の低減を示している。

また、キメラタンパク質Ｑ２とのＩｇＥの低結合能が、ＥＡＳＴによって測定されたカベイラクサに対してアレルギーであるさらなる３０人の患者由来の血清によって実証された（図１４）。全ての患者において、ＩｇＥ結合は、天然タンパク質の混合物に比べて、キメラＱ２で大きく低減した。

ＩｇＥ結合能、及びしたがってＢエピトープの欠失による拒絶反応の誘発能のこの大きな低減は、免疫原性能の維持を伴った。タンパク質Ｑ２によって、図１６で示されるように、天然抽出物及び組み合わされた２つの純粋な天然タンパク質の混合物によって誘導されたものと同程度のリンパ増殖指数が実証された。このことは全て、Ｐａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２の断片で構築されたキメラタンパク質Ｑ２が、より少数のＩｇＥエピトープを含有したが、保護的な免疫応答を誘導するのに十分なＴエピトープを維持したことを示している。

本発明は、本発明の調製及びその質の実証における実験段階に関して、以下の実施例によってより良好に理解される。これらの実施例は単に例示的な実施例であり、本発明を限定しない。

Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３融合体の構築
キメラタンパク質は、Gonzalez-Rioja et al.著「組み換えアレルゲンＰａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２の発現及び精製（Expression and purification of the recombinant allergens Par j 1 and Par j 2）」（XXIII Congreso EAACI, Abstracts Book（2004）, 181-182）で記載されたＰａｒ ｊ １．０１０３及びＰａｒ ｊ ２．０１０１をコードする配列と、それぞれの場合に特異的な誘発因子（triggers）とを含有するプラスミドをマトリクスとして用いるポリメラーゼの連鎖増幅（ＰＣＲ）によって構築された。この誘発因子は、ハイブリダイゼーション（hybridation）域と、異なる制限エンドヌクレアーゼに対する様々なセクション部位（下線）と、幾つかのアンカーヌクレオチドとから構成される。ＰＣＲ誘導性の増幅反応は、反応量５０μｌ中に以下の成分を有していた：増幅緩衝液×１０、５μｌ、２００μＭのｄＮＴＰ、１００ｐｍｏｌの各誘発オリゴヌクレオチド：２．５単位のポリメラーゼＴａｑ（Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Invitrogen）、ＤＮＡマトリクス１ｎｇ、及び５０μｌまで滅菌蒸留水。増幅反応が、それぞれの場合において記載される特定条件下でＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒサーモサイクラー（Stratagene）において行われた。反応生成物をアガロースゲル（２％）中で電気泳動にかけ、製造業者によって記載された方法を利用してＧｅｎｅｃｌｅａｎ（Bio101）を用いて、対象のバンドをゲルから単離した。単離した断片を適切な制限酵素で消化し、同じ酵素で消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターと結合させた。ライゲーション混合物を用いて、大腸菌ＤＨ５α（Invitrogen（Paisley, UK）から入手可能）のコンピテント細胞を形質転換した。プラスミドＤＮＡを単離するために、得られたコロニーを培養させ、これを対象の断片を遊離させるために、適切な酵素で消化した。陽性コロニーがそのシーケンシングで選択された。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに挿入されたＤＮＡのシーケンシングは、製造業者の取扱説明書に従って、蛍光ジデオキシヌクレオチドによる使用のために改良されたサンガー法［（３０）Hanahan, D.（1983）著「プラスミドによる大腸菌の形質転換に対する研究（Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids）」 J. Mol. Biol. 166, 557-580］及びＰＲＩＳＭレディ反応ジデオキシ末端化サイクルシーケンシングキット（Ready Reaction DiDeoxy Termination Cycle Sequencing Kit）（Perkin Elmer）を用いたサーモサイクラーにおける増幅によって行われた。

Ａ）キメラタンパク質Ｑ１
この場合、不安定な三次構造を有するが、連続的なＩｇＥエピトープ全てが完全であるタンパク質を得るために、両方のタンパク質（Ｐａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２）の完全な配列が融合されると考えられた。Ｑ１として知られている構築物を得るために、ベクターｐＫＳ−ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔでクローニングしたＰａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２のｃＤＮＡをマトリクスとして用いた。２つの配列を融合するために、Ｐａｒ ｊ １の配列のＣ末端と、Ｐａｒ ｊ ２のＮ末端との両方においてリンカー（この場合ＥｃｏＲＩ標的）を有し、その後断片をライゲーションさせる必要があった。当該標的は対応する合成オリゴヌクレオチド（Ｆ１Ｒ１及びＦ１Ｆ２）に付加され、ＰＣＲプロセスにおいて増幅断片に組み込まれた。

