CN114790229B

CN114790229B - 一种重组蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114790229B
Application number: CN202210380483.7A
Authority: CN
Inventors: 宴玲英; 羊涛
Original assignee: Beijing Huideyi Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Huideyi Technology Co ltd
Filing date: 2022-04-12
Publication date: 2024-07-12
Anticipated expiration: 2042-04-12

Abstract

本发明公开了一种犬瘟热病毒H蛋白重组蛋白以及再此基础上筛选合成的融合蛋白，所述的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明同时公开了一种疫苗，所述的疫苗含有所述的重组蛋白或所述的融合蛋白；所述的疫苗同时含有所述的重组蛋白和所述的融合蛋白，所述的重组蛋白和融合蛋白的质量比为1:1。本发明公开的重组蛋白和融合蛋白均具有良好的免疫原性，且同时使用重组蛋白和融合蛋白制备疫苗，具有比单独使用更好的免疫原性。因此，本发明公开的重组蛋白和融合蛋白均能够作为犬瘟热病毒亚单位疫苗的备选抗原，为犬瘟热病毒亚单位疫苗的研发提供了重要参考。

Description

一种重组蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

犬瘟热(Canine distemper)是一种犬科动物的疾病，根据国家农业部于2020年1月15日公布的动物疫病名录统计，犬瘟热属二类动物疫病，主要感染犬科动物，传染渠道主要是通过与病兽直接接触传染，也可通过空气或食物传染，不属于人畜共患病。犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的一种高度接触性传染病，传染性强，死亡率可高达80％以上。犬瘟热症状初期狗的体温高达39.5～41℃，食欲不振，精神沉郁，眼鼻流出水样分泌物，打喷嚏，有腹泻。在以后2～14天内再次出现体温升高，咳嗽，有脓性鼻涕、脓性眼屎这时候已经是犬瘟中期了。同时继发胃肠道疾病，呕吐、拉稀，食欲废绝。精神高度沉郁，嗜睡。犬瘟热发病后期就会出现典型的神经症状，口吐白沫，抽搐，此时比较难治，主要看照料方法。

犬瘟热(caninedistemper，CD)是由于犬感染犬瘟热病毒(caninedistempervirus，CDV)而患的一种高度接触性传染病。在犬所患的各种疾病中无论是传染强度，病情的严重程度，还是死亡率上都可列榜首。CDV的基因组为不分节段的负链RNA，全长15616bp，3′端到5′端依次为3′端前导序列、核衣壳蛋白基因(N)、磷蛋白基因(P)、基质蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)、血凝蛋白基因(H)、大蛋白基因(L)和5′端引导序列。P、N、L为髓芯蛋白，与RNA转录和复制有关，N蛋白有包裹及保护内部基因的功能，P蛋白可能有聚合酶功能。M、F、H为包被蛋白，位于N蛋白的外侧，H蛋白以近N末端的疏水区将其嵌在M蛋白上。其中，H基因全长为1947bp，仅含有一个开放型阅读框，其编码的H蛋白是CDV囊膜表面的糖蛋白之一，可与靶细胞表面的受体(如SLAM和nectin-4)相互作用，介导病毒入侵宿主；同时，H蛋白存在着许多中和性抗原表位，是诱导机体产生中和抗体的主要抗原。因此，H蛋白可能是亚单位疫苗研究的靶标之一。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种H蛋白重组蛋白及其制备方法和应用；本发明的目的之二在于提供一种H蛋白融合蛋白及其制备方法和应用。

因此，一方面，本发明公开了一种重组蛋白，所述重组蛋白为犬瘟热病毒H蛋白重组蛋白，所述的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，本发明所述的重组蛋白为从N端去除aa1～aa107的氨基酸后剩余的犬瘟热病毒H蛋白。

优选地，本发明所述的密码子优化后的重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，本发明所述的重组蛋白的SDS-PAGE相对分子量为80KD。

另一方面，本发明还公开了一种所述的重组蛋白制备的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，本发明所述的密码子优化后的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选地，本发明所述的融合蛋白由5条权利要求1所述的重组蛋白的抗原表位多肽和B细胞抗原表位以及连接子组成。

