BRPI0822408A2 - construção gênica, vetor de expressão recombinante, célula transformada ou transfectada, planta transgênica transformada ou transfectada, célula animal transgênica transformada ou transfectada, proteìna de fusão e vacina - Google Patents

Abstract

CONSTRUçãO GêNICA, VETOR DE EXPRESSãO RECOMBINANTE, CéLULA TRANSFORMADA OU TRANSFECTADA, PLANTA TRANSGêNICA TRANSFORMADA OU TRANSFECTADA, CéLULA ANIMAL TRANSGêNICA TRANSFORMADA OU TRANSFECTADA, PROTEìNA DE FUSãO E VACINA. Proteína de fusão com direcionamento de antígenos vacinais para células apresentadoras de antigenos e suas aplicações. Esta invenção se refere a uma construção gênica que compreende, operacionalmente ligadas, pelo menos uma sequência de nucleotídeos (A), que codifica um polipeptídeo com a SEQ ID NO: 1, o qual tem uma região que reconhece a cadeia <225> do antígeno DR classe II presente na superfície de células apresentadoras de antigenos e uma sequência de nucleotídeos (B), que codifica um antígeno vacinal de interesse. Além disso, esta invenção se refere a vetores recornbinantes úteis para a expressão da construção gênica da invenção, células transgênicas e plantas transformadas ou transfectadas com os ditos vetores, proteínas de fusão codificadas pela construção gênica da invenção e vacinas que compreendem as ditas proteínas de fusão.

Description

CONSTRUÇÃO GÊNICA, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA TRANSFORMADA OU TRANSFECTADA, PLANTA TRANSGÊNICA TRANSFORMADA OU TRANSFECTADA, CÉLULA ANIMAL TRANSGÊNICA TRANSFORMADA OU TRANSFECTADA, PROTEÍNA DE FUSÃO E VACINA

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção se refere a um método de direcionamento de antígenos vacinais para células apresentadoras de antígenos, com base na síntese de uma proteína de fusão que compreende: um polipeptídeo que tem uma região que reconhece um epítopo presente na superfície de células apresentadoras de antígenos, e outro polipeptídeo que é o antígeno vacinai de interesse.

FUDAMENTOS TÉCNICOS DA INVENÇÃO

A obtenção de produtos recombinantes de interesse vacinai em diferentes sistemas de expressão, tais como células de bactérias, fungos, leveduras, plantas, insetos e larvas, células de mamíferos etc. é conhecida há algum tempo. Entre esses sistemas, as plantas oferecem inúmeras vantagens em comparação com outros sistemas de expressão, pois, em geral, elas representam um método econômico, seguro e fácil de obtenção de proteínas de interesse farmacológico potencial, por exemplo, vacinas de subunidade recombinante, sem a necessidade de sistemas de fermentação caros.

No entanto, em todos os sistemas, a principal limitação na obtenção de vacinas de subunidades recombinantes do patógeno é a baixa imunogenicidade dos produtos recombinantes obtidos, como resultado, doses muito altas, repetidas da vacina são geralmente necessárias para a igualdade de resposta imunológica obtida com a imunização convencional (patógeno desativado completo). Esta circunstância torna os custos de produção de vacinas de subunidades recombinantes muito elevados em comparação às vacinas convencionais e, deste modo, muitas delas atualmente não chegam ao mercado.

Diferentes alternativas têm sido seguidas, a fim de melhorar a imunogenicidade das vacinas de subunidades recombinantes. Um deles é baseado no uso de moléculas do tipo CTLA4 e L-selectina para dirigir antígenos vacinais para células apresentadoras de antígenos em camundongos [Boyle JS et al., Enhanced responses to a DNA vaccine encoding a fusion antigen that is directed to sites of immune induction. Nature. 1998, Mar 26; 392 (6674): 408-411]. No entanto, estas estratégias não têm se mostrado igualmente eficazes em outras espécies do que nas espécies de camundongos, o que torna necessária a busca de outras alternativas com base no direcionamento de antígenos vacinais para as células responsáveis pela apresentação de antígenos de outras espécies, particularmente a espécie humana.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A invenção se refere a um método alternativo para aqueles presentes no estado da técnica, o qual aumenta a eficácia de vacinas de subunidades recombinantes, quando estas são aplicadas a diferentes espécies, tanto em animais em geral, como nos seres humanos, em particular. Usando o método da invenção baseado no direcionamento de antígenos para apresentação de suas células, foi possível melhorar a resposta imune mediada pelo hospedeiro, enquanto reduziu a dose da vacina aplicada, equalizando ou excedendo a resposta imune alcançada através da aplicação de vacinas convencionais.

Portanto, o sistema para o direcionamento de antígenos vacinais para células apresentadoras de antígenos proposto por esta invenção é composto de uma proteína de fusão que compreende pelo menos um polipeptídeo (A) que tem uma região que reconhece um epítopo presente na superfície de uma célula apresentadora de antígeno, e outro polipeptídeo (B), o antígeno vacinai de interesse, que é responsável por desencadear a resposta imune no hospedeiro.

Em uma modalidade particular da invenção, o polipeptídeo (A) compreende uma região que reconhece a cadeia β do antígeno DR Classe II (Região D) . 0 dito polipeptídeo é um anticorpo recombinante de cadeia única (scFv) APCHl ("células I apresentadoras de antígenos "Homing" 1"), que se caracteriza pela SEQ ID NO: 1, derivada do anticorpo monoclonal 1F12.

Assim, o polipeptídeo (A) é formado pela região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal 1F12 fundido, por meio de um peptídeo flexível, para a região variável de cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal 1F12. O anticorpo monoclonal 1F12 reconhece a cadeia β do antígeno DR Classe II, em um grande número de espécies e, por conseguinte, seria aplicável a várias espécies, incluindo seres humanos.

Em outra modalidade particular da invenção, o peptídeo (B) (antígeno vacinai de interesse) é o peptídeo vacina contra a parvovirose canina (CPV) chamado 2L21 (SEQ ID NO: 21), proteína E2T (SEQ ID NO: 23) ou E2 do vírus da diarréia viral bovina, proteína VP60 do vírus da doença hemorrágica do coelho, proteína VP6 do rotavírus ou a proteína hemaglutinina do vírus influenza.

2L21 é formado por dois subsítios antigênicos distantes da região amino-terminal da proteína VP2 do capsídeo CPV e foi publicado anteriormente como o primeiro peptídeo vacina sintético peptide (López de Turiso, JA, Cortês, E., Martínez, C., Ruiz de Ybánez, R., Simarro, I., Vela, C., Casal, /1. (1992) J. Virol. 66:2 748-2753).O peptídeo 2L21, fundido a APCHl, tem sido expresso em plantas. Além disso, o dito peptídeo 2L21 tem sido expresso não-fundido em plantas, ou fundido a uma proteína irrelevante do ponto de vista imunogênico (β-glucuronidase, GUS), a expressão da qual tinha sido realizada com sucesso antes desta no laboratório dos inventores (Gil F., Brun A., Wigdorovitz A., Martínez- Torrecuadra JL, Catalá R., Casal I., Salinas J., Borca MV e Escribano JM. FEBS Letters 488: 13-17, 2001). A proteína de fusão 2L21-GUS é uma proteína muito estável, com uma baixa taxa de degradação e perfeitamente adaptada à expressão em plantas.

Assim, a invenção apresenta um método de direcionamento de antígenos vacinais para as células apresentadas, composto por uma proteína de fusão, como, por exemplo, APCH1-2L21 ou APCHl- E2T, que compreende APCHl fundido a vacina ou peptídeo 2L21 ou E2T, respectivamente. Conforme explicado abaixo, a proteína de fusão APCHl-2L21 foi expressa em plantas, levando a plantas transgênicas de Arabidposis thaliana, e a proteína de fusão APCHl-E2T foi expressa em células de mamíferos.

Além disso, foi comprovado que a proteína de fusão APCHl- 2L21 mantidas as características imunogênicas e antigênicas do peptídeo 2L21, induzindo altos títulos de anticorpos específicos em grupos de animais imunizados pela via oral, bem como por via intraperitoneal, intramuscular, subcutânea ou intravenosa, sendo muito maior que a induzida pelo peptídio sintético 2L21 sozinho ou fundido a GUS (2L21-GUS). Estes resultados mostraram que a proteína de fusão APCH1-2L21 aumenta a resposta imune em animais, o que confirma a hipótese de um aumento na imunogeni cidade de um antígeno vacinai através do seu direcionamento para células apresentadoras de antígenos, por meio de um polipeptídeo com uma região (A) que reconhece um epítopo presente na superfície de células apresentadoras de antígenos. O sistema de direcionamento de antigenos vacinais fornecido por esta invenção apresenta inúmeras vantagens, uma vez que torna possível dirigir o antígeno vacinai fundido para células apresentadoras de antigenos, facilitando a captura do antígeno vacinai e melhorando a resposta imune. Isso reduz a dose da vacina de subunidade recombinante do patógeno a ser administrada, a fim de obter uma resposta imune igual ou maior do que a obtida com vacinas convencionais para o patógeno intacto, tanto em animais como em seres humanos.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 é uma visão esquemática da expressão gênica da construção do plasmídeo pBI APCH1-2L21.

A Figura IA mostra esquematicamente a construção de expressão de gene que está integrado no genoma nuclear de Arabidopsis thaliana, que compreende a seqüência de nucleotídeos de APCHl, liderada pelo promotor constitutivo 3 5S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV 35S) [LB: margem esquerda; RB: margem direita; Peptídeo APCHl 2L21: fusão que

codifica a proteína de fusão APCH1-2L21, NOS-Ter: seqüência de poliadenilação sob o controle do promotor da nopalina sintase (NOS-Pro) ; NPT II (Kan

R): gene de resistência a canamicina.

■ A Figura IB mostra a estrutura tridimensional prevista da proteína de fusão para APCH1-2L21, obtida a partir da "proteína-suíça", onde os dois domínios globulares independentemente dobrados (VH e VL) podem ser observados.

A Figura 2 ilustra a análise da expressão do antígeno 2L21 fundido a scFv APCHl em algumas linhagens que expressam essa proteína de fusão (APCH1-2L21). ■ A Figura 2A mostra os resultados de uma análise de Northern blot da transcrição do gene de fusão (APCHl- 2L21) em plantas A. thaliana transgênicas, com mais de 5 ug de RNA total por linhagem de plantas,

hibridizadas com a seqüência de DNA completa de APCHl-2L21 de fusão marcado com 32P como a sonda.

■ A Figura 2B mostra os resultados de uma análise Western blot dos extratos de proteínas (40 ug de proteína solúvel total) extraídos de folhas frescas das linhagens diferentes de A. thaliana analisadas por Northern blot.

A Figura 3 mostra o resultado da rotulagem específica da superfície de macrófagos alveolares de suínos com peroxidase (I) e com rotulagem fluorescente (II).

■ Painel I: (a) macrófagos incubados com extratos de plantas (controle negativo) , (b) rotulagem da superfície celular de macrófagos obtidos com o anticorpo 1F12, (c) rotulagem obtida com o extrato de proteínas solúveis totais, que contém proteína de fusão APCHl- 2L21.

■ Painel II: detalhe da baixa ampliação das células incubadas com extrato de controle (1), anticorpo 1F12 (2) e extrato de planta que expressa a proteína de fusão APCHl-2L21 (3). (b e c) detalhe em alta ampliação de rotulagem celular obtida com anticorpos monoclonais 1F12 e com proteínas de fusão APCH1-2L21, respectivamente.