合成オリゴヌクレオチドには以下のものを用いた：
断片１：Ｆ１Ｆ１、ＣＧ ＧＧＡＴＣＣ ＴＧＣＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＧＧ（ＢａｍＨＩ）及びＦ１Ｒ１、ＣＧ ＧＡＡＴＴＣ ＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣＧＧＴＧＣＧＧ（ＥｃｏＲＩ）。条件：９４℃、４分（１サイクル）、９４℃、３０秒 − ５３℃、３０秒 − ７２℃、９０秒（５サイクル）、９４℃、３０秒 − ６０℃、３０秒 − ７２℃、９０秒（３５サイクル）、７２℃、１０分（１サイクル）。
断片２：Ｆ１Ｆ２、ＣＧ ＧＡＡＴＴＣ ＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＧＧＧＡ（ＥｃｏＲＩ）及びＦ１Ｒ２、ＣＧ ＡＡＧＣＴＴ ＣＴＡＡＴＡＧＴＡＡＣＣＴＣＴＧＡ（ＨｉｎｄＩＩＩ）。条件：９４℃、４分（１サイクル）、９４℃、３０秒 − ５１℃、３０秒 − ７２℃、９０秒（５サイクル）、９４℃、３０秒 − ５９℃、３０秒 − ７２℃、９０秒（３５サイクル）、７２℃、１０分（１サイクル）。

Ｐａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２のそれぞれに対応する２つのＰＣＲ産物が生成された。これらのうちの第１の断片（Ｐａｒ ｊ １）に関しては、合成オリゴヌクレオチドＦ１Ｆ１及び合成オリゴヌクレオチドＦ１Ｒ１をそれぞれＮ末端及びＣ末端に用いて、約４２０塩基対（ｐｂ）のサイズが得られた。増幅断片がｐＫＳ−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターでクローニングされ、その配列が確認された。Ｐａｒ ｊ ２に対応する第２の断片に関しては、オリゴヌクレオチドＦ１Ｆ２及びオリゴヌクレオチドＦ１Ｒ２をそれぞれＮ末端及びＣ末端に用いて、同じ手順を用いた。この際、約３００ｐｂの断片が得られ、これをｐＫＳ−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターでクローニングして、その配列を確認した。この第２の断片は、ＥｃｏＲＩ標的によるライゲーションによって第１の断片と結合し、Ｐａｒ ｊ １がＮ末端で、Ｐａｒ ｊ ２がＣ末端で維持され、その後得られた断片が市販の発現ベクターｐＱＥ−３２（Qiagen）でサブクローニングされ、親和性末端（affinity tail）に対応するＮ末端で１３個のアミノ酸の追加配列を含有していた（図２）。当該配列は、２５６個のアミノ酸を有し、見かけの分子量が２８０７０Ｄａのポリペプチドをコードした。

Ｂ）キメラタンパク質Ｑ２
このキメラを得る場合、両方のタンパク質の断片は結合されているが、記載の連続的なＩｇＥエピトープを全く含んでいないと考えられた［（１８）Asturias, J.A, Gomez-Bayon, N., Eseverri, J. L.及びMartinez, A.（2003）著「カベイラクサ花粉由来の主要なアレルゲンであるＰａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２は同様の免疫グロブリンＥエピトープを有している（Par j 1 and Par j 2, the major allergens from Parietaria judaica pollen, have similar immunoglobulin E epitopes）」 Clinical and Experimental Allergy 33, 518-524］。以下の断片を含んだ幾つかの合成オリゴヌクレオチドを設計した：Ｐａｒ ｊ １（残基１〜２８及び残基５３〜１３９の断片）及びＰａｒ ｊ ２（残基１〜２８及び残基５３〜１０３の断片）（図３及び図４）。ＩｇＥエピトープを含有する配列の一部はこの方法で取り除かれた。

４つの断片（それぞれのアレルゲンに対して２つの断片）がこの構築物で増幅され、ｐＫＳ ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターでクローニングしたＰａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２のｃＤＮＡをマトリクスとして用いた。新規のタンパク質の構造機構は、異なる増幅断片の連続結合への制限酵素（この場合、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲｉ及びＥｃｏＲＶ）の使用である。