优选地，本发明所述的5条权利要求1所述的重组蛋白的抗原表位多肽的氨基酸序列分别为：

抗原表位多肽2：PNREFDFRDLHWCINPPSKIKVNFTNYCDT；

抗原表位多肽5：FKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDP；

抗原表位多肽7：LTAISGGVYGKTYLLMPDYTEGEFDTQKIR；

抗原表位多肽17：TYGPIILNGDGMDYYESPLLDSGWLTIPPK；

抗原表位多肽23：RTISYTYPFRLTTKGRPDFLRIECFVWDDD；

所述的B细胞抗原表位的氨基酸序列为PGVQKNRGEVQDKETS；

所述的连接子的氨基酸序列为：GSAGSAAG。

再一方面，本发明还公开了一种疫苗，所述的疫苗含有所述的重组蛋白或所述的融合蛋白。

再一方面，本发明还公开了一种疫苗，所述的疫苗同时含有所述的重组蛋白和所述的融合蛋白，所述的重组蛋白和融合蛋白的质量比为1:1。

本发明公开的重组蛋白和融合蛋白均具有良好的免疫原性，且同时使用重组蛋白和融合蛋白制备疫苗，具有比单独使用更好的免疫原性。因此，本发明公开的重组蛋白和融合蛋白均能够作为犬瘟热病毒亚单位疫苗的备选抗原，为犬瘟热病毒亚单位疫苗的研发提供了重要参考；同时两者的联合使用对亚单位疫苗的研发具有重要的参考意见。另外，本发明公开的本发明筛选到的犬瘟热病毒H重组蛋白的5条抗原表位多肽，具有较好的抗原性，为犬瘟热病毒H重组蛋白的研究提供了重要的参考，也为后续开发犬瘟热病毒H重组蛋白的单克隆抗体提供了重要的线索。

附图说明

图1犬瘟热病毒H蛋白的氨基酸序列Blast分析结果。

图2犬瘟热病毒H蛋白肽跨膜区分析结果。Inside表示胞内区，inside数值越大，表示该氨基酸位于胞内区的可能性越大；Outside表示胞外区，outside数值越大，表示该氨基酸位于胞外区的可能性越大；Transmembrane表示跨膜区，Transmembrane数值越大，表示该氨基酸在跨膜区的可能性越大。

图3犬瘟热病毒H蛋白重组蛋白SDS-PAGE图，其中1是纯化后的犬瘟热病毒H蛋白重组蛋白。

图4犬瘟热病毒H蛋白融合蛋白SDS-PAGE图，其中1是纯化后的犬瘟热病毒H蛋白融合蛋白。

图5疫苗免疫后相对抗体检测图。

具体实施方式

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1：犬瘟热病毒H蛋白重组蛋白设计和制备

犬瘟热病毒H蛋白重组蛋白设计：从NCBI中挑选6个CDV H蛋白的氨基酸序列，通过Blast进行分析，结果见图1所示；对CDV H蛋白的跨膜区进行分析，aa1～aa35位为胞内区，aa36～aa58位为跨膜区。综合考虑比对结果和跨膜区分析结果，从N端开始去除aa1～aa107的氨基酸序列，形成新的H蛋白重组蛋白，具体序列如SEQ ID NO.1所示。

犬瘟热病毒H蛋白重组蛋白制备：将密码子优化后的H蛋白重组蛋白的核苷酸序列(具体序列如SEQ ID NO.2所示)克隆到真核表达载体(如pEE12.4等)中。以密码子优化的H蛋白重组蛋白核苷酸序列为模板，分别用EcoRI和HindⅢ双酶切位点进行连接以构建pEE12.4-H-6His表达质粒。将鉴定为阳性的重组质粒送到华大生物公司进行序列测定，用软件对测定的核苷酸序列及编码的氨基酸序列进行分析比对，检查阅读框架的正确性。后续参照CN 113607952 A

