CN102943087A - 兔出血症病毒新型亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种兔出血症病毒新型亚单位疫苗的重组表达质粒，所述的重组表达质粒中含有一个包括下列元件的融合编码基因：(1)如SEQ ID NO：1所示的兔出血症病毒的优势抗原区A，(2)如SEQ ID NO：2所示的兔出血症病毒的优势抗原区B，优选的，上述融合编码基因还包括编码序列为SEQ ID NO：3所示的Th通用细胞表位，所述的融合编码基因是由插入元件按A-B-Th顺序串联而成。本发明的疫苗融合了兔出血症病毒的优势抗原区域和通用Th细胞表位，既可以刺激机体产生体液免疫应答，又能刺激机体产生细胞免疫应答，可以用于预防兔出血症病毒感染性疾病，该疫苗安全、免疫效果好，适于产业化生产。

Description

兔出血症病毒新型亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药高技术领域，特别涉及一种兔出血症病毒新型亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)俗称“兔瘟”，是由兔出血症病毒(RHDV)引起的一种急性高致死性兔传染病。本病具有病死率高、死亡快，而且传播迅速等特点，对养兔业的健康发展造成了严重威胁，因而被国际兽疫局正式列为“国际动物保健编目”B类传染病，我国农业部也将之列为二类动物疫病。兔出血症病毒(RHDV)被划归到可以引起动物和人广泛疾病的嵌杯病毒科中，其基因组是一种单股正链的RNA分子，基因组长约7437bp，含有两个开放阅读框架(Open Read Frames)，分别编码多个蛋白，其中衣壳蛋白是RHDV的主要结构蛋白，分子量约为60Kd。因此，该蛋白又称为VP60。研究证明，RHDV的衣壳蛋白在没有其它任何成分存在的情况下，可自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)，拥有立体构象，能够模拟完整病毒粒子诱导宿主的免疫系统。

兔病毒性出血症(RHD)第一次大流行于1984年出现在中国(Liu，S.J.，H. P.Xue，B.Q.Pu，and S.H. Qian.，1984，A new viral disease in rabbits..Anim.Husb.Vet.Med，16，253-255)。该病在9个月内迅速波及中国各地的家兔，造成了1400万只家兔死亡。随后，兔出血症病毒(RHDV)在欧洲、中东和亚洲扩散开来。到20世纪90年代后期，已经在40多个国家有本病的报道。1995年，RHD在澳大利亚南部海岸的Wardang岛爆发，由于防制措施不力，造成了8个月内1000多万只家兔及野兔死亡的惨剧。自1988年以来，该病毒已经在许多野兔种群中适应。目前，RHD已蔓延至我国大多数省、市和地区，给我国养兔业造成了严重经济损失，被视为养兔业的“头号杀手”。目前，用于预防和控制RHD疫情的疫苗主要是以发病兔内脏组织为原材料的组织灭活疫苗。这种疫苗具有良好的免疫效果，20多年来，该疫苗在RHD疫情的控制方面发挥了重要作用。但目前随着家兔饲养成本的提高以及非免疫兔的减少，可用于制苗的肝组织日趋减少，使组织灭活苗的成本不断增加，加之组织灭活苗本身所不可避免的种种缺点和不足，如生产安全难以保证，时刻存在散毒的危险，以及该种疫苗对于变异了的兔瘟病毒预防效果不理想，有可能造成免疫失败等。人们逐渐将目光投向新型疫苗，应用现代生物技术开展兔瘟新型疫苗的研究将是RHDV应用研究的一个必然趋势。

