CN101970666A - 将疫苗抗原指向抗原呈递细胞的融合蛋白及其应用 - Google Patents

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奥格斯坦·奥斯塔查克
马里亚诺·菲尔曼拉佩雷斯
耶维尔·多明格斯
卡门·努内兹塞拉诺
玛里亚·何塞·杜斯桑托斯
科瓦东加·阿隆索马蒂
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Abstract

将疫苗抗原指向抗原呈递细胞的融合蛋白及其应用。本发明涉及基因构建体，其包括操作性结合的至少一个编码具有SEQ ID NO：1的多肽的核苷酸序列(A)，所述多肽具有识别抗原呈递细胞表面上存在的II型DR抗原的β链的区域；和一个编码目的疫苗抗原的核苷酸序列(B)。另外，本发明涉及有效用于表达本发明的基因构建体的重组载体，用所述载体转化或转染的转基因细胞和植物，由本发明的基因构建体编码的融合蛋白和包含所述融合蛋白的疫苗。

Description

将疫苗抗原指向抗原呈递细胞的融合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及基于融合蛋白合成来将疫苗抗原指向抗原呈递细胞的方法，所述融合蛋白包括：具有识别抗原呈递细胞表面上存在的表位的区域的多肽，和作为目的疫苗抗原的另一种多肽。
发明背景
在不同表达系统，诸如细菌、真菌、酵母、植物、昆虫细胞和幼虫、哺乳动物细胞等中获得疫苗意义的重组产物已经已知一段时间。在这些系统中，植物与其他表达系统相比，提供许多优势，因为，通常，它们代表经济、安全且易得的在不需要昂贵的发酵系统的条件下获得潜在有药物意义的蛋白，例如，重组亚单位疫苗的方法。
然而，在所有系统中，由病原体的重组亚单元获得疫苗中的主要限制是获得的重组产物的低免疫原性；结果，为了与使用常规免疫原(完全失活的病原体)获得的免疫应答相等，通常需要非常高的、重复的疫苗剂量。这种情形使得重组亚单位疫苗与常规疫苗相比，生产成本非常高，并且因此它们中的许多目前没有上市。
为了提高重组亚单位疫苗的免疫原性，已经进行了不同的改变。其中之一基于CTLA4-型和L-选择蛋白-型分子将疫苗抗原指向小鼠抗原呈递细胞的应用[Boyle J.S.等，Enhanced responses to a DNA vaccine encoding afusion antigen that is directed to sites of immune induction(针对编码被指引到免疫诱导位点的融合抗原的DNA疫苗的增强的反应).Nature(自然).1998年3月26日；392(6674)：408-411]。然而，这些策略尚未在除鼠科物种以外的其他物种中证明同等有效，这使得需要搜索基于在其他物种，特别在人类物种中将疫苗抗原指向负责抗原呈递的细胞的其他备选方案。
发明概述
本发明涉及作为现有技术中存在的那些方式的备选方案的一种方法，该方法在重组亚单位疫苗应用于不同物种，一般地动物和具体地人二者时，增加其效力。利用本发明基于将抗原指向其呈递细胞的方法，可能增强宿主介导的免疫应答，同时减小应用的疫苗剂量，从而引起等于或超过由应用常规疫苗获得的免疫应答。
因此，本发明提议的用于将疫苗抗原指向抗原呈递细胞的系统包括融合蛋白，所述融合蛋白包括至少一种多肽(A)，其具有识别抗原呈递细胞表面上存在的表位的区域，和另一种多肽(B)，即目的疫苗抗原，其负责触发宿主中的免疫应答。
在本发明的具体实施方案中，多肽(A)包括识别II型DR抗原β链的区域(区域D)。所述多肽是单链(scFv)重组APCH1(“抗原呈递细胞归巢1”)抗体，其特征在于SEQ ID NO：1，源自单克隆抗体1F12。因此，多肽(A)由单克隆抗体1F12的重链(VH)可变区，通过柔性肽与单克隆抗体1F12的轻链(VL)可变区融合而形成。单克隆抗体1F12在大量物种中识别II型DR抗原的β链；因此，其应该适合于多种物种，包括人类。
在本发明的另一个具体实施方案中，肽(B)(目的疫苗抗原)是针对犬细小病毒(CPV)疫苗肽，称为2L21(SEQ ID NO：21)，来自牛病毒性腹泻病毒的蛋白E2T(SEQ ID NO：23)或E2，来自兔出血症病毒的蛋白VP60，来自轮状病毒的蛋白VP6或来自流感病毒的血细胞凝集素蛋白。
2L21由远离来自CPV衣壳的蛋白VP2的氨基端区域的2个抗原亚位点形成，且以前作为第一合成疫苗肽公开(López de Turiso，J.A.，Cortés，E.，Martínez，C.，Ruiz de Ybánez，R.，Simarro，I.，Vela，C.，Casal，I.(1992)J.Virol.(病毒学杂志)66：2748-2753)。与APCH1融合的肽2L21已经植物中表达。此外，所述肽2L21已经在植物中未融合地表达，或融合于从免疫原观点来看无关的蛋白(β-葡糖醛酸糖苷酶，GUS)，其中的表达已经在此前成功地在本发明人的实验室中进行(Gil F.，Brun A.，Wigdorovitz A.，Martínez-Torrecuadra J.L.，CataláR.，Casal I.，Salinas J.，Borca M.V.和Escribano J.M..FEBS Letters(FEBS快报)488：13-17，2001)。融合蛋白2L21-GUS是非常稳定的蛋白，其具有低降解率且优选适合在植物中表达。
因此，本发明提供将疫苗抗原指向其呈递细胞的方法，其包括融合蛋白，诸如例如APCH1-2L21或APCH1-E2T，其包括分别与疫苗肽2L21或E2T融合的APCH1。如下解释地，融合蛋白APCH1-2L21在植物中表达，由此导致转基因拟南芥(Arabidposis thaliana)植物，且融合蛋白APCH1-E2T在哺乳动物细胞中表达。
而且，证明融合蛋白APCH1-2L21保持肽2L21的抗原性和免疫原性特征，包括由口服途径以及腹膜内、静脉内、肌内或皮下途径免疫的动物组中特异性抗体的高效价(title)，其比由单独的合成肽2L21或与GUS融合的合成肽2L21(2L21-GUS)诱导的效价高得多。这些结果显示融合蛋白APCH1-2L21增强动物中的免疫应答，这验证疫苗抗原通过借助于具有识别抗原呈递细胞表面上存在的表位的区域(A)的多肽将其指向抗原呈递细胞而引起疫苗抗原免疫原性增加的假说。
由本发明提供的指导疫苗抗原的系统表现出许多优势，因为其使得可能指导融合的疫苗抗原靠近抗原呈递细胞，由此促进疫苗抗原的捕获和增强免疫应答。这减小待施用的来自病原体的重组亚单位疫苗的剂量，从而在动物和人二者中，获得等于或大于使用来自完整病原体的常规疫苗获得的免疫应答的免疫应答。
附图说明
图1是质粒pBI APCH1-2L21的基因表达构建体的示意图。
图1A：示意性显示在拟南芥核基因组中整合的基因表达构建体，其包括APCH1的核苷酸序列，其由花椰菜花叶病毒的35S组成型启动子(CaMV35S)引导[LB：左边缘；RB：右边缘；APCH1-肽2L21：编码融合蛋白APCH1-2L21的融合；NOS-Ter：受胭脂氨酸合酶启动子控制的聚腺苷酸化序列(NOS-Pro)；NPT II(Kan R)：卡那霉素抗性基因。
图1B：显示关于融合蛋白APCH1-2L21预期的三维结构，其获自“Swiss-蛋白(Swiss-protein)”，其中可以观察到2个独立的折叠球状结构域(VH和VL)。
图2图示与scFv APCH1融合的抗原2L21在一些表达所述融合蛋白(APCH1-2L21)的品系中表达的分析。
图2A：显示Northern印迹法分析转基因拟南芥植物中融合基因(APCH1-2L21)转录的结果，5μg总RNA/植物品系，使用以32P作为探针标记的APCH1-2L21融合的完整DNA序列杂交。
图2B：显示Western印迹法分析由通过Northern印迹法分析的拟南芥不同转基因品系的新鲜叶片提取的蛋白提取物(40μg总可溶性蛋白)的结果。
图3显示用过氧化物酶(I)和用荧光标记(II)特异性标记猪尘细胞表面的结果。
图I：(a)用植物提取物温育的巨噬细胞(阴性对照)；(b)标记用抗体1F12获得的巨噬细胞的细胞表面；(c)使用总可溶性蛋白提取物(其包含融合蛋白APCH1-2L21)获得的标记。
图II：使用对照提取物(1)，抗体1F12(2)和表达融合蛋白APCH1-2L21的植物提取物(3)温育的细胞的低倍放大图。(b和c)：分别用单克隆抗体1F12和用融合蛋白APCH1-2L21获得的细胞标记的高倍放大图的细节。
图4显示分析使用多种来自CPV的肽2L21的制剂获得免疫应答的结果的柱形图，具体地，通过使用肽2L21本身(2L21)，与抗体APCH1融合(APCH1-2L21)或与β-GUS(2L21-GUS)蛋白融合免疫小鼠获得的特异性抗体免疫应答。
图5生产表达APCH1-E2T和E2T的稳定CHOK1(哺乳动物卵巢细胞)细胞系。该图的更详细解释可以参见实施例2第2.4点。