O diagrama de barras da Figura 4 mostra o resultado da análise da resposta imune obtida com várias preparações de peptideo 2L21 de CPV, especificamente, o anticorpo específico de resposta imune obtido em camundongos através da imunização com peptideo 2L21, por si só (2L21) , fundido ao anticorpo APCHl (APCH1-2L21) ou fundido à proteína β-GUS (2L21-GUS). A Figura 5 mostra a produção das linhagens estáveis de CHOK1 (células do ovário de mamíferos) que expressam APCH1-E2T e E2T. Uma explicação mais detalhada desta figura pode ser encontrada no ponto 2.4 do Exemplo 2.

A Figura 6 mostra a avaliação da produção de proteínas recombinantes no sobrenadante das linhagens desenvolvidas. Os ensaios foram realizados em duplicata para cada iam dos grupos, em frascos de cultura (T75) , com e sem DMSO e em garrafas (cilindros), com e sem DMSO. No caso de T75 no período 0,3 x 10^6 células foram semeadas, enquanto que os cilindros foram iniciados com 16 x 10^6 células, de modo que a proporção de células por volume entre os dois foi mantida. 1 mL foi extraído a cada 24 horas e foram preservados a -20°C antes do teste ELISA ser realizado. Uma explicação mais detalhada desta figura pode ser encontrada no ponto 2.8 do Exemplo 2. x ■ Figura 6A: linhagens de células cultivadas em frascos de cultura de tecidos (T75).

■ Figura 6b: linhagens de células cultivadas em garrafas "cilíndricas".

Figura 7 coloração com Coomassie e Western blot de APCHl- E2T e E2T. Uma explicação mais detalhada desta figura pode ser encontrada no ponto 2.9 do Exemplo 2.

Figura 8 reconhecimento de APCHl E2T para MHCII (complexo principal de histocompatibilidade) de células mononucleares. MHCII é uma família de genes que codifica as glicoproteínas da membrana plasmática envolvidas em certos mecanismos de apresentação de antígenos e de transformação dos linfócitos T, bem como das citocinas e proteínas do sistema de complemento, que são importantes na resposta imunológica.

Figura 9 resposta imune em cobaias imunizadas com a molécula experimental. O gene Lac-z codifica a β- galactosidase, uma enzima que converte a lactose em glicose e galactose, e foi utilizada como controle negativo. 0 termo DPV localizado na figura refere-se aos dias pós-vacinação.

Figura 10 resposta imune em bovinos imunizados com sobrenadantes de cultura que expressam a proteína APCH1-E2T e E2T.

■ Figura 10A: bovinos imunizados com 1 ug de APCH1-E2T ou E2T.

■ Figura 10B: bovinos imunizados com 0,2 pg de APCHl-E2T ou E2T.

Figura 11 título de anticorpos em bovinos vacinados com 0,2 ug de APCH1-E2T ou E2T.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a uma construção de DNA, doravante a construção de DNA da invenção, que compreende, operacionalmente ligados, direta ou indiretamente, pelo menos: a) uma seqüência de ácido nucléico (A) , que codifica vim polipeptídeo que compreende uma região que reconhece um epítopo presente na superfície de células apresentadoras de antígeno; e

b) uma seqüência de ácido nucléico (B) que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o antígeno vacinai de interesse, responsável pelo desencadeamento da resposta imune no hospedeiro.

A seqüência de ácido nucléico (A) codifica um polipeptídeo que compreende uma região que reconhece um epítopo presente na superfície de células apresentadoras de antígenos.

Praticamente qualquer polipeptídeo que compreende uma região que reconhece um epítopo presente na superfície de células apresentadoras de antigénios pode ser utilizada nesta invenção, como, por exemplo, um anticorpo monoclonal, ou iam fragmento do mesmo, em suas formas de cadeia única (scFv), bi-funcional ("diabody") ou completa (Fab + Fe). No entanto, em uma modalidade particular da invenção, a seqüência de ácido nucléico (A) codifica um polipeptídeo APCHl (SEQ ID NO: 1) que compreende uma região que reconhece iam epitopo (cadeia β) do antígeno DR Classe II. Classe II é expressa em células do sistema imune como polipeptídeos de superfície e inclui os antígenos HLAD (antígeno D de leucócito humano) , sub- classifiçados em DR (DRA e DRB) , DQ e DP. O dito polipeptídeo é um anticorpo recombinante de cadeia única, derivado do anticorpo monoclonal 1F12, composto da região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal 1F12 fundido, por meio de um peptídeo flexível (ligador ou dobrador) , para a região variável de cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal 1F12. A extremidade 3' da seqüência de codificação VL é vinculada a extremidade 5' da seqüência de codificação para o dito ligador e a extremidade 3 ' da seqüência de nucleotídeos codificando o dito ligador é vinculada a extremidade 5' da seqüência de codificação de VL. scFv APCHl foi projetado de tal forma que uma ou mais seqüências de restrição podem ser adicionadas na extremidade 3' de VL, a fim de ser capaz de realizar fusões diferentes com os antígenos a serem testados, e que contém uma seqüência de restrição (XbaI) na extremidade 5' de VH, o que tornou possível obter com facilidade fusões a partir de plasmídeos onde elas estão localizados e são levadas para os plasmídeos de transformação de plantas.

O anticorpo monoclonal 1F12 reconhece a cadeia β do antígeno DR Classe II em um granite- número de espécies animais e, portanto, pode ser aplicado a várias espécies, incluindo humanos. Devido às suas propriedades, o dito anticorpo, em qualquer de suas formas (scFv, bi-funcional ou completo), pode dirigir um peptídeo de vacina fusionado para células apresentadoras de antígenos que exibem este tipo de moléculas na superfície, facilitando a captura do antígeno e melhorando a resposta, pois a maioria das proteínas expressas chegam ao seu destino antes de serem degradadas. Assim, é possível compensar o acúmulo baixo de níveis de xenoproteinas (vacinas de subunidade recombinante do patógeno), apresentado por plantas transgênicas ou animais para compensar os custos de produção em outros sistemas.

A seqüência de ácido nucleico (B) codifica um antígeno vacinai de interesse que pode ser praticamente qualquer peptídeo ou proteína, independentemente da origem do mesmo (eucariótico, procariótico, viral etc.), suscetível de ser expresso na forma recombinante e de induzir uma resposta imune no hospedeiro, em um animal em geral ou em seres humanos, em particular. Abaixo, apresentamos uma série de exemplos que podem atuar como antígenos vacinais de. interesse: peptideo 2L21 de CPV, proteína VP60 do vírus da doença hemorrágica do coelho (RHDV), proteína VP6 de rotavírus, proteína E2 ou E2T do vírus da diarréia viral bovina, um antígeno vacinai contra tumores e células tumorais etc.

Em uma modalidade preferida, seqüência de ácidos nucleicos (A) não é diretamente fundida a seqüência de ácido nucléico (B), mas, em vez disso, é vantajosa para introduzir um peptídeo espaçador (ligador) entre a extremidade 3' da seqüência de ácido nucléico (A) e a extremidade 5' da seqüência de ácido nucleico (B). Portanto, se assim o desejar, a construção de DNA da invenção pode também conter uma seqüência de ácido nucléico (C) , que contém a seqüência de nucleotídeos que codifica um peptídeo espaçador localizado entre as ditas seqüências de ácido nucleico (A) e (B), onde a extremidade 5' da dita seqüência de ácidos nucleico (C) está ligada à extremidade 3' da dita seqüência de ácido nucléico (A) e a extremidade 3' da referida seqüência de ácido nucléico (C) está ligada à extremidade 5' da dita seqüência de ácido nucléico (B). Vantajosamente, o dito peptídeo espaçador (C) é um peptídeo com flexibilidade estrutural. Praticamente qualquer peptídeo com flexibilidade estrutural pode ser usado. Para fins ilustrativos, o dito peptídeo flexível pode conter repetições de resíduos de aminoácidos, em particular resíduos Gly e Ser, ou qualquer outra repetição adequada de resíduos de aminoácidos. Em uma modalidade particular, o dito peptídeo espaçador flexível é selecionado a partir da seqüência SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

A fim de facilitar o isolamento e purificação do peptídeo de fusão ou proteína obtida por meio da presente invenção, a P construção de DNA da invenção pode conter, se assim o desejar, uma seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo suscetível de ser utilizado para fins de isolamento ou purificação do peptídeo de fusão ou de proteína. Portanto, em uma modalidade especial, a construção de DNA da invenção inclui, se assim o desejar, uma seqüência de ácido nucléico (D) que contém a seqüência de nucleotídeos que codifica um peptídeo suscetível de ser utilizado para isolamento ou para fins de purificação. A dita seqüência de ácido nucléico (D) pode ser localizada em qualquer posição que não altera a funcionalidade do polipeptídeo que compreende a região que reconhece um epítopo presente na superfície de células apresentadoras de antigénios ou o polipeptídeo de interesse. Para fins ilustrativos, a dita seqüência de ácido nucléico (D) pode ser localizada a jusante da extremidade 3' da referida seqüência de ácido nucléico (B).

Praticamente qualquer peptídeo ou seqüência de peptídeo que permite o isolamento ou purificação do peptídeo de fusão ou proteína pode ser usado, por exemplo, seqüências polihistidina, seqüências de peptídeo suscetíveis de serem reconhecidas por anticorpos monoclonais que podem servir para purificar a proteína de fusão resultante por cromatografia de imunoafinidade, tais como peptídeos tag etc.; por exemplo, epítopos derivados da proteína hemaglutinina do vírus da gripe ou o epítopo C-myc etc.

A construção de DNA da invenção pode ser obtida através de técnicas que são amplamente conhecidas no estado da [Sambrook et al. "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2 8 ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989 , vol. 1-3]. A dita construção de DNA da invenção pode incorporar, operacionalmente ligado, uma seqüência de regulação de expressão da seqüência de nucleotídeos que codifica o produto ou produtos de interesse, constituindo uma construção de expressão gênica. Conforme utilizada nesta descrição, a expressão "operacionalmente ligado" significa que o produto ou produtos de interesse é (são), expresso no quadro de leitura correto sob o controle de seqüências de controle ou de regulação de expressão.

Portanto, em uma modalidade preferida, a construção gênica da invenção compreende, operacionalmente ligado, uma seqüência de controle de expressão da seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão da invenção. As seqüências de controle são seqüências que controlam e regulam a transcrição e, se for caso, a tradução da referida proteína de fusão, e incluem seqüências promotoras, seqüências que codificam reguladores de transcrição, seqüências de ligação de ribossomo (RBS) e/ou seqüências de terminação da transcrição. Em uma modalidade particular, a dita seqüência de controle de expressão é funcional em células procarióticas e organismos, por exemplo, bactérias, etc, enquanto, em outra modalidade particular, a dita seqüência de controle de expressão é funcional em células eucarióticas e organismos, por exemplo, células de inseto, células vegetais, células de mamíferos, etc. Exemplos de promotores que podem estar presentes na construção de expressão do gene fornecida por esta invenção incluem o promotor CaMV 3 5S para plantas, o promotor polihedrina ou a proteína plO para o sistema baculovírus, o promotor recente de citomegalovírus para vacinas de DNA, o promotor poxvirus sintético recente/tardio etc.

Vantajosamente, a dita construção de expressão gênica adicionalmente compreende um marcador ou um gene que codifica um motivo ou um fenótipo que permite a seleção da célula hospedeira transformada pela dita construção de expressão gênica. Exemplos ilustrativos desses marcadores que podem estar presentes na construção de expressão gênica da invenção incluem genes de resistência a antibióticos, genes que conferem resistência a compostos tóxicos, e, em geral, todos aqueles que tornam possível selecionar as plantas geneticamente transformadas.