在兔瘟新型疫苗研究方面，国外开展的比较早。1994年，Boga等(Boga JA，Casais R，Marin M S，et al.Mo lecular cloning，sequencing and exp ression in Escherich iaco li of thecap sid pro tein gene from rabbit haemo rrhagic disease virus(Spanish isolate A ST/89).J Gen V iro l，1994，75：240922413)率先将RHDV的VP60在大肠杆菌中进行了表达，表达产物可诱导兔体产生特异性抗体，但是不能对抗致死剂量兔瘟病毒的攻击。后来，Laurent等(L aurent S，Kut E，Remy2Delaunay S，et al.Fo lding of the rabbit hemo rrhagic disease virus cap sid p ro tein anddelineation of N-term inal domains dispensable fo r assembly.A rch ives of Virology，2002，147：155921571.)选用杆状病毒-昆虫细胞系统表达VP60，经ELISA、Western-blot分析及电镜形态观察，表达的衣壳蛋白可自我装配成VLPs，并且与天然病毒的形态和抗原性非常相似。动物试验结果显示，由表达产物激发的中和性抗体能为兔子提供足够的保护，说明VLPs有可能作为一种新型疫苗代替传统组织灭活疫苗。近年来，Farnós等(Farnós O，Boue O，Parra F，et al.High-level expression and immunogenic properties of the recombinant rabbit hemorrhagic diseasevirus VP60 capsid protein obtained in Pichia pastoris[J].J.Biotech，2005，117(3)，215-224.)又用酵母表达系统表达了VP60。其试验结果表明，表达产物不仅在抗原性上与天然病毒相近，在形态上也与天然病毒十分相似，将表达产物作为抗原，与免疫佐剂一起接种试验动物，可以对抗强毒的攻击。1999年。Castanon等(Castanon，S.，Marin，M.S.，Martin-Alonso，J.M.，Boga，JA.，Casais，R.，Humara，J.M.，Ordas，R.J.，Parra，F.，1999，Immunization with potato plants expressingVP60 protein protects against rabbit hemorrhagic disease virus.J Virol 73，4452-4455)尝试将VP60基因转入植物进行表达，结果他获得了能表达RHDVVP60的转基因马铃薯。将马铃薯饲喂兔子，结果也能为兔子提供一定的保护。但VP60的最终表达量偏低，直接饲喂动物达不到预期的免疫效果。

我国在兔瘟新型疫苗研究方面开展的比较晚，目前还主要集中于个别毒株的基因组测序、结构蛋白的表达和监测方法的建立等等方面。如严维巍等(严维巍，崔治中，王永坤.中国株兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因在大肠杆菌中的表达及其免疫原性鉴定。中国兽医学报，2003，23：447-449.)、王永山等(王永山，陆承平，周宗安，薛家宾.原核表达的兔出血症病毒衣壳蛋白对兔的免疫保护效果。中国农业科学，2004，37(11)：1677-1681)、刘怀然等(刘怀然，胡迎东，陈洪岩，张龄，李昌文，关云涛，曲连东.兔出血症病毒VP60蛋白的原核表达及检测方法初步应用.中国预防兽医学报，2006，28：201-203.)先后用原核表达系统表达了RHDV的VP60基因，免疫学试验结果表明所表达的VP60蛋白具有一定免疫学活性。近年来，扬州大学的严维巍(严维巍，崔治中，王永坤。在昆虫细胞中表达能自聚成病毒样颗粒的兔出血症病毒衣壳蛋.病毒学报，2004，4(4)：135-8.)和浙江农科院的陈柳等(陈柳，云涛，刘光清等.兔出血症病毒衣壳蛋白VP60在杆状病毒表达系统中的表达和定位.浙江农业学报，2010，22(2)：135-139)等又用杆状病毒和酵母表达系统表达了VP60蛋白，获得了与天然RHDV病毒粒子相似的病毒样颗粒，免疫动物后都能有效保护动物抵抗RHDV的攻击，为研制RHDV新型疫苗带来了希望。

尽管如此，迄今还没有商品化的RHDV基因工程疫苗问世，其重要原因之一是VP60在上述表达系统中的表达量不够高，需要大量表达抗原，并进行浓缩和纯化，增加了疫苗的生产成本，限制了基因工程疫苗的实际应用。因此，如何提高抗原的表达量，降低疫苗的生产成本已成为科研工作者亟待解决的问题之一。