图6评估形成的细胞系上清液中重组蛋白的生产。该测定针对每组一式两份地进行，其在有和无DMSO的培养瓶(T75)中，和在有和无DMSO的瓶(滚筒)中进行。在T75情形中，在时间0接种3×106个细胞，而滚筒以16×106个细胞开始，由此保持二者之间的细胞/体积比。每24h提取1ml，且它们保存在-20℃直至进行ELISA。该附图的更详细解释可以参见实施例2的第2.8点。
图6A：组织培养瓶(T75)中的细胞系生长。
图6B：“滚筒”瓶中的细胞系生长。
图7用考马斯染色和APCH1-E2T和E2T的Western印迹法。该附图的更详细解释可以参见实施例2的第2.9点。
图8APCH1-E2T对单核细胞的MHCII(主要组织相容性复合物)的识别。MHCII是编码参与抗原呈递和加工至T淋巴细胞的机制的某些质膜糖蛋白、以及细胞因子和补体系统蛋白(其在免疫学反应中是相关的)的基因家族。
图9使用实验分子免疫的豚鼠中的免疫应答。Lac-z基因编码β-半乳糖苷酶，即将乳糖转化为葡萄糖和半乳糖的酶，并用作阴性对照。位于该附图中的DPV术语指接种疫苗后的天数。
图10用表达蛋白APCH1-E2T和E2T的培养上清免疫的牛中的免疫应答。
图10A：用1μgAPCH1-E2T或E2T免疫的牛。
图10B：用0.2μg APCH1-E2T或E2T免疫的牛。
图11用0.2μg APCH1-E2T或E2T接种疫苗的牛中的抗体的效价。
发明详述
本发明涉及DNA构建体，即下文中的本发明的DNA构建体，其包括直接或间接地操作性结合的至少：
a)一个核酸序列(A)，其编码包括识别抗原呈递细胞表面上存在的表位的区域的多肽；和
b)一个核酸序列(B)，其包括编码目的疫苗抗原的核苷酸序列，其负责触发宿主中的免疫应答。
核酸序列(A)编码包括识别抗原呈递细胞表面上存在的表位的区域的多肽。实际上，包括识别抗原呈递细胞表面上存在的表位的区域的任何多肽可以用于本发明中，诸如，例如，采用其单链(scFv)、双功能性(双抗体)或完整(Fab+Fc)形式的单克隆抗体，或其片段。然而，在本发明的具体实施方案中，核酸序列(A)编码APCH1多肽(SEQ ID NO：1)，其包括识别II型DR抗原的表位(链β)的区域。II型在免疫系统细胞中作为表面多肽表达且包括HLAD抗原(人白细胞抗原D)，进一步分类为DR(DRA和DRB)，DQ和DP。所述多肽是单链重组抗体，其源自单克隆抗体1F12，包括单克隆抗体1F12的重链(VH)可变区，其通过柔性肽(接头或铰合部)与单克隆抗体1F12的轻链(VL)可变区融合。VL编码序列的3’末端与所述接头的编码序列的5’末端结合且编码所述接头的核苷酸序列的3’末端与VL编码序列的5’末端结合。scFv APCH1以这样的方式设计，即可以在VL的3’末端处添加一个或多个限制序列，从而能够进行与待测定抗原的不同融合，且其在VH的5’末端处包含限制序列(XbaI)，这使其可能从它们所在的质粒容易地获得融合并将它们运送至植物转化质粒。
单克隆抗体1F12在大量动物物种中识别II型DR抗原的β链并因此可以应用于多种物种，包括人类。由于其特性，采用其任何形式(scFv、双功能性或完整)的所述抗体可以指导与其融合的疫苗肽靠近在表面上表现出此类分子的抗原呈递细胞，由此促进抗原的捕获和增强反应，因为大部分表达的蛋白应该在降解前到达其目的地。由此，可能补偿由转基因植物或动物呈递的低异种蛋白(病原体的重组亚单位疫苗)累积水平，或补偿其他系统中的生产成本。
核酸序列(B)编码目的疫苗抗原，不考虑其来源(真核，原核，病毒等)，实际上其可以是易于以重组形式表达和易于诱导宿主中免疫应答的任何肽或蛋白，无论是一般地动物或具体地人类。以下，我们提供许多可以起目的疫苗抗原作用的实例：来自CPV的肽2L21，来自兔出血症病毒(RHDV)的蛋白VP60，来自轮状病毒的蛋白VP6，来自牛病毒性腹泻病毒的蛋白E2或E2T，针对肿瘤和肿瘤细胞的疫苗抗原，等。
在优选的实施方案中，核酸序列(A)不是直接融合于核酸序列(B)，而代替地，其有利地在核酸序列(A)的3’末端和核酸序列(B)的5’末端之间引入间隔肽(接头)。因此，如果需要，则本发明的DNA构建体可以另外地包含核酸序列(C)，其包含编码位于所述核酸序列(A)和(B)之间的间隔肽的核苷酸序列，其中所述核酸序列(C)的5’末端结合所述核酸序列(A)的3’末端且述核酸序列(C)的3’末端结合所述核酸序列(B)的5’末端。有利地，所述间隔肽(C)是具有结构柔性的肽。实际上，可以使用任何具有结构柔性的肽。为了举例说明的目的，所述柔性肽可以包含氨基酸残基，具体地Gly和Ser残基的重复序列，或任何其他合适氨基酸残基的重复序列。在具体的实施方案中，所述柔性间隔肽选自序列SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3。
为了促进由本发明的方法获得的融合肽或蛋白的分离和纯化，本发明的DNA构建体可以包含，如果需要，编码易于用于分离或纯化融合肽或蛋白目的的肽的核酸序列。因此，在具体的实施方案中，本发明的DNA构建体包括，如果需要，核酸序列(D)，其包含编码易于用于分离或纯化目的的肽的核苷酸序列。所述核酸序列(D)可以位于任何不改变包括识别抗原呈递细胞表面上存在的表位的区域的多肽或目的多肽功能性的位置。为了举例说明的目的，所述核酸序列(D)可以位于所述核酸序列(B)的3’末端的下游。
实际上，可以使用容许分离或纯化所述融合肽或蛋白的任何肽或肽序列；例如，多组氨酸序列，易于被可以起通过免疫亲合层析法纯化由此产生的融合蛋白作用的单克隆抗体识别的肽序列，诸如标签肽，等；例如，源自流感病毒的血细胞凝集素蛋白的表位或C-myc表位，等。
本发明的DNA构建体可以利用本领域中公知的技术来获得[Sambrook等，“Molecular cloning，a Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)”，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，N.Y.，1989，卷1-3]。所述本发明的DNA构建体可以整合，操作性结合，编码一个或多个目的产物的核苷酸序列的表达调节序列，由此构成基因表达构建体。如本说明书中所使用地，表述“操作性结合”意指一个或多个目的产物在表达调节或控制序列的控制下在正确读框中表达。
因此，在优选的实施方案中，本发明的基因构建体包括，操作性结合的编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列的表达控制序列。控制序列是控制和调节所述融合蛋白的转录和，如果适合，翻译的序列，且包括启动子序列、编码转录调节子的序列，核糖体结合序列(RBS)和/或转录终止序列。在具体的实施方案中，所述表达控制序列在原核细胞和生物体，例如，细菌等中具有功能，而在另一个具体实施方案中，所述表达控制序列在真核细胞和生物体，例如，昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞等中具有功能。由本发明提供的基因表达构建体中可以存在的启动子的示范性实例包括植物的CaMV 35S启动子，杆状病毒系统的多角体蛋白启动子或p10蛋白，DNA疫苗的早期巨细胞病毒启动子，合成早期/完全痘病毒启动子，等。
有利地，所述基因表达构建体另外包括标记物或基因，其编码容许选择由所述基因表达构建体转化的宿主细胞的基序或表型。本发明的基因表达构建体中可以存在的所述标记物的示范性实例包括抗生素抗性基因，赋予针对毒性化合物的抗性的基因，且一般地，使可能选择遗传转化的植物的所有那些。
本发明的DNA构建体，或由本发明提供的基因表达构建体，可以插入到适合的载体中。因此，本发明的另一方面涉及载体，诸如表达载体，其包括所述DNA构建体。所述载体的选择应该取决于其将随后引入的宿主细胞。为了举例说明的目的，其中引入所述DNA序列的载体可以是质粒或这样的载体，即其在引入宿主细胞时，整合或不整合到所述细胞的基因组中。所述载体可以通过本领域中技术人员已知的常规方法获得[Sambrook等，1989，引用见上]。在具体的实施方案中，所述重组载体是有效用于转化或被插入植物细胞或动物细胞的载体。因此，本发明的载体可以是，例如，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或能够感染或被表达在动物细胞(诸如例如，哺乳动物或昆虫细胞)或植物细胞中的病毒载体。在本发明的具体实施方案中，所用的病毒载体是杆状病毒(Baculovirus)。
所述载体可以用于转化、转染或感染易于由此被转化、转染或感染的细胞。因此，本发明的另一方面涉及用本发明提供的病毒载体感染的细胞。在具体的实施方案中，所述感染的细胞是用合适病毒载体感染的植物细胞，所述感染的植物细胞能够表达由本发明提供的融合蛋白。用重组病毒载体感染的植物细胞可以遵从使用所述重组病毒载体对植物的感染来获得。因此，植物感染性病毒载体可以用于在植物中表达动物病原体或肿瘤细胞的表位，从而生产抗所述病原体或肿瘤细胞的可食用疫苗。
另外，由本发明提供的重组载体可以用于转化或转染真核细胞或原核细胞。因此，本发明的另一方面涉及转化或转染的细胞，其包括所述重组载体，或由本发明提供的所述DNA构建体，或由本发明提供的所述基因表达构建体。转化或转染的细胞可以通过本领域中技术人员已知的常规方法获得[Sambrook等，1989，引用见上]。