合成オリゴヌクレオチドには、以下のものを用いた：
断片１：Ｆ１Ｆ１、ＣＧ ＧＧＡＴＣＣ ＴＧＣＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＧＧ（ＢａｍＨＩ）及びＦ２Ｒ１、ＣＧ ＣＴＧＣＡＧ ＣＣＣＣＴＴＴＧＡＣＧＧＣＴＣＴＴ（ＰｓｔＩ）。条件：分（１サイクル）、９４℃、３０秒 − ５４℃、３０秒 − ７２℃、９０秒（３５サイクル）、７２℃、１０分（１サイクル）。
断片２：Ｆ２Ｆ２、ＣＧ ＣＴＧＣＡＧ ＡＴＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡ（ＰｓｔＩ）及びＦ２Ｒ２、ＣＧ ＧＡＡＴＴＣ ＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣＧＧＴＧＣＧＧＧ（ＥｃｏＲＩ）。
断片３：Ｆ２Ｆ３、ＣＧ ＧＡＡＴＴＣ ＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＧＧＧＡＡ（ＥｃｏＲＩ）及びＦ２Ｒ３、ＣＧ ＧＡＴＡＴＣ ＣＴＣＣＴＴＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴ（ＥｃｏＲＶ）。
断片４：Ｆ２Ｆ４、ＣＧ ＧＡＴＡＴＣ ＡＴＡＧＴＧＣＧＣＧＣＣＡＣＧＡＡ（ＥｃｏＲＶ）及びＦ１Ｒ２、ＣＧ ＡＡＧＣＴＴ ＣＴＡＡＴＡＧＴＡＡＣＣＴＣＴＧＡ（ＨｉｎｄＩＩＩ）。３つの断片の条件は、９４℃、４分（１サイクル）、９４℃、３０秒 − ５４℃、３０秒 − ７２℃、９０秒（５サイクル）、９４℃、３０秒 − ６２℃、３０秒 − ７２℃、９０秒（３５サイクル）、７２℃、１０分（１サイクル）であった。

Ｐａｒ ｊ １（断片１）に対応する、これらのうちの第１の断片に関しては、合成オリゴヌクレオチドＦ１Ｆ１及び合成オリゴヌクレオチドＦ２Ｒ１をそれぞれＮ末端及びＣ末端に用いて、約９０塩基対のサイズが得られ、ｐＫＳ−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターでクローニングした。Ｐａｒ ｊ １に対応する第２の断片に関しては、オリゴヌクレオチドＦ２Ｆ２及びオリゴヌクレオチドＦ２Ｒ２をそれぞれＮ末端及びＣ末端に用いて、同じ手順を実行した。この際、約２６０ｐｂの断片が得られ、ｐＫＳ−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターでクローニングした。この最後の断片は、ＰｓｔＩによって担持された標的のリンカーによるライゲーションによって第１の断片と結合し、その配列が確認された。

Ｐａｒ ｊ ２（断片３及び断片４）の配列から増幅された２つの断片に関しては、断片１及び断片２に記載された手順に従った。Ｎ末端及びＣ末端それぞれに対してオリゴヌクレオチドＦ２Ｆ３／Ｆ２Ｒ３及びオリゴヌクレオチドＦ２Ｆ４／Ｆ１Ｒ４をその増幅のために用い、ＰＣＲ産物のサイズは断片３では約９０ｐｂ、及び断片４では約１５０ｐｂであった。断片４は、ＥｃｏＲＶによって担持された標的のリンカーによるライゲーションによって断片３と結合し、その配列が確認された。

最終工程において、生成された２つの新規の断片（それぞれのアレルゲンに対して１つの断片）が、ＥｃｏＲＩによって担持された標的のリンカーによるライゲーションによって結合し、Ｐａｒ ｊ １がＮ末端で、Ｐａｒ ｊ ２がＣ末端で維持された。その後、当該断片が市販の発現ベクターｐＱＥ−３２でサブクローニングされ、親和性末端に対応するＮ末端で１３個のアミノ酸の追加配列を含有していた（図５）。当該配列は、２１２個のアミノ酸を有し、見かけの分子量が２３３３６Ｄａのポリペプチドをコードした。

Ｃ）キメラタンパク質Ｑ３
この最後の構築物は、この場合、存在し得る任意のＩｇＥエピトープを取り除こうと試みた以外はＱ２と実質的に同一であり、Ｐａｒ ｊ １（残基７１〜８０）及びＰａｒ ｊ ２（残基７２〜８１）（図６及び図７）の配列に存在する８つのアミノ酸の別の付加的な配列が取り除かれた。

合成オリゴヌクレオチドには以下のものを用いた：
断片１：Ｆ１Ｆ１、ＣＧ ＧＧＡＴＣＣ ＴＧＣＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＧＧ（ＢａｍＨＩ）及びＦ３Ｒ１、ＣＧ ＡＧＡＴＣＴ ＧＡＣＣＴＣＧＣＴＧＡＣＧＡＧ（ＢｇｌＩＩ）。
断片２：Ｆ３Ｆ２、ＣＧ ＡＧＡＴＣＴ ＡＧＣＡＡＧＣＴＣＣＣＧＣＣＣ（ＢｇｌＩＩ）及びＦ３Ｒ２、ＣＧ ＧＧＴＡＣＣ ＧＧＧＧＡＣＣＴＣＧＧＣＧＡＣ（ＫｐｎＩ）。２つの断片の条件は、９４℃、４分（１サイクル）、９４℃、３０秒 − ５４℃、３０秒 − ７２℃、９０秒（５サイクル）、９４℃、３０秒 − ６３℃、３０秒 − ７２℃、９０秒（３５サイクル）、７２℃、１０分（１サイクル）であった。
断片３：Ｆ３Ｆ３、ＣＧ ＧＧＴＡＣＣ ＣＴＣＣＣＧＣＣＣＡＴＣＡＣＣ（ＫｐｎＩ）及びＦ３Ｒ３、ＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＴＡＡＴＡＴＣＣ。条件：９４℃、４分（１サイクル）、９４℃、３０秒 − ５６℃、３０秒 − ７２℃、９０秒（３５サイクル）、７２℃、１０分（１サイクル）。