实施例1制备H蛋白重组蛋白，共筛选到1株稳定分泌表达H蛋白重组蛋白的CHO-K1细胞株，其表达产量能达到300mg/L或以上；经镍柱纯化后的H蛋白重组蛋白的SDS-PAGE纯度能达到90％以上(图3所示)，SDS-PAGE分子量(图3所示)约为80KD，比预测的分子量(约69KD)要大，说明该重组蛋白有糖基化修饰；BCA检测重组蛋白浓度为1.89mg/ml。

实施例2：犬瘟热病毒H蛋白重组蛋白抗原表位多肽设计和筛选

对实施例1中设计的重组蛋白进行分析，设计合成了26条抗原表位多肽(表1)。将26条抗原表位多肽分别免疫小鼠，采集小鼠血清进行ELISA抗体效价检测，筛选抗体效价最高的抗原表位多肽。经过检测，共有5条抗原表位多肽的抗体效价最高(表1)，因此，选择这5条抗原表位多肽(第2、第5、第7、第17和第23)作为后续研究的重点。

使用常规的ELISA方法检测抗体效价，简述为：使用H蛋白重组蛋白(实施例1制备)包被酶标板，100ng/孔，0.1ml/孔，4℃包被过夜；洗涤3次后，使用含2％的BSA的PBST封闭，37℃孵育2h；用PBS将小鼠血清做10倍系列稀释(10～10⁷)，再加到包被的酶标板中，0.1ml/孔，37℃孵育1h；洗涤3次后，加入1:5000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，0.1ml/孔，37℃孵育30min；洗涤3次后，加入0.1ml TMB单组分显色液(购自北京索莱宝生物科技有限公司)，37℃孵育10min；加入终止液(2M硫酸)，测定OD450nm值；当OD450nm值大于0.1时判定为阳性。

表1犬瘟热病毒H蛋白重组蛋白抗原表位多肽

实施例3：犬瘟热病毒H蛋白融合蛋白的设计和制备

合并实施例2筛选到的5条抗原表位多肽，两两之间通过连接子进行连接，所述连接子的氨基酸序列为GSAGSAAG，并在C端添加一段氨基酸序列(PGVQKNRGEVQDKETS，为B细胞抗原表位之一)，形成一条完整的融合蛋白，其序列(SEQ ID NO.3)为：

PNREFDFRDLHWCINPPSKIKVNFTNYCDTGSAGSAAGFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPGSAGS AAGLTAISGGVYGKTYLLMPDYTEGEFDTQKIRGSAGSAAGTYGPIILNGDGMDYYESPLLDSGWLTIPPKGSAGS AAGRTISYTYPFRLTTKGRPDFLRIECFVWDDDGSAGSAAGPGVQKNRGEVQDKETSHHHHHH。

将融合蛋白序列交付南京金斯瑞生物科技有限公司进行真核表达体系(如CHO、293T等)密码子优化以及全基因合成；合成的基因连接到pET12.4载体的EcoRI和HindⅢ的酶切位点之间，合成的的基因序列如SEQ ID NO.4所示。参照实施例1的重组蛋白制备方法制备融合蛋白。经过筛选，同样筛选到一株高效分泌表达该融合蛋白的CHO-K1细胞株，其表达量初步核算能达到200mg/L。经过镍柱纯化后的融合蛋白使用SDS-PAGE蛋白凝胶进行电泳检验，在27KD左右有一条清晰条带，纯度大于90％(图4)，比预测的条带(约22KD)要大，说明也有一部分的糖基化修饰；使用BCA检测蛋白浓度，融合蛋白浓度为1.58mg/ml。

实施例4：犬瘟热病毒H蛋白重组蛋白和融合蛋白疫苗的制备

疫苗1：将实施例1制备的重组蛋白稀释至40μg/ml，取稀释后的重组蛋白20ml，按照质量比1:1的比例与ISA 201 VG佐剂(购自法国赛彼克公司)乳化制备疫苗，共制备40ml疫苗，其中疫苗中含重组蛋白浓度约为20μg/ml。按照现行《中国兽药典》附录进行检验，检验结果符合要求。制备及检验合格的疫苗置于2～8℃保存备用。