在具体的实施方案中，所述重组载体是病毒载体。本发明的重组载体能够感染或被表达在植物细胞、藻类细胞或动物细胞中，优选在昆虫细胞或昆虫幼虫细胞中。
因此，本发明的另一方面涉及转化的或转染的细胞，其至少包括，本发明的DNA构建体，或由本发明提供的重组载体，或由本发明提供的基因表达构建体。
本发明的另一方面涉及转基因细胞，其包括，插入其基因组中的至少一个本发明的DNA构建体。在具体的实施方案中，所述转基因细胞来自植物细胞，且包括，插入其基因组中或叶绿体的基因组中的，至少一个本发明的DNA构建体。转基因植物可以获自所述转基因植物细胞或获自转基因植物材料。因此，本发明的另一方面涉及转基因植物，其至少包括一种由本发明提供的植物转基因细胞。如公知地，转基因植物的潜在目的应用是在植物中表达动物病原体的或肿瘤细胞的蛋白或表位，由此生产针对所述病原体或肿瘤细胞的可食用疫苗。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述转基因细胞是动物细胞，优选来自哺乳动物或昆虫，且更优选，来自昆虫幼虫。因此，本发明还涉及转基因非人动物，具体地，以高产率表达目的肽或目的蛋白的转基因哺乳动物、昆虫或昆虫幼虫。
本发明的DNA构建体可以用于生产在本发明中描述的融合蛋白。因此，本发明的另一方面涉及生产所述融合蛋白的方法，其包括在容许生产所述融合蛋白的条件下培养由本发明提供的细胞或生物体。用于最优化所述细胞或生物体培养的条件应该取决于所用的细胞或生物体。如果需要，由本发明提供的生产目的产物的方法还包括分离和纯化所述融合蛋白。
本发明的另一方面还提供在植物中表达编码由本发明提供的融合蛋白的基因的方法，其包括用至少一种由本发明提供的DNA构建体转化所述植物。来自植物组织的细胞的转化可以通过常规方法进行。关于基因转移至植物，包括载体，DNA转移方法等的综述，参见例如，标题为“Ingenieríagenética y transferencia génica”[Genetic Engineering and Gene Transfer(遗传工程和基因转移)]，Marta Izquierdo，Ed.Pirámide(1999)的书，具体地第9章，标题为“基因转移至植物”，第283-316页。
本发明的另一方面涉及可以通过表达由本发明提供的DNA构建体中包含的核苷酸序列获得的融合蛋白。更特别地，本发明提供融合蛋白，其包括：
(A)具有识别抗原呈递细胞表面上存在的表位的区域的多肽，和
(B)目的疫苗抗原。
在具体的实施方案中，本发明提供融合蛋白，其包括：
(A)选自由以下各项形成的组的多肽：完整单克隆抗体1F12；单克隆抗体1F12片段，其包含识别II型DR抗原的β链的区域；采用双功能性形式的单克隆抗体1F12和重组scFv，其包含单克隆抗体1F12的重链(VH)可变区，其通过柔性肽与单克隆抗体1F12(APCH1)的轻链(VL)可变区融合；和
(B)目的疫苗抗原。
由本发明提供的融合蛋白可以还包含，如果需要，在包括识别抗原呈递细胞表面上存在的表位的区域的多肽和目的多肽之间的间隔肽；和/或设计用于促进所述融合蛋白的分离或纯化的肽。
一般地，由本发明提供的融合蛋白，具体地，当包括识别抗原呈递细胞表面上存在的表位的区域的多肽是scFv时，其是相对的小分子且通常保持该包括识别抗原呈递细胞表面上存在的表位的区域的多肽源自的原始抗体的结合特异性，并且不需要完整抗体的复杂装配过程。另一方面，由于其小尺寸，它们具有更大的组织渗透性。
本发明的另一方面涉及重组疫苗，其包括由本发明提供的融合蛋白和，任选地，药用赋形剂。
进行的测定(见实施例)显示由本发明提供的融合蛋白增强动物中的免疫应答，因为其诱导比使用疫苗肽本身或与无关蛋白融合的疫苗肽获得的大得多的抗体效价，由此验证疫苗肽通过使用多肽将其指向抗原呈递细胞而增加免疫原性的假说，所述多肽包括识别抗原呈递细胞表面上存在的表位的区域，诸如scFv APCH1。
因此，由于其指导融合的疫苗抗原靠近在其表面上表现出相应表位的抗原呈递细胞，所以由本发明提供的指导疫苗抗原的系统促进疫苗抗原的捕获且增强免疫应答，因为大部分表达的蛋白在被降解前到达其目的地；此外，这防止疫苗抗原在受到负责将其呈递至免疫系统并因此产生保护性免疫应答的细胞处理前，被从血流中消除。由于将疫苗抗原指向抗原呈递细胞，其大部分正确呈递至免疫系统；结果是强有力的免疫应答，其根据具体的情形，应该是，通过疫苗抗原本身获得的至少50倍(在特异性抗体的效价方面)。因此，该发明通过免疫学改进在任何系统中生成的重组亚单位疫苗。
生物材料的保藏
质粒pBIAPCH1-2L21：于12.12.2003，保藏在西班牙典型培养物中心(CECT)，Burjassot，巴伦西亚，保藏号为CECT：5857。
质粒pcDNAAPCH1-E2T：于05.03.2008，保藏在西班牙典型培养物中心(CECT)，Burjassot，巴伦西亚，保藏号为CECT：7387。
以下提供的实施例起举例说明本发明的作用且不应该被认为限制其范围。
实施例
实施例1.将疫苗抗原指向抗原呈递细胞以增强动物中的免疫应答。单链重组抗体APCH1(SEQ ID NO：1)与肽2L21的融合及其在转基因植物中的表达
1.1植物材料
使用的模型植物是拟南芥，哥伦比亚生态型。拟南芥属属于十字花科(Brassicaceae或Cruciferae)。
1.2使用的细菌菌株
1.2.1大肠杆菌(Escherichia coli)
大肠杆菌的菌株DH5-α和TOP-10(Clontech)，其表现出以下特征，用于质粒的转化和生长：
1.2.2根癌土壤杆菌
使用根癌土壤杆菌菌株C58C1和AGL05-α(Hellens R.和Mullineaux P.A guide to Agrobacterium binary Ti vectors(土壤杆菌双元Ti载体指南).Trends in Plant Science(植物科学趋势)5：446-451，2000)浸润拟南芥花。
1.3使用的质粒
1.3.1商业质粒
为了获得表达不同测定肽的不同构建体，使用不同商业质粒。质粒pGEM-Teasy用于PCR产物的克隆和测序，而双元质粒PBI-121及其衍生物用于转化土壤杆菌和随后浸润拟南芥植物。
pGEM-Teasy(Promega)：该质粒特别设计用于PCR产物的克隆和测序。其包含多限制性位点(多接头)区域。所述多接头已经预先使用EcoRV消化并随后在两末端添加3’-胸苷，从而促进PCR产物的克隆。而且，其使得可能借助于LacZ基因选择重组体。
pBI-121(Clontech Cat.6018-1)：源自质粒pBI-101。其含有花椰菜花叶病毒的35S启动子(CaMV 35S)并指导GUS基因和包含土壤杆菌质粒Ti的胭脂氨酸合酶(NOS-ter)的聚腺苷酸化序列的260-bp(碱基对)片段的表达。其还含有RK2复制原(具有少量拷贝)和卡那霉素抗性基因(Npt2)。
除这些商业质粒外，还使用质粒p35S-TEV(4,051bp)，其在Escribano博士实验室生成(National Institute for Agricultural Research(国家农业研究所)[INIA])并源自质粒pBI121[Escribano博士实验室收集(INIA)]，包含花椰菜花叶病毒的35S启动子(CaMV 35S)，烟草斑纹病毒的转录增强序列(TEV)，其后出现多克隆区和Vsp聚腺苷酸化信号。该质粒在双元质粒中重新用于亚克隆一些构建体，作为对其进行克隆之前的步骤。这两种质粒在本发明人的实验中可供公众获得并且不是本发明要求保护的一部分。
1.3.2执行本发明过程中开发的植物转化质粒
关于该实施例的实施方案，生成鉴定为pBI APCH1-2L21的质粒，其用在植物的遗传转化中。所述质粒pBI APCH1-2L21中表达的抗原是APCH1与来自犬细小病毒(CPV)的肽2L21的融合。
编码所述抗原及其各自融合的序列借助于PCR扩增获得。使用两种类型的商业聚合酶，即ECOTAQ(Ecogen)，其主要用于菌落分析，和PowDNA-聚合酶(Roche(罗氏))，其表现出校正活性并用于扩增转基因序列。使用的引物显示在表1中。SEQ ID NO：4的位置1-6；SEQ ID NO：5的位置1-6；SEQ ID NO：6的位置2-7和SEQ ID NO：9的位置1-18是限制性靶标。SEQ ID NO：7的位置1-35和SEQ ID NO：8的位置1-32代表在scFv(APCH1)中起结合作用的人造柔性序列。
表1
使用的引物
引物名称   5’-3’序列
  2L21 XhoI   SEQ ID NO：4
  2L21 SmaI   SEQ ID NO：5
  5’VH XbaI   SEQ ID NO：6
  3’VH接头   SEQ ID NO：7
  5’VL接头   SEQ ID NO：8
  3’VL   SEQ ID NO：9
1.4抗体
为了检测植物中产生的不同重组抗原，使用不同商业小鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体，和与碱性磷酸酶(AP)和/或过氧化物酶(HRP)缀合的各自的第二抗体。
表2