この場合、構築物Ｑ２−ｐＱＥ−３２をマトリクスとして用い、断片１、断片２及び断片３それぞれに対して、約１５０ｐｂ、約３７０ｐｂ及び約２９０ｐｂのサイズが得られた。用いられたオリゴヌクレオチドは、断片１に対してＦ３Ｆ１及びＦ３Ｒ１、断片２に対してＦ３Ｆ２及びＦ３Ｒ２、並びに断片３に対してＦ３Ｆ３及びＦ３Ｒ３であった。上記の場合の断片の連続ライゲーションのプロセスを再び繰り返した。用いられる新規の制限酵素はＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩであった。第３のそして最後の断片では、そのサイズが小さかったので（６６ｐｂ）、その後の精製プロセスにおいてより高い利便性で働くことができるようにより大きなサイズの断片を得るため、ベクターｐＱＥ−３２−Ｑ２の配列の一部を増幅することになった。それぞれの工程で、ベクターｐＫＳ−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔでクローニングされた、ＰＣＲによって得られた断片、及びその配列が確認された。第１のグルタミンアミノ酸（Ｑ）に対応する第１の断片における自然突然変異がプロリン（Ｐ）によって生じた。

最終的に、得られた断片が発現ベクターｐＱＥ−３２でサブクローニングされ、親和性末端に対応するＮ末端で１３個のアミノ酸の追加の配列を含有していた（図８）。当該配列は、２００個のアミノ酸を有し、見かけの分子量が２１９３８Ｄａのポリペプチドをコードした。

キメラタンパク質Ｑ１、キメラタンパク質Ｑ２、及びキメラタンパク質Ｑ３の発現及び精製
ＬＢ（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２５μｇ／ｍｌのカナマイシンをそれぞれ補充した）のシートから単離したコロニーから始め、同じ培地５０ｍｌの前接種材料（pre-inoculum）を産生し、撹拌しながら（２６０ｒｐｍ）、３７℃で一晩インキュベートした。光学密度（６００ｎｍ）を０．２から始めて、同じ培地１Ｌを当該前接種材料で接種させた。混合物を撹拌しながら３７℃で１時間３０分インキュベートした後、同じインキュベート条件下で３時間、ＩＰＴＧ（１ｍＭの最終濃度）による誘導を行った。

Ｑ２の場合、細胞を１００００ｒｐｍ、４℃で１５分間、遠心分離して、溶解緩衝液（２０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．４）、５０ｍＭのイミダゾール、０．５ＭのＮａＣｌ）５０ｍｌに再懸濁させた。撹拌しながら、３７℃で３０分間、再懸濁質（matter）をリゾチーム（０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度）で処理した。それから、超音波処理（５パルス、２０秒）を行い、混合物を１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分間、遠心分離した。上清を０．４５μｍのフィルタ（Millex HV, Millipore）で濾過し、ＡＫＴＡプライムシステム（Ａはウムラウト）（GE-Healthcare）に適合されたＨｉ−Ｔｒａｐキレート化ＨＰカラム（GE-Healthcare）５ｍｌに加えた（２．５ｍｌ／分）。このカラムをニッケルでキレート化し、予め１０容量の溶解緩衝液で平衡化していた。カラムを１５容量の溶解緩衝液で洗浄すると、カラムと結合したタンパク質の溶出を溶出緩衝液（２０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．４）、０．５Ｍのイミダゾール）を用いて１００％まで行った。塩を除去し、２０ｍＭでｐＨ７のリン酸緩衝液サンプルを交換するために、溶出液をＨｉ−Ｔｒａｐ脱塩カラム（GE-Healthcare）５ｍｌに通した。タンパク質は−４０℃に維持した。

Ｑ１及びＱ３の場合、さらなる精製工程が必要であった。その誘導後に、細胞を１００００ｒｐｍ、４℃で１５分間、遠心分離し、８Ｍの尿素を補充した溶解緩衝液５０ｍｌで再懸濁して、前の段落で記載された手順を採用した。２番目の精製工程では、予めＰＢＳで平衡化したＨｉ−Ｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム（GE-Healthcare）に、得られた溶出液を加えた（１ｍｌ／分）。前の段落で記載された緩衝液でタンパク質の溶出を行った。タンパク質は−４０℃に維持した。