A construção de DNA da invenção, ou a construção de expressão gênica fornecidas por esta invenção, podem ser inseridas em um vetor apropriado. Portanto, outro aspecto da invenção refere-se a um vetor, como um vetor de expressão, que compreende a dita construção de DNA. A escolha do vetor depende da célula hospedeira na qual será posteriormente apresentado. Para fins ilustrativos, o vetor em que a dita seqüência de DNA é introduzida pode ser um plasmídeo ou um vetor que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma da dita célula ou não. 0 dito vetor pode ser obtido por métodos convencionais conhecidos por aqueles hábeis na arte [Sambrook et al. , 1989, citados] supra. Em uma modalidade particular, o dito vetor recombinante é um vetor que é útil para transformar ou ser inserido em células de plantas ou células de animais. Assim, o vetor da invenção pode ser, por exemplo, Agrobacterium tumefaciens, ou um vetor viral capaz de infectar e se expressar em células animais (como, por exemplo, células de insetos ou células de mamíferos), ou células de plantas. Em uma modalidade particular da invenção, o vetor viral utilizado é Baculovírus. O dito vetor pode ser usado para transformar, transfectar ou infectar células suscetíveis de serem transformadas, transfectadas ou infectadas assim. Por conseguinte, outro aspecto da invenção refere-se a uma célula infectada com um vetor viral fornecido por esta invenção. Em uma modalidade particular, a dita célula infectada é uma célula vegetal infectada com um vetor viral apropriado, a dita célula vegetal infectada sendo capaz de expressar a proteína de fusão fornecida por esta invenção. Células vegetais infectadas com vetores virais recombinantes podem ser obtidas após a infecção de uma planta com o dito vetor viral recombinante. Assim, os vetores virais de infecção de plantas podem ser utilizados para a expressão de epítopos de patógenos animais ou células tumorais em plantas, para produzir vacinas comestíveis contra os ditos patógenos ou células tumorais.

Além disso, os vetores recombinantes fornecidos por esta invenção podem ser usados para transformar ou transfectar células eucarióticas ou procarióticas. Portanto, outro aspecto da invenção refere-se a uma célula transformada ou transfectada que compreende o dito vetor recombinante, ou a dita construção de DNA fornecido por esta invenção, ou a dita construção de expressão gênica prevista pela invenção. Células transfectadas ou transformadas podem ser obtidas pelos métodos convencionais conhecidos por aqueles versados na técnica [Sambrook et al., 1989, citado supra].

Em uma modalidade particular, o dito vetor recombinante é um vetor viral. Os vetores recombinantes da invenção são capazes de infectar e se expressar em células vegetais, células de algas ou células de origem animal, de preferência em células de insetos ou células de larvas de insetos.

Por conseguinte, outro aspecto da invenção refere-se a uma célula transformada ou transfectada que compreende, pelo menos, uma construção de DNA da invenção, ou um vetor recombinante fornecido por esta invenção, ou uma construção de expressão gênica fornecida por esta invenção.

Outro aspecto da invenção refere-se a uma célula transgênica, que compreende, inserida no seu genoma, pelo menos, uma construção de DNA da invenção. Em uma modalidade particular, as ditas células transgênicas vêm de uma célula vegetal e compreendem, inserida no seu genoma ou no genoma de um cloroplasto, pelo menos, uma construção de DNA da invenção. Plantas transgênicas podem ser obtidas a partir das ditas células vegetais transgênicas ou a partir de material vegetal transgênico. Portanto, outro aspecto da invenção refere-se a uma planta transgênica que compreende, pelo menos, uma célula vegetal transgênica fornecida por esta invenção. Como é conhecida, uma aplicação potencial interessante das plantas transgênicas é a expressão de proteínas ou epítopos de patógenos animais ou de células tumorais em plantas, para produzir vacinas comestíveis contra os ditos patógenos ou células tumorais.

Em outra modalidade particular da invenção, a dita célula transgênica é uma célula animal, de preferência de um mamífero ou de um inseto, e, preferencialmente, de uma larva de inseto. Portanto, a invenção também se refere a um animal não-humano transgênico, particularmente um mamífero transgênico, inseto ou larva de inseto que expressa o peptídeo ou proteína de interesse, com um elevado rendimento.

A construção de DNA da invenção pode ser utilizada para produzir proteínas de fusão descritas na presente invenção. Portanto, outro aspecto da invenção refere-se a um método para produzir a dita proteína de fusão, que compreende o cultivo de uma célula ou organismo fornecido por esta invenção em condições que permitam a produção da dita proteína de fusão. As condições para otimizar a cultura da dita célula ou organismo vai depender da célula ou organismo utilizado. Se assim o desejar, o método para produzir um produto de interesse fornecido por esta invenção inclui também o isolamento e purificação da dita proteína de fusão.

Outro aspecto da invenção também fornece um método para expressar um gene que codifica uma proteína de fusão fornecida por esta invenção em uma planta, que compreende a transformação da dita planta com, pelo menos, uma construção de DNA fornecida por esta invenção. A transformação de células de tecidos vegetais pode ser realizada por métodos convencionais. Para uma revisão da transferência de genes para plantas, incluindo vetores, métodos de transferência de DNA etc., ver, por exemplo, o livro intitulado "Ingeniería Genética γ transferencia genica" [de Engenharia Genética e Transferência de Gene], por Marta Izquierdo, Ed. Pirâmide (1999), em particular o capítulo 9, intitulado "Gene transfer to plants", páginas 283-316.

Outro aspecto da invenção refere-se a uma proteína de fusão que pode ser obtida pela expressão da seqüência de ácido nucléico contida na construção de DNA fornecida por esta invenção. Mais especificamente, a invenção fornece uma proteína de fusão que compreende:

(A) um polipeptídeo com uma região que reconhece um epítopo presente na superfície da célula apresentadora de antígenos, e

(B) um antígeno vacinai de interesse.

Em uma modalidade particular, a invenção fornece uma proteína de fusão que compreende:

(A) um polipeptídeo selecionado do grupo formado pelo anticorpo monoclonal intacto 1F12, um fragmento do anticorpo monoclonal 1F12 que contém a região que reconhece a cadeia β do antígeno DR Classe II, o anticorpo monoclonal 1F12 na forma bi-funcional e um scFv recombinante que contém a região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo monoclonal 1F12 fundido, por meio de um peptideo flexível, à região variável de cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal 1F12 (APCHl) e

(B) um antígeno vacinai de interesse. A proteína de fusão fornecida por esta invenção pode ainda conter, se assim o desejar, um peptideo espaçador entre o polipeptídeo que compreende uma região que reconhece um epítopo presente na superfície de células apresentadoras de antígenos e o polipeptídeo de interesse, e/ou um peptideo concebido para facilitar o isolamento ou purificação da proteína de fusão.

Em geral, a proteína de fusão fornecida por esta invenção, em particular quando o polipeptídeo que compreende a região que reconhece um epítopo presente na superfície de células apresentadoras de antígenos é um scFv, é uma molécula relativamente pequena e, em geral, mantém a especificidade de ligação do anticorpo original onde o polipeptídeo que compreende a região que reconhece um epítopo presente na superfície de células apresentadoras de antigénios é derivado, e não exige o complexo processo de montagem para o anticorpo completo. Por outro lado, devido à sua pequena dimensão, têm uma maior penetração do tecido.

Outro aspecto da invenção refere-se a uma vacina recombinante que compreende a proteína de fusão fornecida por esta invenção e, opcionalmente, um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Os ensaios realizados (ver exemplos) mostram que a proteína de fusão prevista pela presente invenção aumenta a resposta imune dos animais, uma vez que induz títulos de anticorpos que são muito superiores aos obtidos com o peptideo de vacina por si próprio ou fundido a uma proteína irrelevante, confirmando, assim, a hipótese de um aumento na imunogenicidade da vacina de um peptídio através do seu direcionamento para células apresentadoras de antigenos, por meio de um polipeptídeo que compreende uma região que reconhece um epitopo presente na superfície de células apresentadoras de antigenos, tais como scFv APCHl.

Portanto, uma vez que direciona o antígeno vacinai fundido para a célula apresentadora de antigenos que apresenta o epitopo correspondente sobre a superfície do mesmo, o sistema de direcionamento de antigenos vacinais fornecidos por esta invenção facilita a captura do antígeno vacinai e a resposta imune é maior, como a maioria das proteínas expressas que chegam ao seu destino antes de tornar-se degradadas, além disso, isso impede que o antígeno vacinai seja eliminado da corrente sangüínea antes de ser processado pelas células responsáveis pela apresentação dele ao sistema imunológico e, conseqüentemente, gera uma resposta imunoprotetora. Graças ao direcionamento do antígeno vacinai para células apresentadoras de antigenos, uma grande parte dele é corretamente apresentada ao sistema imune, o resultado é uma resposta imune potente que, dependendo do caso concreto, será, pelo menos, 50 vezes maior que a obtida pelo antígeno vacinai, por si só (em termos de título de anticorpos específicos). Portanto, esta invenção imununologicamente melhora as vacinas de subunidade recombinante produzidas em qualquer sistema.

DEPÓSITO DO MATERIAL BIOLÓGICO

Plasmídeo pBIAPCHl-2L21: foi depositado na Spanish Type Culture Collection (CECT), Burjassot, Valencia, em 12.12.2003, sendo atribuído o número de acesso CECT: 5857.

Plasmídeo pcDNAAPCHl E2T: foi depositado no Spanish Type Culture Collection (CECT), Burjassot, Valencia, em 05.03.2008, sendo atribuído o número de acesso CECT: 7387. Os exemplos a seguir apresentados servem para ilustrar a invenção e não devem ser consideradas para limitar o seu escopo.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1. Direcionamento de antigenos vacinais para células apresentadoras de antigenos, a fim de reforçar a resposta imunológica em animais. Fusão do anticorpo recombinante de cadeia única APCHl (SEQ ID NO: 1) ao peptídeo 2L21 e sua expressão em plantas transgênicas

1.1 Material vegetal

A planta modelo utilizada foi Arabidopsis thaliana, ecótipo Columbia. 0 gênero Arabidopsis pertence à família Cruciferae (Brassicaceae ou Cruciferae) .

1.2 Cepas bacterianas utilizadas

1.2.1 Eseheriehia eoli

Cepas DH5-oí e TOP-IO de Eseheriehia eoli (Clontech) , que apresentam as seguintes características, foram utilizadas para a transformação e o crescimento dos plasmídeos:

<table>table see original document page 20</column></row><table> 1.2.2 Agrobacterium tumefaciens

Cepas C58C1 e AGLO 5-α de Agrobacterium tumefaciens (Hellens R. e P. Mullineaux A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science 5: 446-451, 2000) foram usadas para a infiltração de flores de A. thaliana.

1.3 Plasmídeos utilizados

1.3.1 Plasmídeos comerciais

A fim de obter diferentes constructos que expressam os diferentes peptídeos analisados, vários plasmídeos comerciais foram utilizados. Plasmídeo pGEM-Teasy foi utilizado para a clonagem e seqüenciamento dos produtos de PCR, enquanto o plasmídeo binário PBI-121 e seus derivados foram utilizados na transformação de Agrobaeterium e na subseqüente infiltração de plantas de A. thaliana.

pGEM-Teasy (Promega): Este plasmídeo é especialmente concebido para a clonagem e seqüenciamento dos produtos de PCR. Ele contém uma região com vários sítios de restrição ρ (poliligador). O poliligador tem sido previamente digerido com EcoRV e, posteriormente, 3'-timidinas foram adicionadas em ambas as extremidades para facilitar a clonagem dos produtos de PCR. Além disso, torna-se possível selecionar os recombinantes por meio do gene LacZ.

pBI-121 (Clontech Cat. 6018-1) : Ele é derivado do plasmídeo pBI-101. Ele contém o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV 35S) e dirige a expressão do gene GUS e um fragmento de 260 pb (pares de base) que contém a seqüência de poliadenilação do nopalina sintase (NOS-ter) do gene do plasmídio Ti de Agrobaeterium. Ele também contém uma origem de replicação RK2 (com um baixo número de cópias) e iam gene de resistência a canamicina (Npt2).