单克隆抗体(小鼠)   特异性   应用   供应商
  3C9   抗-2L21CPV   WB/ELISA   Ingenasa
Figure BPA00001223719900141
缀合的第二抗体   供应商
  与AP缀合的抗-小鼠   Biorad
  与HRP缀合的抗-小鼠   Amersham
*WB：Western印迹法
1.5杂交瘤1F12
为了开发鉴别为APCH1的scFv，我们从由Javier Domínguez博士(Dept.of Biotechnology(生物技术系)，INIA)提供的杂交瘤1F12开始，其表达识别II型DR抗原的β链的1F12单克隆抗体。杂交瘤1F12保持培养在RPMI-1640培养基(Biowhittaker)中，其中补入0.01mM丙酮酸(Sigma)，2mM L-谷氨酰胺(Sigma)，100U/ml青霉素和20μg/ml硫酸庆大霉素(Biowhittaker)。杂交瘤1F12在INIA实验室中可供公众获得并且不是本发明所要求保护的一部分。
1.6商业ELISAS
INGEZIM PARVO CANINO 1.5.CPV.K.1(Ingenasa)，即用于检测和量化狗血清中抗犬细小病毒的特异性抗体的间接型免疫酶测定。
1.7拟南芥的生长
使用的模型植物是拟南芥，哥伦比亚生态型。拟南芥属属于十字花科(Brassicaceae或Cruciferae)。
1.7.1在土壤上
为了在土壤中培养拟南芥植物，将种子种植在装有通用基质和蛭石(3∶1)混合物的花盆或塑料槽的表面上。该混合物预先浸泡在蒸馏水中，并在120℃，101kPa(1atm)压力下，高压灭菌20分钟。将花盆或槽置于托盘中，并随后对其覆盖塑料，以在萌芽过程中保持足够湿度并防止污染。将托盘保持在黑暗中，4℃，48小时，从而有助于种子的均匀萌芽。随后，将托盘放入22℃培养室中，光周期为16小时荧光光照和8小时黑暗。种植后1周时，除去塑料，始终保持托盘中有水。使用通用基本培养基(Haughn和Somerville，(1986)，Sulfonylurea resistant mutants of Arabidopsis thaliana.(拟南芥的磺酰脲抗性突变体)Molec.General Genetics(分子和一般遗传学)204：430-434)对植物进行浇水，每周一次。将植物保持在这些条件下直至开始开花(6-7周)，这是浸润的理想时间。偶尔，为了提高浸润产率，剪下一些花直到第二开花期逐渐形成，这时更大量。
1.7.2在培养皿中
为了在平板中萌芽种子，使用增补1％蔗糖并使用0.8％琼脂固化的MS培养基(Murashige T.和F.Skoog.A revised medium for rapid growth andbioassays with tobacco tissue cultures(用于快速生长和生物测定烟草组织培养物的改良培养基).Physiol.Plant.(植物生理学)15：473-497，1962)，和相应的抗生素。将种子在30％次氯酸钠和0.01％Triton X-100溶液中灭菌10分钟，并随后在无菌水中洗涤5次。将种子播种到培养皿中，将其置于4℃，黑暗中48小时。随后，将它们置于处于这样的条件下的培养室中：22℃，16小时光照随后是8小时黑暗。2周后，将幼苗移植至土壤并在上述条件下培养。
1.8细菌培养基和感受态细胞的获得
大肠杆菌的培养在LB培养基(Sigma)中，在存在相应的选择性试剂(Sambrook等，1989)的条件下，在37℃进行14-16小时。感受态细胞的制备利用Hanahan所述的氯化铷法进行(Studies on transformation of E.coliwith质粒(关于使用质粒转化大肠杆菌的研究).J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)166：557-580.1983)。
不同菌株的土壤杆菌培养在液体LB或在培养皿中进行，其增补50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福霉素(rifampycin)(Sambrook等，1989)，并在28℃保持36-48小时。
细菌培养物的长期保存在终浓度为6％的二甲亚砜(DMSO)中，-80℃下进行(Sambrook等，1989)。
1.9细菌转化法
1.9.1大肠杆菌的转化
使用菌株DH5-α和TOP-10来保持质粒并生成新质粒。这两种感受态菌株均遵从Birnboim和Dolly方案转化(Birnboin H.C.和Dolly J.A rapidalkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA(用于筛选重组质粒DNA的快速减小提取程序).Nucl.Acid Res.(核酸研究)7：1513-1516.1979)。简言之，将质粒DNA或连接产物加入至100-μl解冻感受态细胞等分试样中并在4℃保持30分钟。随后，在42℃进行热激，这增加孔渗透性，加入600μl LB并在37℃，搅拌下温育1-1.5小时。细菌细胞通过在3,500rpm离心3分钟来沉积并涂布在固体培养基中，所述培养基中已经预先加入了必要的选择抗生素。将该平板在37℃炉子中温育过夜。
1.9.2根癌土壤杆菌的转化
用双元质粒转化菌株C58C1和AGL0。简言之，在不解冻条件下，将1μg DNA(双元质粒)加入200-μl所述感受态细胞等分试样中，并使它们在37℃温育5分钟，其后立即使它们在4℃温育30分钟。随后，加入1ml LB并在28℃培养3-4小时。离心后，将它们涂布在具有卡那霉素-利福霉素的LB培养基中。将该平板在28℃温育，并在约48小时后出现菌落。随后，培养它们并将它们用于浸润拟南芥植物。
1.10由杂交瘤1F12获得scFv(APCH1)
为了获得对应于scFv(APCH1)的序列，我们由杂交瘤1F12开始(如1.5项中的材料所示)。利用来自Roche(罗氏)的“Tripure”商业试剂盒分离杂交瘤细胞中的总RNA并利用AMV-RT聚合酶[Promega]借助于RT-PCR获得表达单克隆抗体1F12的杂交瘤的cDNA。随后，使用关于免疫球蛋白不同可变结构域的特异性引物进行第一次PCR。PCR扩增分别利用与重链和轻链的可变区末端特异性杂交的两组引物进行。
以下引物用于第一次PCR中：
  引物名称   序列
  5’VH.1a   SEQ ID NO：10
  5’VH.1b   SEQ ID NO：11
  5’VH.1c   SEQ ID NO：12
  3’VH.1   SEQ ID NO：13
  5’VL.1a   SEQ ID NO：14
  5’VL.1b   SEQ ID NO：15
  5’VL.1c   SEQ ID NO：16
  5’VL.1d   SEQ ID NO：17
  3’VL.1   SEQ ID NO：18
VH和VL：关于免疫球蛋白重链和轻链的可变结构域的特异性引物。
进行3次PCR，以获得重链(VH)的可变区(具有3’VH1的5’VH1a.1b.1c)，且进行4次PCR，以获得轻链(VL)的可变区。不同结构域的序列，如所预期地，在关于每种结构域的PCR混合物中的一种中扩增。这些扩增的序列(VH和VL)直接克隆在用于PCR产物的pGEM-Teasy克隆质粒中，并获得亚克隆质粒pGEM VH和pGEM VL，其在测序后，用作第二次PCR中的模板。在该第二次PCR中，使用以前设计的引物对它们进行扩增，两种结构域均与人造柔性序列(接头)结合。因此，VH在其3’区域处与接头结合，且VL在其5’区域处与该序列结合(VH3’接头和VL5’接头)(表1)。因此，由于这两种结构域具有重叠的人造序列，所以在这两种序列的首次扩增周期后，进行第三次PCR，以获得与人造柔性序列结合的两种构建体。因此，APCH1含有重链的可变区，所述重链借助于柔性肽与单克隆抗体1F12的轻链的可变区融合。一旦APCH1序列通过使用特异性引物(VH5’xbaI和VL3’)(表1)的PCR扩增，其在用于PCR产物的克隆质粒pGEM-Teasy中克隆，并获得亚克隆质粒pGEM-APCH1。设计APCH1，从而在VL3’末端添加若干限制性序列，从而能够进行与待测定抗原的不同融合，且其在VH5’末端处包含XbaI序列，这使得可能容易地从pGEM中提取融合物并将其置于植物转化质粒。
1.11获得质粒pBI APCH1-2L21
在测序质粒pGEM-APCH1和验证其完整性后，克隆与scFv APCH1的3’区融合的CPV的抗原2L21。为了该目的，使用引物2L21XhoI和2L21SmaI(表1)，通过PCR扩增肽2L21的序列，并在pGEM中对其克隆，以对其进行测定。验证序列后，通过用XhoI和SmaI酶消化对其进行提取，并以直接方式将其引入质粒pGEM-APCH1中，所述质粒pGEM-APCH1已经预先用这些相同的酶消化。在若干连接和转化后，最终获得质粒pGEMAPCH1-2L21，并对其测序以验证其正确保持融合阅读框。随后，用XbaI和SmaI酶消化该质粒，从而提取融合APCH1-2L21并将其引入质粒pBI-121中，所述质粒pBI-121已经预先用这些相同的酶消化。