ＳＤＳを有するポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で、電気泳動を行った。Laemmliによって記載された方法は、ＭＩＮＩ−ＰＲＯＴＥＡＮ電気泳動装置（Bio-Rad）を用いて、基本的に［（３１）Laemmli, U.K.（1970）著「バクテリオファージＴ_４頭部集合化中の構造タンパク質の切断（Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T₄）」 Nature 277, 680-685］に従った。１０×１０ｃｍであり、ポリアクリルアミド濃度が１２．５％であるゲルに、トリス−グリシン緩衝液で４５分間、２００ボルトの電流を流した。参照として用いられるタンパク質は、低分子量に関するBio-Radのキット由来のものであった。分子量の算出及びゲルの濃度測定分析は、画像分析器（Diversity, BioRad）を用いて行った。

ハイブリッドタンパク質Ｑ１は、３２ｋＤａのＨｉｓ標識化融合タンパク質として表され（図９）、細菌培養物の最終収率は２ｍｇ／Ｌであった。Ｑ２タンパク質及びＱ３タンパク質は、２８ｋＤａのＨｉｓ標識化融合タンパク質として表され、培養物の最終収率はそれぞれ、５ｍｇ／Ｌ及び７ｍｇ／Ｌであった（図９）。

精製ハイブリッド分子の円偏光二色性分析
ｐＨ７．０、２０℃でのＦａｒ−ＵＶ（１９０ｎｍ〜２５０ｎｍ）のＣＤスペクトルが、２０℃で温度を自動調節したキュベット中に日本分光株式会社のＰＴＣ−４２３Ｓ温度制御装置を備えた日本分光株式会社のＪ−８１０分光偏光計によって記録された。タンパク質濃度は、０．２ｃｍキュベットにおいて２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中で０．０３５ｍｇ／ｍｌであり、４０個の走査が集積した。全てのスペクトルは適切なバックグラウンドを差し引き、平均残余楕円率に変換した。

二次構造要素は、天然のパリエタリアのアレルゲン混合物（Ｐａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２）、及びハイブリッドタンパク質を適用したＣＤ分光法によって分析された（図１０）。ハイブリッドタンパク質のスペクトルはそれらの中でほぼ同一であったが、天然アレルゲンのＣＤスペクトルとは全く異なっていた。ＮＰＡスペクトルは、２０８ｎｍで最小を示し、２２２ｎｍで明確に増大し（shoulder）、１９０ｎｍで最大を示したが、ハイブリッドタンパク質のスペクトルは、ほぼ完全な変性（unfolded）状態になるランダムコイル構造に移行した。

カベイラクサに対してアレルギーである患者の血清混合物に対するキメラタンパク質の低ＩｇＥ固定の反応性を実証するための免疫試験
Ａ）免疫検出
融合物１、融合物２及び融合物３のＩｇＥ結合活性の第１の評価が、カベイラクサに対してアレルギーである患者由来の血清混合物を用いる免疫移動法（immunotransfer method）によって行われた。タンパク質抽出物及び精製タンパク質をポリアクリルアミドゲルに適用したら、Towbin et al［（３２）Towbin, H., Staehelin, I.及びGordon, J.（1979）著「ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースシートへのタンパク質の電気泳動転写：手順及び幾つかの用途（Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications）」 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354］の方法によって電気的移行を行った。この目的のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単離したタンパク質をＰＶＤＦ Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ膜（GE-Healthcare）に電気的に固定した（transfixed）。周囲温度で１時間、膜を遮断したら、４℃で一晩、膜を一次抗体とインキュベートして、同じ洗浄緩衝液で様々な回数（various）洗浄後、周囲温度で１時間、膜を二次ペルオキシダーゼ結合抗体とインキュベートした。製造業者によって記載されたように、膜をフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ．ＥＣＬ、GE-Healthcare）に曝すことによって、ＥＣＬ化学発光法（GE-Healthcare）でバンドを検出した。

免疫検出試験によって、３つの融合物間でＩｇＥ結合能が異なることが実証された。したがって、ＩｇＥ抗体の認識はＱ１の場合でのみ存在した（図１１）。Ｑ２の場合では、認識は非常に急激に落ちたが、Ｑ３の場合では、実証された認識は０であった。

