WO2009112603A1 - Proteína de fusión con direccionamiento de antígenos vacunales a células presentadoras de antígeno y sus aplicaciones - Google Patents

Proteína de fusión con direccionamiento de antígenos vacunales a células presentadoras de antígeno y sus aplicaciones Download PDF

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gene
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José Ángel MARTÍNEZ ESCRIBANO
Andrés WIGDOROVITZ
Félix GIL DONES
Agustín OSTACHUK
Mariano PÉREZ FILGUERA
Javier DOMÍNGUEZ
Carmen NÚÑEZ SERRANO
María José DUS SANTOS
Covadonga ALONSO MARTÍ
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Instituto Nacional De Investigación Y Tecnología Agraria Y Alimentaria
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Definitions

  • This invention relates to a method of targeting vaccine antigens to antigen presenting cells, based on the synthesis of a fusion protein comprising: a polypeptide having a region that recognizes an epitope present on the surface of a cell presenting a antigen, and another polypeptide that is the vaccine antigen of interest.
  • the invention relates to a method, alternative to those existing in the state of the art, which increases the effectiveness of recombinant subunit vaccines when they are applied in different species, both in animals in general, and in humans in particular.
  • the method of the invention based on the targeting of antigens to its presenting cells, it was possible to enhance the host-mediated immune response while decreasing the dose of vaccine applied, matching or exceeding the immune response achieved by applying conventional vaccines
  • the vaccination antigen targeting system to the antigen presenting cells proposed by this invention is therefore constituted by a fusion protein comprising at least one polypeptide (A) having a region that recognizes an epitope present on the surface of an antigen presenting cell, and another polypeptide (B) which is the vaccine antigen of interest, responsible for triggering the immune response in the host.
  • the polypeptide (A) comprises a region that recognizes the ⁇ chain of the DR antigen (Region D) of Class II.
  • Said polypeptide is a recombinant antibody APCH1 ("Antigen Presenting CeIJs Homing 1")) characterized by SEQ ID NO: 1, single chain (scFv), derived from the monoclonal antibody IF 12,
  • APCH1 Antigen Presenting CeIJs Homing 1
  • scFv single chain
  • the polypeptide (A) is formed by Ia variable heavy chain (VH) region of the fused IFl 2 monoclonal antibody, through a peptide flexible, to the variable region of the light chain (VL) of the monoclonal antibody IF 12.
  • VH variable heavy chain
  • VL variable region of the light chain of the monoclonal antibody IF 12
  • the monoclonal antibody IFl 2 recognizes the ⁇ chain of the Class II DR antigen in a large number of species, so it
  • the peptide (B) (vaccine antigen of interest) is the vaccine peptide named 2L21 (SEQ ID NO: 21) from parvo canine virus (CPV), the E2T protein (SEQ ID NO: 23) or E2 of the bovine viral diarrhea virus, the VP60 protein of the rabbit hemorrhagic disease virus, the VP6 protein of the rotavirus or the hemagglutinin protein of the influenza virus.
  • 2L21 is formed by two antigenic sub-sites distant from the amino terminal region of the VP2 protein of the CPV capsid and was previously published as the first synthetic vaccine peptide (López de Turiso, JA, Cortés, E., Mart ⁇ nez, C, Ruiz de Ybánez, R., Simairo, L, Vela, C, Casal, I. (1992) J. Virol. 66: 2748-2753).
  • the 2L21 peptide, fused to APCH1 has been expressed in plants.
  • said 2L21 peptide has been expressed in unbound plants, or fused to an irrelevant protein from the immunogenic point of view ( ⁇ -glucuronidase, GUS), whose expression had previously been successfully carried out in the inventors' laboratory (Gil F ., Brun A., Wigdorovitz A., Mart ⁇ nez-Torrecuadra JL, Cátala R., Casal L, Salinas J., Borca MV and Escribano JM. FEBS Letters 488: 13-17, 2001).
  • the 2L21-GUS fusion protein is a very stable protein, with a low degradation rate and perfectly adapted to plant expression.
  • the invention presents a method of targeting vaccine antigens to its presenting cells, consisting of a fusion protein, such as, for example, APCH1-2L21 or APCHl -E2T, comprising APCHl fused to the vaccine peptide 2L21 or E2T respectively.
  • a fusion protein such as, for example, APCH1-2L21 or APCHl -E2T
  • the APCHl -2L21 fusion protein was expressed in plants, giving rise to transgenic Arabidposis thaliana plants, and the APCH1-E2T fusion protein was expressed in mammalian cells.
  • the APCHl -2L21 fusion protein maintained the antigenic and immunogenic characteristics of the 2L21 peptide, inducing high specific antibody titres in groups of animals immunized both orally and intraperitoneally, intravenously, intramuscularly or subcutaneously, being this much higher to that induced by synthetic peptide 2L21 alone or fused to GUS (2L21-GUS).
  • the vaccination antigen targeting system has numerous advantages as it allows the fused vaccine antigen to be directed to the antigen presenting cells, facilitating the capture of the vaccine antigen and enhancing the immune response.
  • the vaccine dose of the subunit vaccine of the recombinant pathogen to be administered, both to animals and to humans, is reduced to obtain an immune response equal to or greater than that obtained with conventional vaccines with the whole pathogen.
  • Figure 1 Schematically shows the gene expression construct of plasmid pBI APCHl-2L21.
  • Figure IA schematically shows the gene expression construct that is integrated into the Arabidopsis thaliana nuclear genome, which comprises the APCH1 nucleotide sequence, driven by the constitutive 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV 35S) [LB: left edge; RB: right edge; APCH1-Peptide 2L21: fusion coding for APCH1-2L21 fusion protein; NOS-Ter: polyadenylation sequence and under the control of the nopalin synthetase promoter (NOS-Pro); NPT II (Kan R): Kanamycin resistance gene.
  • Figure IB shows the expected three-dimensional structure for the APCH1-2L21 fusion protein, obtained from the "Swiss-protein", where the two globular domains (VH and VL) folded independently can be observed.
  • Figure 2 Illustrates the analysis of the expression of the 2L21 antigen fused to the scCHv APCH1 in some lines expressing said fusion protein (APCH1-2L21).
  • Figure 2A shows the results of a Northern blot analysis of the transcription of the fusion gene (APCHl -2L21) in transgenic plants of A. thaliana, on 5 ⁇ g of total RNA per plant line and hybridized using as a probe the sequence of Complete DNA of fusion APCH1-2L21 labeled with 32 P.
  • Figure 2B shows the results of a Western blot analysis of the protein extracts (40 ⁇ g of total soluble protein) extracted from fresh leaves of the different transgenic A. thaliana lines analyzed by
  • Figure 3 Shows the result of specific surface marking of porcine alveolar macrophages with peroxidase (I) and with fluorescent (II) marking.
  • Panel I (a) macrophages incubated with plant extracts (negative control); (b) macrophage cell surface marking obtained with the 1F12 antibody; (c) marking obtained with the total soluble protein extract, which contained the APCH1-2L21 fusion protein.
  • Panel II detail at low magnifications of cells incubated with control extract (1), IF 12 antibody (2) and plant extract expressing APCHl -2L21 fusion protein (3).
  • Figure 4 Bar chart showing the result of the analysis of the immune response obtained with various preparations of the CPV 2L21 peptide, specifically, the immune response of specific antibodies obtained in mice by immunizing with peptide 2L21 only (2L21), fused to APCHl antibody (APCH 1-2L21) or fused to ⁇ -GUS protein (2L21-GUS).
  • FIG. 8 Recognition of APCH1 -E2T to MHCII (major histocompatibility complex) of mononuclear cells.
  • MHCII is a family of genes that codes for certain plasma membrane glycoproteins involved in the mechanisms of presentation and processing of antigens to T-lymphocytes, as well as cytokines and proteins of the complement system, important in the immune response.
  • Figure 9. Immune response in guinea pigs immunized with the experimental molecule.
  • the Lac z gene codes for ⁇ -galactosidase, an enzyme that converts lactose into glucose and galactose and was used as a negative control.
  • the term DPV in the figure refers to days after vaccination.
  • FIG. 10 Immune response in cattle immunized with culture supernatants expressing APCH1-E2T and E2T protein.
  • Figure 1OA cattle immunized with 1 ⁇ g of APCHl -E2T or E2T.
  • Figure 10 B cattle immunized with 0.2 ⁇ g of APCHl -E2T or E2T.
  • the invention relates to a DNA construct, hereinafter referred to as the DNA construct of the invention, comprising, operably linked, directly or indirectly, at least:
  • nucleic acid sequence A encoding a polypeptide comprising a region that recognizes an epitope present on the surface of an antigen presenting cell; and b) a nucleic acid sequence (B) comprising the nucleotide sequence encoding the vaccine antigen of interest, responsible for triggering the immune response in the host.
  • the nucleic acid sequence (A) encodes a polypeptide comprising a region that recognizes an epitope present on the surface of an antigen presenting cell.
  • a polypeptide comprising a region that recognizes an epitope present on the surface of an antigen presenting cell can be used in this invention, such as, for example, a monoclonal antibody, or a fragment thereof, both in its simple (scFv), bifunctional (diabody) or complete (Fab + Fc) chain form.
  • the nucleic acid sequence (A) encodes an APCH1 polypeptide (SEQ ID NO: 1) comprising a region that recognizes an epitope ( ⁇ chain) of the Class II DR antigen.
  • Class II is expressed in the cells of the immune system as surface polypeptides and comprises the antigens HLAD (human leukocyte antigen D), subclassified into DR (DRA and DRB), DQ and DP.
  • Said polypeptide is a single chain recombinant antibody, derived from the IFl 2 monoclonal antibody, comprised of the heavy chain variable region (VH) of the fused monoclonal antibody 1F12, through a flexible peptide (linker or hinge), to the variable region of the light chain (VL) of the IF 12 monoclonal antibody.
  • the 3 'end of the VL coding sequence is attached to the 5' end of the linker coding sequence and the V end of the coding nucleotide sequence of said Linker is attached to the 5 'end of the VL coding sequence.
  • the APCH1 scFv was designed so that one or more restriction sequences could be added at the 3 'end of VL in order to be able to perform different fusions with the antigens to be tested and at the 5' end of VH contains a restriction sequence (Xbal), which allowed the fusions to be easily removed from the plasmid in which they are found and taken to the plant transformation plasmids.
  • the 1F12 monoclonal antibody recognizes the ⁇ chain of the Class II DR antigen in a large number of animal species, so it can be applied to multiple species, including man. Due to its properties, said antibody, in any of its forms (scFv, bifunctional or complete) can direct a vaccine peptide fused thereto to the antigen presenting cells that present such molecules on their surface, facilitating the capture of the antigen and enhancing the response, since most of the expressed protein would reach its destination before degrading. In this way, the low levels of accumulation of xenoproteins (vaccines of recombinant subunits of the pathogen) presented by transgenic plants or animals can be compensated for or offset production costs in other systems.
  • the nucleic acid sequence IB encodes a vaccine antigen of interest that can be virtually any peptide or protein, regardless of its origin (eucaiotic, prokaryotic, viral, etc.), capable of being expressed recombinantly and inducing a response immune in the host, either an animal in general or the human being in particular.
  • the following are a series of examples that can act as a vaccine antigen of interest: CPV 2L21 peptide, rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) VP60 protein, rotavirus VP6 protein, E2 protein or E2T diarrhea virus bovine viral, a vaccine antigen against tumors and tumor cells, etc.
  • the nucleic acid sequence (A) is not fused directly to the nucleic acid sequence (B) but it is advantageous to introduce a spacer peptide (linker) between the 3 'end of the nucleic acid sequence (A ) and the 5 'end of the nucleic acid sequence (B). Therefore, if desired, the DNA construct of the invention can also contain, in addition, a nucleic acid sequence (O containing the nucleotide sequence that encodes a spacer peptide located between said nucleic acid sequences (A) and (B), wherein the 5 'end of said nucleic acid sequence (C) is bound to the 3?
  • said spacer peptide (C) is a peptide with structural flexibility.
  • said flexible peptide may contain repeats of amino acid residues, in particular of GIy and Ser residues or any other suitable amino acid residue repeat, in a particular embodiment, said flexible spacer peptide is selected and Enter the sequence SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the DNA construct of the invention may contain, if desired, a nucleic acid sequence encoding a peptide capable of being used with isolation or purification purposes of the fusion peptide or protein. Therefore, in a particular embodiment, the DNA construct of the invention includes, if desired, a nucleic acid sequence (D) containing the nucleotide sequence encoding a peptide capable of being used for isolation or purification purposes. Said nucleic acid sequence (D) may be located in any position that does not alter the functionality of the polypeptide comprising the region that recognizes an epitope present on the surface of an antigen presenting cell or of the polypeptide of interest. By way of illustration, said nucleic acid sequence (D) may be located downstream of the 3 'end of said nucleic acid sequence (B).
  • Virtually any peptide or peptide sequence that allows isolation or purification of the fusion peptide or protein can be used, for example, polyhistidine sequences, peptide sequences capable of being recognized by monoclonal antibodies that can be used to purify the resulting fusion protein by chromatography immunoaffinity, such as tag peptides, etc., for example, epitopes derived from influenza virus hemagglutinin or C-myc epitope, etc.
  • the DNA construct of the invention can be obtained by using well - known techniques in the prior art [Sambrook et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989 VoI 1-3].
  • Said DNA construct of the invention may, operably linked, incorporate a sequence regulating the expression of the nucleotide sequence encoding the product or products of interest, thereby constituting a gene expression construct.
  • the term "operably linked” means that the product or products of interest is (are) expressed in the correct reading frame under the control of the control or regulatory expression sequences.
  • the gene construct of the invention comprises operably linked an expression control sequence of the nucleotide sequence encoding the fusion protein of the invention.
  • Control sequences are sequences that control and regulate transcription and, where appropriate, the ⁇ translation of said fusion protein, and include promoter sequences, coding sequences for transcriptional regulators, ribosome binding sequences (RBS) and / or transcription terminator sequences.
  • said expression control sequence is functional in prokaryotic cells and organisms, for example, bacteria, etc., while in another particular embodiment, said expression control sequence is functional in eukaryotic cells and organisms, for example. , insect cells, plant cells, mammalian cells, etc.
  • said gene expression construct also comprises a marker or gene that codes for a motif or for a phenotype that allows the selection of the host cell transformed with said gene expression construct.
  • the invention relates to a vector, such as an expression vector, comprising said DNA construct.
  • a vector such as an expression vector
  • the choice of the vector will depend on the host cell into which it will be subsequently introduced.
  • the vector where said DNA sequence is introduced can be a plasmid or a vector that, when introduced into a host cell, is integrated or not into the genome of said cell.
  • the obtaining of said vector can be carried out by conventional methods known by those skilled in the art [Sambrok et al., 1989, cited supra].
  • said recombinant vector is a vector useful for transforming or being inserted into plant cells. or animal cells.
  • the vector of the The invention can be, for example, Agrobacterium tumefaciens or a viral vector, capable of infecting and expressing itself in cells of animals (such as mammals or insects) or plants.
  • the viral vector used is Baculovints.
  • Said vector can be used to transform, transfect or infect cells susceptible to being transformed, transfected or infected by it. Therefore, in another aspect, the invention relates to an infected cell with a viral vector provided by this invention.
  • said infected cell is a plant cell infected with an appropriate viral vector, said infected plant cell being capable of expressing the fusion protein provided by this invention.
  • Plant cells infected with recombinant viral vectors can be obtained after infection of a plant with said recombinant viral vector.
  • plant-infectious viral vectors can be used for plant expression of animal pathogen or tumor cell epitopes in order to produce edible vaccines against said pathogens or tumor cells.
  • the recombinant vectors provided by this invention can be used to transform or transfect eukaryotic or prokaryotic cells. Therefore, in another aspect, the invention relates to a transformed or transfected cell comprising said recombinant vector, or said DNA construct provided by this invention, or said gene expression construct provided by the invention. Transformed or transfected cells can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art [Sambrok et al, 1989, cited supra].
  • said recombinant vector is a viral vector.
  • the recombinant vectors of the invention are capable of infecting and expressing themselves in plant cells, algal cells or animal cells, preferably in insect or larval cells thereof. Accordingly, in another aspect, the invention relates to a transformed or transfected cell comprising at least one DNA construct of the invention, or a recombinant vector provided by this invention or a gene expression construct provided by this invention.
  • the invention in another aspect, relates to a transgenic cell comprising, inserted in its genome, at least one DNA construct of the invention.
  • said transgenic cell is derived from a plant cell and comprises, inserted in its genome or in the genome of a chloroplast, at least one DNA construct of the invention. From said transgenic plant cells or from transgenic plant material, transgenic plants can be obtained. Therefore, in another aspect, the invention relates to a transgenic plant comprising at least one transgenic plant cell provided by this invention.
  • a potentially interesting application of transgenic plants is the expression in plants of proteins or epitopes of animal pathogens or of tumor cells in order to produce edible vaccines against said pathogens or tumor cells.
  • said transgenic cell is an animal cell, preferably of a mammal or an insect and more preferably of an insect larva. Therefore, the invention also relates to a transgenic non-human animal, particularly a mammal, an insect or a transgenic insect larva that expresses the peptide or protein of interest, with high yield.
  • the DNA construct of the invention can be used to produce fusion proteins described in the present invention. Therefore, in another aspect, the invention relates to a method for producing said fusion protein comprising growing a cell or organism provided by this invention under conditions that allow the production of said fusion protein. The conditions for optimizing the culture of said cell or organism will depend on the cell or organism used. If desired, the method of producing a product of interest provided by this invention further includes isolation and purification of said fusion protein.