Também é usado, em adição a estes plasmideos comerciais, o plasmídeo-P35S TEV (4,051 pb) , gerado no laboratório do Dr.

Escribano (National Institute for Agricultural Research [INIA]) e derivado do plasmídeo pBI121 [do laboratório de coleta do Dr. Escribano (INIA)], que contém o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV 35S), a seqüência de reforço de transcrição (TEV) do vírus do mosqueado do tabaco, depois da região de clonagem múltipla e do sinal de poliadenilação Vsp aparecerem. Este plasmídeo foi reutilizado na sub-clonagem de alguns constructos como uma etapa prévia para a clonagem dos mesmos no plasmídeo binário. Estes dois plasmideos estão disponíveis para o público no laboratório dos inventores e não fazem parte da invenção reivindicada.

1.3.2 Plasmideos de transformação de plantas desenvolvidos durante a execução da presente invenção

Para a materialização deste exemplo, o plasmídeo identificado como PBI APCH1-2L21 foi gerado, o qual foi utilizado na transformação genética de plantas. 0 antígeno expresso no plasmídeo pBI APCH1-2L21 é a fusão de APCHl ao peptídeo 2L21 do parvovírus canino (CPV).

As seqüências que codificam o dito antígeno e as respectivas fusões do mesmo foram obtidas por meio de amplificação por PCR. Dois tipos de polimerases comerciais foram utilizados, ECOTAQ (Ecogen) , que foi usada principalmente na análise da colônia, e Pow DNA polimerase (Roche), que exibe uma atividade corretiva e foi usada para amplificar as seqüências do transgene. Os iniciadores utilizados estão apresentados na Tabela 1. Posições 1-6 da SEQ ID NO: 4; 1-6 da SEQ ID NO: 5; 2-7 da SEQ ID NO: 6 e 1-18 da SEQ ID NO: 9 são sítios de restrição. Posições 1-3 5 da SEQ ID NO: 7 e posições 1-32 da SEQ ID NO: 8 representam a seqüência flexível artificial que serve para ligação de scFv (APCHl).

Tabela 1

Iniciadores utilizados

<table>table see original document page 23</column></row><table>

10 1.4 Anticorpos

Para detectar os diferentes antígenos recombinantes produzidos em plantas, diferentes anticorpos monoclonais de camundongo comerciais e anticorpos policlonais de coelho, e os respectivos anticorpos secundários conjugados com fosfatase alcalina (AP) e/ou peroxidase (HRP), foram utilizados.

<table>table see original document page 23</column></row><table> <table>table see original document page 24</column></row><table>

* wb ϊ Western blot

1.5 Hibridoma 1F12

A fim de desenvolver o scFv identificado como APCHl, partimos do hibridoma 1F12, fornecido pelo Dr. Javier Dominguez (Departamento de Biotecnologia, INIA), que expressa o anticorpo monoclonal 1F12 que reconhece a cadeia β do to antígeno DR Classe II. Hibridoma 1F12 foi mantido em cultura em meio RPMI-1640 (Biowhittaker) , suplementado com 0,01 mM de ácido pirúvico (Sigma) , 2 mM de L-glutamina (Sigma) , 100 U/mL de penicilina e 20 ug/mL de sulfato de gentamicina (Biowhittaker). Hybridoma 1F12 está disponível para o público nos laboratórios do INIA e não é uma parte da invenção reivindicada.

1.6 ELISAS comerciais

INGEZIM PARVO CANINO 1.5.CPV.K.1 (Ingenasa) , ensaio imunoenzimático do tipo indireto para a detecção e quantificação de anticorpos específicos contra o parvovírus canino em soros de cães.

1.7 Crescimento de Arabidopsis thaliana

A planta modelo Arabidopsis thaliana foi utilizada, ecótipo Columbia. O gênero Arabidopsis pertence à família Cruciferae (Brassicaceae ou Cruciferae) . 1.7.1 Em solo

Para cultivar as plantas de Arabidopsis no solo, as sementes foram plantadas na superfície, em vasos ou células plásticas contendo uma mistura de substrato universal e vermiculita (3:1). A mistura foi previamente embebida em água destilada e esterilizada em autoclave a 101 kPa (1 atm) de pressão por 20 minutos a 120°C. Os vasos ou as células foram colocadas em bandejas que foram posteriormente cobertas com plástico para manter uma umidade adequada e evitar contaminações durante a germinação. As bandejas foram mantidas no escuro a 4°C por 48 horas, a fim de favorecer a germinação homogênea das sementes. Posteriormente, as bandejas foram levadas para câmaras de cultura a 22°C, com fotoperíodo de 16 horas de luz fluorescente e 8 horas no escuro. Uma semana após o plantio, o plástico foi retirado, mantendo sempre a bandeja com água. As plantas foram regadas uma vez por semana com o meio mínimo universal (Haughn e Somerville (1986), Sulfonylurea resistant mutants of Arabidopsis thaliana. Molec. General Genetics 204: 430-434). As plantas foram mantidas nessas condições até a floração ter começado (6-7 semanas) , que é o tempo ideal para infiltração. Ocasionalmente, a fim de melhorar os rendimentos de infiltração, algumas flores são cortadas até as inflorescências secundárias, que são mais numerosas, desenvolverem.

1.7.2 Em placas de Petri

Para a germinação das sementes em placas, Meio MS (Murashige T. Skoog F. A revised médium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497, 1962), suplementado com sacarose a 1% e solidificado com ágar a 0,8%, e o antibiótico correspondente foram utilizados. As sementes foram esterilizadas durante 10 minutos em solução de hipoclorito de sódio a 30% e de Triton X-100 a 0,01%, e posteriormente lavadas 5 vezes em água estéril. As sementes foram semeadas em placas de Petri, que foram levadas a 4°C no escuro por 48 horas. Posteriormente, elas foram levadas para câmaras de cultura sob condições de 22°C e 16 horas de luz, seguidas por 8 horas no escuro. Depois de duas semanas, as mudas foram transplantadas para o solo e cultivadas sob as condições descritas acima.

1.8 Meio de cultura bacteriana e obtenção de células competentes

As culturas de E. coli foram realizadas em meio LB (Sigma), na presença do agente seletivo correspondente (Sambrook et al. , 1989) por 14-16 horas a 37aC. A preparação de células competentes foi realizada utilizando o método do cloreto de rubídio, descrito por Hanahan (Studies on transformation of E. coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166: 557-580. 1983).

As culturas de diferentes cepas de Agrobacterium foram realizadas em LB líquido ou em placas, suplementadas com 50 ug/mL de canamicina e 50 ug/mL de rifampicina (Sambrook et al., 1989), e mantidas a 28°C por 36-48 horas.

Preservação a longo prazo das culturas de bactérias foi realizada em dimetilsulfóxido (DMSO) numa concentração final de 6% a -80aC (Sambrook et al., 1989). 1.9 Métodos de transformação bacterial

1.9.1 Transformação de E. coli

Cepas DH5-α e TOP-10 foram usadas para manter os plasmídeos e gerar novos plasmídeos. Ambas as cepas competentes foram transformadas seguindo o protocolo de Birnboim e Dolly (Birnboin HC e Dolly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucl. Acid Res. 7: 1513-1516. 1979). Resumidamente, o DNA plasmidial ou produto de ligação foi adicionado a uma alíquota de 100 μL, de descongelamento de células competentes e mantidos a 4°C por 30 minutos. Posteriormente, um choque térmico a 42°C foi causado, o que aumentou a permeabilidade dos poros, 600 μL de LB foram adicionados e incubados a 37°C, sob agitação, por 1-1,5 horas. As bactérias foram sedimentadas por centrifugação a 3.500 rpm por 3 minutos e plaqueadas em meio sólido onde os antibióticos de seleção necessários já haviam sido adicionados. As placas foram incubadas em estufa a 37°C durante a noite.

1.9.2 Transformação de A. tumefaciens

Cepas C58C1 e AGLO foram transformadas com os plasmídeos binários. Resumidamente, 1 μg de DNA (plasmídeos binários) foi adicionado a uma alíquota de 200 μg das ditas células competentes, sem descongelar, e elas foram incubadas por 5 minutos a 37°C, e imediatamente a seguir foram incubadas a 4°C por 30 minutos. Em seguida, 1 mL de LB foi adicionado e foi cultivado a 28°C por 3-4 horas. Após centrifugação, foram semeadas em meio LB com canamicina-rifampicina. As placas foram incubadas a 28°C e as colônias apareceram cerca de 48 horas depois. Posteriormente, elas foram cultivadas e usadas para a infiltração de plantas de A. thaliana.

1.10 Obtenção do scFv (APCHl) do hibridoma 1F12

A fim de obter a seqüência correspondente ao scFv (APCHl) , partimos do hibridoma 1F12 (conforme indicado nos Materiais, seção 1.5). O RNA total das células de hibridoma foi isolado utilizando o kit comercial da Roche "Tripure" e o cDNA do hibridoma que expressa o anticorpo monoclonal 1F12 foi obtido por meio de RT-PCR usando polimerase AMV-RT [Promega] . Posteriormente, a primeira PCR foi realizada com iniciadores específicos para os diferentes domínios variáveis das imunoglobulinas. Amplificação por PCR foi realizada separadamente, utilizando dois conjuntos de iniciadores especificamente hibridizados às extremidades das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves.

Os seguintes iniciadores foram utilizados na primeira PCR:

<table>table see original document page 28</column></row><table>

VH e VL: iniciadores específicos para os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas.

3 PCRs foram realizadas a fim de obter a região variável da cadeia pesada (VH) (5' VHla. Ib. Ic com 3'VHl) e 4 foram realizadas a fim de obter a região variável da cadeia leve (VL). As seqüências dos diferentes domínios foram amplificadas, como esperado, em uma das misturas de PCR para cada domínio. Essas seqüências amplificadas (VH e VL) foram clonadas diretamente no plasmídeo de clonagem pGEM-Teasy para produtos de PCR, e plasmídeos de sub-clonagem pGEM VH e pGEM VL foram obtidos, que, após o seqüenciamento dos mesmos, foram utilizados como modelos em uma segunda PCR. Nesta segunda PCR, foram amplificados com os iniciadores projetados anteriormente, ambos os domínios estando vinculados a uma seqüência flexível artificial (vinculador) . Portanto, o VH está vinculado ao vinculador na sua região 3 e VL está vinculado a esta seqüência na sua região 5' (vinculador VH3 e vinculador VL5) (Tabela 1) . Portanto, uma vez que ambos os domínios têm a seqüência artificial sobreposta, depois de vários ciclos de amplificação de ambas as seqüências, uma terceira PCR foi realizada para a obtenção de ambos os domínios vinculados a uma seqüência flexível artificial. Portanto, APCHl contém a região variável da cadeia pesada fundida, por meio de um peptídeo flexível, à região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal 1F12. Uma vez que a seqüência APCHl foi amplificada por PCR com os iniciadores específicos (wXbaI VH5 e VL3) (Tabela 1), foi clonada no plasmídeo de clonagem para produtos de PCR, pGEM-Teasy e plasmídeo de sub-clonagem pGEM-APCHl foi obtido . APCHl foi concebido de modo a incluir diversas seqüências de restrição na extremidade VL3', a fim de ser capaz de realizar a fusão de diferentes antígenos a serem analisados, e que contém a seqüência XbaI na extremidade VH5', o que torna possível extrair facilmente fusões de pGEM e levá-las para os plasmídeos de transformação de plantas. 1.11 Obtenção de plasmídeo pBI APCHl-2L21

Após o seqüenciamento do plasmídeo pGEM-APCHl e verificação da integridade do mesmo, antígeno 2L21 de CPV fusionado à região 3" de scFv APCHl foi clonada. Para este fim, a seqüência de peptídeo 2L21 foi amplificada por PCR, com iniciadores 2L2lXhoI e 2L21SmaI (Tabela 1), e foi clonada em pGEM para o seqüenciamento da mesma. Depois de verificar a seqüência, foi extraída por digestão com as enzimas XhoI e SmaI, e introduzida, de forma dirigida, no plasmídeo pGEM- APCHl, que havia sido previamente digerido com as mesmas enzimas. Após várias ligações e transformações, o plasmídeo pGEM APCH1-2L21 foi finalmente obtido, e foi seqüenciado, a fim de verificar se manteve corretamente o quadro de leitura de fusão. Posteriormente, este plasmídeo foi digerido com as enzimas XbaI e SmaI, a fim de extrair a fusão APCH1-2L21 e introduzir o plasmídeo PBI-121, que tinha sido previamente digerido com as mesmas enzimas.