综上所述，本领域急切需求表达量高、安全性好、免疫效价高的优质疫苗。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种安全、新型、免疫效果好、适于产业化生产的兔出血症病毒新型亚单位疫苗，该疫苗融合了兔出血症病毒保护性抗原组分和通用Th细胞表位，可以刺激机体产生良好免疫应答，可以用于预防兔出血症感染性疾病。本发明同时还提供上述疫苗的制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种兔出血症病毒新型亚单位疫苗的重组表达质粒，该重组表达质粒含有一个包括下列元件的融合编码基因：

(1)兔出血症病毒的优势抗原区A，该优势抗原区A为兔出血症病毒衣壳蛋白核苷酸序列的第31位-250位氨基酸，如SEQ ID NO：1所示；

(2)兔出血症病毒的优势抗原区B，该优势抗原区B为兔出血症病毒衣壳蛋白核苷酸序列的第475位-579位氨基酸，如SEQ ID NO：2所示。

优选地，所述的重组表达质粒的原始质粒是pET-30a。

优选地，所述的融合编码基因还包括如下元件：编码序列为SEQ ID NO：3所示的Th通用细胞表位，所述的融合编码基因是由插入元件按A-B-Th顺序串联而成。

一种兔出血症病毒新型亚单位疫苗的重组表达质粒，该重组表达质粒含有一个由下列元件组成的融合编码基因：

(1)兔出血症病毒的优势抗原区A，该优势抗原区A为兔出血症病毒衣壳蛋白核苷酸序列的第31位-250位氨基酸，如SEQ ID NO：1所示；

(2)连接肽：GGGGS；

(3)兔出血症病毒的优势抗原区B，该优势抗原区B为兔出血症病毒衣壳蛋白核苷酸序列的第475位-579位氨基酸，如SEQ ID NO：2所示；

(4)编码序列为SEQ ID NO：3所示的Th通用细胞表位；

(5)编码序列为SEQ ID NO：4所示的连续6个组氨酸编码序列，其中所述的融合编码基因是由插入元件按A-B-Th顺序串联而成。

优选地，所述的重组表达质粒的原始质粒是pET-30a。

一种兔出血症病毒新型亚单位疫苗，该疫苗是由上述任一项所述的重组表达质粒转化靶细菌后表达得到的融合蛋白，所述融合蛋白不包裹有任何核苷酸。

优选地，所述的靶细菌为来源于大肠杆菌的宿主细菌。

一种兔出血症病毒新型亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)将上述任一项所述的兔出血症病毒新型亚单位疫苗的重组表达质粒导入靶细菌进行转化；

(2)当转化的靶细菌培养至OD600值为0.5时，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，在30℃下培养4小时，收集诱导细菌；

(3)将收集的诱导细菌超声破壁，并收集包涵体；

(4)溶解上述包涵体，用包涵体粗纯的方法进行纯化；

(5)用洗液I、洗液II洗涤包涵体，所述洗液I为2M尿素+0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton100)+50mM氯化钠(NaCl)+0.2mM乙二胺四乙酸(EDTA)+磷酸盐缓冲液(PBS)，所述洗液II为2M尿素+0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton100)+磷酸盐缓冲液(PBS)；

(6)用尿素溶解步骤(5)洗涤后的包涵体，并经透析处理后得到所需的兔出血症病毒亚单位疫苗。

一种上述的兔出血症病毒新型亚单位疫苗在用于制备预防兔出血症的药物中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)该疫苗融合了兔出血症病毒的优势抗原区域和通用Th细胞表位，既可以刺激机体产生体液免疫应答，又能刺激机体产生细胞免疫应答；

(2)可以用于预防兔出血症病毒感染性疾病；

(3)表达量高，生产成本低，免疫效果好。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1为本发明实施例制备的重组表达质粒酶切鉴定的电泳检测图；

图2为本发明实施例制备的融合蛋白Western blot检测图；

图3为本发明实施例制备的融合蛋白SDS-PAGE电泳图；

图4为构建本发明的兔出血症病毒新型亚单位疫苗的策略示意图；

图5为本发明实施例的兔出血症病毒新型亚单位疫苗刺激兔子体内产生特异性抗体后，实验组与对照组在λ450nm处测定每孔的OD值的对比图；

图6为本发明实施例的兔出血症病毒新型亚单位疫苗刺激兔子淋巴细胞增值后，实验组与对照组在λ570nm处测定OD值的对比图；

图7为本发明实施例的兔出血症病毒新型亚单位疫苗刺激兔子分泌IFN-γ，实验组与对照组在λ450nm处测定每孔的OD值的对比图；

图8为本发明实施例的兔出血症病毒新型亚单位疫苗刺激兔子分泌IL-4，实验组与对照组在λ450nm处测定每孔的OD值的对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