Ｂ）直接ＥＬＩＳＡ
カベイラクサに対してアレルギーの患者由来の個々の血清を用いたＥＬＩＳＡ法によって、３つの融合物に対するＩｇＥの反応性を分析した。周囲温度で一晩、ポリスチレンプレート（Greiner）を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．２）、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ）中で、カップ１つ当たり１μｇのカベイラクサ抽出物タンパク質又は１μｇの純粋なタンパク質とインキュベートした。１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充した、２００μｌ／カップのＰＢＳでこれらを遮断し、３７℃で１時間維持した。アレルギー患者由来の１００μｌ／カップの血清（１０倍希釈） を添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。２００μｌ／カップのＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）による３回の洗浄の後、ペルオキシダーゼと結合したヒトＩｇＥ免疫グロブリン（Dako）に対する１００μｌ／カップの抗血清を添加し（１０００倍希釈）、３７℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで新たに３回洗浄した後、製造業者の取扱説明書に従って調製した、２００μｌ／カップのｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ−Ｆａｓｔのタブレットセット、Sigma）溶液を添加し、プレートを３０分間暗所に維持した。反応を５０μｌ／カップの３ＭのＨ_２ＳＯ_４で停止させ、ＥＬＩＳＡイージーリーダーＥＡＲ−４００ＡＴ（SLT-Lab Instruments）プレートリーダーにおいて４９２ｎｍで吸光度を測定した。

ＩｇＥに対する反応性は、Ｑ１の場合でのみ実証されたが、Ｑ２及びＱ３の両方はＩｇｅ抗体の認識が実質的にないことが実証された（図１２）。

Ｃ）ＥＬＩＳＡ阻害
ＥＬＩＳＡ阻害試験に関して、カベイラクサに対してアレルギーの患者由来の血清混合物を、４℃で一晩、所定の濃度の阻害タンパク質（１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ）と予めインキュベートした。後の残りの手順は、ＥＬＩＳＡ直接試験に記載されたものと同じである。

カベイラクサに対してアレルギーの患者由来の血清混合物によるＥＬＩＳＡ阻害試験において、Ｑ１では、カベイラクサの花粉のＩｇＥ結合活性の約５０％程度の阻害が実証され、これはｎＰａｒ ｊ １−Ｐａｒ ｊ ２のものより幾らか低く（９２％）、５００倍以上のタンパク質を添加する必要があった（図１３）。キメラＱ２及びキメラＱ３は、最大阻害の約６０％程度に達したが、これは同程度の阻害に達するためには、ｎＰａｒ ｊ 1−Ｐａｒ ｊ ２で必要とされるものよりも１００００倍高いタンパク質濃度を必要とし、このことは、これらのキメラがアレルギー誘発性を約９９．９９％低減させたことを示唆していた。

キメラタンパク質Ｑ１、キメラタンパク質Ｑ２、及びキメラタンパク質Ｑ３の低皮膚反応性を実証するためのｉｎ ｖｉｖｏ実験
ｉｎ ｖｉｖｏ皮膚反応（プリック）試験を行い、カベイラクサ花粉に対するアレルギーに対する満足のいく免疫療法を開発することができるために、候補低アレルギー誘発性の分子を求めるという目的で、キメラ１、２、及び３の低アレルギー誘発性を評価した。

カベイラクサ抽出物、ｎＰａｒ ｊ １−Ｐａｒ ｊ ２、大腸菌で発現したｒＰａｒ ｊ １及びｒＰａｒ ｊ ２、並びにキメラ１、２及び３を用いて、皮膚試験を行った。精製タンパク質は、０．５％フェノール含有及び５０％グリセリン含有生理食塩水溶液で希釈した。天然のＰａｒ ｊ、Ｐａｒ ｊ ２、Ｑ１の場合に用いる濃度は、０．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、及び５０μｇ／ｍｌであり、Ｑ２又はＱ３の場合の濃度は５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、及び２５０μｇ／ｍｌであった。０．９％ＮａＣｌ及び塩酸ヒスタミン（１０ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ、陰性対照及び陽性対照に用いた。

この実験では、試験されるそれぞれのアレルゲンの液滴を、前腕の掌面上に沈着させた後に、ランセットを用いて、液滴を通して穿刺穴を作製した。二重で、増大濃度及び低減濃度の反対の条件（strings）で、それぞれの試験を行った。１５分後、パッチの輪郭を先端が細い黒色のマーカーペンで描いた。低アレルギー誘発性の絆創膏の細片をパッチ上に貼り、ゆっくり押し付けて、インクのマーキングを細片に写し、これをパッチ記録シートに転写させた。Ｓｕｍｍａｓｋｅｔｃｈデジタル化タブレット及びコンピュータベースのプログラム（Ａｕｔｏｃａｄ ｖ．１１）を用いてこの記録をスキャンすることによって、パッチ領域を測定した。

ブロック図で結果を図示し、関連変数に関してウィルコクスン検定を用いて統計調査を行うことによって、得られた結果を解釈した（図１４）。これらの図は、皮膚反応に対応する値の分布（パッチ領域（ｍｍ^２）で測定された）が、抽出物（平均６５．２５ｍｍ^２、信頼範囲（９５％）：５４．９８〜７５．５３）及びｎＰａｒ ｊ １−Ｐａｒ ｊ ２（平均１０６．８０ｍｍ^２、信頼範囲（９５％）：９１．９０〜１２１．７０）に対して、３つのキメラの場合で有意に異なることを示している（Ｐ＜０．００１）。キメラ２及びキメラ３の値は実質的に０である：Ｑ２（平均０．９５ｍｍ^２、信頼範囲（９５％）：０〜２．８９）及びＱ３（平均０．１５ｍｍ^２、信頼範囲（９５％）：０〜０．４７）。