  • the invention also provides, in another aspect, a method for expressing in a plant a gene encoding a fusion protein provided by this invention, which comprises transforming said plant with at least one DNA construct provided by this invention. The transformation of plant tissue cells can be carried out by conventional methods.
  • the invention relates to a fusion protein obtainable by expression of the nucleic acid sequence contained in the DNA construct provided by this invention. More specifically, the invention provides a fusion protein comprising:
  • the invention provides a fusion protein comprising:
  • IF 12 containing the region that recognizes the ⁇ chain of the Class II DR antigen, the monoclonal antibody 1F12 in bifunctional form, and a recombinant scFv containing the heavy chain variable region (VH) of the fused monoclonal antibody 1F12, through from a flexible peptide, to the light chain variable region (VL) of the IF 12 monoclonal antibody (APCHl); Y
  • the fusion protein provided by this invention may also contain, if desired, a spacer peptide between the polypeptide comprising a region that recognizes an epitope present on the surface of an antigen presenting cell and the polypeptide of interest; and / or a peptide to facilitate the isolation or purification of the fusion protein.
  • the fusion protein provided by this invention in particular when the polypeptide comprising the region that recognizes an epitope present on the surface of an antigen presenting cell is an scFv, is, in general, a relatively small molecule and therefore maintains
  • the binding specificity of the original antibody from which the polypeptide is derived comprises the region that recognizes an epitope present on the surface of an antigen presenting cell, and does not require the complex assembly process of the entire antibody.
  • due to their small size they have better tissue penetrability.
  • the invention relates to a recombinant vaccine comprising the fusion protein provided by this invention, and, optionally, a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the tests carried out show that the fusion protein provided by this invention enhances the immune response in animals since it induces antibody titers much higher than those obtained with the vaccine peptide alone or fused to an irrelevant protein, confirming that thus the hypothesis of the increase in immunogenicity of a vaccine peptide through its targeting to antigen presenting cells by means of a polypeptide comprising a region that recognizes an epitope present on the surface of an antigen presenting cell, such as the APCH1 scFv.
  • the vaccine antigen targeting system by directing the fused vaccine antigen to the antigen presenting cells that have the corresponding epitope on its surface, facilitates the capture of the vaccine antigen and enhances the immune response, since that most of the The expressed protein arrives at its destination before degrading, preventing the vaccine antigen from being removed from the bloodstream without being processed by the cells responsible for presenting it to the immune system and, therefore, generating a protective immune response. Thanks to the targeting of the vaccine antigen to antigen presenting cells, a large part of it is correctly presented to the immune system and results in a potent immune response that, depending on the cases, will be at least 50 times that obtained by the vaccine antigen alone (referred to the specific antibody titer). Therefore, this invention immunologically improves vaccines of recombinant subunits produced in any system.
  • Plasmid pBIAPCHl-2L21 It was deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT), Burjassot, Valencia, on 12/12/2003, corresponding to the CECT access number: 5857.
  • Plasmid pcDNAAPCHl-E2T it was deposited in the Spanish Type Crops Collection (CECT), Burjassot, Valencia, on 05.03.2008, corresponding to the CECT access number: 7387.
  • EXAMPLE 1 Addressing of vaccine antigens to antigen presenting cells for potentiation of the immune response in animals. Fusion of APCH1 recombinant single chain antibody (SEQ ID NO: 1) to peptide 2L21 and its expression in transgenic plants 1.1 Plant material
  • the model plant used was Arabidopsis thaliana, Columbia ecotype.
  • the genus Arabidopsis belongs to the family of the Cruciferas (Brassicaceae or Cruciferae). 5
  • pGEM-Teasy This plasmid is specially designed for cloning and sequencing of PCR products. It contains a region with multiple restriction sites (polylinker). The polylinker has been previously digested with EcoRV and subsequently 3 'thymidines have been added at both ends to facilitate cloning of the PCR products. In addition, it allows the selection of recombinants through the LacZ gene.
  • PBI-121 fClontech Cat. 6018-1) Derived from plasmid pBI-101. It contains the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (35S CaMV) directing the expression of the GUS gene and a 260 bp fragment (base pairs) containing the polyadenylation sequence of the nopalin synthetase (NOS-ter) gene of the Ti plasmid of Agrobacterium. It also contains an RK2 origin of replication (low copy number) and a kanamycin resistance gene (Npt2).
  • plasmid p35S-TEV (4,051 bp), generated in the laboratory of Dr. Escribano (INIA) and derived from plasmid pBI121 [laboratory collection of Dr. Escribano (INIA)] was also used. It contains the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (35SCaMV) 3 the transcription enhancer sequence (TEV) of the tobacco mottling virus, after which a region of multiple cloning and the Vsp polyadenylation signal appears. This plasmid was used in the subcloning of some constructions as a previous step to its cloning in the binary plasmid. These two plasmids are freely available to the public in the inventors' laboratory and are not part of the claimed invention. 1.3.2 Plant transformation plasmids developed during the implementation of this invention
  • the plasmid identified as pBI APCHl -2L21 was generated, which was used in the genetic transformation of plants.
  • the antigen expressed in said plasmid pBI APCHl -2L21 is the fusion of APCHl to the canine parvovirus 2L21 peptide (CPV).
  • sequences encoding said antigen and their respective fusions were obtained by amplification by PCR.
  • Two types of commercial polymerases were used, ECOTAQ (Ecogen), which was mainly used in colony analyzes, and Pow DNA polymerase (Roche), which exhibits corrective activity and was used to amplify the transgene sequences.
  • the primers used are shown in Table 1.
  • Positions 1-6 of SEQ ID NO: 4; 1-6 of SEQ ID NO: 5; 2-7 of SEQ ID NO: 6 and 1-18 of SEQ ID NO: 9 are restriction targets.
  • Positions 1-35 of SEQ ID NO: 7 and positions 1-32 of SEQ ID NO: 8 represent the flexible artificial sequence that serves as a link in the scFv (APCHl).
  • Hybridoma 1F12 was maintained in culture in RPMI-1640 medium (Biowhittaker) supplemented with 0.01 mM pyruvic acid (Sigma), 2 mM L-glutamine (Sigma), 100 U / ml penicillin and 20 ⁇ g / ml gentamicin sulfate (Biowhittaker ). Hybridoma 1F12 is freely available to the public in INIA laboratories and is not part of the claimed invention. 1.6 ELIAS commercial
  • INGEZIM PARVO CANINO 1.5.CPV.K.1 (Ingenasa), indirect immunoenzymatic assay for the detection and quantification of specific antibodies against canine parvo virus in dog sera.
  • the model plant used has been Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia.
  • the genus Arabidopsis belongs to the family of the Cruciferas (Brassicaceae or Cruciferaé).
  • the seeds were sown on the surface, in plastic pots or alveoli, which contained a mixture of universal substrate and vermiculite (3: 1). The mixture was previously soaked in distilled water and autoclaved at 101 kPa (1 atm) pressure for 20 minutes at 12O 0 C.
  • the pots or alveoli were placed in trays that were then covered with plastic to maintain moisture adequate and avoid contamination during germination.
  • the trays were kept for 48 hours at 4 0 C and in the dark, to favor a homogeneous germination of the seeds. After that, the trays were carried culture chambers at 22 0 C with a photoperiod of 16 hours of fluorescent light and 8 hours dark.
  • the cultures of E. coli were carried out in LB medium (Sigma) in the presence of the corresponding selective agent (Sambrook et al. 1989) for 14-16 hours at 37 ° C.
  • the preparation of competent cells was carried out by the chloride chloride method. Rubidium, described by Hanahan (Studies on transformation of E. coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166: 557-580. 1983).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Plasmids DH5- ⁇ and TOP-10 were used for plasmid maintenance and new generation. Both competent strains were transformed following the Birnboim and Dolly protocol (Bimboin HC and Dolly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nuc ⁇ . Acid Res. 7: 1513-1516. 1979). Briefly, plasmid DNA or ligation product was added to an aliquot of 100 ul of thawed competent cells and kept at 4 0 C for 30 minutes. Next, a thermal shock is caused at 42 0 C, which increases the permeability of the pore, 600 ul of LB were added and incubated under stirring at 37 0 C for 1-1.5 hours. Bacterial cells were pelleted by centrifugation for 3 minutes at 3,500 rpm and plated in solid medium to which the necessary selection antibiotics had previously been added. The plates were incubated in an oven at 37 ° C overnight.
  • the C58C1 and AGLO strains were transformed with the binary plasmids. Briefly, he was added 1 g of DNA (binary plasmids) to an aliquot of 200 ul of these competent cells, without thawing and incubated for 5 minutes at 37 0 C, and then immediately incubated at 4 0 C for 30 minutes. Then he was added 1 ml of LB and grown at 28 0 C for 3-4 hours. After centrifugation, they were plated in LB medium with kanamycin-rifampin. The plates were incubated at 28 0 C and the colonies took approximately 48 hours to appear. They were subsequently cultivated and used for the infiltration of A. thaliana plants.
  • the hybridoma 1F12 was used (as indicated in the Materials, section 1.5).
  • Total RNA from hybridoma cells was isolated using Roche's "Tripure” commercial kit and by RT-PCR using AMV-RT polymerase [Promega], the hybridoma cDNA expressing monoclonal antibody IFl 2 was obtained.
  • a first PCR was performed with specific primers for the different variable domains of immunoglobulins. PCR amplification was carried out separately. using two sets of primers that specifically hybridized at the ends of the variable regions of the heavy and light chain.
  • the primers used in the first PCR are the following:
  • VH and VL specific primers for the variable domains of the heavy and light chains of immunoglobulins.
  • VH variable region of the heavy chain
  • VL variable region of the light chain
  • both domains linked to a flexible artificial sequence were amplified with previously designed primers. Therefore, the VH is attached in its 3 'region linked to the linker and the VL attached to this sequence in its 5' region (VH3 'linker and linker VL5') (Table 1). Therefore, since both domains carry the overlapping artificial sequence, after several cycles of amplification of both sequences a third PCR was performed to obtain both domains linked to a flexible artificial sequence.
  • the APCHl contains the heavy chain variable region fused by a flexible peptide to the light chain variable region of the IFl 2 monoclonal antibody.
  • APCHl sequence has been amplified by PCR with the specific primers (5'VH xbal and 3'VL) (Table 1) was cloned into the plasmid for cloning of PCR products, pGEM-Teasy, generating the subcloning plasmid pGEM-APCHl.
  • the APCHl was designed to add several restriction sequences at the 3 'VL end in order to be able to perform the different fusions to the antigens to be tested and at the 5' VH end it contains the Xbal sequence, which allows the fusions to be easily removed from the pGEM and take them to plant transformation plasmids.
  • the 2V21 antigen of CPV fused to the 3 'region of the scFv APCH1 was cloned.
  • the sequence of peptide 2L21 was amplified by PCR, with primers 2L21XhoI and 2L21 SmaI (Table 1) and cloned into pGEM for sequencing. After checking its sequence, it was removed by digestion with the enzymes Xhol and Smal and introduced in a directed manner in the plasmid pGEM-APCHl previously digested with these same enzymes.
  • plasmid pGEM APCH1-2L21 was finally obtained, which was sequenced to verify that it correctly maintained the reading frame of the fusion.
  • This plasmid was subsequently digested with the enzymes Xbal and Smal to remove the APCHl-2L21 fusion and introduce it into plasmid pBI-121, previously digested with these same enzymes.
  • Plasmid pB 1-121 contains the ⁇ -glucuronidase gene, so it was digested with the HindlII and Smal enzymes and cloned into plasmid p35S TEV with the same enzymes (HindlII-Smal).
  • the new vector generated (p35 S-APCH 1-2L21), which contained the 35SCaMV promoter, the APCH1-2L21 fusion, part of the polilinker (Sacl, Kpnl) and the Vsp-ter polyadenylation sequence, was digested with the enzymes HindlII-EcoRI, to introduce said APCH1-2L21 fusion into the binary plasmid pBI-121 digested with those same enzymes, obtaining the plasmid pBI APCHl -2L21. 1.12 Genetic transformation of plants mediated by A tumefaciens
  • Agrobacterium cells previously transformed with the different plant transformation plasmids were grown in 500 ml of LB medium (Sigma), supplemented with kanamycin and rifampin (Sambrook et al. 1989), for 48 hours at 28 0 C. After centrifugation at 3,000 rpm for 20 minutes, the sediment (containing the bacteria) was resuspended in 200 ml of infiltration medium: 2.35 g / 1 of
  • Inflorescences were immersed in the infiltration medium containing Agrobacterium in a vacuum chamber, subjecting them to a pressure of 5 kPa (50 mbar) for 10 minutes (Bechtold N. and Pelletier G. In plant
  • GM medium MS 4.7 g / 1, 1% sucrose, morpholin-acid ketanesulfonic acid (MES) 0.5 g / 1, agar 8 g / 1 and pH 5.7
  • the Tl seeds were kept at 4 0 C temperature and dark for 48 hours and then in vitro culture chamber, under controlled conditions (16 hours light and 8 hours dark, 22 0 C temperature). After 12-15 days, the transgenic seedlings (capable of growing normally in the presence of kanamycin) were transplanted to land and taken to culture chambers for growth and development.
  • RNA was purified following the guanidine hydrochloride method described by Logeman et al. (Logemann J., Schell J ,, and Willmitzer L. Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Anal. Biochem. 163: 16-20, 1987). RNA quantification was performed by spectrophotometry.
  • RNA was resolved in 1.5% horizontal agarose gels in the presence of formaldehyde / formamide (Sambrook et al. 1989).
  • the RNA samples were loaded with ethidium bromide, in order to visualize them by fluorescence and thus check their integrity. Subsequently, the RNA was transferred to Hybond N + membranes (Amersham) using 0.05 M sodium hydroxide by conventional methods (Sambrook et al. 1989).
  • Nucleic acid hybridizations were performed in glass tubes, containing 10-15 ml of prehybridization solution. The membranes were prehybridized for at least two hours at the hybridization temperature. After this time, the radioactively denatured labeled probe was added and the membranes were maintained in this solution for 16 to 20 hours.
  • Southern hybridizations at low astringency were carried out in a prehybridization solution with 5X SSPE (0.15 M NaCl, 10 mM NaH 2 PO 4 , 1 mM EDTA Na 2 ),
  • 5X Denhardt solution 0.02% Ficoll, 0.02% Polyvinylpyrrolidone, 0.02% bovine serum albumin, 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS) and denatured herring sperm DNA 0.5 mg / ml.
  • Hybridization was carried out at 65 ° C. After hybridization, the membranes were subjected to successive washes with 5X SSPE and 0.5% SDS, decreasing the concentration of salts in each wash.
  • Northern hybridizations were performed to type 42 0 C in phosphate buffer 0.25 M pH 7.2, 0.25 M NaCl 5 1 mM EDTA, 7% SDS, 10% PEG 6000, 40% formamide and herring sperm DNA denatured 0.2 mg / ml.
  • the membranes were subjected to several washes with 5X SSPE and 0.5% SDS, at 65 ° C. Each wash was approximately 20 minutes long. Sometimes it was necessary to wash with 0.5% SDS.
  • the membranes were exposed with autoradiographic film (Hyperfilm MP 5 Amersham) and intensifying screens, at -8O 0 C, for the time necessary to visualize the hybridization bands. In order to reuse the membranes, they were inhibited with a boiling 5% SDS solution, and stirring until the solution cooled. To verify that there was no radioactivity in the membrane, the filters were exposed with autoradiographic film for several days.
  • Fresh plant material was homogenized in protein extraction buffer (10 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.1% Triton x-100, 1% ⁇ -mercaptoethanol and 1 mM PMFS as a protease inhibitor), after being cut and introduced into 1.5 ml eppendorf tubes and kept on ice (4 0 C). After homogenization, they were centrifuged 10-15 minutes at 13,000 rpm, collecting the supernatant. In some cases, frozen material was used. To solubilize some of the precipitated proteins and improve extraction yields, a buffer containing urea was used. Protein analysis was performed on acrylamide-bisacrylamide electrophoresis gels (30: 1) in the presence of SDS.
  • Protein electrophoresis under denaturing conditions were performed on discontinuous acrylamide-bisacrylamide gels in the presence of SDS, following the conventional method (Sambrook et al. 1989).
  • Acrylamide bisacrylamide separator gels (Biorad or Serva) were prepared, at varying concentrations of 7 to 15% depending on the expected molecular weight of the protein to be analyzed and caking gels with a 3.5% arcrilamide-bisacrylamide concentration (Sambrook and col. 1989).
  • Electrophoresis developed at a constant voltage of 100 to 140 V in the case of minigeles (7x9 cm). All samples were quantified prior to separation by electrophoresis, according to the Bradford-Lowry method (Biorad protein assay). They were solubilised in protein dissociation buffer (0.5 M Tris pH 8.0, 10% SDS, glycerol, ⁇ -mercaptoethanol, 0.02% bromophenol blue), heated 5 minutes at 100 0 C and then applied to the gel
  • the proteins were transferred to the nitrocellulose filters, they were stained to verify their integrity with a solution of 0.2% Ponceau (Sigma) in 30% trichloric acetic acid (w / v) and 30% sulfosalicylic acid (p / v) for 1 minute per dive. They were subsequently washed with distilled water to remove excess dye.