Plasmídeo pBI-121 contém o gene β-glucuronidase, por esta razão, foi digerido com as enzimas HindIII e SmaI e clonado no plasmídeo P3 5S TEV com as mesmas enzimas (HindIII-SmaI) . Posteriormente, o novo vetor gerado (P35S-APCH1-2L21) , que continha o promotor 35ScaMV, a fusão APCH1-2L21, parte do poliligador (Saci, KpnI) e a seqüência de poliadenilação Vsp- ter, foi digerido com as enzimas HindIII-EcoRI, a fim de introduzir a dita fusão APCH1-2L21 no plasmídeo binário pBI- 121 digerido com as mesmas enzimas, e o plasmídeo PBI APCHl- 2L21 foi obtido. 1.12 Transformação genética de plantas mediada por A. tumefaciens

As células de Agrobacterium anteriormente transformadas com os diferentes plasmídeos de transformação de plantas foram cultivadas em 500 mL de meio LB (Sigma) , suplementado com canamicina e rifampicina (Sambrook et al. , 1989), por 48 horas a 28°C. Após centrifugação a 3.000 rpm por 20 minutos, o sedimento (que continha a bactéria) foi re-suspenso em 200 mL de meio de infiltração: 2,3 5 g/L de MS (Murashige e Skoog, 1962), 5% de sacarose, 10 g/L de 6-benzilaminopurina e 0,02% de Silweet L-77 (Lehle sementes, número de catálogo VIS-01).

1.12.1 Infiltração das flores

A fim de executar a infiltração, plantas de 6-7 semanas de idade, com o maior número possível de inflorescências, foram utilizadas. As inflorescências foram imersas no meio de infiltração com Agrobacterium numa câmara de vácuo, e foram submetidas a uma pressão de 5 kPa (50 mbar) durante 10 minutos (N. Bechtold e Pelletier G. In planta Agrobacterium -mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods Mol. Biol. 82: 259-266, 1998). Uma vez o tempo decorrido, o vácuo foi lançado o mais rapidamente possível, as plantas foram lavadas com água e cobertas com plástico para evitar o ressecamento das mesmas e de uma eventual contaminação entre as diferentes plantas infiltradas. Ocasionalmente, as plantas foram infiltradas na ausência de vácuo (Clough SJ e Bent AF Floral dip: a simplified method for Agrobacterium -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant. J. 16: 735-743, 1998). Elas foram mantidas em câmaras de cultura, sob condições controladas de luz, umidade e temperatura até o desenvolvimento e maturação dos siliques. 1.12.2 Meios de crescimento e seleção das plantas transgênicas

As sementes das plantas previamente infiltradas de A. thaliana foram esterilizadas em uma solução contendo soda cáustica a 30 % e Triton X-IOO a 10%, e foram semeadas em uma placa de Petri, em meio GM (4,7 g/L de MS, 1% de sacarose, 0,5 g/L de ácido morfolino etanossulfônico (MES) , 8 g/L de ágar, pH 5,7), suplementado com ampicilina e canamicina (Sambrook et al., 1989).

As sementes Tl foram mantidas a uma temperatura de 4 2C no escuro por 48 horas e, posteriormente, em uma câmara de cultura in vitro, sob condições controladas (16 horas de luz e 8 horas no escuro, à temperatura de 22aC). Depois de 12-15 dias, as mudas transgênicas (capazes de crescer normalmente, na presença de canamicina) foram transplantadas para o solo e levadas para câmaras de cultura para o crescimento e desenvolvimento das mesmas.

1.13 Análise das plantas transgênicas

1.13.1 Isolamento do RNA total, quantificação e eletroforese, transferência para membranas

O RNA total foi purificado seguindo o método de hidrocloreto de guanidina descrito por Logemann et al. (Logemann J., Schell J., e Willmitzer L. Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Anal. Biochem. 163: 16-20, 1987) . A quantificação do RNA foi realizada por espectrofotometria.

Para a transferência para membranas, o RNA foi resolvido em 1,5% de gel de agarose horizontal na presença de formaldeído/formamida (Sambrook et al., 1989). As amostras de RNA foram carregadas com brometo de etídio para visualizá-las por fluorescência e, assim, verificada a integridade das mesmas. Posteriormente, o RNA foi transferido para membranas Hybond N + (Amersham) utilizando 0,05 M de hidróxido de sódio por métodos convencionais (Sambrook et al., 1989).

1.13.2 Rotulagem radioativa de sondas e hibridização de ácidos nucléicos

Todas as sondas de DNA foram marcadas com 50 µCi de a32P-dCTP (Amersham ou ICN), por meio do método de extensão I aleatória de iniciador, utilizando o kit Oligolabelling (Pharmacia Biotech). Os nucleotídeos não incorporados foram eliminados por cromatografia de exclusão molecular em colunas S-200 (Pharmacia Biotech), seguindo as instruções do fabricante. Os diferentes fragmentos de DNA usados como sondas (seqüências completas dos genes de fusão), bem como o método utilizado para obtê-los, são mostrados em detalhes abaixo.

TABELA 3

<table>table see original document page 33</column></row><table>

* N , Northern blot; S, Southern Blot

As hibridações do ácido nucléico foram realizadas em tubos de vidro contendo 10-15 mL de solução de pré-hibridização. As membranas foram pré-hibridizadas por, pelo menos, duas horas à temperatura de hibridização. Uma vez que este tempo decorreu, a sonda marcada radioativamente desnaturada foi adicionada e as membranas foram mantidas nesta solução por 16 a 20 horas. As hibridizações de baixo rigor do tipo Southern foram realizadas em uma solução de pré-hibridização com 5X SSPE (0,15 M de NaCl, 10 mM de NaH 2 PO 4, 1 mM de EDTA Na2), Solução de Denhardt 5X (0,02% de Ficoll, 0,02% de polivinilpirrolidona, 0,02% de albumina de soro bovino, 0,5% de sódio dodecil sulfato (SDS) e 0,5 mg/mL de DNA de esperma desnaturado). A hibridização foi realizada a 659C. Após a hibridização, as membranas foram submetidas a lavagens sucessivas com 5X SSPE e SDS a 0,5%, diminuindo a concentração de sal a cada lavagem.

As hibridizações do tipo Northern foram realizadas em 42sC em 0,25 M de tampão fosfato, pH 7,2, 0,25 M de NaCl, 1 mM de EDTA, 7% de SDS, 10% de PEG 6000, 40% de formamida e 0,2 mg/mL de DNA de esperma desnaturado. Após a hibridização, as membranas foram submetidas a lavagens sucessivas com 5X SSPE e 0,5% de SDS, a 65aC. Cada lavagem durou aproximadamente 20 minutos. Ocasionalmente, era necessário lavar com SDS 0,5%.

As membranas foram expostas ao filme de autoradiografia (Hyperfilm MP, Amersham) e telas de intensificação, a -80aC, durante o tempo necessário para visualizar as bandas de hibridização. A fim de reutilização das membranas, estas foram hibridizadas com solução de SDS a 5% em ebulição, com agitação até o resfriamento da solução. A fim de verificar que nenhuma radioactividade permaneceu na membrana, os filtros foram expostos a filmes de autoradiografia por vários dias.

1.14 Análise de proteínas recombinantes produzidas em plantas transgênicas

1.14.1 Obtenção da proteína solúvel total

Material vegetal fresco, geralmente obtido a partir de folhas basais de plantas de roseta, foi homogeneizado em tampão de extração de proteínas (10 mM Tris, pH 7,5, 500 itiM NaCl, 0,1% Triton X-100, de 1% β-mercaptoetanol e 1 mM de PMFS como inibidor de protease), depois de ser cortado e introduzido em tubos de 1,5 mL de Eppendorf e mantido em gelo (4 °C) . Após homogeneização, foram centrifugados por 10-15 minutos a 13.000 rpm, e o sobrenadante foi coletado. Em alguns casos, o material congelado foi utilizado. A fim de dissolver algumas das proteínas precipitadas e melhorar o rendimento de extração, um tampão contendo uréia foi utilizado. A análise das proteínas foi realizada em géis de eletroforese bisacrilamida-acrilamida (30:1) na presença de SDS.

1.14.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida-glicina na presença de SDS

A eletroforese de proteínas em condições de desnaturação foi realizada em géis de acrilamida-bisacrilamida descontínuos, na presença de SDS, seguindo o método convencional (Sambrook et al. , 1989). Géis de separação de

Acrilamida-bisacrilamida foram preparados (BioRad ou Serva) , em concentrações variáveis entre 7% e 15%, dependendo do peso molecular esperado da proteína a ser analisada, em conjunto com géis de espessamento com uma concentração de 3,5% de acrilamida-bisacrilamida (Sambrook et al., 1989). A eletroforese foi desenvolvida por uma tensão constante entre 100 e 140 V, no caso de minigéis (7x9 cm) .

Todas as amostras foram quantificadas após a separação de fato por eletroforese, em conformidade com o método de Bradford-Lowry (ensaio de proteína BioRad). Eles foram solubilizados em tampão de dissociação de proteína (0,5 M

Tris, pH 8,0, SDS 10%, glicerol, β-mercaptoetanol, 0,02% azul de bromofenol), aquecidos durante 5 minutos a 100°C e, posteriormente, aplicados ao gel. 1.14.3 Transferência de proteínas para filtros de nitrocelulose

A transferência das proteínas para filtros de nitrocelulose (Bio-Rad 2) foi realizada em um cuvette úmido a uma tensão constante de 100 V por 1 hora, ou por transferência semi-seca (Bio-Rad) por 25 minutos a 20 volts. Em ambos os casos, o tampão de transmissão também foi utilizado (25 mM Tris, 151,8 mM de glicina e 20% de metanol (v/v)).

1.14.4 Coloração das proteínas com Vermelho Ponceau transferidas para nitrocelulose

Uma vez que as proteínas foram transferidas para os filtros de nitrocelulose, estes foram corados, a fim de verificar a integridade dos mesmos, com uma solução de Ponceau 0,2% (Sigma) em 30% de ácido tricloroacético (p/v) e 30% de ácido sulfosalicílico (p/v) por 1 minuto por imersão.

Posteriormente, foram lavados com água destilada para eliminar o excesso de corante.