本发明提供一种兔出血症病毒亚单位疫苗的重组表达质粒，该重组表达质粒包括下列元件的融合编码基因：

(1)兔出血症病毒的优势抗原区A，该优势抗原区A为兔出血症病毒衣壳蛋白核苷酸序列的第31位-250位氨基酸，如SEQ ID NO：1所示；

(2)兔出血症病毒的优势抗原区B，该优势抗原区B为兔出血症病毒衣壳蛋白核苷酸序列的第475位-579位氨基酸，如SEQ ID NO：2所示。该重组表达质粒的原始质粒可以是pET-30a。

优选地，上述融合编码基因还可包括如下元件：编码序列为SEQ ID NO：3所示的Th通用细胞表位，所述的融合编码基因是由插入元件按A-B-Th顺序串联而成，从而得到另外一个重组表达质粒，该重组表达质粒含有一个由下列元件组成的融合编码基因：(1)兔出血症病毒的优势抗原区A，该优势抗原区A为兔出血症病毒衣壳蛋白核苷酸序列的第31位-250位氨基酸，如SEQ ID NO：1所示；(2)连接肽：GGGGS；(3)兔出血症病毒的优势抗原区B，该优势抗原区B为兔出血症病毒衣壳蛋白核苷酸序列的第475位-579位氨基酸，如SEQ IDNO：2所示；(4)编码序列为SEQ ID NO：1所示的Th通用细胞表位；(5)编码序列为SEQ IDNO：2所示的连续6个组氨酸编码序列，其中上述融合编码基因是由插入元件按A-B-Th顺序串联而成。

上述兔出血症病毒新型亚单位疫苗的重组表达质粒，其原始质粒是pET-30a。所述的融合编码基因是由插入元件按A-B-Th顺序串联，A-B-Th的序列是由上海捷瑞生物工程公司合成后，利用限制性内切酶Kpn I和HindIII将其插入pET-30a中构建重组表达质粒pET/ABTh。AB基因序列由上海捷瑞生物工程公司合成后，利用限制性内切酶Kpn I和HindIII将其插入pET-30a中构建重组表达质粒pET/AB。优势抗原区A序列是SEQ ID NO：1所示的兔出血症病毒衣壳蛋白(VP60)的核苷酸序列的第31位-250位氨基酸。优势抗原区B序列是SEQ IDNO：2所示的兔出血症病毒衣壳蛋白(VP60)的核苷酸序列的第475位-579位氨基酸。Th通用细胞表位序列是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。上述重组表达质粒转化靶细菌后表达后得到的融合蛋白不包裹有任何核苷酸。

实施例

兔出血症病毒新型亚单位疫苗的制备，包括如下的步骤：

第一步：兔出血症病毒新型亚单位疫苗的重组表达质粒的制备步骤如下：

1)将兔出血症病毒新型亚单位疫苗的重组表达质粒pET-ABTh(该重组表达质粒系采用上述的方法人工合成，其外源基因分别含有RHDV的优势抗原区A、优势抗原区B和通用T细胞表位Th)和不带T细胞表位Th的重组表达质粒pET-AB(该重组质粒系采用上述的方法人工合成，其外源基因分别含有RHDV的优势抗原区A和优势抗原区B)分别转化大肠杆菌BL21宿主细菌，混匀，冰浴放至30min，42℃水浴中热激90S后迅速置冰上2min，然后涂布于卡那抗性平板中，12h后挑取菌落并摇菌；

2)将步骤1)得到的菌液利用AxyPrep DNA质粒抽提试剂盒抽提重组表达质粒；

3)重组表达质粒酶切鉴定：根据pET-ABTh和pET-AB载体上的酶切位点，将步骤2)抽提的重组表达质粒用Kpn I、HindIII进行双酶切鉴定。酶切体系如下：