  • nitrocellulose filters Once transferred and immobilized proteins on nitrocellulose filters, said nitrocellulose filters well were blocked for 1 hour at 37 0 C with skimmed milk powder 2% (w / v) PBS, either overnight at 4 0 C under stirring, with the same blocking solution. The filters were then incubated for 1 hour with the specific antibody diluted in 0.05% PBS-Tween 20 (v / v) and at the appropriate concentration for each assay. The filters were washed 3 times for 10 minutes in wash buffer (PBS lX-Tween) each time and incubated in the same dilution solution with the corresponding secondary antibody, for 1 hour at room temperature. After repeated washing, the development was carried out using the appropriate substrate according to the conjugation of the secondary antibody (NBT-BCIP (Roche), ECL (Amersham).
  • the sera were obtained by incubation of the blood for 30 minutes at 37 0 C, followed by incubation for 14 hours at 4 0 C. blood clots were separated and the sera were clarified by centrifugation at 1,500 rpm for 10 minutes.
  • the wells of the ELISA plates were upholstered with 0.2 ⁇ g of the 2L21 peptide per well, diluted in bond buffer (carbonate / bicarbonate), for 12 hours at 4 ° C. It was blocked with a solution of PBS-Tween-20 0.05% (v / v) and fetal bovine serum or 5% BSA for 1 hour at 37 0 C under stirring. After washing 3 times with a PBS-Tween 20 0.05%, the sera were incubated at different dilutions determined in PBS-0.05% Tween 20, for 1 hour at 37 0 C under stirring.
  • the INGEZIM PARVO CANINO 1.5.CPV.K.1 Kit (Ingenasa) was used, designed for the detection and quantification of specific antibodies against canine parvovirus in dog sera.
  • serial dilutions of the sera were made to the holder, expressing the titre of each serum, as the inverse of the maximum dilution of said serum in which the absorbance at 492 nm was significantly greater than that of the negative controls (2 times greater).
  • the antigen specificity of antibodies from immunized animals was determined by immunoblotting.
  • the VP2 capsid protein produced in baculovirus (Ingenasa) was resuspended in protein dissociation buffer, boiled for 5 minutes and loaded on polyacrylamide-glycine gel in the presence of SDS and transferred to a nitrocellulose membrane (Biorad).
  • Mouse sera were tested at a dilution limit from 1/10, and the secondary anti-mouse antibody was conjugated to alkaline phosphatase (Roche).
  • the substrate used for the reaction was nitroblue-tetrazolum-4-chloro-3 indolphosphate (NBT-BCIP, Roche).
  • Freund's complete adjuvant (Sigma) and incomplete Freund's adjuvant (Sigma) were used for the rest.
  • mice were immunized using the same protocol with untransformed plant extracts or transformed with the vector without the transgene. Ten days after the last immunization, the mice were bled and the sera were obtained for study. 1.17 Obtaining the recombinant single chain antibody APCHl fused to peptide 2L21 and its expression in transgenic plants
  • APCH1 recombinant single chain antibody
  • the final construct consists of the variable domain of the heavy chain (VH) with the native signal peptide of the IFl 2 antibody, the variable domain of the light chain (VL) to which its signal peptide has been removed and a flexible artificial peptide that unites After sequencing the resulting chimeric gene and checking its integrity, the fused CPV 2L21 antigen was cloned into the 3 'region of APCHl.
  • the sequence of the 2L21 antigen was amplified by PCR, with the specific primers that allowed to keep the fusion reading frame open.
  • This fragment was introduced, after several subcloning, into the binary plasmid pBI 121, giving rise to the pBI plasmid APCHl-2L21, which contains the constitutive promoter 35S, which directs the expression of the sequence corresponding to the fusion protein and the sequence of polyadenylation of the Agrobacterium Nos gene ( Figure 1).
  • This plasmid was introduced into Agrobacterium tumefaciens, with which Arabidopsis thaliana plants were transformed, by floral infiltration (Clough, SJ. And Bent, AF 1998. Floral dip: a simplified meted for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16: 735-743).
  • transgenic lines of wild-type phenotype were obtained.
  • approximately 30 independent transgenic lines were analyzed to know the expression of the transgene and accumulation of the fusion protein (APCHl -2L21). They have previously expressed themselves in different scFv plants with different objectives, obtaining a great variation in the levels of expression and accumulation of these molecules (Fiedler, U. And Conrad, U. 1995. High-level production and long-term storage of engineered antibodies in transgenic tobaceous seeds. Biotechnology (N .Y.) 13: 1090-1093). Therefore, the first step was to study the correct transcription of the transgene to subsequently analyze the accumulation levels of the fusion protein.
  • RNA of the different lines was obtained from fresh leaves of plants transformed with this construction, separated the different RNAs in agarose-formamide gels, then transferring them to nitrocellulose filters for later analysis.
  • mice were immunized intraperitoneally by immunogen, 1 week of age and Swiss strain, on days 0, 7 and 14 with plant extracts (3 mg total soluble protein / dose), which expressed the recombinant protein under study, the same 2L21 peptide fused to an irrelevant protein ( ⁇ -GUS) or with 100 ⁇ g of synthetic 2L21 peptide.
  • plant extracts 3 mg total soluble protein / dose
  • ⁇ -GUS irrelevant protein
  • SIGMA incomplete Freund's adjuvant
  • SIGMA incomplete Freund's adjuvant
  • Mammalian CHO-K1 cells (ovarian cells) from the Cell Culture section of the adventology-free Virology Institute (PVA76 / 04) were used.
  • CHOKl Chonese Hamster Ovary cells
  • Genotype supE44 hsd R17 recAl endAl gyrA96 thi-1 relAl • Remarkable units: Strain deficient in recombination, used for plating and growth of plasmids.
  • plasmid pGEM-Teasy was used, while plasmid pcDNA 3.1 was used for the generation of the stable mammalian line: • pGEM-Teasy (Promega):
  • This plasmid is specially designed for cloning and sequencing of PCR products. It contains a region with multiple restriction sites (polylinker). The polylinker has been previously digested with EcoRV and subsequently 3 'thymidines have been added at both ends to facilitate cloning of the PCR products. In addition, it allows the selection of recombinants by means of the LacZ gene.
  • pcDNA 3.1 (Invitrogen): This plasmid is derived from pcDNA3 and was designed for transient and stable expression in mammalian cells.
  • the vector contains the following elements.
  • the plasmid identified as pcDNA APCH1 -E2T was generated, which was used in the transformation of CHOK-I cells.
  • the antigen expressed in said plasmid comes from the fusion of APCH1 with the E2 secretion protein without its transmembrane domain (E2T) of the Bovine Viral Diarrhea Virus (VDVB).
  • Positions 2-7 of SEQ ID NO: 19 are the restriction targets.
  • Stably transfected lines were obtained.
  • T-75 bottles with CHO-K1 monolayers were transfected with lipofectamine at a confluence of 80%.
  • a monolayer of cells with a vector of the same series of pcDNA 3.1 (Invitrogen) containing the LACZ gene was transfected with pcDNA E2T and pcDNAAPCHl-E2T, in order to use this line to more easily check the evolution and development of stable lines
  • pcDNA E2T and pcDNAAPCHl-E2T was transfected with pcDNA E2T and pcDNAAPCHl-E2T, in order to use this line to more easily check the evolution and development of stable lines
  • a subculture of the transfected cells was carried out at four T-75s and the selection process was initiated by adding to the culture medium the antibiotic geneticin (Invitrogen) at a concentration of 700 ug / ml.
  • SDS-PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions
  • the membrane was incubated with the peroxidase enzyme substrate, the Western Lighting Chemiluminescence Reagent Plus commercial kit (Perkin Elmer LAS, INC.) was used and the manufacturer's recommendations were followed.
  • the membrane was exposed in photosensitive plates (Hyperfilm-Amersham Biosciences) and later revealed in radiographic developing solution (G 150 Agfa), then it was rinsed in acetic acid 2% v / v and finally fixed in radiographic fixation solution (G 334 Agfa),
  • the gel was stained with Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma) 0.1% m / v in a mixture of methanol: acetic acid: water (40: 10: 50).
  • a decolorizing solution methanol: acetic acid: water 5.0: 7.5: 87.5 respectively was used for decolorization of the gels. The discoloration was carried out under stirring at room temperature.
  • the supernatant was harvested once the monolayer formed (usually 72 Hs), PMSF was added at a final concentration of 1 mM and stored until use at -20 ° C.
  • the supernatant was thawed and its ionic strength was raised with the 10X glue-wash solution (3M NaCl, 0.5M NaHPO 4 ). 20 mM Imidazole was added and brought to pH: 8 with NaOH ION.
  • the nickel was equilibrated with the glue-wash solution IX (0.3M NaCl, 0.05M NaHPO 4 ) with 20 mM Imidazole, and incubated with stirring at 4 ° C for 30 minutes. It was centrifuged at 2500 g for 5 minutes, the supernatant was discarded and the nickel was incubated with the supernatant ON 4 0 C under stirring.
  • IX glue-wash solution
  • the animals were bled by cardiac puncture, drawing 3 ml of blood per animal. It was incubated at 37 0 C for 1 Hs. And 4 0 C for 30 minutes. Serum was removed by centrifugation at 1000 g for 15 minutes, aliquoted and stored at -2O 0 C until use.
  • the animals were kept in groups of four in Im2 cages, which were kept in an enclosure isolated from the outside with a ventilated atmosphere. The beds and water in the cages were changed periodically.
  • Seronegative, non-infected cattle belonging to the INTA previously tested were used to demonstrate their sanitary status by ELISA, SN and PCR.
  • the bovines were immunized with two doses of the vaccine to be tested, one at the initial time and the other at 30 days post-prime vaccination.
  • the immunization will be carried out by the intramuscular route
  • the volume of inoculum will be 5 ml. Blood samples were taken every seven days post vaccination for subsequent serum antibody analysis.
  • the sera were obtained by incubation of the blood for 30 minutes at 37 0 C, followed by incubation for 14 hours at 4 0 C. blood clots were separated and the sera were clarified by centrifugation at 1,500 rpm for 10 minutes.
  • the level of neutralizing antibodies was determined following the protocol of Howard et al (1987).
  • the level of antibodies was determined using a slightly modified assay based on the ELISA developed by Marzocca et al 2007.
  • the selected clones were grown in MEM E medium (Gibco); 10% SFB (Quiroga) and 1% antibiotic (penicillin; streptomycin; gentamicin).
  • MEM E medium Gibco
  • SFB Quiroga
  • antibiotic penicillin; streptomycin; gentamicin
  • T75 Figure 6A
  • rollers Figure 6B
  • the tests were performed in duplicate for each of the T75 groups with and without DMSO and rollers with and without DMSO.
  • 3 x 106 cells were seeded while the rollers were started with 16 x 106 so as to maintain the ratio of cells by volume between them. 1 ml was extracted every 24 hours and they were kept at -20 until the ELISA was performed.
  • IMAC metal chelate chromatography
  • the APCHl -E2T protein was obtained in a high degree of purity, registering the appearance of a single band for E2T and three bands for APCHl -E2 T, the heaviest corresponding to the fusion protein, The intermediate probably traces BSA, and the lightest is a product of the proteolysis of APCH1-E2T (confirmed by western blot).
  • the approximate yield of the entire process was of the order of 100 ug of purified protein every 1 liter of supernatant ( Figure 7).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • PBS isotype control
  • E2T or APCHl-E2T were then incubated with PBS (isotype control), E2T or APCHl-E2T, and then labeled with a mouse anti-E2 monoclonal antibody (VDVB, NADL strain) and a mouse anti-IgG monoclonal antibody Phycoerythrin coupled.
  • VDVB mouse anti-E2 monoclonal antibody
  • Phycoerythrin Phycoerythrin coupled.
  • the labeled cells were analyzed in a flow cytometer, and the results were reported as the percentage of positive cells, which were those cells whose fluorescence intensity was in a range of intensities that left out the mark corresponding to the isotype control. In all the species analyzed, the binding of APCH1-E2T was markedly greater than that obtained for E2T.

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Abstract

Proteína de fusión con direccionamiento de antígenos vacunales a células presentadoras de antígeno y sus aplicaciones. La presente invención se relaciona con una construcción génica que comprende operativamente unidas al menos una secuencia nucleotídica (A) que codifica para un polipéptido de SEQ ID NO: 1 que presenta una región que reconoce a la cadena β del antígeno DR de clase II presente en la superficie de las células presentadoras de antígeno; y una secuencia nucleotídica (B) que codifica para un antígeno vacunal de interés. Además, la presente invención se refiere a vectores recombinantes útiles para la expresión de la construcción génica de la invención, células y plantas transgénicas transformadas o transfectadas con dichos vectores, proteínas de fusión codificadas por la construcción génica de la invención y vacunas que comprendan dichas proteínas de fusión.

Description

PROTEÍNA DE FUSIÓN CON DIRECCIONAMIENTO DE ANTÍGENOS VACUNALES A CÉLULAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENO Y SUS
APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se relaciona con un método de direccionamiento de antígenos vacunales a las células presentadoras de antígeno, basado en la síntesis de una proteína de fusión que comprende: un polipéptido que presenta una región que reconoce un epítopo presente en la superficie de una célula presentadora de antígeno, y otro polipéptido que es el antígeno vacunal de interés.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Desde hace algún tiempo, se conoce Ia obtención de productos recombinantes con interés vacunal en distintos sistemas de expresión, tales como bacterias, hongos, levaduras, plantas, células y larvas de insecto, células de mamífero, etc. Entre estos sistemas, las plantas ofrecen numerosas ventajas frente a otros sistemas de expresión ya que, en general, constituyen una vía económica, segura y fácil de obtener proteínas de potencial interés farmacéutico, por ejemplo, vacunas de subunidades recombinantes, sin necesidad de los costosos sistemas fermentativos.
No obstante, la obtención de vacunas a partir de subunidades recombinantes del patógeno, en cualquier sistema, tiene como principal limitación la baja inmunogenicidad de los productos recombinantes obtenidos y, por tanto, suelen ser necesarias dosis vacunales muy elevadas y repetidas para igualar la respuesta inmune obtenida con el inmunógeno convencional (patógeno completo inactivado). Esta circunstancia hace que los costes de producción de las vacunas de subunidades recombinantes sean muy elevados con respecto a las vacunas convencionales y por tanto muchas de ellas no llegan mercado en la actualidad.
Con el fin de mejorar la inmunogenicidad de las vacunas de subunidades recombinantes se han seguido distintas alternativas. Una de ellas se basa en el empleo de moléculas tipo CTLA4 y L-selectin para dirigir antígenos vacunales a células presentadoras de antígeno en ratones [Boyle J.S. et al., Enhanced responses to a DNA vaccine encoding a fusión antigen that is directed to sites of immune induction. Nature. 1998, Mar 26; 392(6674):408-411]. Sin embargo, estas estrategias no se han mostrado igualmente eficaces en otras especies diferentes a la murina, lo que hace necesaria la búsqueda de otras alternativas basadas en el direccionamiento de los antígenos vacunales a las células encargadas de Ia presentación antigénica, en otras especies, particularmente en el hombre.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con un método, alternativo a los existentes en el estado de la técnica, que aumenta la efectividad de las vacunas de subunidades recombinantes cuando éstas son aplicadas en distintas especies, tanto en animales en general, como en humanos en particular. Mediante el método de la invención basado en el direccionamiento de antígenos a sus células presentadoras, se consiguió potenciar la respuesta inmune mediada por el hospedador a la vez que se disminuyó la dosis de vacuna aplicada, igualando o superando la respuesta inmune conseguida mediante la aplicación de vacunas convencionales.
El sistema de direccionamiento de antígenos vacunales a las células presentadoras de antígeno propuesto por esta invención está constituido, por tanto, por una proteína de fusión que comprende al menos un polipéptido (A) que presenta una región que reconoce un epítopo presente en la superficie de una célula presentadora de antígeno, y otro polipéptido (B) que es el antígeno vacunal de interés, responsable de desencadenar la respuesta inmune en el hospedador.
En una realización particular de la invención, el polipéptido (A) comprende una región que reconoce la cadena β del antígeno DR (Región D) de Clase II. Dicho polipéptido es un anticuerpo recombinante APCHl ("Antigen Presenting CeIJs Homing 1")) caracterizado por la SEQ ID NO: 1, de cadena sencilla (scFv), derivado del anticuerpo monoclonal IF 12, Así el polipéptido (A) está formado por Ia región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal IFl 2 fusionada, a través de un péptido flexible, a la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal IF 12. El anticuerpo monoclonal IFl 2 reconoce la cadena β del antígeno DR de Clase II en un gran número de especies, por lo que sería de aplicación en múltiples especies, incluyendo el hombre.
En otra realización particular de la invención, el péptido (B) (antígeno vacunal de interés) es el péptido vacunal denominado 2L21 (SEQ ID NO: 21) de parvo virus canino (CPV), la proteína E2T (SEQ ID NO: 23) o E2 del virus de la diarrea viral bovina, la proteína VP60 del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo, la proteína VP6 del rotavirus o la proteína hemaglutinina del virus influenza.