1.14.5 Análise de proteínas por imunoblotting ou Western blotting

Uma vez que as proteínas foram transferidas e imobilizadas em filtros de nitrocelulose, os ditos filtros de nitrocelulose foram bloqueados em 37°C durante 1 hora, com 2 % de leite em pó desnatado (p/v) em PBS, ou por toda a noite a 4°C, sob agitação, com o bloqueio da mesma solução. Posteriormente, os filtros foram incubados por uma hora com o anticorpo específico diluído em 0,05% de PBS-Tween 20 (v/v) na concentração adequada para cada ensaio. Os filtros foram lavados três vezes durante 10 minutos em tampão de lavagem (PBS-Tween IX) de cada vez e incubados na mesma solução de diluição com o anticorpo secundário correspondente, à temperatura ambiente por uma hora. Depois de repetir as lavagens, o desenvolvimento foi realizado utilizando o substrato adequado a partir da conjugação do anticorpo secundário (NBT-BCIP (Roche), ECL (Amersham)).

1.15 Análise imunogênica das proteínas expressas em plantas

1.15.1 Obtenção dos soros

Os soros foram obtidos através da incubação do sangue a 37°C por 30 minutos, seguido por umas 14 horas ao longo da incubação a 4aC. Os coágulos de sangue foram separados e as amostras foram clarificadas por centrifugação a 1.500 rpm por 10 minutos.

1.15.2 Detecção de anticorpos por ELISA

As placas de ELISA foram alinhadas com 0,2 ug de peptideo 2L21 por poço, diluído em tampão de ligação (carbonato/bicarbonato) , a 42C por 12 horas. Elas foram bloqueadas com uma solução de 0,05% PBS-Tween-20 v/v) e 5% de soro fetal bovino ou BSA, a 37aC durante 1 hora sob agitação. Depois de lavar 3 vezes com solução 0,05% PBS-Tween 20, o soro a ser determinado foi incubado em diferentes diluições em 0,05% de PBS-Tween 20, a 37eC por 1 hora, sob agitação. Após cinco lavagens com PBS-Tween, os poços foram incubados com solução 0,05% PBS-Tween-20 que continha conjugado com peroxidase anti-rato (Amersham) com uma diluição de 1/500, a 37°C por 1 hora, sob agitação. As placas foram lavadas e desenvolvidas com fenilenodiamina (OPD) (Sigma-Aldrich) como substrato, preparado em água contendo 0,1% de peróxido de hidrogênio. As reações foram interrompidas com ácido sulfúrico 3N e, posteriormente, a absorbância de cada placa foi lida em iam leitor de ELISA em um comprimento de onda de 492 nm.

A fim de detectar anticorpos contra o capsídeo do parvovírus canino, o Kit INGEZIM PARVO CANINO 1.5.CPV.K.1 (Ingenasa) foi usado, que é concebido para a detecção e quantificação de anticorpos específicos contra o parvovírus canino em soros de cães.

Para determinar o título de anticorpos no soro analisado pelo ELISA, diluições seriadas dos soros a serem titulados foram realizadas, expressando o título de cada soro como o inverso da diluição máxima do soro onde a dita absorvância a 492 nm foi significativamente maior do que a dos controles negativos (2 vezes maior).

1.15.3 Caracterização de anticorpos por Imunoblotting

A especificidade do antígeno dos anticorpos obtidos de animais imunizados foi determinada por meio de imunoblotting. A proteína do capsídeo VP2 produzida em baculovírus (Ingenasa) foi re-suspensa em tampão de dissociação da proteína, fervida por 5 minutos e carregada em gel de glicina-poliacrilamida na presença de SDS e transferida para uma membrana de nitrocelulose (BioRad). Os soros de camundongo foram testados em uma diluição limite de 1/10, e o anticorpo secundário anti- camundongo foi conjugado com fosfatase alcalina (Roche). 0 substrato utilizado para a reação foi nitroblue-tetrazólio-4- cloro-3-indolfosfato (NBT-BCIP, Roche). 1.16 Modelos experimentais e vacinas

1.16.1 Vacinação de camundongos com extratos de plantas por via intraperitoneal

Os ratos fêmeas dos estoques Suíços, de 11 semanas de idade, foram imunizados, por via intraperitoneal, nos dias 0, 7 e 14, com extratos de plantas que expressam a proteína recombinante sob estudo (APCH1-2L21) (3 mg da proteína solúvel total/dose).

Adjuvante completo de Freund (Sigma) foi utilizado para a primeira inoculação e adjuvante incompleto de Freund (Sigma) foi utilizado para o resto.

Os ratos controle foram imunizados, usando o mesmo protocolo, com extratos de plantas não transformadas ou extratos de plantas transformadas com o vetor sem o transgene. Dez dias após a última imunização, os camundongos foram sangrados e os soros foram obtidos a fim de serem estudados.

1.17 Obtenção do anticorpo recombinante APCHl de cadeia única fusionado ao peptídeo 2L21 e sua expressão em plantas transgênicas

A obtenção do anticorpo recombinante (scFv) de cadeia única chamado APCHl nesta descrição foi realizada por meio de amplificações de PCR de RNAm, a partir de hibridomas 1F12 e posterior clonagem molecular, tal como descrita na seção Materiais e Métodos. A construção final é composta do domínio variável de cadeia pesada (VH) com o peptídeo de sinal do anticorpo 1F12 nativo, o domínio variável de cadeia leve (VL) onde o peptídeo sinal e um peptídeo artificial flexível que os une foram eliminados. Após seqüenciamento do gene quimérico resultante e verificação da integridade dos mesmos, antígeno 2L21 de CPV fusionado à região 3' de APCHl foi clonado. Para este fim, a seqüência do antígeno 2L21 foi amplificada por PCR, com iniciadores específicos que permitem manter o quadro de leitura de fusão aberto. Na seqüência de várias sub- clonagens, este fragmento foi introduzido no plasmídeo binário pBI 121, levando ao plasmídeo pBI APCHl-2L21, que contém o promotor constitutivo 35S, este último dirige a expressão da seqüência correspondente à proteína de fusão e a seqüência de poliadenilação do gene Nos de Agrobacterium (Figura 1). Este plasmídeo foi introduzido em Agrobacterium tumefaciens, onde plantas de Arabidopsis thaliana foram transformadas por meio da infiltração floral (Clough, SJ e Bent, AF 1998. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16: 735-743).

1.18 Análise da expressão do antígeno de fusão (APCH1-2L21) nas plantas transgênicas obtidas

Após a transformação das plantas, várias linhagens transgênicas com um fenótipo semelhante ao selvagem foram obtidas. Posteriormente, cerca de 30 linhagens transgênicas independentes foram analisadas para determinar a expressão do transgene e a acumulação da proteína de fusão (APCH1-2L21). Anteriormente, scFv diferentes foram expressos em plantas com diferentes objetivos, e uma grande variação na expressão e nos níveis de acúmulo destas moléculas foi obtida por Fiedler, U. e Conrad, U. 1995. High-Ievel production and long-term storage of engineered antibodies in transgenic tobacco seeds. Biotechnology (NY) 13: 1090-1093. Portanto, o primeiro passo foi estudar a transcrição correta do transgene para posteriormente analisar os níveis de acumulação da proteína de fusão. O RNA total das linhagens diferentes foi obtido a partir de folhas frescas de plantas transformadas com esta construção, separando os RNAs diferentes em gel de formamida- agarose e, posteriormente transferindo estes para filtros de nitrocelulose, a fim de serem analisados. Os Northern blots realizados sobre estes filtros, usando a seqüência completa de fusão (APCH1-2L21) como uma sonda, mostraram que algumas linhagens transgênicas apresentaram uma banda de hibridização muito intensa do tamanho esperado para o mRNA correspondente à proteína de fusão (Figura 2).

Posteriormente, a fim de verificar a tradução correta e acúmulo da proteína recombinante em células vegetais, géis com 12 % de SDS-PAGE foram realizados com extratos da proteína solúvel total destas linhagens. Para este fim, anticorpo monoclonal 3C9 (Ingenasa), específico para peptídeo 2L21, foi utilizado na análise de Western blot. Essas análises revelaram a presença de uma banda de aproximadamente 32 kDa, correspondente à proteína APCH1-2L21, nos extratos das linhagens que apresentaram o maior acúmulo de níveis de mensageiros.

Como pode ser observado na Figura 2, existe uma correlação positiva entre os níveis de transcrição detectados e a proteína nas linhagens analisadas, de tal forma que as plantas com os mais altos níveis de mRNA exibiram maior acúmulo desta proteína. A estrutura tridimensional prevista de APCH1-2L21 indica que é uma proteína globular, e não uma multimérica (Figura 1C) . Estes resultados indicam que não existem obstáculos para transcrição e tradução desta proteína de fusão no citoplasma de células de A. thaliana. 1.19 Análise da capacidade de ligação ao seu antígeno alvo em células apresentadoras de antígeno do anticorpo recombinante fusionado ao peptídeo vacina (APCH1-2L21)

A fim de verificar que a proteína de fusão APCH1-2L21 produzida em plantas manteve as características de reconhecimento do antígeno do anticorpo original 1F12, fluorescência e ensaios imunohistoquímicos foram realizados com macrófagos alveolares de suínos, que têm um grande número destes receptores (SLA -DR classe II).

Para estes ensaios, os macrófagos alveolares, previamente marcados com 1 pg de proteína solúvel foram extraídos de plantas transformadas com o plasmídeo pBI APCH1-2L21, e foram incubados durante a noite a 42C. Posteriormente, após a lavagem dos macrófagos com PBS-Tween, a fim de eliminar ligações inespecíficas, uma segunda incubação foi realizada com anticorpos específicos 3C9 contra epítopos 2L21. Posteriormente, o imuno-complexo foi desenvolvido de duas maneiras diferentes. Para imunofluorescência, um anticorpo conjugado anti-camundongo Alexa-FluorTM488 de cabra (Molecular Probes) foi utilizado, nos quais os rótulos eram verdes. No caso da marcação com peroxidase, um anticorpo anti-rato de ovelhas conjugado com peroxidase (Amersham Pharmacia) foi usado, o qual foi rotulado de marrom. Como controle negativo, os macrófagos foram incubados em paralelo com extratos de plantas transformadas com o plasmídeo pBI-TEV Vp60, nas mesmas condições, e o sobrenadante (10 ug) do hibridoma que expressa o anticorpo 1F12 foi utilizado como controle positivo.

Como um resultado deste experimento, a rotulagem só foi obtida nos macrófagos incubados com o sobrenadante do hibridoma 1F12 e nos extratos de plantas que expressavam APCH1-2L21, enquanto nenhum sinal apareceu no controle negativo. Uma rotulagem padrão específica foi encontrada na superfície dos macrófagos com os dois conjugados, que foi muito similar nas células tratadas com o sobrenadante do hibridoma e nos extratos de plantas que expressam APCH1-2L21 (Figura 3).

Estes resultados confirmam a funcionalidade e a atividade da proteína de fusão APCH1-2L21 expressa em plantas, que mantém a sua especificidade para moléculas de SLA-DR classe II de macrófagos alveolares suínos.

1.20 Estudo do aumento da imunogenicidade conferida ao peptídeo 2L21 pelo anticorpo APCHl

A fim de avaliar a eficácia da molécula de aumento da resposta imune fornecida por esta invenção, cinco camundongos fêmeas dos estoques Suíços, com 11 semanas de idade, foram imunizadaos com a imunização, por via intraperitoneal, nos dias 0, 7 e 14, com extratos de plantas (3 mg de proteína solúvel total/dose), que expressam a proteína recombinante em estudo, o mesmo peptídeo 2L21 fundido a uma proteína irrelevante (β-GUS), ou com 100 mg de peptídio sintético 2L21.