キメラタンパク質Ｑ１、キメラタンパク質Ｑ２、及びキメラタンパク質Ｑ３の低ＩｇＥ抗体結合能を実証するための実験
ｉｎ ｖｉｖｏ試験の補足として、ＥＡＳＴ直接法を用いて、特異的なＩｇＥを求めることによって、新たにｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行った。

天然タンパク質及び組み換えタンパク質（５０μｇ／ｍｌ）、並びにカベイラクサ抽出物（２ｍｇ／ｍｌ）を、臭化シアンで活性化したディスクにカップリングさせることによって、Ceska et al.［（３３）Ceska, M. and Lundkvist, U.（1972）著「ＩｇＥの決定のための新規の簡易なラジオイムノアッセイ法（A new and simple radioimmunoassay method for the determination of IgE）」 Immunochemistry 9, 1021-1030］に従って、特異的なＩｇＥを求めた。その後、患者由来の血清５０μｌを添加し、周囲温度で１時間、インキュベートした。洗浄後、３７℃で３０分間、ディスクをアルカリホスファターゼと結合したヒト抗ＩｇＥ抗体５０μｌとインキュベートして、製造業者（Hycor Biomedical Inc.）によってＩｇＥ特異的なハイテックキットＥＩＡで与えられた取扱説明書に従って、定量を行った。

得られた結果は、単にｉｎ ｖｉｖｏで得られた結果を再確認しているだけである。３つのキメラのうち、Ｑ１はｎＰａｒ ｊ １−Ｐａｒ ｊ ２に対して、その免疫原性能を維持したが、Ｑ２及びＱ３では当該免疫原性能が非常に顕著に低減した（Ｐ＜０．００１）（図１５）。

キメラタンパク質Ｑ１、キメラタンパク質Ｑ２及びキメラタンパク質Ｑ３の免疫原性能を実証する誘導性リンパ増殖実験
免疫療法における低アレルギー誘発性分子の使用に対する本質的な要求は、その抗原性（Ｔエピトープ）の維持である。したがって、ＩｇＥ抗体と結合しないことに加えて、本発明のタンパク質が抗原性を維持するか否か確認するために、この実験で用いられる様々なタンパク質によって刺激された末梢血単核球（ＣＭＳＰ）でリンパ増殖試験を行った。比色分析によって測定されるホルマザン化合物を発生させるために、生存細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるテトラゾール塩ＷＳＴ−１の消化に基づく比色法によって、この試験が行われた。

リンパ球（lymphocite）分離溶液（Lymphoprep, Nycomed）を用いる密度勾配における遠心分離によって、カベイラクサに対してアレルギーの１３人の患者のＣＭＳＰを単離した。それから、培養培地（血清無含有培地ＡＩＭ Ｖ、Gibco）において１×１０^６個の生存細胞／ｍｌでＣＭＳＰを再懸濁し、ＰＢＳ（Sigma Chemical Co.）中の０．２５％トリパンブルー（tripan blue）でこれらの生存率を試験した。製造業者によって記載されたように、９０％を超える生存率で調製されたＣＭＳＰをｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖試験に直ちに用いた（細胞増殖剤ＷＳＴ−１、Roche Diagnostics）。最終容量が２００μｌの培地中の２×１０^５個のＣＭＳＰで、それらを底が平らなマイクロプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ、NUNC）に沈着させた後に、カベイラクサ抽出物を用いて、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下、３７℃で三重で測定を行い、最終濃度が０．０００５μｇ／ｍｌ−０．００５μｇ／ｍｌ−０．０５μｇ／ｍｌ−０．５μｇ／ｍｌ−５μｇ／ｍｌになるまで、様々なタンパク質を精製した。三重の対照の刺激を受けない培養物は全ての場合に含まれた。３日後、細胞増殖剤ＷＳＴ−１ ２０μｌを全てのカップに加え、４時間インキュベートした。代謝的に活性のある細胞によって産生されたホルマザンを４５０ｎｍでの吸光によって定量した。この試験で用いた組み換えタンパク質は、３つのキメラ、並びに大腸菌で発現したｒＰａｒ ｊ １及びｒＰａｒ ｊ ２であった。

第１の工程において、免疫原性（immunuogenic）タンパク質をスキャンして、その後の試験の進行のために最適濃度を求めた。全ての場合、最大増殖（ＩＥ％）を示すタンパク質濃度が０．５μｇ／ｍｌであることが見出された（図１６）。