2L21 está formado por dos sublugares antigénicos distantes de la región amino terminal de la proteína VP2 de la cápside del CPV y fue publicado anteriormente como el primer péptido sintético vacunal (López de Turiso, J.A., Cortés, E., Martínez, C, Ruiz de Ybánez, R., Simairo, L, Vela, C, Casal, I. (1992) J. Virol. 66:2748-2753). El péptido 2L21, fusionado a APCHl, ha sido expresado en plantas. Asimismo, dicho péptido 2L21 ha sido expresado en plantas sin fusionar, o fusionado a una proteína irrelevante desde el punto de vista inmunogénico (β-glucuronidasa, GUS), cuya expresión había sido realizada con éxito anteriormente en el laboratorio de los inventores (Gil F., Brun A., Wigdorovitz A., Martínez-Torrecuadra J.L., Cátala R., Casal L, Salinas J., Borca M. V. and Escribano J. M.. FEBS Letters 488:13-17, 2001). La proteína de fusión 2L21- GUS es una proteína muy estable, de bajo índice de degradación y perfectamente adaptada a la expresión en plantas.
Por lo tanto la invención presenta un método de direccionamiento de antígeno s vacunales a sus células presentadoras, constituido por una proteína de fusión, como por ejemplo APCH1-2L21 o APCHl -E2T, que comprende el APCHl fusionado al péptido vacunal 2L21 o E2T respectivamente. Tal y como se explica a continuación, la proteína de fusión APCHl -2L21 se expresó en plantas, dando lugar a plantas transgénicas de Arabidposis thaliana, y la proteína de fusión APCH1-E2T se expresó en células de mamíferos. Además, se comprobó que la proteína de fusión APCHl -2L21 mantuvo las características antigénicas e inmunogénicas del péptido 2L21, induciendo altos títulos de anticuerpos específicos en grupos de animales inmunizados tanto por vía oral como intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o subcutánea, siendo ésta muy superior a la inducida por el péptido 2L21 sintético solo o fusionado a GUS (2L21-GUS). Estos resultados pusieron de manifiesto que la proteína de fusión APCH1-2L21 potencia la respuesta inmune en animales, lo que confirma la hipótesis del aumento de inmunogenicidad de un antígeno vacunal a través de su direccionamiento a células presentadoras de antígeno mediante un polipéptido con una región (A), que reconoce un epítopo presente en la superficie de una célula presentadora de antígeno.
El sistema de direccionamiento de antígenos vacunales proporcionado por esta invención presenta numerosas ventajas ya que permite dirigir el antígeno vacunal fusionado a las células presentadoras de antígeno, facilitando la captura del antígeno vacunal y potenciando la respuesta inmune. Así se reduce Ia dosis vacunal de vacuna de subunidad del patógeno recombinante a administrar, tanto a animales como a humanos, para obtener una respuesta inmune igual o superior a la obtenida con las vacunas convencionales con el patógeno íntegro.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1, Muestra esquemáticamente la construcción génica de expresión del plásmido pBI APCHl-2L21.
• Figura IA: muestra esquemáticamente la construcción génica de expresión que se integra en el genoma nuclear de Arabidopsis thaliana, que comprende la secuencia nucleotídica del APCHl, conducida por el promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S) [LB: borde izquierdo; RB: borde derecho; APCHl-Péptido 2L21 : fusión codificante de la proteína de fusión APCH1-2L21; NOS-Ter: secuencia de poliadenilación y bajo el control del promotor de la nopalín sintetasa (NOS-Pro); NPT II (Kan R): gen de resistencia a la kanamicina. • Figura IB: muestra la estructura tridimensional esperada para la proteína de fusión APCH1-2L21, obtenida del "Swiss-protein", donde pueden observarse los dos dominios globulares (VH y VL) plegados de forma independiente.
Figura 2. Ilustra el análisis de la expresión del antígeno 2L21 fusionado al scFv APCHl en algunas líneas que expresan dicha proteína de fusión (APCH1-2L21).
• Figura 2A muestra los resultados de un análisis por Northern blot de la transcripción del gen de fusión (APCHl -2L21) en plantas transgénicas de A. thaliana, sobre 5 μg de ARN total por línea de planta e hibridados utilizando como sonda la secuencia de ADN completa de la fusión APCH1-2L21 marcada con 32P.
• Figura 2B muestra los resultados de un análisis mediante Western blot de los extractos proteicos (40 μg de proteína soluble total) extraídos a partir de hojas frescas de las diferentes líneas de A. thaliana transgénicas analizadas mediante
Northern blot.
Figura 3. Muestra el resultado del mareaje específico de la superficie de macrófagos alveolares porcinos con peroxidasa (I) y con mareaje fluorescente (II).
• Panel I: (a) macrófagos incubados con extractos de planta (control negativo); (b) mareaje de la superficie celular de los macrófagos obtenida con el anticuerpo 1F12; (c) mareaje obtenido con el extracto de proteína soluble total, que contenía la proteína de fusión APCH1-2L21. • Panel II: detalle a bajos aumentos de células incubadas con extracto control (1), anticuerpo IF 12 (2) y extracto de planta que expresa la proteína de fusión APCHl -2L21 (3). (b y c) detalle del mareaje celular a mayores aumentos, obtenido con el anticuerpo monoclonal IF 12 y con la proteína de fusión APCH1-2L21, respectivamente.
Figura 4. Diagrama de barras que muestra el resultado del análisis de la respuesta inmune obtenida con diversas preparaciones del péptido 2L21 de CPV, concretamente, la respuesta inmune de anticuerpos específicos obtenida en ratones inmunizando con el péptido 2L21 sólo (2L21), fusionado al anticuerpo APCHl (APCH 1-2L21) o fusionado a la proteína β-GUS (2L21-GUS).
Figura 5. Producción de las líneas estables de CHOKl (células ováricas de mamífero) que expresan APCH1-E2T y E2T. Una explicación más detallada de esta figura puede encontrarse en el punto 2.4 del Ejemplo 2.
Figura 6. Evaluación de la producción de proteínas re combinantes en el sobrenadante de las líneas celulares desarrolladas. Los ensayos fueron realizados por duplicado para cada uno de los grupos en frascos destinados al cultivo (T75), con y sin DMSO, y en botellas (rollers), con y sin DMSO. Para el caso de los T75 a tiempo 0 se sembraron 3 x
10 células mientras que los rollers se iniciaron con 16 x 106 de manera que se mantuvo la relación de células por volumen entre ambos. Cada 24 h se extrajo 1 mi y los mismos fueron conservados a -2O0C hasta que se realizó el ELISA. Una explicación más detallada de esta figura puede encontrarse en el punto 2.8 del Ejemplo 2.
• Figura 6A. Líneas celulares crecidas en frascos para el cultivo de tejido (T75).
• Figura 6B. Líneas celulares crecidas en botellas "rollers".
Figura 7. Tinción con coomassie y western blot de APCHl E2T y E2T. Una explicación más detallada de esta figura puede encontrarse en el punto 2.9 del Ejemplo 2.
Figura 8. Reconocimiento de APCHl -E2T a MHCII (complejo mayor de histocompatibüidad) de células mononucleares. El MHCII es una familia de genes que codifica para ciertas glucoproteínas de la membrana plasmática involucradas en los mecanismos de presentación y procesamiento de antígenos a los Iinfocitos T, así como citocinas y proteínas del sistema del complemento, importantes en la respuesta inmunológica. Figura 9. Respuesta inmune en cobayas inmunizadas con la molécula experimental. El gen Lac z codifica para la β-galactosidasa, una enzima que convierte la lactosa en glucosa y galactosa y se utilizó como control negativo. El término DPV situado en la figura se refiere a días post vacunación.
Figura 10. Respuesta inmune en bovinos inmunizados con sobrenadantes de cultivos que expresan la proteína APCHl -E2T y E2T.
• Figura 1OA: bovinos inmunizados con 1 μg de APCHl -E2T o E2T. • Figura 10 B: bovinos inmunizados con 0,2 μg de APCHl -E2T o E2T.
Figura 11. Título de anticuerpos en bovinos vacunados con 0,2 μg de APCHl- E2T o E2T.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con una construcción de ADN, en adelante construcción de ADN de la invención, que comprende, operativamente unidas, directa o indirectamente, al menos:
a) una secuencia de ácido nucleico (A) que codifica para un polipéptido que comprende una región que reconoce un epítopo presente en la superficie de una célula presentadora de antígeno; y b) una secuencia de ácido nucleico (B) que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para el antígeno vacunal de interés, responsable de desencadenar la respuesta inmune en el hospedador.
La secuencia de ácido nucleico (A) codifica para un polipéptido que comprende una región que reconoce un epítopo presente en la superficie de una célula presentadora de antígeno. Prácticamente cualquier polipéptido que comprenda una región que reconozca un epítopo presente en la superficie de una célula presentadora de antígeno puede ser utilizado en esta invención, tal como, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo, tanto en su forma de cadena sencilla (scFv), bifuncional (diabody) o completo (Fab + Fc). No obstante, en una realización particular de la invención, la secuencia de ácido nucleico (A) codifica para un polipéptido APCHl (SEQ ID NO: 1) que comprende una región que reconoce un epítopo (cadena β) del antígeno DR de Clase II. La Clase II se expresa en las células del sistema inmune como polipéptidos de superficie y comprende los antígenos HLAD (antígeno humano leucocitario D), subclasificados en DR (DRA y DRB), DQ y DP. Dicho polipéptido es un anticuerpo recombinante, de cadena sencilla, derivado del anticueipo monoclonal IFl 2, comprendido por la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal 1F12 fusionada, a través de un péptido flexible (linker o bisagra), a la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal IF 12. El extremo 3' de la secuencia codificante de VL está unido al extremo 5' de la secuencia codificante de dicho linker y el extremo V de la secuencia de nucleótidos codificante de dicho linker está unido al extremo 5' de la secuencia codificante de VL. El scFv APCHl fue diseñado de forma que se pudieran añadir una o más secuencias de restricción en el extremo 3' de VL con el fin de poder realizar distintas fusiones con los antígenos a ensayar y en el extremo 5' de VH contiene una secuencia de restricción (Xbal), lo que permitió sacar las fusiones fácilmente del plásmido en el que se encuentren y llevarlas a los plásmidos de transformación de plantas.
El anticuerpo monoclonal 1F12 reconoce la cadena β del antígeno DR de Clase II en un gran número de especies animales, por lo que puede ser aplicado en múltiples especies, incluyendo el hombre. Debido a sus propiedades, dicho anticuerpo, en cualquiera de sus formas (scFv, bifuncional o completo) puede dirigir a un péptido vacunal fusionado al mismo hacia las células presentadoras de antígeno que presentan ese tipo de moléculas en su superficie, facilitando Ia captura del antígeno y potenciando la respuesta, ya que la mayoría de la proteína expresada llegaría a su destino antes de degradarse. De esta forma se pueden compensar los bajos niveles de acumulación de las xenoproteínas (vacunas de subunidades recombinantes del patógeno) que presentan las plantas o animales transgénicos o compensar costes de producción en otros sistemas. La secuencia de ácido nucleico ÍB) codifica para un antígeno vacunal de interés que puede ser prácticamente cualquier péptido o proteína, independientemente de su origen (eucaiϊótico, procariótico, viral, etc.), susceptible de ser expresado de forma recombinante y de inducir una respuesta inmune en el hospedador, ya sea un animal en general o el ser humano en particular. A continuación se exponen una serie de ejemplos que pueden actuar como antígeno vacunal de interés: péptido 2L21 de CPV, proteína VP60 del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV), proteína VP6 de rotavirus, proteína E2 o E2T del virus de la diarrea viral bovina, un antígeno vacunal frente a tumores y células tumorales, etc.
En una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico (A) no se fusiona directamente a la secuencia de ácido nucleico (B) sino que resulta ventajoso introducir un péptido espaciador (linker) entre el extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico (A) y el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico (B). Por tanto, si se desea, la construcción de ADN de Ia invención también puede contener, además, una secuencia de ácido nucleico (O que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido espaciador situada entre dichas secuencias de ácido nucleico (A) y (B), en donde el extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (C) está unido al extremo 3! de dicha secuencia de ácido nucleico (A) y el extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (C) está unido al extremo 5' de dicha secuencia de ácido nucleico (B). Ventajosamente, dicho péptido espaciador (C) es un péptido con flexibilidad estructural. Prácticamente, cualquier péptido con flexibilidad estructural puede ser utilizado. A modo ilustrativo, dicho péptido flexible puede contener repeticiones de restos de aminoácidos, en particular de restos de GIy y Ser o cualquier otra repetición de restos de aminoácidos adecuada. En una realización particular, dicho péptido espaciador flexible se selecciona entre la secuencia SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3.
Con el fin de facilitar el aislamiento y purificación del péptido o proteína de fusión obtenida mediante la presente invención, la construcción de ADN de Ia invención puede contener, si se desea, una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificación del péptido o proteína de fusión. Por tanto, en una realización particular, la construcción de ADN de la invención incluye, si se desea, una secuencia de ácido nucleico (D) que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificación. Dicha secuencia de ácido nucleico (D) puede estar situada en cualquier posición que no altere la funcionalidad ni del polipéptido que comprende la región que reconoce un epítopo presente en la superficie de una célula presentadora de antígeno ni del polipéptido de interés. A modo ilustrativo, dicha secuencia de ácido nucleico (D) puede estar situada aguas abajo del extremo 3' de dicha secuencia de ácido nucleico (B).
Prácticamente cualquier péptido o secuencia peptídica que permita el aislamiento o purificación del péptido o proteína de fusión puede ser utilizada, por ejemplo, secuencias de polihistídina, secuencias peptídicas susceptibles de ser reconocidas por anticuerpos monoclonales que pueden servir para purificar la proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad, tales como péptidos etiqueta, etc., por ejemplo, epítopos derivados de la hemaglutinina del virus de la gripe o epítopo C-myc, etc.
La construcción de ADN de la invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, N. Y., 1989 VoI 1-3]. Dicha construcción de ADN de la invención puede incorporar, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica para el producto o productos de interés, constituyendo de este modo una construcción génica de expresión. Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "operativamente unida" significa que el producto o productos de interés es (son) expresado(s) en el marco de lectura correcto bajo el control de las secuencias de control o reguladoras de expresión.
Por lo tanto, en una realización preferida, la construcción génica de la invención comprende operativamente unida una secuencia de control de expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención. Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la π traducción de dicha proteína de fusión, e incluyen secuencias promotoras, secuencias codificantes para reguladores transcripcionales, secuencias de unión a ribosomas (RBS) y/o secuencias terminadoras de transcripción. En una realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en células y organismos procariotas, por ejemplo, bacterias, etc., mientras que en otra realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en células y organismos eucariotas, por ejemplo, células de insecto, células vegetales, células de mamífero, etc. Ejemplos ilustrativos de promotores que pueden estar presentes en la construcción génica de expresión proporcionado por esta invención incluyen el promotor 35SCaMV para plantas, el promotor de la polihediϊna o la proteína plO para el sistema baculovirus, el promotor temprano de citomegalovirus para vacunas ADN, el promotor sintético temprano/tardío de poxvirus, etc.
Ventajosamente, dicha construcción génica de expresión comprende, además, un marcador o gen que codifica para un motivo o para un fenotipo que permita la selección de Ia célula hospedadora transformada con dicho construcción génica de expresión.
Ejemplos ilustrativos de dichos marcadores que podrían estar presentes en la construcción génica de expresión de la invención incluyen genes de resistencia a antibióticos, genes de resistencia a compuestos tóxicos, y, en general, todos aquellos que permitan seleccionar a las plantas transformadas genéticamente.
La construcción de ADN de la invención, o la construcción génica de expresión proporcionada por esta invención, pueden ser insertadas en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, tal como un vector de expresión, que comprende dicha construcción de ADN. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo ilustrativo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en Ia materia [Sambrok et al., 1989, citado supra], En una realización particular, dicho vector recombinante es un vector útil para transformar o ser insertado en células de plantas o células animales. Así, el vector de la invención puede ser, por ejemplo, Agrobacterium tumefaciens o un vector viral, capaces de infectar y expresarse en células de animales (como por ejemplo mamíferos o insectos) o de plantas. En una realización particular de la invención el vector viral utilizado es Baculovints.
Dicho vector puede ser utilizado para transformar, transfectar o infectar células susceptibles de ser transformadas, transfectadas o infectadas por el mismo. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula infectada con un vector viral proporcionado por esta invención. En una realización particular, dicha célula infectada es una célula vegetal infectada con un vector viral apropiado, siendo dicha célula vegetal infectada capaz de expresar la proteína de fusión proporcionada por esta invención. Células vegetales infectadas con vectores virales recombinantes pueden obtenerse tras la infección de una planta con dicho vector viral recombinante. De este modo, los vectores virales infectivos de plantas pueden utilizarse para la expresión en plantas de epítopos de patógenos animales o de células tumorales con el fin de producir vacunas comestibles frente a dichos patógenos o células tumorales.
Adicionalmente, los vectores recombinantes proporcionados por esta invención pueden ser utilizados para transformar o transfectar células eucariotas o procariotas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula transformada o transfectada que comprende dicho vector recombinante, o dicha construcción de ADN proporcionada por esta invención, o bien dicho construcción génica de expresión proporcionado por la invención. Células transformadas o transfectadas pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok et al, 1989, citado supra].