质粒pBI-121含有β-葡糖醛酸糖苷酶基因；由于该原因，用HindIII和SmaI酶对其进行消化，并在使用相同酶(HindIII-SmaI)的条件下在质粒p35S TEV中克隆。随后，用HindIII-EcoRI酶消化生成的新载体(p35S-APCH1-2L21)，其包含35ScaMV启动子，融合APCH1-2L21，多接头部分(SacI，KpnI)的一部分和Vsp-ter聚腺苷酸化序列，从而将所述融合APCH1-2L21引入至用这些相同的酶消化的pBI-121双元质粒中，并获得质粒pBI APCH1-2L21。
1.12由根瘤土壤杆菌介导的植物遗传转化
预先用不同植物转化质粒转化的土壤杆菌在增补卡那霉素和利福霉素(Sambrook等，1989)的500ml LB培养基(Sigma)中，在28℃培养48小时。在3,000rpm离心20分钟后，将沉积物(其包含细菌)重新悬浮在200ml浸润培养基中：2.35g/l MS(Murashige和Skoog，1962)，5％蔗糖，10g/l 6-苄基氨基嘌呤和0.02％Silweet L-77(Lehle Seeds，目录号VIS-01)。
1.12.1花的浸润
为了进行浸润，使用6-7周龄的植物，其具有最大可能的花序数量。将花序浸没在处于真空室中的含有土壤杆菌的浸润培养基中，并使其经历5kPa(50毫巴)的压力10分钟(Bechtold N.和Pelletier G.In plantaAgrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plantsby vacuum infiltration(由真空浸润引起的成熟拟南芥的植物原位土壤杆菌介导转化).Methods Mol.Biol.(分子生物学方法)82：259-266，1998)。时间一旦过去，真空尽可能快地解除，植物用水洗涤并用塑料覆盖，以防止其干燥和不同浸润植物之间的可能污染。有时候，植物在无真空条件下浸润(Clough S.J.和Bent A.F.Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.(花浸：土壤杆菌介导转化拟南芥的简化方法)Plant.J.(植物杂志)16：735-743，1998)。将它们保持在受控光照、湿度和温度条件下的培养室中，直至长角果发育和成熟。
1.12.2转基因植物的生长培养基和选择
来自预先浸润的拟南芥植物的种子在包含30％碱液和10％TritonX-100的溶液中灭菌，并接种到培养皿中GM培养基(4.7g/l MS，1％蔗糖，0.5g/l吗啉代乙磺酸(MES)，8g/l琼脂和pH 5.7)中，其中增补氨苄青霉素(ampicillin)和卡那霉素(Sambrook等，1989)。
将T1种子保持在温度4℃，黑暗中48小时并随后保持在受控条件(16小时光照和8小时黑暗，温度22℃)下的体外培养室。12-15天后，将转基因幼苗(能够在存在卡那霉素的条件下正常生长)移植至土壤并置于培养室中，以使其生长和发育。
1.13分析转基因植物
1.13.1分离总RNA，量化，电泳，转移至膜
遵从由Logemann等所述的盐酸胍法纯化总RNA(Logemann J.，SchellJ.，和Willmitzer L.Improved method for the isolation of RNA from planttissues(从植物组织中分离RNA的改良方法).Anal.Biochem.(生物化学分析)163：16-20，1987)。RNA的量化通过分光光度法进行。
为了转移至膜，在存在甲醛/甲酰胺的条件下，将RNA溶解在1.5％水平琼脂糖凝胶上(Sambrook等，1989)。将RNA样品与溴化乙锭一起加样，从而通过荧光使其显现并由此验证其完整性。随后，利用0.05M氢氧化钠，通过常规方法将RNA转移至Hybond N+膜(Amersham)(Sambrook等，1989)。
1.13.2放射性标记探针和核酸的杂交
全部DNA探针用50μCi α32P-dCTP(Amersham或ICN)，借助于随机引物延长法，利用寡标记试剂盒(Oligolabelling kit)(Pharmacia Biotech)来标记。按照制造商的说明书，用分子排阻层析法，在S-200柱(PharmaciaBiotech)，消除不结合的核苷酸。用作探针的不同DNA片段(融合基因的完整序列)，以及用于获得它们的方法在下文中详细显示。
表3
  探针   尺寸   获得方法   应用
  2L21-GUS   1.8kb(大约)   PCR和消化   N/S
  APCH1-2L21   0.8kb(大约)   消化   N
*N，Northern印迹法；S，Southern印迹法
核酸杂交在装有10-15ml预杂交溶液的玻璃管中进行。膜在杂交温度下预杂交至少2小时。时间一旦过去，加入变性放射性标记的探针并将膜保持在该溶液中16-20小时。
低严格性Southern型杂交在具有5X SSPE(0.15M NaCl，10mMNaH2PO4，1mM EDTA Na2)，5X Denhardt溶液(0.02％菲可，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清清蛋白，0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)和0.5mg/ml变性的鲱鱼精DNA)的预杂交溶液中进行。杂交在65℃进行。杂交后，使用5X SSPE和0.5％SDS对膜进行连续洗涤，其盐浓度随每次洗涤而减小。
Northern型杂交在42℃，在0.25M磷酸盐缓冲液，pH 7.2，0.25M NaCl，1mM EDTA，7％SDS，10％PEG 6000，40％甲酰胺和0.2mg/ml变性的鲱鱼精DNA中进行。杂交后，在65℃，使用5X SSPE和0.5％SDS对膜进行连续洗涤。每次洗涤持续约20分钟。有时候，必需使用0.5％SDS洗涤。
使膜在-80℃，暴露于放射自显影胶片(Hyperfilm MP，Amersham)和增光屏一段必需的时间，以显现杂交条带。为了再使用所述膜，这些用沸腾的5％SDS溶液去杂交，同时搅拌，直至溶液冷却。为了验证膜中保留的放射活性，使滤器暴露于放射自显影胶片数日。
1.14分析转基因植物中生成的重组蛋白
1.14.1获得总可溶蛋白
新鲜植物材料，通常获自植物基生莲座丛叶，在切割和引入1.5-mlEppendorf管中并保持在冰中(4℃)后，在蛋白提取缓冲液(10mM Tris，pH7.5，500mM NaCl，0.1％Triton x-100，1％β-巯基乙醇和1mM PMFS作为蛋白酶抑制剂)中匀浆。匀浆后，使它们在13,000rpm离心10-15分钟，并收集上清。在一些情形中，使用冷冻材料。为了溶解一些沉淀的蛋白和提高提取产率，使用含有尿素的缓冲液。蛋白质分析在存在SDS条件下的丙烯酰胺-双丙烯酰胺电泳凝胶(30∶1)来进行。
1.14.2在存在SDS条件下的聚丙烯酰胺-甘氨酸凝胶中电泳
在变性条件下的蛋白质电泳在存在SDS条件下的不连续丙烯酰胺-双丙烯酰胺凝胶中进行，其遵从常规方法(Sambrook等，1989)。以7％和15％之间的不同浓度制备丙烯酰胺-双丙烯酰胺分离凝胶(Biorad或Serva)，所述浓度取决于待分析蛋白的预期分子量，以及具有浓度3.5％的丙烯酰胺-双丙烯酰胺的增稠凝胶(Sambrook等，1989)。电泳在微型凝胶(7×9cm)的情形中，在100和140V之间的恒定电压下进行。
全部样品在其分离后，通过电泳来量化，这根据Bradford-Lowry法(Biorad protein assay(Biorad生物测定))。它们溶解在蛋白解离缓冲液(0.5MTris，pH 8.0，10％SDS，甘油，β-巯基乙醇，0.02％溴酚蓝)中，在100℃加热5分钟，并随后应用于凝胶。
1.14.3转移蛋白至硝化纤维滤器
蛋白转移至硝化纤维滤器(Bio-Rad 2)在湿润试管中，以恒定电压100V进行1小时，或在20伏特通过半干燥转移(Bio-Rad)25分钟。在这两种情形中，使用相同的转移缓冲液(25mM Tris，151.8mM甘氨酸和20％甲醇(v/v))。
1.14.4转移至硝化纤维的蛋白的丽春红染色
蛋白一旦转移至硝化纤维滤器，对后者进行染色，从而检查其完整性，所述染色使用处于30％三氯乙酸(p/v)和30％磺酸基水杨酸(p/v)中的0.2％丽春红溶液(Sigma)，通过浸没进行1分钟。随后，用蒸馏水对其进行洗涤，从而消除过量的着色剂。
1.14.5通过免疫印迹或Western印迹进行蛋白质分析
蛋白一旦转移和固定在硝化纤维滤器上，所述硝化纤维滤器在37℃，用处于PBS中的2％脱脂奶粉(p/v)来封闭，或在4℃，用相同封闭溶液，在搅拌下封闭过夜。随后，用以对各种测定适合的浓度稀释在0.05％PBS-吐温20(v/v)中的特异性抗体温育滤器1小时。滤器洗涤3次，每次在洗涤缓冲液(PBS 1X-吐温)中10分钟，并在环境温度下，在相同的稀释溶液中与相应的第二抗体一起温育1小时。重复洗涤后，基于第二抗体的缀合，利用适当底物(NBT-BCIP(Roche(罗氏))，ECL(Amersham))进行显色。