酶切反应体系为10μL，37℃水浴2h。之后用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，鉴定结果如图1，样品条带大小与pET-30a载体(图1，5422bp)和目的基因(图1，936bp)大小一致，初步判定重组表达质粒构建正确。

4)上述重组表达质粒经Invitrogen公司测序显示，结果完全正确，说明成功构建了重组表达质粒。

第二步：重组表达质粒在原核细胞中的表达

取两管-80℃保存的感受态细胞，置冰上融化；分别加入上述制备的重组表达质粒pET-ABTh和pET-AB，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min；将离心管置于42℃热击60-90秒，然后迅速置冰浴2-3分钟；再向每个离心管中加入500ul液体LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟(150转/分钟)。将离心管内容物混匀，吸取100μl已转化的感受态细胞加到含50μg/ml卡那霉素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16小时，并挑取含重组表达质粒的菌体单斑至含有Kan+的LB培养基中，37℃振荡培养12h；按照1％的比例再转接种于新的含有Kan+的LB培养基中，30℃培养2.5h，当转化的靶细菌培养至OD600值为0.5时，加入终浓度为1mM的诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，30℃震荡培养4h，然后取菌液，离心后收集沉淀，该沉淀即为融合蛋白。用10％SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)对得到的表达产物进行电泳分析，并用Western Blot对得到的融合蛋白进行鉴定，如图2显示，其位置出现特异性蛋白条带，说明重组蛋白得到了表达。其中，M为蛋白质分子量标准，pET-AB代表兔出血症病毒衣壳蛋白优势抗原区A和B的融合表达产物，pET-ABTh代表融合有Th表位以及兔出血症病毒衣壳蛋白优势抗原区A和B的融合蛋白。

第三步：融合蛋白的纯化

采用包涵体粗纯蛋白的一般方法进行：

1)将上述离心收集的细菌沉淀用10ml 20mM tris-HCl(PH＝8)重悬；

2)向上述重悬液中加入100ul终浓度为1mg/ml的溶菌酶，37℃孵育30min；

3)将上述重悬液反复冻融3次后，超声破碎至溶液不粘稠；然后10000rpm离心20min，弃上清液得到包涵体；

4)先后用洗液I(2M 120g尿素+1ml 0.1％聚乙二醇辛基苯基醚triton100+2.92g 50mM氯化钠NaCl+0.05g 0.2mM乙二胺四乙酸EDTA+1000ml磷酸盐缓冲液PBS)和洗液II (120g2M尿素+1ml 0.1％聚乙二醇辛基苯基醚triton100+1000ml磷酸盐缓冲液PBS)依次洗涤上述包涵体；

5)将步骤4)得到的洗涤纯化的包涵体溶解于8mol/L尿素中，溶解的包涵体进行SDS-PAGE电泳分析，电泳结果如图3所示，融合蛋白pET-AB和pET-ABTh均得到了良好表达，其分子量为35.3KD。将溶解的包涵体装入处理过的透析袋中，在磷酸盐缓冲液PBS中进行透析，每隔2h换1次PBS，最后透析12h(整个透析过程在冰上进行)，透析处理后得到所需的用于制备兔出血症病毒新型亚单位疫苗的抗原，即兔出血症病毒新型亚单位疫苗。