En una realización particular, dicho vector recombinante es un vector viral. Los vectores recombinantes de la invención son capaces de infectar y expresarse en células de plantas, células de algas o células animales, preferentemente en células de insectos o de larvas de los mismos. Por consiguiente, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula transformada o transfectada que comprende, al menos, una construcción de ADN de la invención, o un vector recombinante proporcionado por esta invención o un construcción génica de expresión proporcionado por esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula transgénica que comprende, insertada en su genoma, al menos, una construcción de ADN de la invención. En una realización particular, dicha célula transgénica procede de una célula vegetal y comprende, insertada en su genoma o en el genoma de un cloroplasto, al menos una construcción de ADN de la invención. A partir de dichas células vegetales transgénicas o bien a partir de material vegetal transgénico, pueden obtenerse plantas transgénicas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una planta transgénica que comprende, al menos, una célula vegetal transgénica proporcionada por esta invención. Como es conocido, una aplicación potencialmente interesante de las plantas transgénicas es la expresión en plantas de proteínas o epítopos de patógenos animales o de células tumorales con el fin de producir vacunas comestibles frente a dichos patógenos o células tumorales.
En otra realización particular de la invención dicha célula transgénica es una célula animal, preferentemente de un mamífero o de un insecto y más preferentemente de una larva de insecto. Por lo tanto, la invención también se relaciona con un animal no humano transgénico, particularmente un mamífero, un insecto o una larva de insecto transgénica que exprese el péptido o proteína de interés, con alto rendimiento.
La construcción de ADN de la invención puede ser utilizada para producir proteínas de fusión descritas en la presente invención. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir dicha proteína de fusión que comprende crecer una célula u organismo proporcionado por esta invención bajo condiciones que permiten la producción de dicha proteína de fusión. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula u organismo dependerán de la célula u organismo utilizado. Si se desea, el método para producir un producto de interés proporcionado por esta invención incluye, además, el aislamiento y purificación de dicha proteína de fusión. La invención también proporciona, en otro aspecto, un método para expresar en una planta un gen que codifica para una proteína de fusión proporcionada por esta invención, que comprende transformar dicha planta con, al menos, una construcción de ADN proporcionada por esta invención. La transformación de células de tejidos vegetales puede realizarse por métodos convencionales. Para una revisión de la transferencia génica a plantas, incluyendo vectores, métodos de transferencia de ADN, etc., véase, por ejemplo, el libro titulado "Ingeniería genética y transferencia génica", de Marta Izquierdo, Ed. Pirámide (1999), en particular, el capítulo 9, titulado "Transferencia génica a plantas", páginas 283-316.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión obtenible por expresión de la secuencia de ácido nucleico contenida en la construcción de ADN proporcionada por esta invención. De modo más concreto, la invención proporciona una pro teína de fusión que comprende:
(A) un polipéptido con una región que reconoce un epítopo presente en la superficie de una célula presentadora de antígeno, y
(B) un antígeno vacunal de interés.
En una realización particular, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende:
(A) un polipéptido seleccionado del grupo formado por el anticuerpo monoclonal IFl 2 completo, un fragmento del anticuerpo monoclonal
IF 12 que contiene la región que reconoce la cadena β del antígeno DR de Clase II, el anticuerpo monoclonal 1F12 en forma bifuncional, y un scFv recombinante que contiene la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal 1F12 fusionada, a través de un péptido flexible, a la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal IF 12 (APCHl); y
(B) un antígeno vacunal de interés. La proteína de fusión proporcionada por esta invención puede contener, además, si se desea, un péptido espaciador entre el polipéptido que comprende una región que reconoce un epítopo presente en Ia superficie de una célula presentadora de antígeno y el poíipéptido de interés; y/o un péptido para facilitar el aislamiento o purificación de la proteína de fusión.
La proteina de fusión proporcionada por esta invención, en particular cuando el polipéptido que comprende la región que reconoce un epítopo presente en Ia superficie de una célula presentadora de antígeno es un scFv, es, en general, una molécula relativamente pequeña y mantiene, por lo general, la especificidad de unión del anticuerpo original del que deriva el polipéptido que comprende la región que reconoce un epítopo presente en la superficie de una célula presentadora de antígeno, y no requiere del complejo proceso de ensamblaje del anticuerpo completo. Por otra parte, debido a su pequeño tamaño, presentan una mejor penetrabilidad en los tejidos.
En otro aspecto, Ia invención se relaciona con una vacuna recombinante que comprende la proteína de fusión proporcionada por esta invención, y, opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los ensayos realizados (ver ejemplos) ponen de manifiesto que la proteína de fusión proporcionada por esta invención potencia la respuesta inmune en animales ya que induce títulos de anticuerpos muy superiores a los obtenidos con el péptido vacunal sólo o fusionado a una proteína irrelevante, confirmándose de este modo la hipótesis del aumento de inmunogenicidad de un péptido vacunal a través de su direccionamiento a células presentadoras de antígeno mediante un polipéptido que comprende una región que reconoce un epítopo presente en la superficie de una célula presentadora de antígeno, tal como el scFv APCHl.
Por tanto, el sistema de direccionamiento de antígenos vacunales proporcionado por esta invención, al dirigir al antígeno vacunal fusionado a las células presentadoras de antígeno que presentan el epítopo correspondiente en su superficie, facilita la captura del antígeno vacunal y se potencia la respuesta inmune, ya que Ia mayoría de la proteína expresada llega a su destino antes de degradarse evitándose, además, que el antígeno vacunal sea eliminado del torrente circulatorio sin que sea procesado por las células encargadas de presentarlo al sistema inmune y, por tanto, de generar una respuesta inmune protectora. Gracias al direccionamiento del antígeno vacunal a células presentadoras de antígeno, una gran parte del mismo es presentado correctamente al sistema inmune y tiene como resultado una potente respuesta inmune que, dependiendo de los casos, será de, al menos, 50 veces la obtenida por el antígeno vacunal solo (referida al título de anticuerpos específicos). Por tanto, esta invención mejora inmunológicamente las vacunas de subunidades recombinantes producidas en cualquier sistema.
DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO
Plásmido pBIAPCHl-2L21; fue depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Burjassot, Valencia, en la fecha 12.12.2003, correspondiéndole el número de acceso CECT: 5857.
Plásmido pcDNAAPCHl-E2T: fue depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Burjassot, Valencia, en la fecha 05.03.2008, correspondiéndole el número de acceso CECT: 7387.
Los ejemplos que se exponen a continuación sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1. Direccionamiento de antígenos vacunales a células presentadoras de antígeno para la potenciación de la respuesta inmune en animales. Fusión del anticuerpo de cadena sencilla recombinante APCHl (SEQ ID NO: 1) al péptido 2L21 y su expresión en plantas transgénicas 1.1 Material vegetal
La planta modelo utilizada fue Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia. El género Arabidopsis pertenece a la familia de las Cruciferas (Brassicaceae o Cruciferae). 5
1.2 Cepas bacterianas utilizadas
1.2.1 Escherichia coli 0 Para la transformación y crecimiento de los plásmidos se usaron las cepas de Escherichia coli, DH5-α y TOP-IO (Clontech), que presentan las siguientes características:
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5 1.2.2 Agrobacterium tumefaciens
Las cepas de Agrobacterium tumefaciens C58C1 y AGLO 5-α (Hellens R. and Mullineaux P. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science 5:446-451, 2000), fueron utilizadas para Ia infiltración de las flores de A thaliana. 0
1.3 Plásmidos utilizados
1.3.1 Plásmidos comerciales 5 Para obtener las distintas construcciones que expresaban los diferentes péptidos ensayados se utilizaron diversos plásmidos comerciales. Para el clonaje y secuenciación de productos de PCR se utilizó el plásmido pGEM-Teasy, mientras que el plásmido binario PBI-121 y derivados fueron utilizados en la transformación de Agi'obacterium y en la posterior infiltración de plantas A. thaliana.
pGEM-Teasy (Promesa): Este plásmido está especialmente diseñado para el clonaje y secuenciación de los productos de PCR. Contiene una región con múltiples lugares de restricción (polylinker). El polylinker ha sido previamente digerido con EcoRV y posteriormente se le han añadido timidinas 3' en ambos extremos para facilitar el clonaje de los productos de PCR. Además, permite seleccionar los recombinantes por medio del gen LacZ.
PBI-121 fClontech Cat. 6018-1): Deriva del plásmido pBI-101. Contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S CaMV) dirigiendo la expresión del gen GUS y un fragmento de 260 pb (pares de bases) que contiene la secuencia de poliadenilación del gen nopalin sintetasa (NOS-ter) del plásmido Ti de Agrobacterium. También contiene un origen de replicación RK2 (de bajo número de copias) y un gen de resistencia a kanamicina (Npt2).
Además de estos plásmidos comerciales, también se utilizó el plásmido p35S-TEV (4.051 pb), generado en el laboratorio del Dr. Escribano (INIA) y derivado del plásmido pBI121 [colección del laboratorio del Dr. Escribano (INIA)], el cual contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (35SCaMV)3 la secuencia potenciadora de Ia transcripción (TEV) del virus del moteado del tabaco, tras la cual aparece una región de clonaje múltiple y Ia señal de poliadenilación del Vsp. Este plásmido fue utilizado en el subclonaje de algunas construcciones como paso previo a su clonaje en el plásmido binario. Estos dos plásmidos se mantienen a libre disposición del público en el laboratorio de los inventores y no forman parte de la invención reivindicada. 1.3.2 Plásmidos de transformación de plantas desarrollados durante la puesta en práctica de esta invención
Para la realización de este ejemplo se generó el plásmido identificado como pBI APCHl -2L21, el cual se utilizó en la transformación genética de plantas. El antígeno expresado en dicho plásmido pBI APCHl -2L21 es la fusión de APCHl al péptido 2L21 de parvovirus canino (CPV).
Las secuencias que codifican dicho antígeno y sus respectivas fusiones fueron obtenidas por amplificación mediante PCR. Se utilizaron 2 tipos de polimerasas comerciales, la ECOTAQ (Ecogen), que fue utilizada principalmente en los análisis de colonias, y la Pow DNA-polimerasa (Roche), que presenta actividad correctora y se utilizó para amplificar las secuencias de los transgenes. Los cebadores utilizados se recogen en Ia Tabla 1. Las posiciones 1-6 de la SEQ ID NO: 4; 1-6 de la SEQ ID NO: 5; 2-7 de la SEQ ID NO: 6 y 1-18 de la SEQ ID NO: 9 son dianas de restricción. Las posiciones 1-35 de la SEQ ID NO: 7 y las posiciones 1-32 de la SEQ ID NO: 8 representan la secuencia artificial flexible que sirve de unión en el scFv (APCHl).
Tabla 1 Cebadores utilizados
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1.4 Anticuerpos
Para la detección de las distintos antígenos recombinantes producidos en plantas se utilizaron distintos anticuerpos monoclonales comerciales de ratón y policlonales de conejo, y sus respectivos secundarios conjugados a fosfatasa alcalina (AP) y o peroxidasa (HRP).
Tabla 2
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Figure imgf000021_0002
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* WB: Western Blot
1.5 Hibridoma íF12
Para desarrollar el scFv identificado como APCHl, se partió del hibridoma 1F12, cedido por el Dr. Javier Domínguez (Dpto de Biotecnología, INIA), que expresa el anticuerpo monoclonal 1F12 que reconoce la cadena β del antígeno DR de Clase II. El hibridoma 1F12 se mantuvo en cultivo en medio RPMI- 1640 (Biowhittaker) suplementado con ácido pirúvico 0,01 mM (Sigma), L-glutamina 2 mM (Sigma), penicilina 100 U/ml y gentamicin sulfato 20 μg/ml (Biowhittaker). El hibridoma 1F12 se encuentra a libre disposición del público en los laboratorios del INIA y no forma parte de la invención reivindicada. 1.6 ELISAS comerciales
INGEZIM PARVO CANINO 1.5.CPV.K.1 (Ingenasa), ensayo inmunoenzimático de tipo indirecto para la detección y cuantificación de anticuerpos específicos frente al parvo virus canino en sueros de perro.
1.7 Crecimiento de Arabidopsis thaliana
La planta modelo utilizada ha sido Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia. El género Arabidopsis pertenece a la familia de las Cruciferas (Brassicaceae o Cruciferaé).
1.7.1 En tierra
Para el crecimiento de plantas de Arabidopsis en tierra, las semillas se sembraron en superficie, en macetas o alvéolos de plástico, que contenían una mezcla de sustrato universal y vermiculita (3:1). La mezcla fue previamente empapada en agua destilada y esterilizada en autoclave a 101 kPa (1 atm) de presión durante 20 minutos a 12O0C. Las macetas o alvéolos se colocaron en bandejas que, a continuación, se cubrieron con plástico para mantener una humedad adecuada y evitar contaminaciones durante la germinación. Las bandejas se mantuvieron durante 48 horas a 40C y en oscuridad, para favorecer una germinación homogénea de las semillas. Tras esto, las bandejas se llevaron a cámaras de cultivo a 220C con un foto período de 16 horas de luz fluorescente y 8 horas en oscuridad. Transcurrida una semana desde la siembra, se retira el plástico, manteniéndose siempre la bandeja con agua. Las plantas se regaron una vez por semana con medio universal mínimo (Haughn y Somerville, (1986), Sulfonylurea resistant mutants of Arabidopsis thaliana. Molec. General Genetics 204:430-434). Se mantuvieron las plantas en estas condiciones hasta que se inicia la floración (6-7 semanas), momento idóneo para la infiltración. En ocasiones, para intentar mejorar los rendimientos de las infiltraciones, se cortan algunas flores y se espera a que se desarrollen las inflorescencias secundarias, más numerosas.
1 -7.2 En placas petri Para la germinación de las semillas en placa, se utilizó medio MS (Murashige T. and F. Skoog. A revised médium for rapid growth and bioassays with tobáceo tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473-497, 1962), suplementado con sacarosa al 1% y solidificado con agar al 0,8%, y el antibiótico correspondiente. Las semillas fueron esterilizadas durante 10 minutos en una solución de hipoclorito sódico al 30% y Tritón X-IOO al 0,01%, y lavadas posteriormente 5 veces en agua estéril. Las semillas se sembraron sobre las placas petri, que fueron llevadas a 40C y oscuridad durante 48 horas. Posteriormente se llevaron a cámaras de cultivo en condiciones de 220C y 16 horas de luz seguidas de 8 horas de oscuridad. Tras dos semanas, las plántulas fueron transplantadas a tierra y crecidas en las condiciones anteriormente comentadas.
1.8 Medios de cultivo de bacterias y obtención de competentes
Los cultivos de E. coli se realizaron en medio LB (Sigma) en presencia del correspondiente agente selectivo (Sambrook y col. 1989) durante 14-16 horas a 370C. La preparación de células competentes se realizó por el método del cloruro de rubidio, descrito por Hanahan (Studies on transformation of E. coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166:557-580. 1983).
Los cultivos de las distintas cepas de Agrobacteήum se realizaron en LB líquido o en placa, suplementado con 50 μg/ml de kanamicina y 50 μg/ml rifampicina (Sambrook y col. 1989), y fueron mantenidos 36-48 horas a 28°C.
Los cultivos bacterianos se conservaron a largo plazo en dimetilsufóxido (DMSO) a una concentración final del 6% a -8O0C (Sambrook y col., 1989).
1.9 Métodos de transformación bacteriana
1.9.1 Transformación de E. coli
Las cepas DH5-α y TOP-10, fueron utilizadas para el mantenimiento de plásmidos y generación de nuevos. Ambas cepas competentes fueron transformadas siguiendo el protocolo de Birnboim y Dolly (Bimboin H.C. and Dolly J. A rapid alcalina extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucí. Acid Res. 7:1513-1516. 1979). Brevemente, el ADN plasmídico o producto de ligación se añadió a una alícuota de 100 μl de células competentes descongeladas y se mantuvo a 40C durante 30 minutos. A continuación, se provocó un choque térmico a 420C, lo que aumenta la permeabilidad de los poros, se añadieron 600 μl de LB y se incubaron en agitación a 370C durante 1-1,5 horas. Las células bacterianas sedimentaron por centrifugación durante 3 minutos a 3.500 r.p.m. y se plaquearon en medio sólido al que previamente se la habían añadido los antibióticos de selección necesarios. Las placas se incubaron en estufa a 37°C durante toda la noche.
1.9.2 Transformación de A. tumefaciens
Las cepas C58C1 y AGLO, fueron transformadas con los plásmidos binarios. Brevemente, se añadió 1 μg de ADN (plásmidos binarios) a una alícuota de 200 μl de dichas células competentes, sin descongelar y se incubaron durante 5 minutos a 370C, e inmediatamente después se incubaron a 40C durante 30 minutos. A continuación, se añadió 1 mi de LB y se cultivó a 280C durante 3-4 horas. Tras centrifugar, se plaquearon en medio LB con kanamicina-rifampicina. Las placas se incubaron a 280C y las colonias tardaron aproximadamente 48 horas en aparecer. Posteriormente fueron cultivadas y usadas para la infiltración de plantas de A. thaliana.
1.10 Obtención del scFv (APCHl) a partir del hibridoma 1F12
Para obtener la secuencia correspondiente al scFv (APCHl) se partió del hibridoma 1F12 (tal como se indica en los Materiales, apartado 1.5). Se aisló el RNA total de las células del hibridoma utilizando el kit comercial "Tripure" de Roche y mediante RT- PCR utilizando la AMV-RT polimerasa [Promega] se obtuvo el cDNA del hibridoma que expresaba el anticuerpo monoclonal IFl 2. A continuación, se realizó una primera PCR con cebadores específicos para los distintos dominios variables de las inmunoglobulinas. La amplificación por PCR se llevó a cabo de manera separada utilizando dos conjuntos de cebadores que hibridaban específicamente en los extremos de las regiones variables de la cadena pesada y ligera.
Los cebadores utilizados en la primera PCR son los siguientes:
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VH y VL: cebadores específicos para los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas.