カベイラクサに対してアレルギーの１３人の患者による増殖の結果は、ブロック図の統計分析及び２つの対になったサンプルに関するノンパラメトリック試験によって求められた。統計分析によって、対照に用いられたカベイラク抽出物には、ｎＰａｒ ｊ １−Ｐａｒ ｊ ２とあまり変わらない抗原刺激能があり（Ｐ＝０．１４２）、Ｑ１及びＱ２は、これらの抽出物（それぞれ、Ｐ＝０．１５２及びＰ＝０．２９４）及びｎＰａｒ ｊ １−Ｐａｒ ｊ ２（それぞれ、Ｐ＝０．４８４及びＰ＝０．１８２）と有意差のない値分布を示したことが示された（図１７）。一方で、Ｑ３は、この抽出物（Ｐ＝０．００２）及びｎＰａｒ ｊ １−Ｐａｒ ｊ ２（Ｐ＝０．００４）に対してほとんど刺激能を有しなかった。またその一方で、この抽出物（それぞれ、Ｐ＝０．１４２及びＰ＝０．００３）及びｎＰａｒ ｊ １−Ｐａｒ ｊ ２（それぞれ、Ｐ＝０．０４１及びＰ＝０．００２）に対して、ｒＰａｒ ｊ １へのｒＰａｒ ｊ ２の抗原力が大きかったことが指摘されるべきである。

得られた結果によって、依然として、Ｑ２は上記特性を維持したのに対し、Ｑ３はそれを完全に喪失したことが示される。カベイラクサに対するアレルギーを治療するために様々な低アレルギー誘発性分子を得るプロセスについて記載された全てのものから、Ｑ２がカベイラクサに対するアレルギーの満足のいく免疫療法を開発する候補低アレルギー誘発性分子であることを結論付けることができる。

投与方法
本発明は、哺乳動物における減感作治療のための、記載の低アレルギー誘発性キメラ又はこれら由来の合成ペプチドの使用に関する。減感作方法は、非経口経路（皮下、静脈内、又は筋肉内）、経口、舌下、経鼻若しくは直腸経路による対象のアレルゲンの反復投与を伴う。これらの（ポリ）ペプチドは、使用に関する現行の法律及びガレノス製剤手順に従って、単独又は他の薬学的に許容可能な希釈剤及び賦形剤と併用して投与することができる。

Claims (21)

1. キメラタンパク質であって、配列番号２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、キメラタンパク質。
2. Ｐａｒ ｊ １及びＰａｒ ｊ ２として知られるカベイラクサ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ ｊｕｄａｉｃａ）花粉の主要なアレルゲンに対応する配列由来のアミノ酸配列を含み、該配列に対応するＩｇＥ抗体と結合する１つ又は複数のエピトープを欠いていることを特徴とする、請求項１に記載のキメラタンパク質。
3. 配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなる請求項１及び２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
4. ＥＬＩＳＡ阻害試験で測定すると、アレルギー誘発性が、天然のＰａｒ ｊ１アレルゲンタンパク質及びＰａｒ ｊ２アレルゲンタンパク質と比較して５００分の１以下に低減されていることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
5. Ｐａｒ ｊ １とＰａｒ ｊ ２の両方の完全なアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
6. Ｐａｒ ｊ １とＰａｒ ｊ ２の連続的なＩｇＥエピトープを全て有することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
7. Ｐａｒ ｊ １またはＰａｒ ｊ ２の２８位〜５３位を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
8. 精製され、変性状態である請求項１から７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
9. Ｐａｒ ｊ １とＰａｒ ｊ ２の複合天然タンパク質と同様の免疫原性を有することを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
10. カベイラクサ花粉に対するアレルギーの減感作治療の治療のための薬剤の製造のための請求項１から９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の使用。
11. 請求項１から９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む、ポリ核酸。
12. 配列番号１の核酸を有するポリ核酸。
13. 配列番号１の核酸からなるポリ核酸。
14. 形質転換された宿主生物における微生物発現ビヒクルであって、自己複製しており、請求項１１から１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを発現するのに用いられる、形質転換された宿主生物における微生物発現ビヒクル。
15. 請求項１４に記載の微生物発現ビヒクルで形質転換されたヒト以外の宿主生物。
16. 原核生物である、請求項１５に記載の生物。
17. 前記原核生物が大腸菌属に属する、請求項１６に記載の生物。
18. 請求項１から９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を含有するポリペプチドを製造する方法であって、宿主生物において自己複製しており、且つ請求項１から９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を発現するのに用いられる微生物発現ビヒクルを含有する該宿主生物の培養を含む方法。
19. 該キメラタンパク質を培養物、細胞又はその両方から単離することを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を精製する方法。
20. 請求項１から９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を含むカベイラクサ花粉に対するアレルギーの減感作治療のための医薬組成物。
21. ワクチンとして用いられる請求項２０に記載の医薬組成物。

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