Adjuvante completo de Freund (SIGMA) foi utilizado para a I primeira inoculação e adjuvante incompleto de Freund (SIGMA) foi utilizado para o resto. Dez dias após a última imunização, os camundongos foram sangrados e os soros foram obtidos a fim de serem estudados.

Como resultado deste estudo, o peptídeo fundido ao anticorpo induziu títulos de anticorpos em ratos que foram 600 vezes superior aos obtidos com o peptídeo isolado e mais de 50 vezes superior aos obtidos com o peptídeo fundido a uma proteína irrelevante (Figura 4) . Esse dado confirma a hipótese do aumento da imunogenicidade de um peptídio através do seu direcionamento para células apresentadoras de antígenos através de anticorpos APCHl. Além disso, experimentos comparativos da imunogenicidade deste peptídeo fusionado à proteína KLH, um transportador habitual para as vacinas de peptídeos, e fundido ao anticorpo APCHl mostrou que o antígeno de direcionamento para o anticorpo gerou um número de moléculas de anticorpos por molécula de peptídeo, que foi 26 vezes maior.

exemplo 2. Direcionamentos de antigenos vacinais para células apresentadoras de antigenos para a melhoria da resposta imune nos animais. Fusão do anticorpo recombinante de cadeia única Q) APCHl à proteína E2T do Vírus da Diarréia Viral Bovina e a sua expressão em células de mamíferos

2.1 Células

Células CHO-Kl de mamíferos (células do ovário) livres de vírus acidental, obtidas a partir da seção Cell Culture do Instituto de Virologia (PVA76/04) foram utilizadas. Células CHOKl de mamíferos (células de ovário de hamster chinês) foram usadas.

2.2 Cepas de Escherichia coli utilizadas

Cepas DH5 de Escherichia coli (Clontech), as quais apresentam as seguintes características, foram utilizadas para a transformação e o crescimento dos plasmídeos:

• Cepa bacteriana: DH5-a

• Genótipo: supE44 hsd Rl 7 recAl endAl gyrA9 6 thi-1 relAl

• Unidades Notáveis: Cepa deficiente em recombinação, utilizada para revestimento e crescimento de plasmídeos. 2.3 Plasmídeos utilizados

2.3.1 Plasmideos Comerciais

A fim de obter diferentes construções que expressam os diferentes peptídeos analisados, vários plasmídeos comerciais foram utilizados. Plasmídeo pGEM-Teasy foi utilizado para a clonagem e seqüenciamento dos produtos de PCR, enquanto plasmídeo pcDNA 3.1 foi utilizado para a geração da linhagem estável de mamífero:

• pGEM-Teasy (Promega): este plasmídeo é especialmente concebido para a clonagem e seqüenciamento de produtos de PCR. Ele contém uma região com vários sítios de restrição (poliligador). O poliligador tem sido previamente digerido com EcoRV e, posteriormente, 31-timidinas foram adicionadas em ambas as extremidades para facilitar a clonagem dos produtos de PCR. Além disso, torna-se possível selecionar os recombinantes por meio do gene lacZ.

• pcDNA 3.1 (Invitrogen) : este plasmídeo é derivado do pcDNA3 e foi projetado para a expressão transiente, estável, em células de mamíferos. O vetor contém os seguintes elementos.

2.3.2 Plasmídeos de transformação de células de mamíferos desenvolvidos durante a execução da presente invenção

Para a materialização deste exemplo, o plasmídeo identificado como pcDNA APCH1-E2T foi gerado, o qual foi utilizado na transformação das células CHOK-1. O antígeno expresso no dito plasmídeo vem da fusão de APCH1 com a proteína E2 secretora, sem o seu domínio transmembrana (E2T), do Vírus da Diarréia Viral Bovina (VDVB).

As seqüências que codificam o dito antígeno e as suas respectivas fusões foram obtidas por amplificação por PCR. Os iniciadores utilizados estão listados na tabela a seguir:

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Posições 2-7 da SEQ ID NO: 19 são os alvos de restrição.

A fim de detectar a proteína recombinante produzida no sobrenadante de células de mamíferos, um anticorpo monoclonal comercial de rato e um soro policlonal de coelho desenvolvidos especificamente para esta finalidade, e os respectivos anticorpos secundários conjugados com fosfatase alcalina (AP) e/ou peroxidase (HRP), foram utilizados:

<formula>formula see original document page 46</formula>

<formula>formula see original document page 46</formula>

<formula>formula see original document page 46</formula> 2.4 Transfecção da linhagem celular CHOK 1

Para obter a linhagem estável, o método de transfecção previamente padronizado no laboratório foi usado.

Linhagens transfectadas de maneira estável foram obtidas. Para este efeito, frascos T-75 com monocamadas de CHO-Kl foram transfectados com Lipofectamina numa confluência de 80%. Uma monocamada de células foi transfectada com pcDNA E2T e ρcDNAAPC Hl E2T com um vetor de mesma série de pcDNA 3.1 (Invitrogen) que continha o gene IacZ, a fim de usar essa linhagem para mais facilmente verificar a evolução e o desenvolvimento das linhagens estáveis. Às 24 h pós- transfecção, uma sub-cultura das células transfectadas foi realizada em quatro T-75s e o processo de seleção foi iniciado pela adição do antibiótico geneticina (Invitrogen) na concentração de 700 ug/mL de meio de cultura. Nos 14 dias de cultura, a presença de focos de células resistentes ao antibiótico escolhido foi evidente. Naquela época, uma nova sub-cultura de células foi realizada e uma primeira rodada de isolamento de células individuais por diluição limite foi P iniciada em placas 96. Aos 21 dias de cultura, os focos foram novamente observados e uma nova rodada de diluição limite foi iniciada, a fim de isolar clones individuais. 0 processo de diluição limite foi repetido duas vezes para cada rodada. A maior diluição que deu positivo por Western blot para a expressão das proteínas recombinantes foi utilizada no segundo processo de diluição limite. Finalmente, os clones positivos foram amplificados e congelados em nitrogênio líquido para o armazenamento (Figura 5). 2.5. Detecção da proteína recombinante em linhagens celulares desenvolvidas

2.5.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)

Eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE) foi realizada de acordo com o método descrito por LaemmLi UK, usando o sistema de gel descontínuo em xim equipamento Mini Protean II (Bio-Rad). Este último é composto por um gel de empilhamento, com uma concentração de 1,7% de poliacrilamida (m/v), e um gel de separação, com uma concentração de 8% de poliacrilamida (m/v). As amostras foram pré-incubadas com tampão de semeadura (12,5% de Tris-HCl v/v (pH 6.8), 10% de glicerol v/v, 2% de SDS m/v, 5% de β- mercaptoetanol v/v, 0,2% de azul de bromofenol m/v) por 5 minutos em banho-maria em ebulição. Uma vez que a semeadura foi realizada a separação eletroforética foi realizada em tampão de corrida IX (5X tampão execução: 1,5% Tris base m/v, 7,2% de glicina m/v, 0,5% SDS m/v), aplicando uma tensão constante de 100 V por 4 horas.

2.5.2 Western blot

Uma vez que a separação eletroforética foi concluída, electrotransfer em membranas de PVDF com um poro de tamanho de 0.45-μm (Immobilon Transfer Membrana-Millipore) foi realizado. Foi realizado por 60 min a 20 V em um equipamento Mini Protean II (Bio-Rad) contendo solução de transferência de IX (25 mM Tris Base, 192 mM de glicina, 0.15% de SDS v/v, 20% de metanol v/v). Assim que a transferência foi concluída, a superfície da membrana foi bloqueada com solução de bloqueio (3% leite desnatado em pó (Molico) m/v em PBS Tween 0,05% buffer v-1X/v) a 37°C por 1 h. Posteriormente, foi incubado em temperatura de 4°C, com um anticorpo monoclonal anti-E2 (CA3-Bommelli) convenientemente diluído em solução de bloqueio. Posteriormente, foram incubadas com um anticorpo monoclonal anti-IgG de rato conjugado com peroxidase (KPL) convenientemente diluído em solução de bloqueio à temperatura ambiente por 1h. Após as incubações, três lavagens em 0,05% de PBS-Tween IX v/v foram realizadas, durante 10 minutos cada.

A membrana foi incubada com o substrato da enzima peroxidase, o kit comercial Western Lighting Chemiluminescence Reagent Plus (Perkin Elmer LAS, Inc.) foi utilizado, seguindo as recomendações do fabricante.

Finalmente, a membrana foi exposta em placas fotossensíveis(HyperfiIm-Amersham Biosciences) e, posteriormente, desenvolvida em solução reveladora radiográfica (G 150 Agfa) , que foi posteriormente lavada em 2% de ácido acético v/v, e, finalmente, fixada em solução fixadora radiográfica (G 334 Agfa).

2.5.3 Coloração com Coomassie

Uma vez que a corrida eletroforética foi concluída, o gel foi submetido à coloração com 0,1% m/v de Coomassie Brilhante Azul R-250 (Sigma) em uma mistura de metanol: ácido acético: água (40: 10: 50). A fim de descolorar o gel, uma solução de descoloração (metanol: ácido acético: água, 5,0: 7,5: 87,5, respectivamente) foi utilizada. A descoloração foi realizada sob agitação à temperatura ambiente.

2.5.4 ELISA sanduíche para a detecção de APCH1-E2T e E2T de sobrenadante de cultura de células

Placas Maxisorp (NUNC) foram sensibilizadas com anticorpo monoclonal 2.9H, devidamente diluído em tampão carbonato- bicarbonato (1,59 g/L Na2CO3, 2,93 g/L, NaHCO3), a 4 °C. Posteriormente, a placa foi bloqueada com solução de bloqueio (0,1% IX PBS-Tween 20 v/v, 1% de leite desnatado m/v), incubando-se a 37°C por 1 h. Posteriormente, as amostras a serem analisadas foram incorporadas (sobrenadante de CHO-Kl- APCH1-E2T ou células E2T), incubando as placas a 37°C por 1 h. Ela foi lavada 5 vezes e incubada a 37°C por 1 h com um soro policlonal de coelho contra a glicoproteína E2, na diluição adequada. Uma vez lavada cinco vezes e, finalmente, um anticorpo monoclonal anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase (KPL), devidamente diluído, foi incorporado, incubando a 37°C por 40 minutos. Foi lavada 5 vezes e o substrato peroxidase (0,55 mg/mL ABTS, 0,015% de H2O2, tampão citrato (pH: 5) ) foi colocado. A reação foi interrompida com 5% de SDS m/v. Leitura das placas foi realizada em 405 nm (leitor de ELISA, Ex Multiskan, Labsystems Inc). As diluições foram realizadas em solução de bloqueio, as lavagens foram feitas com PBS IX e um volume de 50 uL por poço foi usado.

2.6 Purificação da E2T a partir de CHOKl APCH1-E2T e sobrenadante de célula CHOKl E2T

Uma vez que a monocamada foi formada (normalmente 72 h) , o sobrenadante foi colhido, PMSF na concentração final de 1 mM foi adicionado, e foi preservada a -20°C até que ela estivesse para ser utilizada.

O sobrenadante foi descongelado e a força iônica foi aumentada com a solução de lavagem 10X (3 M NaCl, 0,5 M NaHPO4). 20 mM de Imidazol foi adicionado e o pH foi levado para 8 com 10 N de NaOH.

Por outro lado, o níquel foi equilibrado com a solução de lavagem de ligação de IX (0,3 M NaCl, 0,05 M NaHPO4) com 20 mM de Imidazol e incubado sob agitação durante 30 minutos a 4°C. Foi centrifugado a 2.500 g por 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e o níquel foi incubado com o sobrenadante a 4°C, sob agitação.