Se llevaron a cabo 3 PCRs para obtener la región variable de la cadena pesada (VH) (5'VHla,lb,lc con 3'VHl) y 4 para obtener la región variable de la cadena ligera (VL). Se consiguió amplificar las secuencias de los distintos dominios, como era de esperar, en una de las mezclas de PCR para cada dominio. Estas secuencias amplificadas (VH y VL) fueron clonadas directamente en el plásmido de clonaje para productos de PCR pGEM-Teasy, obteniéndose los plásmidos de subclonaje pGEM VH y pGEM VL que, tras su secuenciación fueron utilizados como molde en una segunda PCR. En esta segunda PCR se amplificaron con cebadores previamente diseñados ambos dominios unidos a una secuencia artificial flexible (linker). Por tanto, se tiene el VH unido en su región 3' unido al linker y el VL unido a esta secuencia en su región 5' (VH3' linker y linker VL5') (Tabla 1). Por tanto, como ambos dominios llevan la secuencia artificial solapante, tras varios ciclos de amplificación de ambas secuencias se realizó una tercera PCR para obtener ambos dominios unidos a una secuencia artificial flexible. Por consiguiente, el APCHl contiene la región variable de la cadena pesada fusionada por un péptido flexible a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal IFl 2. Una vez amplificada la secuencia del APCHl por PCR con los cebadores específicos (5'VH xbal y 3'VL) (Tabla 1) fue clonado en el plásmido para clonaje de productos de PCR, pGEM-Teasy, generándose el plásmido de subclonaje pGEM- APCHl . El APCHl fue diseñado para añadir varias secuencias de restricción en el extremo 3 'VL con el fin de poder realizar las distintas fusiones a los antígenos a ensayar y en el extremo 5 'VH contiene la secuencia Xbal, lo que permite sacar las fusiones fácilmente del pGEM y llevarlas a los plásmido s de transformación de plantas.
1.11 Obtención del plásmido pBI APCH1-2L21
Tras la secuenciación del plásmido pGEM-APCHl y comprobación de su integridad, se procedió a clonar el antígeno 2L21 de CPV fusionado a la región 3' del scFv APCHl. Para ello, se amplificó la secuencia del péptido 2L21 por PCR, con los cebadores 2L21XhoI y 2L21 SmaI (Tabla 1) y se clonó en el pGEM para su secuenciación. Tras comprobar su secuencia se procedió a sacarlo por digestión con las enzimas Xhol y Smal e introducirlo de forma dirigida en ei plásmido pGEM-APCHl previamente digerido con estas mismas enzimas. Tras varias ligaciones y transformaciones, finalmente se obtuvo el plásmido pGEM APCH1-2L21, que fue secuenciado para comprobar que mantenía correctamente el marco de lectura de la fusión. Posteriormente se digirió este plásmido con las enzimas Xbal y Smal para sacar la fusión APCHl- 2L21 e introducirla en el plásmido pBI-121, digerido previamente con estas mismas enzimas.
El plásmido pB 1-121 contiene el gen de la β-glucuronidasa, por lo que se digirió con las enzimas HindlII y Smal y se clonó en el plásmido p35S TEV con las mismas enzimas (HindlII-Smal). Posteriormente, el nuevo vector generado (p35 S-APCH 1-2L21), que contenía el promotor 35SCaMV, la fusión APCH1-2L21, parte del polilinker (Sacl, Kpnl) y la secuencia de poliadenilación Vsp-ter, fue digerido con las enzimas HindlII- EcoRI, para introducir dicha fusión APCH1-2L21 en el plásmido binario pBI-121 digerido con esas mismas enzimas, obteniéndose el plásmido pBI APCHl -2L21. 1.12 Transformación genética de plantas mediada por A tumefaciens
Las células de Agrobacterium transformadas previamente con los distintos plásmidos de transformación de plantas fueron crecidas en 500 mi de medio LB (Sigma), suplementado con kanamicina y rifampicina (Sambrook y col. 1989), durante 48 horas a 280C. Tras centrifugación a 3.000 r.p.m. durante 20 minutos, se resuspendió el sedimento (que contenía las bacterias) en 200 mi de medio de infiltración: 2,35 g/1 de
MS (Murashige y Skoog, 1962), 5% de sacarosa, 10 g/1 de 6-benzilaminopurina y 0,02% de Silweet L-77 (Lehle Seeds, número de catálogo VIS-Ol).
1.12.1 Infiltración de las flores
Para realizar la infiltración se utilizaron plantas de 6-7 semanas de edad, con el mayor número de inflorescencias posibles. Se sumergieron las inflorescencias en el medio de infiltración conteniendo Agrobacterium en una cámara de vacío, sometiéndolas a una presión de 5 kPa (50 mbar) durante 10 minutos (Bechtold N. and Pelletier G. In planta
Agrobacterium-mediated transformation of adult Arαbidopsis thαliαnα plants by vacuum infiltration. Methods Mol. Biol. 82:259-266, 1998). Una vez transcurrido el tiempo se liberó el vacío lo más rápidamente posible, se lavaron las plantas con agua y se les cubrió con plástico para evitar su desecación y posible contaminación entre las diferentes plantas infiltradas. En algunas ocasiones se infiltraron plantas en ausencia de vacío (Clough S.J. and Bent A.F. Floral dip: a simplified method for Agrobαcterium- mediated transformation of Arαbidopsis thαliαnα. Plant. J. 16:735-743, 1998). Se mantuvieron en cámaras de cultivo, en condiciones controladas de luz, humedad y temperatura hasta el desarrollo y maduración de las silicuas.
1.12.2 Medios de crecimiento y selección de las plantas transgénicas
Las semillas procedentes de plantas de A. thαliαnα previamente infiltradas, se esterilizaron en una solución que contenía lejía ai 30% y Tritón X-100 al 10%, y se sembraron en placa petri en medio GM (MS 4,7 g/1, 1% de sacarosa, ácido morfolin- cetanesulfónico (MES) 0,5 g/1, agar 8 g/1 y pH 5,7) suplementado con ampicilina y kaπamicina (Sambrook y col. 1989).
Las semillas Tl se mantuvieron a 40C de temperatura y oscuridad durante 48 horas y posteriormente en cámara de cultivo in vitro, en condiciones controladas (16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, 220C de temperatura). Tras 12-15 días, las plántulas transgénicas (capaces de crecer normalmente en presencia de kanamicina) fueron transplantadas a tierra y llevadas a cámaras de cultivo para su crecimiento y desarrollo.
1.13 Análisis de las plantas transgénicas
1.13.1 Aislamiento de ARN total, cuantifícación. electroforesis, transferencia a membranas
El ARN total se purificó siguiendo el método de hidroclorato de guanidina descrito por Logeman y col. (Logemann J., Schell J,, and Willmitzer L. Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Anal. Biochem. 163:16-20, 1987). La cuantificación del ARN se realizó por espectrofotometría.
Para su transferencia a membranas, el ARN se resolvió en geles horizontales de agarosa al 1,5% en presencia de formaldehído/formamida (Sambrook y col. 1989). Las muestras de ARN se cargaron con bromuro de etidio, con el fin de visualizarlas por fluorescencia y así comprobar su integridad. Posteriormente, el ARN se transfirió a membranas Hybond N+ (Amersham) utilizando hidróxido sódico 0,05 M por métodos convencionales (Sambrook y col. 1989).
1.13.2 Mareaje radiactivo de sondas e hibridación de ácidos nucleicos
Todas las sondas de ADN se marcaron con 50 μCi de α32P-dCTP (Amersham o ICN) mediante el método de extensión a partir de cebadores aleatorios, utilizando el Oligolabelling kit (Pharmacia Biotech). Los nucleótidos no incorporados se eliminaron por cromatografía de exclusión molecular en columnas S-200 (Pharmacia Biotech), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los distintos fragmentos de ADN utilizados como sondas (secuencias completas de los genes de fusión), así como el método utilizado para obtenerlos, se detallan a continuación.
TABLA 3
Figure imgf000029_0001
* N, Northern Blot S, Southern Blot
Las hibridaciones de ácidos nucleicos se realizaron en tubos de vidrio, conteniendo 10- 15 mi de solución de prehibridación. Las membranas se prehibridaron durante, al menos, dos horas a la temperatura de hibridación. Transcurrido este tiempo, se añadió la sonda marcada radiactivamente desnaturalizada y las membranas se mantuvieron en esta solución de 16 a 20 horas.
Las hibridaciones tipo Southern a baja astringencia se llevaron a cabo en una solución de prehibridación con 5X SSPE (NaCl 0,15 M, NaH2PO4 10 mM, EDTA Na2 1 mM),
5X Solución de Denhardt (0,02% Ficoll, 0,02% Polivinilpirrolidona, 0,02% albúmina sérica bovina, 0,5% dodecil sulfato sódico (SDS) y ADN de esperma de arenque desnaturalizado 0,5 mg/ml). La hibridación se llevó a cabo a 650C. Tras la hibridación, las membranas fueron sometidas a sucesivos lavados con 5X SSPE y 0,5% SDS, disminuyendo la concentración de sales en cada lavado.
Las hibridaciones tipo Northern se realizaron a 420C en tampón fosfato 0,25 M pH 7,2, NaCl 0,25 M5 EDTA 1 mM, 7% SDS, 10% PEG 6000, 40% formamida y ADN de esperma de arenque desnaturalizado 0,2 mg/ml. Tras la hibridación, las membranas fueron sometidas a varios lavados con 5X SSPE y 0,5% SDS, a 650C. Cada lavado fue de aproximadamente 20 minutos de duración. En ocasiones, fue necesario lavar con SDS al 0,5%. Las membranas se expusieron con película autorradiográfica (Hyperfilm MP5 Amersham) y pantallas intensificadoras, a -8O0C, durante el tiempo necesario para visualizar las bandas de hibridación. Con el fin de reutilizar las membranas, estas se deshibridaron con una solución de SDS al 5% hirviendo, y agitando hasta el enfriamiento de la solución. Para comprobar que no quedaba radiactividad en Ia membrana, los filtros se expusieron con película autorradiográfica durante varios días.
1.14 Análisis de proteínas rccombinantes producidas en plantas transgénicas
1.14.1 Obtención de la proteína total soluble
Material vegetal fresco, generalmente procedente de las hojas de la roseta basal de las plantas, fue homogeneizado en tampón de extracción de proteínas (Tris 10 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, 0,1% Tritón x-100, 1% β-mercaptoetanol y PMFS 1 mM como inhibidor de proteasas), tras ser cortado e introducido en tubos eppendorf de 1,5 mi y mantenido en hielo (40C). Tras su homogenización se centrifugaron 10-15 minutos a 13.000 r.p.m. recogiéndose el sobrenadante. En algunos casos se usó material congelado. Para solubilizar algunas de las proteínas precipitadas y mejorar los rendimientos de extracción se utilizó un tampón conteniendo urea. El análisis de proteínas se llevó a cabo en geles de electroforesis de acrilamida-bisacrilamida (30:1) en presencia de SDS.
1.14.2 Electroforesis en geles de poliaciϊlamida-glicina en presencia de SDS
Las electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes se realizaron en geles discontinuos de acrilamida-bisacrilamida en presencia de SDS, siguiendo el método convencional (Sambrook y col. 1989). Se prepararon geles separadores de acrilamida- bisacrilamida (Biorad o Serva), a concentraciones variables del 7 al 15% dependiendo del peso molecular esperado de la proteína a analizar y geles apelmazadores con una concentración de arcrilamida-bisacrilamida al 3,5% (Sambrook y col. 1989). Las electroforesis se desarrollaron a voltaje constante de 100 a 140 V en el caso de minigeles (7x9 cm). Todas las muestras fueron cuantificadas previa su separación mediante electroforesis, según el método de Bradford-Lowry (Biorad protein assay). Se solubilizaron en tampón de disociación de proteínas (Tris 0,5 M pH 8,0, SDS 10%, glicerol, β-mercaptoetanol, azul de bromofenol 0,02%), se calentaron 5 minutos a 1000C y posteriormente se aplicaron al gel.
1.14.3 Transferencia de proteínas a filtros de nitrocelulosa
La transferencia de proteínas a filtros de nitrocelulosa (Bio-Rad 2) se realizó en cubeta húmeda a un voltaje constante de 100 V durante 1 hora, o mediante transferencia semiseca (Bio-Rad) durante 25 minutos a 20 voltios. En ambos casos se utilizó el mismo tampón de transferencia (Tris 25 raM, glicina 151,8 mM y metanol al 20%
(Wv)).
1.14.4 Tinción Rojo Ponceau de proteínas transferidas a nitrocelulosa
Una vez transferidas las proteínas a los filtros de nitrocelulosa, estos se tiñeron para comprobar su integridad con una solución de Ponceau (Sigma) al 0,2% en ácido tricloro acético 30% (p/v) y ácido sulfosalicílico al 30% (p/v) durante 1 minuto por inmersión. Posteriormente se lavaron con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
1.14.5 Análisis de proteínas por Inmuno blotting o Western Blotting
Una vez transferidas e inmovilizadas las proteínas en filtros de nitrocelulosa, se bloquearon dichos filtros de nitrocelulosa bien durante 1 hora a 370C con leche desnatada en polvo al 2% (p/v) en PBS, o bien durante toda la noche a 40C en agitación, con la misma solución de bloqueo. A continuación, los filtros se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo específico diluido en PBS-Tween 20 al 0,05% (v/v) y a la concentración adecuada para cada ensayo. Los filtros se lavaron 3 veces durante 10 minutos en tampón de lavado (PBS lX-Tween) cada vez y se incubaron en la misma solución de dilución con el anticuerpo secundario correspondiente, durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras repetir los lavados se procedió al revelado utilizando el sustrato adecuado acorde con la conjugación del anticuerpo secundario (NBT-BCIP (Roche), ECL (Amersham).
1.15 Análisis inmunogénico de las proteínas expresadas en plantas
1.15.1 Obtención de los sueros
Los sueros fueron obtenidos mediante incubación de la sangre durante 30 minutos a 370C, seguida de una incubación de 14 horas a 40C. Se separaron los coágulos sanguíneos y los sueros fueron clarificados por centrifugación a 1.500 r.p.m durante 10 minutos.
1.15.2 Detección de anticuerpos por ELISA
Se tapizaron los pocilios de las placas de ELISA con 0,2 μg del péptido 2L21 por pocilio, diluido en tampón de pegada (carbonato/bicarbonato), durante 12 horas a 4°C. Se bloqueó con una solución de PBS-Tween-20 0,05% (v/v) y suero bovino fetal o BSA al 5% durante 1 hora a 370C en agitación. Tras lavar 3 veces con una solución de PBS-Tween 20 0,05%, se incubaron los sueros a determinar a diferentes diluciones en PBS-Tween 20 0,05%, durante 1 hora a 370C en agitación. Tras 5 lavados con PBS- Tween, se incubaron los pocilios con solución de PBS-Tween-20 0,05% que contenía un anti-ratón conjugado con peroxidasa (Amersham) a una dilución de 1/500, durante 1 hora a 37°C con agitación. Las placas se lavaron y revelaron usando como sustrato o- fenilendiamina (OPD) (Sigma-AIdrich), preparado en agua conteniendo agua oxigenada al 0,1%. Las reacciones se pararon con ácido sulfúrico 3 N leyéndose a continuación Ia absorbencia de cada pocilio de la placa en un lector de ELISA a una longitud de onda de 492 nm.
Para la detección de anticuerpos contra la cápside del parvovirus canino se utilizó el Kit INGEZIM PARVO CANINO 1.5.CPV.K.1 (Ingenasa), diseñado para la detección y cuantificación de anticuerpos específicos frente al parvovirus canino en sueros de perro. Para determinar el título de anticuerpos de los sueros analizados por ELISA, se realizaron diluciones seriadas de los sueros a titular, expresando el título de cada suero, como el inverso de la dilución máxima de dicho suero en la que la absorbancia a 492 nm era significativamente mayor que la de los controles negativos (2 veces mayor).
1,15.3 Caracterización de anticuerpos por Immunoblotting
La especificidad de antígeno de los anticuerpos provenientes de los animales inmunizados se determinó mediante immunoblotting. La proteína de la cápside VP2 producida en baculovirus (Ingenasa), fue resuspendida en tampón de disociación de proteínas, hervido durante 5 minutos y cargado en gel de poliacrilamida-glicina en presencia de SDS y transferido a membrana de nitrocelulosa (Biorad). Los sueros de ratón se testaron a dilución límite desde 1/10, y el anticuerpo secundario anti-ratón estaba conjugado con fosfatasa alcalina (Roche). El sustrato empleado para la reacción fue nitroblue-tetrazolum-4-cloro-3 indolfosfato (NBT-BCIP, Roche).
1.16 Modelos experimentales e inmunizaciones
1.16.1 Inoculaciones de ratones con extractos de plantas por vía intraperitoneal
Se inmunizaron intraperitonealmente hembras de ratón, de 11 semanas de edad y estirpe Swisse, en días 0, 7 y 14 con extractos de planta, que expresaba la proteína recombinante objeto de estudio (APCH 1-2L21) (3 mg de proteína soluble total/dosis).
Para la primera inoculación se utilizó adyuvante completo de Freund (Sigma) y adyuvante incompleto de Freund (Sigma) para el resto.