1.15在植物中表达的蛋白的免疫原性分析
1.15.1获得血清
血清通过在37℃温育血液30分钟，及随后在4℃温育14小时来获得。分离血凝块并通过在1,500rpm离心10分钟使血清澄清。
1.15.2通过ELISA检测抗体
ELISA板孔用稀释在结合缓冲液(碳酸盐/重碳酸盐)中的0.2μg肽2L21/孔来4℃划线12小时。其用0.05％PBS-吐温-20(v/v)溶液和5％胎牛血清或BSA，在37℃搅拌下，封闭1小时。用0.05％PBS-吐温20溶液洗涤3次后，将待测定的血清以处于0.05％PBS-吐温20中的不同稀释度，在37℃搅拌下温育1小时。用PBS-吐温进行5次洗涤后，所述孔用含有稀释度为1/500的过氧化物酶-缀合抗-小鼠(Amersham)的0.05％PBS-吐温-20溶液，在37℃搅拌下温育1小时。洗涤该板并用在包含0.1％过氧化氢的水中制备的or-苯二胺(OPD)(Sigma-Aldrich)作为底物对其进行显色。用3N硫酸终止反应并，随后，在ELISA读数器中，在波长492nm处对每个板孔的吸光度进行读数。
为了检测抗犬细小病毒衣壳的抗体，使用INGEZIM PARVO CANINO1.5.CPV.K.1试剂盒(Ingenasa)，其设计用于检测和量化狗血清中的抗犬细小病毒的特异性抗体。
为了确定通过ELISA分析的血清中的抗体的效价，对待滴定血清进行连续稀释，将每种血清的效价表述为所述血清最大稀释度的倒数，其中波长492nm处的吸光度显著高于阴性对照的吸光度(2倍)。
1.15.3通过免疫印迹表征抗体
获自免疫动物的抗体的抗原特异性通过免疫印迹来确定。将杆状病毒(Ingenasa)中产生的VP2衣壳的蛋白重新悬浮在蛋白解离缓冲液中，煮沸5分钟并在存在SDS条件下加样到聚丙烯酰胺-甘氨酸凝胶中，并转移至硝化纤维膜(Biorad)。小鼠血清以由1/10开始的有限稀释度检测，且抗小鼠第二抗体与碱性磷酸酶(Roche(罗氏))缀合。用于该反应的底物是氮蓝-四唑鎓-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(NBT-BCIP，Roche(罗氏))。
1.16实验模型和免疫化
1.16.1用植物提取物通过腹膜内途径接种小鼠
11周龄雌性瑞士血统小鼠通过腹膜内途径，在第0、7和14，用植物提取物来免疫，所述植物提取物表达被研究的重组蛋白(APCH1-2L21)(3mg总可溶蛋白/剂量)。
弗氏完全佐剂(Sigma)用于第一次接种并且弗氏不完全佐剂(Sigma)用于其他。
利用相同的流程，用未转化的植物提取物或用无转基因载体转化的植物提取物免疫对照小鼠。最后一次免疫后10天，对小鼠放血并获得血清，以进行研究。
1.17获得与肽2L21融合的单链重组APCH1抗体及其在转基因植物中的表达
获得本说明书中所述的称为APCH1的单链重组抗体(scFv)借助于由杂交瘤1F12开始的mRNA的PCR扩增，和随后的分子克隆来进行，如材料和方法部分中所述。最终构建体包括具有抗体1F12的天然信号肽的重链(VH)的可变结构域，轻链(VL)的可变结构域，已经从其中消除了所述信号肽和结合它们的柔性肽。在由此获得的嵌合基因测序和验证其完整性之后，克隆与APCH1的3’区融合的CPV的抗原2L21。为了该目的，抗原2L21的序列通过PCR，使用特异性引物扩增，所述特异性引物使得可能保持融合阅读框开放。在若干次亚克隆后，将该片段引入双元质粒pBI121中，由此导致质粒pBI APCH1-2L21，其包含35S组成型启动子；后者指导对应于融合蛋白的序列和土壤杆菌的Nos基因的聚腺苷酸化序列的表达(图1)。将该质粒引入根癌土壤杆菌中，用其通过花浸润转化拟南芥植物(Clough，S.J.和Bent，A.F.1998.Floral dip：a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.(花浸：土壤杆菌介导转化拟南芥的简化方法)Plant.J.(植物杂志)16：735-743，1998)。
1.18分析融合抗原(APCH1-2L21)在获得的转基因植物中的表达
在植物转化后，获得具有与野生型品系类似的表现型的多个转基因品系。随后，分析约30种独立的转基因品系，以确定转基因的表达和融合蛋白(APCH1-2L21)的累积。以前，已经以不同的目的，在植物中表达了不同的scFv，并且已经获得了这些分子表达和累积水平的巨大差异(Fiedler，U.和Conrad，U.1995.High-level production and long-term storage ofengineered antibodies in transgenic tobacco seeds(转基因烟草种子中改造抗体的高水平生产和长期保存).Biotechnology(生物技术)(N.Y.)13：1090-1093)。因此，第一步是研究转基因的正确转录，从而随后分析融合蛋白的累积水平。
不同品系的总RNA获自用这种构建体转化的植物的新鲜叶片，在琼脂糖-甲酰胺凝胶中分离不同的RNA，并随后将后者转移至硝化纤维滤器，以进行分析。在这些滤器上进行的，利用完整融合序列(APCH1-2L21)作为探针的Northern印迹显示：一些转基因品系表现出对与所述融合蛋白相对应mRNA所预期的尺寸的非常强的杂交条带(图2)。
随后，为了验证植物细胞中重组蛋白的正确翻译和累积，用来自这些品系的总可溶蛋白提取物进行12％SDS-PAGE凝胶。为了该目的，将特异于肽2L21的单克隆抗体3C9(Ingenasa)用于Western印迹分析中。这些分析显示在来自表现出最高信使累积水平的品系的提取物中存在约32kDa的条带，其对应于APCH1-2L21蛋白。
如在图2中可以观察到地，在检测到的转录水平和分析的品系中的蛋白之间存在正相关性，这样那些具有最高mRNA水平的植物表现出该蛋白的较高累积。预测的APCH1-2L21三维结构显示其是球状蛋白，不是多聚体蛋白(图1C)。这些结果说明在拟南芥细胞的胞质中不存在对所述融合蛋白转录和翻译的妨碍。
1.19分析在与疫苗肽(APCH1-2L21)融合的重组抗体的抗原呈递细胞中与其靶抗原的结合能力
为了验证植物生成的融合蛋白APCH1-2L21保持初始1F12抗体的抗原识别特征，利用猪尘细胞进行荧光和免疫组化测定，所述猪尘细胞具有大量这些受体(II型SLA-DR)。
为了这些测定，预先用1μg从用质粒pBI APCH1-2L21转化的植物中提取的可溶蛋白固定的尘细胞在4℃温育过夜。随后，用PBS-吐温洗涤该巨噬细胞以消除非特异性结合后，用抗表位2L21的特异性抗体3C9进行第二次温育。随后，免疫复合物以两种不同方式显色。关于免疫荧光，使用与Alexa-FluorTM488缀合的山羊抗小鼠抗体(Molecular Probes(分子探针))，其以绿色标记。在用过氧化物酶标记的情形中，使用与过氧化物酶缀合的绵羊抗小鼠抗体(Amersham Pharmacia)，其以褐色标记。作为阴性对照，用使用质粒pBI-TEV Vp60转化的植物提取物，在相同条件下，平行温育巨噬细胞，并将表达抗体1F12的杂交瘤的上清(10μg)用作阳性对照。
作为该实验的结果，标记仅在用杂交瘤1F12的上清温育的巨噬细胞中和在表达APCH1-2L21的植物提取物中获得，而无信号出现在阴性对照中。在具有两种缀合物的巨噬细胞的表面上发现特异性标记模式，其在用所述杂交瘤的上清处理的细胞中和在表达APCH1-2L21的植物提取物中非常类似(图3)。
这些结果证实植物中表达的融合蛋白APCH1-2L21的功能性和活性，这维持其对猪尘细胞的II型SLA-DR分子的特异性。
1.20研究由抗体APCH1赋予肽2L21的免疫原性的增加
为了评估由本发明提供的免疫应答增强分子的功效，用免疫原，通过腹膜内途径，在第0、7和14天，对5只11周龄的雌性瑞士血统小鼠进行免疫，其使用表达被研究的重组蛋白的植物提取物(3mg总可溶蛋白/剂量)，与无关蛋白(β-GUS)融合的相同肽2L21，或100μg合成肽2L21。弗氏完全佐剂(SIGMA)用于第一次接种并且弗氏不完全佐剂(SIGMA)用于其他。最后一次免疫后10天，对小鼠放血并获得血清，以进行研究。
作为该研究的结果，与所述抗体融合的肽将小鼠中抗体的效价诱导为用单独的所述肽获得的600倍和用与无关蛋白融合的肽获得的超过50倍(图4)。这些数据证实肽通过借助于抗体APCH1将其指向抗原呈递细胞来增加免疫原性的假说。此外，这种与蛋白KLH，即肽疫苗的常规载体融合，和与抗体APCH1融合的肽的免疫原性的比较实验显示指导所述抗原靠近抗体生成许多抗体分子/肽分子，其为高26倍。
实施例2.为了动物中的免疫应答增强，将疫苗抗原指向抗原呈递细胞。单链重组APCH1抗体与牛病毒学腹泻病毒的蛋白E2T的融合及其在哺乳动物细胞中的表达
2.1细胞
使用无外来病毒的哺乳动物CHO-K1细胞(卵巢细胞)，其获自病毒学研究所的细胞培养部(PVA76/04)。使用哺乳动物CHOK1(中国仓鼠卵巢细胞)。
2.2使用的大肠杆菌菌株
使用大肠杆菌DH5-α菌株(Clontech)，其存在以下特征来转化和生长质粒：
细菌菌株：DH5-α