兔出血症病毒新型亚单位疫苗的效果检测，包括如下几个方面：

第一：兔出血症病毒新型亚单位疫苗在兔子体内免疫反应的特异性抗体检测

将12只两月龄兔子随机分为3组，每组4只，其中一组免疫重组表达质粒pET-ABTh表达的融合蛋白，另一组免疫重组表达质粒pET-AB表达的融合蛋白，最后一组免疫PBS(磷酸盐缓冲液)，免疫方法为：肌肉注射免疫两次，每次间隔两周。在第一次免疫后第2周、第二次免疫后第2周，对免疫组pET-ABTh、pET-AB和对照组PBS的兔子进行耳静脉采血，血液于37℃放置1h，再置于4℃放置12h，然后离心后分离得到血清，以间接ELISA法测定血清抗体的OD450值，具体为以RHDV-VP60原核表达蛋白为包被抗原(5μg/孔)于96孔酶标板上测定，被检兔子血清为一抗，过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(购自北京康为世纪生物科技有限公司)为二抗，同时设立不加被检血清的空白对照，显色终止后，于λ450nm处测定每孔的OD值，SAS统计软件分析，结果参见表1和图5，该结果显示免疫组与对照组比较差异显著，免疫组可以获得好的免疫效果，从体液水平上则说明，免疫组中携带Th通用表位的新型亚单位疫苗的免疫效果更好。

表1特异性抗体检测结果

第二：兔出血症病毒新型亚单位疫苗在兔子体内T淋巴细胞增殖检测

将12只两月龄兔子随机分为3组，每组4只，其中一组免疫重组表达质粒pET-ABTh表达的融合蛋白，另一组免疫重组表达质粒pET-AB表达的融合蛋白，最后一组免疫PBS(磷酸盐缓冲液)，免疫方法为：肌肉注射免疫两次，每次间隔两周。在第一次免疫后第2周、第二次免疫后第2周，对免疫组pET-ABTh、pET-AB和对照组PBS的兔子进行耳静脉采血分离淋巴细胞，以含10％FBS(胎牛血清)的DMEM(极限必需培养基)稀释成1×10/mL的细胞悬液，于96孔细胞培养板中培养。每孔加入100μL细胞悬液，同时设DMEM自身对照，每个样品设8个重复孔。培养板置37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养68h后，每孔加10μL MTT(4，5-二甲基噻唑-2)(5mg/mL)，孵育4h，加入50ul二甲基亚砜(DMSO)溶液终止反应，待蓝色沉淀溶解后于λ570nm处测定OD值，进行统计学分析，结果参见表2和图6，该结果显示免疫组与对照组比较差异显著，免疫组可以获得好的免疫效果，而且免疫组中携带Th通用表位的新型亚单位疫苗的免疫效果要更好。

表2T淋巴细胞增殖检测结果

第三：兔出血症病毒新型亚单位疫苗在兔体内干扰素-γ(IFN-γ)ELISA检测

按照兔干扰素-γELISA检测试剂盒(购自上海西唐生物科技有限公司)的步骤，检测被分离血清中IFN-γ的浓度，具体步骤如下，其中被分离血清的制备同上述第1)种检测的方法：

1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100μl，将反应板充分混匀后置37℃120分钟；

2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤6次，向滤纸上印干；

3.每孔(空白孔除外)中加入第一抗体工作液100μl，反应板充分混匀后置37℃60分钟；

4.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤6次，向滤纸上印干；

5.每孔加酶标抗体工作液100μl，将反应板于37℃，孵育30分钟；

6.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤6次，向滤纸上印干；

7.每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗处，孵育15分钟；

8.每孔加入100μl终止液混匀；

9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

得到实验数据后，所有的OD值都应减除空白值后再进行计算，在坐标纸上绘图，以标准品稀释度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上画出标准曲线，根据样品的OD值在曲线上查出相应IFN-γ含量(pg/ml)。

SAS统计软件分析，结果如表3和图7，该结果显示免疫组与对照组比较差异显著，免疫组可以获得好的免疫效果，而且从细胞因子水平上说明，免疫组中携带Th通用表位的新型亚单位疫苗的免疫效果要更好。

表3IFN-γELISA检测结果

第四：兔出血症病毒新型亚单位疫苗在兔体内白介素-4(IL-4)ELISA检测

按照兔体内白介素-4ELISA检测试剂盒(购自上海西唐生物科技有限公司)的步骤，检测被分离血清中IL-4的浓度，具体步骤如下，其中被分离血清的制备同上述第1)种检测的方法：

1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100μl，将反应板充分混匀后，于37℃，静置120分钟；