Los ratones controles fueron inmunizados utilizando el mismo protocolo con extractos de planta sin transformar o transformada con el vector sin el transgén. Diez días después de la última inmunización los ratones fueron sangrados y se procedió a la obtención de los sueros para su estudio. 1.17 Obtención del anticuerpo de cadena sencilla recombinante APCHl fusionado al péptido 2L21 y su expresión en plantas transgénicas
La obtención del anticuerpo de cadena sencilla recombinante (scFv) denominado APCHl en esta descripción se realizó mediante amplificaciones por PCR a partir de mRNAs a partir del hibridoma IFl 2 y posteriores clonajes moleculares, tal y como se describe en el apartado de Materiales y Métodos. La construcción final consta del dominio variable de la cadena pesada (VH) con el péptido señal nativo del anticuerpo IFl 2, el dominio variable de la cadena ligera (VL) a la que se ha eliminado su péptido señal y un péptido artificial flexible que las une. Tras la secuenciación del gen quimérico resultante y comprobación de su integridad, se procedió a clonar el antígeno 2L21 de CPV fusionado a la región 3' del APCHl. Para ello, se amplificó la secuencia del antígeno 2L21 por PCR, con los cebadores específicos que permitieran mantener abierto el marco de lectura de la fusión. Este fragmento fue introducido, tras varios subclonajes, en el plásmido binario pBI 121, dando lugar al plásmido pBI APCHl- 2L21, que contiene el promotor constitutivo 35S, el cual dirige la expresión de la secuencia correspondiente a la proteína de fusión y la secuencia de poliadenilación del gen Nos de Agrobacterium (Figura 1). Este plásmido fue introducido en Agrobacterium tumefaciens, con el que se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana, mediante infiltración floral (Clough, SJ. and Bent, A.F. 1998. Floral dip: a simplified meted for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16: 735-743).
1.18 Análisis de la expresión del antígeno de fusión (APCH1-2L21) en las plantas transgénicas obtenidas
Tras la transformación de plantas, se obtuvieron múltiples líneas transgénicas de fenotipo similar al silvestre. A continuación, se analizaron aproximadamente 30 líneas transgénicas independientes para conocer la expresión del transgén y acumulación de Ia proteína de fusión (APCHl -2L21). Se han expresado previamente en plantas diferentes scFv con distintos objetivos, obteniéndose una gran variación en los niveles de expresión y acumulación de estas moléculas (Fiedler, U. And Conrad, U. 1995. High- level production and long-term storage of engineered antibodies in transgenic tobáceo seeds. Biotechnology (N .Y.) 13: 1090-1093). Por tanto, el primer paso que se realizó fue estudiar la correcta transcripción del transgén para, posteriormente, analizar los niveles de acumulación de la proteína de fusión.
El RNA total de las distintas líneas fue obtenido a partir de hojas frescas de plantas transformadas con esta construcción, separado los diferentes RNAs en geles de agarosa-formamida, transfiriendo a continuación estos a filtros de nitrocelulosa para su posterior análisis. Los Northern blots sobre estos filtros, utilizando como sonda la secuencia de fusión completa (APCH1-2L21), revelaron que algunas líneas transgénicas presentaban una banda de hibridación muy intensa del tamaño esperado para el mRNA correspondiente a la proteína de fusión (Figura 2).
Posteriormente, para comprobar Ia correcta traducción y acumulación de la proteína recombinante en células de planta, se realizaron unos geles SDS-PAGE al 12% con extractos de proteína total soluble de estas líneas. Para ello se utilizó en los análisis mediante westera blot el anticuerpo monoclonal 3C9 (Ingenasa) específico del péptido 2L21. Estos análisis demostraron la presencia de una banda de aproximadamente 32 kDa, correspondiente a la proteína APCHl -2L21, en los extractos de las líneas que presentaban mayores niveles de acumulación de mensajeros.
Como se observa en la Figura 2, existe una correlación positiva entre los niveles de transcripción detectados y proteína en las líneas analizadas, de tal forma que aquellas plantas con mayores niveles de mRNAs, presentaban mayor acumulación de esta proteína. La predicción de estructura tridimensional APCHl -2L21 indica que se trata de una proteína globular, no multimérica (Figura IC). Estos resultados indican que no existen impedimentos para la transcripción y traducción de esta proteína de ñisión en el citoplasma de células de A. tholiana. 1.19 Análisis de la capacidad de unión a su antígeno diana en las células presentadoras de antígeno del anticuerpo recombinante fusionado al péptido vacunal (APCH1-2L21)
Para comprobar si Ia proteína de fusión APCH1-2L21 producida en plantas mantenía las características de reconocimiento antígénico del anticuerpo IF 12 original, se realizaron unos ensayos de fluorescencia e ínmunohisto química utilizando macrófagos alveolares porcinos, que presentan un gran número de estos receptores (SLA-DR clase II).
Para estos ensayos, se incubaron macrófagos alveolares previamente fijados con 1 μg de proteína soluble recién extraída a partir de plantas transformadas con el plásmido pBI APCH1-2L21, durante toda la noche a 40C. Posteriormente, tras lavar los macrófagos con PBS-Tween para eliminar uniones inespecíficas, se realizó una segunda incubación con el anticuerpo 3C9 específico contra el epítopo 2L21. A continuación, se reveló el inmuno-complejo de dos formas diferentes. Para la inmunofluorescencia, se utilizó un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con Alexa FluorTM488 (Molecular Probes), que marca en color verde. En el caso del mareaje con peroxidasa, se utilizó un anticuerpo anti-ratón de oveja conjugado con peroxidasa (Amersham Pharmacia), que marca en color marrón. Como control negativo se realizaron, en paralelo, la incubación de macrófagos con extractos de plantas transformadas con el plásmido pBI-TEV Vp60, en las mismas condiciones y, como control positivo, se utilizó sobrenadante (10 μg) del hibridoma que expresa el anticuerpo IFl 2.
Como resultado de este experimento, solamente se obtuvo mareaje en los macrófagos incubados con el sobrenadante del hibridoma IFl 2 y en los extractos de plantas que expresaban el APCH1-2L21, mientras que no apareció señal en el control negativo. Con ambos conjugados se encontró un patrón de mareaje específico en la superficie de los macrófagos, muy similar entre células tratadas con el sobrenadante del hibridoma y los extractos de plantas que expresaban el APCH1-2L21 (Figura 3). Estos resultados confirman la funcionalidad y actividad de la proteína de fusión APCH1-2L21 expresada en plantas, manteniendo sus características de especificidad por las moléculas SLA-DR clase II de los macrófagos alveolares porcinos.
1.20 Estudio del incremento de inmunogenicidad conferido al péptido 2L21 por el anticuerpo APCHl
Para valorar la eficacia de la molécula potenciadora de la respuesta inmune proporcionada por esta invención se inmunizaron intraperitonealmente 5 hembras de ratón por inmunógeno, de 1 1 semanas de edad y estirpe Swiss, los días 0, 7 y 14 con extractos de planta (3 mg de proteína soluble total/dosis), que expresaba la proteína recombinante objeto de estudio, el mismo péptido 2L21 fusionado a una proteína irrelevante (β-GUS) o con 100 μg de péptido 2L21 sintético. Para la primera inoculación se utilizó adyuvante completo de Freund (SIGMA) y adyuvante incompleto de Freund (SIGMA) para el resto. Diez días después de la última inmunización los ratones fueron sangrados y se procedió a la obtención de los sueros para su estudio.
Como resultado de este estudio, el péptido fusionado al anticuerpo indujo en los ratones títulos de anticuerpos 600 veces superiores a los obtenidos con el péptido sólo y más de 50 veces superiores a los obtenidos con el péptido fusionado a una proteína irrelevante (Figura 4). Estos datos confirman la hipótesis del aumento de inmunogenicidad de un péptido a través de su direccionamiento a células presentadoras de antígeno mediante el anticuerpo APCHl. Adicionalmente, en experimentos comparativos entre la inmunogenicidad de este péptido fusionado a la proteína KLH, carrier habitual de vacunas peptídicas, con la fusión al anticuerpo APCHl, pudo comprobarse que el direccionamiento del antígeno a través del anticuerpo generaba un número de moléculas de anticuerpo por molécula de péptido 26 veces superior. EJEMPLO 2. Direccionaraiento de antígenos vacunales a células presentadoras de antígeno para Ia potenciación de la respuesta inmune en animales. Fusión del anticuerpo de cadena sencilla recombinante APCHl a la proteína E2T del Virus de la Diarrea Viral Bovina y su expresión en células de mamífero
2.1 Células
Se utilizaron células CHO-Kl de mamífero (células ováricas) provenientes de la sección de Cultivo de Células del Instituto de Virología libres de virus adventicios (PVA76/04). Se utilizaron células CHOKl (Chínese Hámster Ovary cells) de mamífero
2.2 Cepas de Escherichia coíi utilizadas
Para la transformación y crecimiento de los plásmidos se usaron las cepas de Escherichia coli, DH5-α (Clontech), que presentan las siguientes características:
• Estirpe bacteriana: DH5-α
• Genotipo: supE44 hsd R17 recAl endAl gyrA96 thi-1 relAl • Unidades remarcables: Cepa deficiente en recombinación, usada para plaqueo y crecimiento de pásmidos.
2.3 Plásmidos utilizados
2.3.1 Plásmidos comerciales
Para obtener las distintas construcciones que expresaban los diferentes péptidos ensayados se utilizaron diversos plásmidos comerciales. Para el clonaje y secuenciación de productos de PCR se utilizó el plásmido pGEM-Teasy, mientras que el plásmido pcDNA 3.1 fue utilizado para la generación de la línea estable de mamíferos: • pGEM-Teasy (Promega): este plásmido está especialmente diseñado para el clonaje y secuenciación de los productos de PCR. Contiene una región con múltiples lugares de restricción (polylinker). El polylinker ha sido previamente digerido con EcoRV y posteriormente se le han añadido timidinas 3' en ambos extremos para facilitar el clonaje de los productos de PCR. Además, permite seleccionar los recombinantes por medio del gen LacZ.
• pcDNA 3.1 (Invitrogen): este plásmido es derivado del pcDNA3 y fue diseñado para la expresión transciente y estable en células de mamífero. El vector contiene los siguientes elementos.
2.3.2 Plásmidos de transformación de células de mamífero desarrollados durante Ia puesta en práctica de esta invención
Para Ia realización de este ejemplo se generó el plásmido identificado como pcDNA APCHl -E2T, el cual se utilizó en la transformación de las células CHOK-I . El antígeno expresado en dicho plásmido proviene de la fusión de APCHl con la proteína de secreción E2 sin su dominio de transmembrana (E2T) del Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB).
Las secuencias que codifican dicho antígeno y sus respectivas fusiones fueron obtenidas por amplificación mediante PCR. Los cebadores utilizados se recogen en la siguiente tabla:
Figure imgf000039_0001
Las posiciones 2-7 de la SEQ ID NO: 19 son las dianas de restricción.
Para la detección de la proteína recombinante producida en el sobrenadante de células de mamífero se utilizó un anticuerpo comercial monoclonal de ratón y un suero policlonal de conejo desarrollado específicamente para tal fin, y sus respectivos secundarios conjugados a fosfatasa alcalina (AP) y o peroxidasa (HRP):
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000040_0002
Figure imgf000040_0003
2.4 Transfección de la línea celular CHOK 1
Para la obtención de la línea estable, se utilizó el procedimiento de transfección previamente estandarizado en el laboratorio.
Se procedió a la obtención de líneas establemente transfectadas. Para ello se transfectaron con lipofectamina, frascos T-75 con monocapas de CHO-Kl a una confluencia del 80 %. Se transfectó con pcDNA E2T y pcDNAAPCHl-E2T una monocapa de células con un vector de la misma serie de pcDNA 3.1 (Invitrogen) que contenía el gen LACZ, con el fin de utilizar esta línea para chequear más fácilmente la evolución y el desarrollo de las líneas estables. A las 24 h postransfección se realizó un subcultivo de las células transfectadas a cuatro T-75 y se inició el proceso de selección adicionando al medio de cultivo el antibiótico geneticina (Invitrogen) a una concentración de 700 ug/ml. A los 14 días de cultivo fue evidente la presencia de focos de células resistentes al antibiótico de selección. En ese momento se realizó un nuevo subcultivo de las células y se inició una primera tanda de aislamiento de células individuales por dilución al límite en placas de 96 pocilios. A los 21 días de cultivo se evidenciaron nuevamente los focos y se inició una nueva tanda de dilución al límite para el aislamiento de clones individuales. El proceso de dilución al límite se repitió dos veces para cada tanda. Se utilizaron las diluciones más altas que resultaron positivos por western blot para la expresión de las proteínas recombinantes, para realizar utilizados en el segundo proceso de dilución al límite. Finalmente, los clones positivos fueron amplificados y congelados en nitrógeno líquido para su almacenamiento (Figura 5).
2.5. Detección de la proteína recombinante en las líneas celulares desarrolladas
2.5.1 Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)
La electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS- PAGE) se realizó según el método descrito por Laemmli U.K. utilizando el sistema de geles discontinuos en un equipo Mini Protean II (Bio-Rad). El mismo está compuesto por un gel de apilamiento con una concentración de poliacrilamida de 1,7 % m/v, y uno de separación, con una concentración de poliacrilamida de 8 % m/v. Las muestras se preincubaron con buffer de siembra (Buffer Tris-HCl (pH 6,8) 12,5% v/v, glicerol 10% v/v, SDS 2% m/v, β-mercaptoetanol 5% v/v, azul de bromofenol 0,2% m/v) durante 5 minutos en baño de agua hirviente. Una vez realizada la siembra, la separación electroforética fue llevada a cabo en buffer de corrida IX (Buffer de corrida 5X: Tris base 1,5% m/v, glicina 7,2% m/v, SDS 0,5% m/v) y aplicando un voltaje constante de
100 V por 4 horas.
2.5.2 Western Blot
Una vez finalizada la separación electroforética, se realizó la electro transferencia sobre membranas de PVDF de 0.45 um de tamaño de poso (Immobilon Transfer Membrana- Millipore). Esta se llevó a cabo durante 60 min a 20 V en un equipo de Mini Protean II (Bio -Rad) conteniendo solución de transferencia IX (Tris Base 25 mM, glicina 192 mM, SDS 0,15 % v/v, metanol 20 % v/v). Terminada la transferencia, la superficie de la membrana fue bloqueada con solución de bloqueo (leche descremada en polvo (Molico) 3% m/v en buffer PBS IX-Tween 0.05 % v/v) a 37°C durante 1 h. Luego se incubó O.N. a 4°C con un anticuerpo monoclonal anti-E2 (CA3- Bommelli) convenientemente diluido en solución de bloqueo. Posteriormente se incubó con un anticuerpo monoclonal anti IgG de ratón conjugado a peroxidasa (KPL) convenientemente diluido en solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 h. Luego de las incubación se realizó 3 lavados en PBS IX-Tween 0.05 % v/v de 10 min cada uno.
La membrana se incubó con el sustrato de la enzima peroxidasa, se utilizó el kit comercial Western Lighting Chemiluminescence Reagent Plus (Perkin Elmer LAS, INC.) y se siguió las recomendaciones del fabricante.
Finalmente la membrana fue expuesta en placas fotosensibles (Hyperfilm- Amersham Biosciences) y posteriormente revelada en solución de revelado radiográfico (G 150 Agfa), a continuación fue enjugada en ácido acético 2% v/v y por último fijada en solución de fijado radiográfico (G 334 Agfa),
2.5.3 Tinción con coomassie
Terminada la corrida electroferética, se sometió el gel a tinción con Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma) 0,1% m/v en una mezcla de metanol: ácido acético: agua (40: 10: 50). Para la decoloración de los geles se usó una solución decolorante (metanol: ácido acético: agua 5,0: 7,5: 87,5 respectivamente). La decoloración se realizo en agitación a temperatura ambiente.
2.5.4 ELISA sandwich para la detección de APCH1-E2T y E2T de sodrenadante de cultivo celular
Se sensibilizaron placas Maxisorp (NUNC) con el anticuerpo monoclonal 2.9H, adecuadamente diluido en buffer carbonato-bicarbonato (1.59 g/L Na2CO3, 2,93 g /L NaHCO3) a 4°C O.N. A continuación se bloqueó la placa con solución de bloqueo (PBS IX, Tween 20 0,1 % v/v; leche descremada 1% m/v) incubándola a 370C durante IHs. Posteriormente se incorporó las muestras a analizar (sobrenadante de células CHO-Kl -APCH1-E2T o bien E2T) incubando las placas a 37°C durante 1 Hs. Se lavó 5 veces y se incubó a 370C durante 1 Hs. con un suero policlonal producido en conejo contra la glicoproteína E2, en la dilución adecuada. Se lavó nuevamente 5 veces y finalmente se incorporó un anticuerpo monoclonal anti IgG de conejo conjugado a peroxidasa (KPL) diluido adecuadamente incubándolo a 37°C durante 40 minutos. Se lavo 5 veces y se colocó el sustrato de la peroxidasa (ABTS 0.55 mg/ml, H2O2 0.015%, buffer citrato (pH: 5). La reacción fue detenida con SDS 5% m/v. La lectura de las placas se realizó a 405 nm (lector de ELISA, Multiskan Ex, Labsystems Inc). Las diluciones se realizaron en solución de bloqueo, los lavados se llevaron a cabo con PBS IX y se usó un volumen de 50 ul por pocilio.
2.6 Purificación de Ia E2T de sobrenadante de células CHOKl APCH1-E2T y CHOKl E2T
Se cosechó el sobrenadante una vez formada la monocapa (usualmente 72 Hs), se agregó PMSF a una concentración final de 1 mM y se conservó hasta su utilización a - 200C.