基因型：supE44 hsd R17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1
显著单元：重组缺陷型菌株，用于质粒的平板接种和生长。
2.3所用质粒
2.3.1商业质粒
为了获得表达不同测定肽的不同构建体，使用不同商业质粒。质粒pGEM-Teasy用于克隆和测序PCR产物，而质粒pcDNA 3.1用于生成稳定哺乳动物品系：
pGEM-Teasy(Promega)：该质粒特别设计用于克隆和测序PCR产物。其包含具有多限制性位点(多接头)的区域。所述多接头已经预先用EcoRV消化并，随后，在两末端添加3’-胸苷，从而促进PCR产物的克隆。而且，其使得可能借助于LacZ基因选择重组体。
pcDNA 3.1(Invitrogen)：该质粒源自pcDNA3并设计用于哺乳动物细胞中的瞬时稳定表达。该载体包括以下元件。
2.3.2在执行本发明过程中开发的哺乳动物细胞转化质粒
为了该实施例的实施方案，生成被鉴定为pcDNA APCH1-E2T的质粒，其用于转化CHOK-1细胞。在所述质粒中表达的抗原来自APCH1与牛病毒腹泻病毒(VDVB)的分泌蛋白E2(而无其跨膜结构域(E2T))的融合。
编码所述抗原及其各自融合物的序列通过PCR扩增获得。使用的引物列举在下表中：
  引物名称   5’-3’序列
  P1XmaI   SEQ ID NO：19
  P3SpeI   SEQ ID NO：20
SEQ ID NO：19的位置2-7是限制性靶标。
为了检测哺乳动物细胞上清中生成的重组蛋白，使用商业小鼠单克隆抗体和为了该目的特别开发的兔多克隆血清，和各自与碱性磷酸酶(AP)和/或过氧化物酶(HRP)缀合的第二抗体：
  单克隆抗体(小鼠)   特异性   应用   供应商
  2.9H   抗-E2VDVB   WB/ELISA   CEVAN
  C3A   抗体-E2VDVB   WB   BOMELLI
  多克隆抗体(兔)   特异性   应用   供应商
  IgG   抗-E2T   ELISA   Lab C(IV-INTA)
  第二抗体-缀合的   供应商
  与AP缀合的抗小鼠   KPL
  与HRP缀合的抗小鼠   KPL
2.4CHOK 1细胞系的转染
为了获得稳定品系，使用在实验室中预先标准化的转染方法。
获得以稳定方式转染的品系。为了该目的，具有单层CHO-K1的T-75摇瓶用阳离子脂质体，以80％汇合来转染。单层细胞用具有包含LacZ基因的相同pcDNA 3.1(Invitrogen)系列的载体的pcDNA E2T和pcDNAAPCH1-E2T来转染，从而使用该品系，以便更容易地检测稳定品系的进化和发育。在转染后24h，在四个T-75中进行转染细胞的次培养，并通过向培养基中添加浓度为700μg/ml的抗生素遗传霉素(geneticin)(Invitrogen)来起始选择过程。培养14天时，抗所选抗生素的细胞转化灶的存在明显。在这时，进行新的细胞次培养并在96孔板中开始通过极限稀释进行的各个细胞的第一轮分离。培养21天时，再次观察到转化灶，并开始新一轮极限稀释，从而分离各个克隆。极限稀释过程对每轮重复2次。将通过Western印迹对重组蛋白的表达提供阳性的最高稀释度用在第二次极限稀释过程中。最后，扩增阳性克隆并将其冷冻在液氮中保存(图5)。
2.5检测开发的细胞系中的重组蛋白
2.5.1聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)中的电泳
在变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中的电泳按照由Laemmli U.K.描述的方法进行，其使用处于Mini Protean II仪(Bio-Rad)中的不连续凝胶系统。后者包括浓缩胶，其具有聚丙烯酰胺浓度1.7％(m/v)，和分离凝胶，其具有聚丙烯酰胺浓度8％(m/v)。所述样品用加样(seeding)缓冲液(12.5％Tris-HCl缓冲液v/v(pH 6.8)，10％甘油v/v，2％SDS m/v，5％β-巯基乙醇v/v，0.2％溴酚蓝m/v)在沸腾的水浴中预温育5分钟。一旦进行加样，在1X运行缓冲液(5X运行缓冲液：1.5％Tris碱m/v，7.2％甘氨酸m/v，0.5％SDS m/v)中进行电泳分离，施加100V恒定电压4小时。
2.5.2Western印迹
电泳分离一旦终止，在具有0.45-μm孔尺寸的PVDF模(ImmobilonTransfer Membrana-Millipore)上进行电转移。其在装有1X转移溶液(25mMTris碱，192mM甘氨酸，0.15％SDS v/v，20％甲醇v/v)的Mini Protean II仪(Bio-Rad)中，以20V进行60分钟。转移一旦终止，用封闭溶液(处于0.05％PBS 1X-吐温缓冲液v/v中的3％脱脂奶粉(Molico)m/v)，在37℃封闭所述膜表面1h。随后，用方便地稀释在封闭溶液中的抗E2单克隆抗体(CA3-Bommelli)，在4℃对其进行温育过夜。随后，用方便地稀释在封闭溶液中的与过氧化物酶缀合的小鼠抗IgG单克隆抗体(KPL)，在环境温度下，对其进行温育1h。温育后，在0.05％PBS 1X-吐温v/v中进行3次洗涤，每次10分钟。
所述膜用过氧化物酶底物来温育；使用商业Western光照化学发光试剂加试剂盒(Western Lighting Chemiluminescence Reagent Plus kit)(PerkinElmer LAS，Inc.)，遵从制造商的建议。
最后，使膜暴露于光敏板(Hyperfilm-Amersham Biosciences)并随后在放射显影显色剂溶液(G 150 Agfa)中显色；其随后在2％乙酸v/v中冲洗并，最后在放射显影固定溶液(G 334 Agfa)中固定。
2.5.3用考马斯染色
电泳运行一旦终止，使凝胶进行使用处于甲醇∶乙酸∶水(40∶10∶50)混合物中的0.1％m/v考马斯亮蓝R-250(Sigma)的染色。为了使凝胶脱色，使用脱色溶液(分别地，甲醇∶乙酸∶水；5.0∶7.5∶87.5)。脱色在环境温度下搅拌进行。
2.5.4用于检测来自细胞培养物上清的APCH1-E2T和E2T的ELISA夹心法
用在碳酸盐-重碳酸盐缓冲液(1.59g/l Na2CO3，2.93g/l NaHCO3)中适当稀释的单克隆抗体2.9H，在4℃敏化Maxisorp板(NUNC)过夜。随后，用封闭溶液(0.1％PBS 1X-吐温20v/v；1％脱脂奶m/v)封闭该板，将其在37℃温育1h。随后，引入待分析的样品(CHO-K1-APCH1-E2T或E2T细胞的上清)，在37℃温育该板1h。洗涤5次并在37℃用适当稀释的抗糖蛋白E2的兔多克隆血清温育1h。再次洗涤5次并，最后引入适当稀释的与过氧化物酶缀合的兔抗IgG单克隆抗体(KPL)，将其在37℃温育40分钟。洗涤5次并放置过氧化物酶底物(0.55mg/ml ABTS，0.015％H2O2，柠檬酸盐缓冲液(pH：5))。用5％SDS m/v终止反应。对板进行的读数在405nm处进行(ELISA读数器，Multiskan Ex，Labsystems Inc)。稀释在封闭溶液中进行，洗涤使用PBS 1X进行并且使用50μl/孔的体积。
2.6由CHOK1APCH1-E2T和CHOK1E2T细胞上清纯化E2T
一旦形成单层(通常72h)，收获上清，加入终浓度1mM的PMSF，并将其保存在-20℃直至使用。
解冻上清，并用10X结合-洗涤溶液(3M NaCl，0.5M NaHPO4)增加其离子强度。加入20mM咪唑并用10N NaOH使pH取8。
另一方面，用具有20mM咪唑的1X结合-洗涤溶液(0.3M NaCl，0.05MNaHPO4)平衡镍，并在搅拌下，4℃温育30分钟。在2,500g离心5分钟，弃去上清并且在搅拌下，用上清4℃温育所述镍过夜。
在2,500g离心3分钟，弃去上清并且用添加13mM咪唑、1mM PMSF、1mM亮抑蛋白酶肽的1X结合-洗涤溶液对其在4℃进行洗涤15分钟，直至上清液在280nm处的吸光度很低并恒定。
最后，用洗脱溶液(具有200mM咪唑，1mM PMSF，1mM亮抑蛋白酶肽的1X结合-洗涤溶液)进行洗脱，将其在搅拌下4℃温育15分钟。在2,500g离心3分钟，并回收上清。
2.7植物中表达的蛋白的免疫原性分析
2.7.1豚鼠的免疫
200-300-g豚鼠来自AL II品系，由INTA(National Institute forAgricultural Technology(国家农业技术研究所))Castelar，兽医和农艺科学研究中心(Research Center in Veterinary and Agronomic Sciences(CICVyA))的Biotery提供。将2份1-ml油性疫苗(水性：油性，40％：60％)剂量在第0天和第30天，通过肌内途径接种(每条后腿500μl)。
每次接种前，通过心脏穿刺给动物放血，提取3ml血液/动物。将其在37℃温育1h并在4℃温育30分钟。血清通过在1,000g离心15分钟来提取，等分并保存在-20℃直至使用。