2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4次，向滤纸上印干；

3.每孔(空白孔除外)中加入第一抗体工作液100μl，将反应板充分混匀后置37℃，孵育60分钟；

4.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4次，向滤纸上印干；

5.每孔加酶标抗体工作液100μl，将反应板置37℃，孵育30分钟；

6.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4次，向滤纸上印干；

7.每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗处，反应15分钟；

8.每孔加入100μl终止液混匀；

9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

得到实验数据后，所有的OD值都应减除空白值后再进行计算，在坐标纸上绘图，以标准品稀释度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上画出标准曲线，根据样品的OD值在曲线上查出相应IL-4含量(pg/ml)。

SAS统计软件分析，结果如表4和图8，该结果显示免疫组与对照组比较差异显著，免疫组可以获得好的免疫效果，而且从细胞因子水平上说明，免疫组中携带Th通用表位新型亚单位疫苗的免疫效果要更好。

表4IL-4ELISA检测结果

第五：兔出血症病毒新型亚单位疫苗预防和治疗兔病毒性出血症的效果

将12只两月龄新西兰大白兔随机分为3组，每组4只，分别为：I组免疫重组表达质粒pET-AB表达的融合蛋白，II组免疫携带Th通用细胞表位的重组表达质粒pET-ABTh表达的融合蛋白，III组注射PBS为对照，采用腿部肌肉注射免疫，每组动物均免疫2次，间隔2周，第一次免疫剂量为500μg，第二次为500μg。二次免疫14天后，对所有试验兔用强毒株(RHDV/92)进行攻击，攻毒剂量为2ml/只。连续观察10天，并记录每组兔子死亡情况(见表5)及临床症状，病变。结果为：III组在接毒48-72h分别死亡4只，鼻腔中有泡沫状出血，眼结膜充血，肝肿大，黄褐色，质脆，表面散在灰白色针尖至粟粒大坏死灶，两肾有不同程度淤血、变性，心腔内积留黑红色血液和血块。I组II组未出先死亡情况，并健康生长。

10天后解剖所有白兔，发现I组II组未死的兔子无出血症状，肝，肺和肾都正常。

表5动物免疫试验结果

	兔子总数	死亡数	未死数	死亡率
					pET-AB	4	0	4	0
pET-ABTh	4	0	4	0
					PBS	4	4	0	100％

上述免疫实验结果表明，本发明的兔出血症病毒新型亚单位疫苗可预防和治疗兔病毒性出血症。

本发明的兔出血症病毒新型亚单位疫苗可用于制备预防和治疗兔病毒性出血症的药物，其具有以下优点：

(1)该疫苗融合了兔出血症病毒的优势抗原区域和通用Th细胞表位，既可以刺激机体产生体液免疫应答，又能刺激机体产生细胞免疫应答；

(2)可以用于预防兔出血症病毒感染性疾病；

(3)表达量高，生产成本低，免疫效果好。

以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>兔出血症病毒新型亚单位疫苗及其制备方法

<130>DAG10054

<160>4

<170>PATENTIN33

<210>1

<211>480

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atgtccgtcg cggatgcgcc cggcagcatt ctctacactg tccaacactc tccacagaac    60

aacccattca cagccgtgct gagccagatg tacgctggct gggctggtgg catgcagttc    120

cgcttcatag ttgctggatc aggtgtgttt ggtgggcgac tggtcgcggc tgtgatacca    180

ccaggcatcg agattggacc agggttggag gtcaggcaat ttcctcatgt tgttatcgac    240

gcccgttcac tcgaacctgt taccatcacc atgccagact tgcgtcccaa catgtaccat    300

ccaactggtg accctggcct tgtccccaca ctggtcctta gtgtttacaa caacctcatc    360

aacccgtttg gtgggtccac caacgcaatc caggtaacag tggaaacaag accaagtgat    420

gactttgagt ttgtgatgat tagagccccc tccagcaaga ctgttgactc aatctcaccc    480

<210>2

<211>327

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gacgtcaacg ccgcagctgg gtcaaccaac gggacccagt acggcacagg ctcccaacca    60

ctgccagtaa caattggact ttcgctcaac aactactcgt cagcactcat gcccgggcag    120

tttttcgttt ggcagttaac ctttgcatct ggtttcatgg agattggttt aagtgtggac    180

gggtactttt atgcaggcac aggagcctca accacgctca ttgacttgac tgaactcatt    240

gacgtacgcc cggtgggacc caggccgtcc aagagcacac tcgtgttcaa cctggggggc    300

acaaccaatg gcttttctta tgtctga                                        327

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

LYVISISEIK GVIVHKIEGI LFES                                           24

<210>4

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

HHHHHH                                                       6

Claims (9)