Foi centrifugado a 2.500 g por 3 minutos, o sobrenadante foi descartado e foi lavado com a solução de lavagem de ligação de IX, adicionando 13 mM de imidazol, 1 mM de PMSF, 1 mM de leupeptina a 4°C por 15 minutos, até a absorção do sobrenadante em 280 nm ser baixa e constante.

Finalmente, a eluição foi realizada com solução de eluição (a solução de lavagem de ligação de IX com 200 mM de imidazol, 1 mM de PMSF, 1 mM de leupeptina) , incubando-se a 4°C por 15 minutos sob agitação. Foi centrifugado a 2.500 rpm por 3 minutos e o sobrenadante foi recuperado.

2.7 Análise da imunogenicidade das proteínas expressas em plantas

2.7.1 Imunização de cobaias

200-300-g de cobaias da cepa AL II, fornecidos pelo Biotério do Centro de Pesquisas em Ciências Agronômicas e Veterinárias (CICVyA), INTA (Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuária) de Castelar. Duas doses de 1 mL de vacina oleosa (aquosa:oleosa, 40%:60%) foram inoculadas no dia 0 e 30 por via intramuscular (500 pL para cada perna).

Antes de cada inoculação, os animais foram sangrados por punção cardíaca, extraindo 3 mL de sangue por animal. Ele foi incubado a 379C durante 1 h, e em 43C por 3 0 minutos. O soro foi extraído por centrifugação a 1.000 g por 15 minutos, aliquotado e conservado a -2 0aC até que ele estivesse para ser utilizado.

Durante a experimentação, os animais foram mantidos em grupos de quatro em gaiolas de 1 m2, que foram mantidas em um recinto isolado do exterior, sob uma atmosfera ventilada. As camas das gaiolas e a água foram trocadas periodicamente.

2.7.2 Imunização de bovinos

Bovinos não-infectados de soro negativo do INTA foram utilizados, os quais haviam sido previamente testados para verificar sua condição de saúde por meio de ELISA, SN e PCR.

Os bovinos foram imunizados com duas doses da vacina para serem testados, uma no tempo inicial e outra aos 30 dias após a primeira vacinação. A imunização foi realizada por via intramuscular. 0 volume de inóculo foi de 5 mL. Amostras de sangue foram realizadas a cada sete dias após a vacinação para a posterior análise" de anticorpos no soro.

2.7.3 Obtenção dos soros

Os soros foram obtidos através da incubação do sangue a 37°C por 30 minutos, seguido por uma incubação de 14 horas a 4°C. Os coágulos de sangue foram separados e as amostras foram clarificadas por centrifugação a 1.500 rpm por 10 minutos.

2.7.4 Soroneutralisação Viral (SN)

O nível de anticorpos neutralizantes (NA) foi determinado após o protocolo de Howard et al. (1987).

2.7.5 Detecção de anticorpos por ELISA

0 nível de anticorpos foi determinado utilizando um ensaio ligeiramente modificado com base no ELISA desenvolvido por Marzocca et al. (2007). 2.8 Produção de proteína APCHl E2T e E2T nas células CHOK 1

Os clones selecionados foram cultivados em meio MEM-E (Gibco) , 10% de SFB (Quiroga) e 1% de antibióticos (penicilina, estreptomicina, gentamicina). A fim de avaliar a produção de proteínas recombinantes no sobrenadante das linhagens desenvolvidas, estas últimas foram cultivadas em frascos de T75 (Figura 6A) e em roletes (Figura 6B) . Em cada cultura, a cinética de secreção de proteínas recombinantes foi estudada. Os ensaios foram realizados em duplicata para cada um dos grupos T7 5 com e sem DMSO, e os grupos rolete, com e sem DMSO. No caso do T75, 3 x 10^6 de células foram semeadas no tempo 0, enquanto que os roletes foram iniciados com 16 x 10^6 células, a fim de manter a proporção de células por volume entre os dois. 1 mL foi extraído a cada 24 horas e foi preservado a -2O°C até o teste ser realizado.

2.9 Purificação de APCH1E2T e E2T por cromatografia de quelato metal (XMAC):

Usando o protocolo descrito no ponto 2.3, a proteína APCH1-E2T foi obtida com um elevado grau de pureza e o aparecimento de uma única banda para E2T e de três bandas para APCH1-E2T foi gravado, a banda mais pesada pertencia à proteína de fusão, a banda intermediária, provavelmente, pertencia aos vestígios de BSA, a mais leve é um produto da proteólise do APCHl E2T (confirmado por Western blot). O rendimento aproximado de todo o processo foi da ordem de 100 μg de proteína purificada para cada 1 litro de sobrenadante (Figura 7) . 2.10 Reconhecimento de APCHl E2T em direção a células mononucleares de sangue periférico MHC classe Il (PBMC) de diferentes espécies

PBMCs foram purificados de sangue heparinizado de diferentes animais (bovinos, suínos, eqüinos, caprinos e ovinos) com FicolI-Hypaque (Amersham). As células obtidas desta forma foram posteriormente incubadas com PBS (controle isotípico), E2T ou APCHl E2T, e posteriormente rotuladas com um anticorpo monoclonal de rato anti-E2 (VDVB, cepa NADL) e um anticorpo monoclonal anti-IgG de rato acoplado à ficoeritrina. As células marcadas foram analisadas em um citômetro de fluxo, e os resultados foram reportados como porcentagem de células positivas, que foram as células que tiveram uma intensidade de fluorescência dentro de uma escala de intensidade que está fora do rótulo pertencente ao controle isotípico. Em todas as espécies analisadas, a ligação do APCH1-E2T foi significativamente maior que a obtida para E2T.

2.11 Estudo do aumento na imunogenicidade conferida para proteína E2T pelo anticorpo APCHl

A fim de avaliar a eficácia da molécula de aumento da resposta imune fornecida por esta invenção, ensaios foram realizados em um modelo experimental (cobaias) e em bovinos (alvo final para o qual a molécula fusão APCHl-E2 T foi desenvolvida).

2.11.1 Ensaios em cobaias

Os grupos experimentais usados para avaliar a molécula APCH1-E2T são mostrados na tabela 2. Como pode ser observado, proteína E2T fundida ao anticorpo induziu títulos de anticorpos neutralizantes superiores aos obtidos com proteína E2T em cobaias (Figura 9). Grupos experimentais:

<table>table see original document page 55</column></row><table>

2.11.2 Ensaios em bovinos

Uma vez que o aumento da resposta imune no modelo experimental de cobaias foi obtido, a capacidade de reforço da molécula APCHl em bovinos foi avaliada. A Tabela 3 mostra os grupos experimentais ensaiados. Com a dose mais alta (1 ug) , não foram detectadas diferenças entre os grupos experimentais (Figura 10A) , porém, com a dose de 0,2 ug, proteína APCH1-E2T acabou por ser mais eficiente do que da proteína per se, uma vez que permitiu uma resposta do anticorpo específico (Figura 10B) . Da mesma forma, quando o título de anticorpos obtido para a dose de 0,2 ug, foi calculado, observou-se que apenas a molécula APCH1-E2T foi capaz de induzir anticorpos específicos (Figura 10C). Grupos experimentais:

<table>table see original document page 55</column></row><table>

Claims (21)

1. Construção gênica caracterizada por compreender, operacionalmente ligadas, pelo menos: a) uma seqüência de nucleotídeos (A) , que codifica um polipeptídeo com SEQ ID NO: 1, que tem uma região que reconhece a cadeia β do antígeno DR Classe II presente na superfície de células apresentadoras de antígenos; e b) uma seqüência de nucleotídeos (B) , que codifica um antígeno vacinai de interesse, susceptível de induzir uma resposta imune no hospedeiro em que é introduzido.

2. Construção gênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o antígeno vacinai de interesse é selecionado do grupo: peptídeo 2L21 do parvovírus canino, proteína VP60 do vírus da doença hemorrágica do coelho, proteína VP6 do rotavírus, proteína E2 ou E2T do vírus da diarréia viral bovina ou a proteína hemaglutinina do vírus influenza.

3. Construção gênica pBIAPCHl-2L21, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de compreender uma seqüência de nucleotídeos (A) , que codifica a SEQ ID NO: 1 e uma seqüência de nucleotídeos (B) , que codifica a SEQ ID NO: -21, correspondente ao antígeno vacinai 2L21 do parvovírus canino.

4. Construção gênica pcDNAAPCHl-E2T, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de compreender uma seqüência de nucleotídeos (A) , que codifica a SEQ ID NO: 1 e uma seqüência de nucleotídeos (B), que codifica a SEQ ID NO: -23, correspondente ao antígeno vacinai E2T do vírus da diarréia viral bovina.

5. Construção gênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizada pelo fato de adicionalmente compreender uma seqüência de ácido nucléico (C), que codifica um peptídeo espaçador.

6. Construção gênica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato do peptídeo espaçador ser selecionado a partir da SEQ ID NO: 2 e / ou SEQ ID NO: 3.

7. Construção gênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizada pelo fato de adicionalmente compreender uma seqüência de ácido nucléico (D) , que codifica um peptídeo susceptível de ser utilizado para propósitos de isolamento ou purificação, localizado a jusante da extremidade 3' da seqüência de nucleotídeos (B) .

8. Construção gênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizada pelo fato de adicionalmente compreender seqüências promotoras, seqüências que codificam reguladores transcricionais, seqüências de ligação de ribossomo (RBS) e / ou seqüências de terminação de transcrição.

9. Construção gênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizada pelo fato de adicionalmente compreender um marcador selecionado a partir de genes de resistência a antibióticos e / ou genes que conferem resistência a compostos tóxicos.

10. Vetor de expressão recombinante, útil para transformar células vegetais ou animais em geral, e células humanas, em particular, caracterizado por compreender qualquer uma das construções gênicas de acordo com as reivindicações de -1 a 9.

11. Vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ser Agrobacterium tumefaciens.

12. Vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ser um vírus, de preferência Baculovirus.

13. Célula transformada ou transfectada com o vetor de acordo com as reivindicações 10 a 12, caracterizada por compreender qualquer uma das construções gênicas das reivindicações de 1 a 9 no seu genoma.

14. Planta transgênica transformada ou transfectada com o vetor de acordo com as reivindicações 10 ou 11, caracterizada por compreender qualquer uma das construções gênicas das reivindicações de 1 a 9 no seu genoma.

15. Célula animal transgênica transformada ou transfectada com o vetor de acordo com as reivindicações 10 ou -12, caracterizada por compreender qualquer uma das construções gênicas das reivindicações de 1 a 9 no seu genoma.

16. Proteína de fusão codificada por qualquer uma das construções gênicas das reivindicações de 1 a 9, capaz de produzir uma resposta imunológica no hospedeiro em que é introduzida.

17. Proteína de fusão APCH1-2L21, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por compreender uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 (A) e uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 21 (B), correspondentes ao antígeno vacinai 2L21 do parvovírus canino.

18. Proteína de fusão APCH1-E2T, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por compreender uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 (A) e uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 23 (B) , correspondentes ao antígeno vacinai E2T do vírus da diarréia viral bovina.

19. Vacina caracterizada por compreender qualquer uma das proteínas de fusão de acordo com as reivindicações de 16 a 18 e, opcionalmente, um excipiente farmaceuticamente aceitável.

20. Método concebido para o tratamento ou prevenção de doenças, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade farmaceuticamente aceitável da vacina de acordo com a reivindicação 19 a um indivíduo ou a um animal.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pela administração ser feita por via oral, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal ou intravenosa.