Se descongeló el sobrenadante y se elevó la fuerza iónica del mismo con la solución de pegado-lavado 10X (NaCl 3 M, NaHPO4 0.5M). Se agregó Imidazole 20 mM y se llevó a pH: 8 con NaOH ION.
Por otro lado se equilibró el níquel con la solución de pegado-lavado IX (NaCl 0.3M, NaHPO4 0.05M) con Imidazole 20 mM, e incubó en agitación a 4°C durante 30 minutos. Se centrifugó a 2500 g durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante y se incubó el níquel con el sobrenadante O.N. a 40C en agitación.
Se centrifugó a 2500 g durante 3 minutos, se descartó el sobrenadante y se lavó con solución de pegado-lavado IX con el agregado de Imidazole 13 mM, PMSF ImM, leupeptina 1 mM a 40C durante 15 minutos hasta que la absorbancia del sobrenadante a 280 nm sea baja y constante.
Finalmente la elusión se llevó a cabo con solución de elusión (solución de pegado- lavado IX con Imidalozole 200 mM, PMSF 1 mM, leupeptina ImM) incubando a 4°C durante 15 minutos en agitación. Se centrifugó a 2500 rpm durante 3 minutos y se recuperó el sobrenadante. 2.7 Análisis inmunogénico de las proteínas expresadas en plantas
2.7.1 Inmunización de Cobayas
Se utilizaron cobayas de 200 a 300 g, cepa AL II provistos por el Bioterio del CICVyA, INTA Castelar. Se inocularon 2 dosis de 1 mi de vacuna oleosa (Acuoso: oleoso, 40 %: 60%) al día 0 y 30 por vía intramuscular (500 ul por cada pata trasera).
Previo a cada inoculación se sangró los animales por punción cardiaca, extrayendo 3 mi de sangre por animal. Se incubó a 370C durante 1 Hs. y a 40C durante 30 minutos. Se extrajo el suero por centrifugación a 1000 g por 15 minutos, se lo alicuotó y conservó a -2O0C hasta su utilización.
Durante la experimentación, los animales fueron mantenidos en grupos de a cuatro en jaulas de Im2, las cuales se mantuvieron en un recinto aislado del exterior con una atmósfera ventilada. Las camas y el agua de las jaulas se cambiaron periódicamente.
2.7.2 Inmunización de Bovinos
Se utilizaron bovinos seronegativos, no infectados pertenecientes al INTA previamente testados para demostrar su estatus sanitario por ELISA, SN y PCR.
Los bovinos fueron inmunizados con dos dosis de la vacuna a ensayar, una al tiempo inicial y la otra a los 30 días post-primo vacunación. La inmunización se realizará por la vía intramuscular. El volumen de inoculo será de 5 mi. Se tomaron muestras de sangre cada siete días post vacunación para el posterior análisis de anticuerpos en suero.
2.7.3 Obtención de los sueros.
Los sueros fueron obtenidos mediante incubación de la sangre durante 30 minutos a 370C, seguida de una incubación de 14 horas a 40C. Se separaron los coágulos sanguíneos y los sueros fueron clarificados por centrifugación a 1.500 r.p.m durante 10 minutos.
2.7.4 Seroneutralización viral (SN)
El nivel de anticuerpos neutralizantes (AN) se determinó siguiendo el protocolo de Howard y col (1987).
2.7.5 Detección de anticuerpos por ELISA
El nivel de anticuerpos se determinó utilizando un ensayo ligeramente modificado y basado en el ELISA desarrollado por Marzocca y col 2007.
2.8 Producción de la proteína APCHl E2T y E2T en las células CHOK 1
Los clones seleccionados fueron crecidos en medio MEM E (Gibco); 10 % SFB (Quiroga) y 1% de antibiótico (penicilina; estreptomicina; gentamicina). Con el fin de evaluar la producción de las proteínas recombinantes en el sobrenadante de las líneas celulares desarrolladas se crecieron las mismas en T75 (figura 6A) y en rollers (figura 6B). En cada cultivo se estudió la cinética de secreción de la proteína recombinante. Los ensayos fueron realizados por duplicado para cada uno de los grupos T75 con y sin DMSO y rollers con y sin DMSO. Para el caso de los T75 al tiempo 0 se sembraron 3 x 106 células mientras que los rollers se iniciaron con 16 x 106 de manera de mantener la relación de células por volumen entre ambos. Cada 24 hs se extrajo 1 mi y los mismos fueron conservados a -20 hasta que se realizó el ELISA. 2.9 Purificación de APCH1E2T y E2T por cromatografía de quelatos metálicos (IMAC):
Utilizando el protocolo descrito en el punto 2.3 se obtuvo la proteína APCHl -E2T en un alto grado de pureza, registrándose la aparición de una única banda para E2T y tres bandas para APCHl -E2 T, la más pesada correspondiente a la proteína de fusión, Ia intermedia probablemente trazas de BSA, y la más liviana se trata de un producto de la proteólisis de APCH1-E2T (confirmado por western blot). El rendimiento aproximado de todo el proceso fue del orden de 100 ug de proteína purificada cada 1 litro de sobrenadante (Figura 7).
2.10 Reconocimiento de APCH1-E2T a MHC clase II de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de distintas especies
Se purificaron PBMCs a partir de sangre heparinizada de distintos animales (bovino, cerdo, caballo, cabra y oveja) con Ficoll-Hypaque (Amersham). Las células obtenidas de esta manera fueron luego incubadas con PBS (control de isotipo), E2T o APCHl- E2T, y luego marcadas con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-E2 (VDVB, cepa NADL) y un anticuerpo monoclonal anti-IgG de ratón acoplado a ficoeritrina. Las células marcadas fueron analizadas en un citómetro de flujo, y los resultados se informaron como el porcentaje de células positivas, que eran aquellas células cuya intensidad de fluorescencia se encontraba en un rango de intensidades que dejaba afuera la marca correspondiente al control de isotipo. En todas las especies analizadas, la unión de APCH1-E2T fue notoriamente mayor a la obtenida para E2T.
2.11 Estudio del incremento de inmunogenicidad conferida a la proteína E2T por el anticuerpo APCHl
Con el fin de valorar la eficacia de la molécula potenciadora de la respuesta inmune proporcionada por esta invención se realizaron ensayos en un modelo experimental (cobayas) y en bovinos (target final para lo que fue desarrollada la molécula de fusión APCHl -E2T). 2.11.1 Ensayos en cobayas
Los grupos experimentales utilizados para la evaluación de la molécula APCHl -E2T se muestran en la tabla 2. Como puede observarse la proteína E2T fusionada al anticuerpo indujo en los cobayas títulos de anticuerpos neutralizantes superiores a los obtenidos con la proteína E2T (Figura 9). Grupos experimentales:
Figure imgf000047_0001
2.11.2 Ensayos en bovinos
Habiéndose obtenido la potenciación de la respuesta inmune en el modelo experimental de cobayas se procedió a evaluar la capacidad potenciadora de la molécula APCHl en bovinos. La tabla 3 presenta los grupos experimentales ensayados. En la dosis mayor (1 ugr) no se detecto diferencia entre los grupos experimentales (figura 10A); sin embargo para Ia dosis de 0,2 ugr la proteína APCHl -E2T resultó ser más eficiente que la proteína perse ya que permitió obtener una respuesta de anticuerpos específica (figura 10B). Asimismo cuando se calculó el título de anticuerpos obtenido para la dosis de 0,2 ugr se observó que solamente la molécula APCHl -E2T fue capaz de inducir anticuerpos específicos (figura 10C). Grupos experimentales:
Figure imgf000047_0002

Claims

REIVINDICACIONES
1. Construcción génica que comprende operativamente unidas al menos:
a) una secuencia nucleotídica (A) que codifica para un polipéptido de SEQ ID NO: 1 que presenta una región que reconoce a la cadena β del antígeno DR de clase II presente en la superficie de las células presentadoras de antígeno; y b) una secuencia nucleotídica (B) que codifica para un antígeno vacunal de interés, susceptible de inducir una respuesta inmune en el hospedador donde se introduzca.
2. Construcción génica, según la reivindicación 1, donde el antígeno vacunal de interés se selecciona del grupo: péptido 2L21 del parvovims canino, proteína VP60 del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo, proteína VP6 del rotavirus, proteína E2 o E2T del virus de la diarrea viral bovina o proteína hemaglutinina del virus influenza.
3. Construcción génica pBIAPCHl-2L21, según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada por comprender una secuencia nucleotídica (A) que codifica para la SEQ ID NO: 1 y una secuencia nucleotídica (B) que codifica para la SEQ ID NO: 21 correspondiente al antígeno vacunal 2L21 del parvovirus canino.
4. Construcción génica pcDNAAPCHl-E2T, según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada por comprender una secuencia nucleotídica (A) que codifica para la SEQ ID NO: 1 y una secuencia nucleotídica (B) que codifica para la SEQ ID NO: 23 correspondiente al antígeno vacunal E2T del virus de Ia diarrea viral bovina.
5. Construcción génica, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque además comprende una secuencia de ácido nucleico (C) que codifica para un péptido espaciador.
6. Construcción génica, según la reivindicación 5, caracterizada porque el péptido espaciador se selecciona entre la SEQ ID NO: 2 y/o la SEQ ID NO: 3.
7. Construcción génica, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque además comprende una secuencia de ácido nucleico (D), que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificación, situada aguas abajo del extremo 3' de la secuencia nucleotídica (B).
8. Construcción génica, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque además comprende secuencias promotoras, secuencias codificantes para reguladores transcripcionales, secuencias de unión a ribosomas (RBS) y/o secuencias terminadoras de transcripción.
9. Construcción génica, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque además comprende un marcador seleccionado entre genes de resistencia a antibióticos y/o genes de resistencia a compuestos tóxicos.
10. Vector recombinante de expresión, útil para transformar células vegetales o células animales en general y humanas en particular, caracterizado por comprender alguna de las construcciones génicas de las reivindicaciones 1 a 9.
1 1. Vector recombinante de expresión, según la reivindicación 10, caracterizado por ser Agrobacterium tumefaciens.
12. Vector recombinante de expresión, según la reivindicación 10, caracterizado por ser un virus, preferentemente Baculovirus.
13. Célula transformada o transfectada con el vector de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizada por comprender en su genoma alguna de las construcciones génicas de las reivindicaciones 1 a 9.
14. Planta transgénica transformada o transfectada con el vector de las reivindicaciones 10 ó 1 1 caracterizada por comprender en su genoma alguna de las construcciones génicas de las reivindicaciones 1 a 9.
15. Célula animal transgénica transformada o transfectada con el vector de las reivindicaciones 10 ó 12 caracterizada por comprender en su genoma alguna de las construcciones génicas de las reivindicaciones 1 a 9.
16. Proteína de fusión codificada por alguna de las construcciones génicas de las reivindicaciones 1 a 9 capaz de producir una respuesta inmune en el hospedador donde se introduzca.
17. Proteína de fusión APCHl -2L21, según la reivindicación 16, caracterizada por comprender una secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 (A) y una secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 21 (B) correspondiente al antígeno vacunal 2L21 del parvovirus canino.
18. Proteína de fusión APCHl -E2T, según la reivindicación 16, caracterizada por comprender una secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 (A) y una secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 23 (B) correspondiente al antígeno vacunal E2T del virus de la diarrea viral bovina.
19. Vacuna que comprende alguna de las proteínas de fusión de las reivindicaciones 16 a 18 y, opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
20. Método de tratamiento o prevención de enfermedades que comprende la administración a un individuo o a un animal de una cantidad farmacéuticamente aceptable de la vacuna de la reivindicación 19.
21. Método según la reivindicación 20, caracterizado porque la administración se lleva a cabo por vía oral, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102943087A (zh) * 2012-11-26 2013-02-27 中国农业科学院上海兽医研究所 兔出血症病毒新型亚单位疫苗及其制备方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
AU2016381964B2 (en) 2015-12-30 2024-02-15 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof
WO2021072265A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2304813A1 (es) * 2003-12-16 2008-10-16 Instituto Nacional De Investigacion Y Tecnologia Agraria Y Alimentaria (Inia) Proteina de fusion con direccionamiento de antigenos vacunales a celulas presentadoras de antigeno y sus aplicaciones.

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040146948A1 (en) * 2002-10-18 2004-07-29 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology Compositions and methods for targeting antigen-presenting cells with antibody single-chain variable region fragments

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2304813A1 (es) * 2003-12-16 2008-10-16 Instituto Nacional De Investigacion Y Tecnologia Agraria Y Alimentaria (Inia) Proteina de fusion con direccionamiento de antigenos vacunales a celulas presentadoras de antigeno y sus aplicaciones.

Non-Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Gene transfer to plants", 1999, article "Ingenieria genetica y transferencia génica", pages: 283 - 316
BECHTOLD N.; PELLETIER G.: "In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration", METHODS MOL. BIOL., vol. 82, 1998, pages 259 - 266, XP000914126
BIRNBOIN H.C.; DOLLY J.: "A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA", NUCL. ACID RES., vol. 7, 1979, pages 1513 - 1516
BOYLE J.S. ET AL.: "Enhanced responses to a DNA vaccine encoding a fusion antigen that is directed to sites of immune induction", NATURE, vol. 392, no. 6674, 26 March 1998 (1998-03-26), pages 408 - 411, XP000914533, DOI: doi:10.1038/32932
BULLIDO, R. ET AL.: "Characterization of five monoclonal antibodies specific for swine class II major histocompatibility antigens and crossreactivity studies with leukocytes of domestic animals", DEVELOPMENTAL & COMPARATIVE IMMUNOLOGY., vol. 21, no. 3, 1997, pages 311 - 322, XP009130332 *
CLOUGH S.J.; BENT A.F.: "Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana", PLANT. J., vol. 16, 1998, pages 735 - 743, XP002132452, DOI: doi:10.1046/j.1365-313x.1998.00343.x
CLOUGH, S.J.; BENT, A.F.: "Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana", PLANT J., vol. 16, 1998, pages 735 - 743, XP002132452, DOI: doi:10.1046/j.1365-313x.1998.00343.x
FIEDLER, U.; CONRAD, U.: "High-level production and long-term storage of engineered antibodies in transgenic tobacco seeds", BIOTECHNOLOGY (NY.), vol. 13, 1995, pages 1090 - 1093, XP002033957, DOI: doi:10.1038/nbt1095-1090
GIL F.; BRUN A.; WIGDOROVITZ A.; MARTINEZ-TORRECUADRA J.L.; CATAL6 R.; CASAL I.; SALINAS J.; BORCA M.V.; ESCRIBANO J. M., FEBS LETTERS, vol. 488, 2001, pages 13 - 17
GIL, F. ET AL.: "High-yield expression of a viral peptide vaccine in transgenic plants", FEBS LETTERS., vol. 488, no. 1-2, 12 January 2001 (2001-01-12), pages 13 - 17, XP027292205 *
HANAHAN: "Studies on transformation of E. coli with plasmids", J. MOL. BIOL., vol. 166, 1983, pages 557 - 580, XP026026690, DOI: doi:10.1016/S0022-2836(83)80284-8
HAUGHN; SOMERVILLE: "Sulfonylurea resistant mutants of Arabidopsis thaliana", MOLEC. GENERAL GENETICS, vol. 204, 1986, pages 430 - 434, XP000572737, DOI: doi:10.1007/BF00331020
HELLENS R.; MULLINEAUX P.: "A guide to Agrobacterium binary Ti vectors", TRENDS IN PLANT SCIENCE, vol. 5, 2000, pages 446 - 451, XP002909175, DOI: doi:10.1016/S1360-1385(00)01740-4
LOGEMANN J.; SCHELL J.; WILLMITZER L.: "Improved method for the isolation of RNA from plant tissues", ANAL. BIOCHEM., vol. 163, 1987, pages 16 - 20, XP024822652, DOI: doi:10.1016/0003-2697(87)90086-8
LOPEZ DE TURISO, J.A.; CORTÉS, E.; MARTINEZ, C.; RUIZ DE YBANEZ, R.; SIMARRO, I.; VELA, C.; CASAL, J. VIROL., vol. 66, 1992, pages 2 748 - 2753
MURASHIGE T.; F. SKOOG: "A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures", PHYSIOL. PLANT., vol. 15, 1962, pages 473 - 497
OSTACHUK, A. ET AL.: "Expression of a SCFV-E2T fusion protein in CHO-Kl cells and alfalfa transgenic plants for the selective directioning to antigen presenting cells", 8TH INTERNATIONAL VETERINARY IMMUNOLOGY SYMPOSIUM, 15 August 2007 (2007-08-15), OURO PRETO, BRASIL, pages 124 - 125, XP025987732, Retrieved from the Internet <URL:http://www.bs.izs.it/Referenza/Benessere/Articoli/program.pdf>.> *
SAMBROOK ET AL.: "Molecular cloning, a Laboratory Manual", vol. 1-3, 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
See also references of EP2298910A4
UENO, A. ET AL.: "T-cell immunotherapy for human MK-1-expressing tumors using a fusion protein of the superantigen SEA and anti-MK-1 scFv antibody", ANTICANCER RESEARCH., vol. 22, 2002, pages 769 - 776, XP008116933 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102943087A (zh) * 2012-11-26 2013-02-27 中国农业科学院上海兽医研究所 兔出血症病毒新型亚单位疫苗及其制备方法

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