1.一种兔出血症病毒新型亚单位疫苗的重组表达质粒，其特征在于，该重组表达质粒含有一个包括下列元件的融合编码基因：

(1)兔出血症病毒的优势抗原区A，该优势抗原区A为兔出血症病毒衣壳蛋白核苷酸序列的第31位-250位氨基酸，如SEQ ID NO：1所示；

(2)兔出血症病毒的优势抗原区B，该优势抗原区B为兔出血症病毒衣壳蛋白核苷酸序列的第475位-579位氨基酸，如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的兔出血症病毒新型亚单位疫苗的重组表达质粒，其特征在于，所述的重组表达质粒的原始质粒是pET-30a。

3.根据权利要求1或2所述的兔出血症病毒新型亚单位疫苗的重组表达质粒，其特征在于，所述的融合编码基因还包括如下元件：编码序列为SEQ ID NO：3所示的Th通用细胞表位，所述的融合编码基因是由插入元件按A-B-Th顺序串联而成。

4.一种兔出血症病毒新型亚单位疫苗的重组表达质粒，其特征在于，该重组表达质粒含有一个由下列元件组成的融合编码基因：

(1)兔出血症病毒的优势抗原区A，该优势抗原区A为兔出血症病毒衣壳蛋白核苷酸序列的第31位-250位氨基酸，如SEQ ID NO：1所示；

(2)连接肽：GGGGS；

(3)兔出血症病毒的优势抗原区B，该优势抗原区B为兔出血症病毒衣壳蛋白核苷酸序列的第475位-579位氨基酸，如SEQ ID NO：2所示；

(4)编码序列为SEQ ID NO：3所示的Th通用细胞表位；

(5)编码序列为SEQ ID NO：4所示的连续6个组氨酸编码序列，其中所述的融合编码基因是由插入元件按A-B-Th顺序串联而成。

5.根据权利要求4所述的兔出血症病毒新型亚单位疫苗的重组表达质粒，其特征在于，所述的重组表达质粒的原始质粒是pET-30a。

6.一种兔出血症病毒新型亚单位疫苗，其特征在于，该疫苗是由权利要求1-3或权利要求4-5中任一项所述的重组表达质粒转化靶细菌后表达得到的融合蛋白，所述融合蛋白不包裹有任何核苷酸。

7.根据权利要求6所述的兔出血症病毒新型亚单位疫苗，其特征在于，所述的靶细菌为来源于大肠杆菌的宿主细菌。

8.一种兔出血症病毒新型亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将权利要求1-3或权利要求4-5中任一项所述的兔出血症病毒新型亚单位疫苗的重组表达质粒导入靶细菌进行转化；

(2)当转化的靶细菌培养至OD600值为0.5时，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷进行诱导，在30℃下培养4小时，收集诱导细菌；

(3)将收集的诱导细菌超声破壁，并收集包涵体；

(4)溶解上述包涵体，用包涵体粗纯的方法进行纯化；

(5)先后用洗液I、洗液II洗涤包涵体，所述洗液I为2M尿素+0.1％聚乙二醇辛基苯基醚Triton100+50mM氯化钠+0.2mM乙二胺四乙酸EDTA+磷酸盐缓冲液PBS，所述洗液II为2M尿素+0.1％聚乙二醇辛基苯基醚Triton100+磷酸盐缓冲液PBS；

(6)用尿素溶解步骤(5)洗涤后的包涵体，并经透析处理后得到所需的兔出血症病毒亚单位疫苗。

9.一种权利要求6或7所述的兔出血症病毒新型亚单位疫苗在用于制备预防兔出血症的药物中的用途。

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