在实验过程中，将动物分成每组四个，保持在1-m2笼子中，该笼子保持在与外界隔离的围绕物内，处于通风的大气条件下。所述笼子固定并且水周期性变化。
2.7.2牛的免疫
使用来INTA的血清反应阴性、非感染牛，已经预先通过ELISA，SN和PCR对该牛进行了测试，以检验其健康状况。
用两剂量的待测定疫苗免疫牛，一剂量在开始时且另一剂量在首次接种疫苗后30天。免疫通过肌内途径进行。接种物的体积为5ml。接种疫苗后每7天采血样，以便随后分析血清中的抗体。
2.7.3获得血清
血清通过在37℃温育血液30分钟，及随后在4℃进行14小时长的温育来获得。分离血凝块并通过在1,500rpm离心10分钟使血清澄清。
2.7.4病毒血清中和(SN)
遵从Howard等的方案(1987)确定中和抗体(NA)的水平。
2.7.5通过ELISA检测抗体
抗体水平利用由Marzocca等(2007)开发的基于ELISA的稍微改变的测定来确定。
2.8在CHOK1细胞中生成蛋白APCH1E2T和E2T
选择的克隆在MEM-E培养基(Gibco)；10％SFB(Quiroga)和1％抗生素(青霉素；链霉素；庆大霉素(gentamycin))中生长。为了评估重组蛋白在形成的细胞系上清中的生成，将后者培养在T75摇瓶中(图6A)和滚筒中(图6B)。在每种培养物中，研究重组蛋白的分泌动力学。对每个具有或不具有DMSO的T75组，和具有或不具有DMSO的滚筒组一式两份地进行测定。在T75的情形中，3×106个细胞在时间0时接种，而滚筒由16×106个细胞开始，从而保持这二者之间的细胞/体积比。每24h提取1ml，并将它们保存在-20℃，直至进行ELISA。
2.9通过金属螯合层析法(IMAC)纯化APCH1E2T和E2T
利用点2.3中所述的流程，获得具有高纯度的蛋白APCH1-E2T并且记录关于E2T的单条带和关于APCH1-E2T的三条带的外观；最重的条带是关于融合蛋白，中间条带可能关于BSA的痕迹，且最轻的条带是APCH1-E2T蛋白水解产物(通过Western印迹验证)。整个过程的近似产率是每1升上清100μg纯化蛋白的数量级(图7)。
2.10识别指向来自不同物种的MHC II型外周血单核细胞(PBMCs)的APCH1-E2T
用菲可-Hypaque(Amersham)，从来自不同动物(牛、猪、马、山羊和绵羊)的肝素化血液中纯化PBMCs。以该方式获得的细胞随后用PBS(同种型对照)、E2T或APCH1-E2T来温育，并随后用小鼠抗-E2单克隆抗体(VDVB，品系NADL)和藻红蛋白-偶联的小鼠抗IgG单克隆抗体来标记。标记的细胞在流式细胞计数器中分析，并且结果报告为阳性细胞的百分比，所述阳性细胞是具有在关于同种型对照标记强度以外的强度范围内荧光强度的那些细胞。在所有分析的物种中，APCH1-E2T的结合显著高于关于E2T获得的结合。
2.11研究由抗体APCH1赋予蛋白E2T的免疫原性的增加
为了评估由本发明提供的免疫应答增强分子的功效，测定在实验模型(豚鼠)中和在牛(开发融合分子APCH1-E2T的最终目标)中进行。
2.11.1豚鼠中的测定
用于评估APCH1-E2T分子的实验组显示在表2中。如可以观察到地，在豚鼠中与抗体融合的蛋白E2T诱导中和抗体的效价大于使用蛋白E2T获得的那些(图9)。实验组：
  组   豚鼠数量   剂量/动物(μg)
  E2T   5   0.2
  APCH1-E2T   5   0.2
  Lac Z(-)   4   1
2.11.2牛中的测定
豚鼠实验模型中一旦获得免疫应答的增强，则评估APCH1分子在牛中的增强能力。表3显示测定的实验组。在最高剂量(1μg)条件下，在实验组之间没有检测到差异(图10A)；然而，在0.2-μg剂量条件下，蛋白APCH1-E2T证明比该蛋白本身更有效，因为其容许特异性抗体反应(图10B)。同样地，当计算0.2-μg剂量获得的抗体效价时，观察到只有APCH1-E2T分子能够诱导特异性抗体(图10C)。实验组：
  组   牛数量   剂量/动物(μg)
  E2T   3   1
  E2T   3   0.2
  APCH1-E2T   3   1
  APCH1-E2T   3   0.2
  Lac Z(-)   3   1
Figure IPA00001223719400011
Figure IPA00001223719400021
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Figure IPA00001223719400061
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Figure IPA00001223719400111
Figure IPA00001223719400121

Claims (21)

1.基因构建体，其包括操作性结合的至少以下各项：
a)一个核苷酸序列(A)，其编码具有SEQ ID NO：1的多肽，所述多肽具有识别抗原呈递细胞表面上存在的II型DR抗原的β链的区域；和
b)一个核苷酸序列(B)，其编码目的疫苗抗原，所述目的疫苗抗原易于在其被引入的宿主中诱导免疫应答。
2.如权利要求1所述的基因构建体，其中所述目的疫苗抗原选自下组：来自犬细小病毒的肽2L21，来自兔出血症病毒的蛋白VP60，来自轮状病毒的蛋白VP6，来自牛病毒性腹泻病毒的蛋白E2或E2T，或来自流感病毒的血细胞凝集素蛋白。
3.如权利要求1或2所述的基因构建体pBIAPCH1-2L21，其特征在于所述构建体包括编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列(A)和编码SEQ IDNO：21的核苷酸序列(B)，所述SEQ ID NO：21对应于所述犬细小病毒的疫苗抗原2L21。
4.如权利要求1或2所述的基因构建体pcDNAAPCH1-E2T，其特征在于所述构建体包括编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列(A)和编码SEQ IDNO：23的核苷酸序列(B)，所述SEQ ID NO：23对应于所述牛病毒性腹泻病毒的疫苗抗原E2T。
5.如前述任一项权利要求所述的基因构建体，其特征在于所述构建体另外包括编码间隔肽的核酸序列(C)。
6.如权利要求5所述的基因构建体，其特征在于所述间隔肽选自SEQID NO：2和/或SEQ ID NO：3。
7.如前述任一项权利要求所述的基因构建体，其特征在于所述构建体另外包括编码易被用于分离或纯化目的的肽的核酸序列(D)，其位于所述核苷酸序列(B)的3’末端的下游。
8.如前述任一项权利要求所述的基因构建体，其特征在于所述构建体另外包括启动子序列、编码转录调节子的序列、核糖体结合序列(RBS)和/或转录终止序列。
9.如前述任一项权利要求所述的基因构建体，其特征在于所述构建体另外包括选自抗生素抗性基因和/或赋予针对毒性化合物的抗性的基因的标记物。
10.重组表达载体，其有效用于转化一般地植物或动物细胞和具体地人细胞，所述重组表达载体的特征在于它包括权利要求1-9的任一基因构建体。
11.如权利要求10所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。
12.如权利要求10所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是病毒，优选杆状病毒(Baculovirus)。
13.用权利要求10-12的载体转化或转染的细胞，其特征在于所述细胞在其基因组中包括权利要求1-9的任一基因构建体。
14.用权利要求10或11的载体转化或转染的转基因植物，其特征在于所述转基因植物在其基因组中包括权利要求1-9的任一基因构建体。
15.用权利要求10或12的载体转化或转染的转基因动物细胞，其特征在于所述转基因动物细胞在其基因组中包括权利要求1-9的任一基因构建体。
16.由权利要求1-9的基因构建体编码的融合蛋白，所述融合蛋白能够在引入其的宿主中产生免疫应答。
17.如权利要求16所述的融合蛋白APCH1-2L21，其特征在于所述融合蛋白APCH1-2L21包括氨基酸序列SEQ ID NO：1(A)和氨基酸序列SEQID NO：21(B)，所述SEQ ID NO：21对应于犬细小病毒的疫苗抗原2L21。
18.如权利要求16所述的融合蛋白APCH1-E2T，其特征在于所述融合蛋白APCH1-E2T包括氨基酸序列SEQ ID NO：1(A)和氨基酸序列SEQID NO：23(B)，所述SEQ ID NO：23对应于牛病毒性腹泻病毒的疫苗抗原E2T。
19.疫苗，其包括权利要求16-18的任一融合蛋白和任选地药用赋形剂。
20.一种设计用于治疗或预防疾病的方法，所述方法包括将药用量的权利要求19的疫苗施用于个体或动物。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于所述施用是通过口服、肌内、皮下、腹膜内或静脉内途径来进行。
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