疫苗2：将实施例3制备的融合蛋白稀释至40μg/ml，取稀释后的融合蛋白20ml，按照质量比1:1的比例与ISA 201 VG佐剂(购自法国赛彼克公司)乳化制备疫苗，共制备40ml疫苗，其中疫苗中含融合蛋白浓度约为20μg/ml。按照现行《中国兽药典》附录进行检验，检验结果符合要求。制备及检验合格的疫苗置于2～8℃保存备用。

疫苗3：将实施例1和实施例3制备的重组蛋白和融合蛋白均稀释至40μg/ml，取稀释后的重组蛋白和融合蛋白各10ml(共20ml)，按照质量比1:1的比例与ISA 201 VG佐剂(购自法国赛彼克公司)乳化制备疫苗，共制备40ml疫苗，其中疫苗中含重组蛋白的浓度约10μg/ml、融合蛋白浓度约为10μg/ml。按照现行《中国兽药典》附录进行检验，检验结果符合要求。制备及检验合格的疫苗置于2～8℃保存备用。

实施例5：疫苗免疫以及检验

小鼠免疫：将6周龄的雌性Balb/c小鼠随机分组，每组5只，按照表2进行分组和免疫，于首次免疫前、首次免疫后14日(二免前)、首次免疫后28日(二免14日)采集小鼠血清，对小鼠血清效价检测。

表2小鼠免疫分组

组别	免疫剂量和方式	免疫次数
			组1(疫苗1)	0.2ml/只，腿部肌肉注射	间隔2周加强免疫一次
组2(疫苗2)	0.2ml/只，腿部肌肉注射	间隔2周加强免疫一次
			组3(疫苗3)	0.2ml/只，腿部肌肉注射	间隔2周加强免疫一次
对照组	/	/

使用常规的ELISA方法检测小鼠血清抗体效价，简述为：使用实施例1制备的H蛋白重组蛋白包被酶标板，100ng/孔，0.1ml/孔，4℃包被过夜；洗涤3次后，使用含2％的BSA的PBST封闭，37℃孵育2h；用PBS将小鼠血清做2倍系列稀释(100、200、400、800、1600......)，再加到包被的酶标板中，0.1ml/孔，37℃孵育1h；洗涤3次后，加入1:5000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，0.1ml/孔，37℃孵育30min；洗涤3次后，加入0.1ml TMB单组分显色液(购自北京索莱宝生物科技有限公司)，37℃孵育10min；加入终止液(2M硫酸)，测定OD450nm值；当P/N值(样品OD450nm值/空白对照孔OD450nm值)大于2.1且样品ODOD450nm值＞0.1时判定为阳性。

抗体检测结果显示(图5)：组1和组2的抗体效价均较高，且组1较组2稍高，但没有显著性差异；组3较组1和组2的抗体效价均要高，且有显著性差异。综合来看，本发明设计制备的重组蛋白和融合蛋白制备疫苗后均具有良好的免疫效果，且两者混合使用能产生更高的抗体滴度。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广州臻卓生物技术有限公司

<120> 一种重组蛋白及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 500

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Pro Gln Lys Leu Asn Glu Ile Lys Gln Phe Ile Leu Gln Lys Thr Asn

1 5 10 15

Phe Phe Asn Pro Asn Arg Glu Phe Asp Phe Arg Asp Leu His Trp Cys

20 25 30

Ile Asn Pro Pro Ser Lys Ile Lys Val Asn Phe Thr Asn Tyr Cys Asp

35 40 45

Thr Ile Gly Ile Arg Lys Ser Ile Ala Ser Ala Ala Asn Pro Val Leu

50 55 60

Leu Ser Ala Leu Ser Gly Gly Arg Gly Asp Ile Phe Pro Pro Tyr Arg

65 70 75 80

Cys Asn Gly Ala Thr Ile Ser Val Gly Lys Ile Phe Pro Leu Ser Val

85 90 95

Ser Leu Ser Met Ser Leu Ile Ser Arg Thr Ser Glu Ile Ile Asn Met

100 105 110

Leu Thr Ala Ile Ser Gly Gly Val Tyr Gly Lys Thr Tyr Leu Leu Met

115 120 125

Pro Asp Tyr Thr Glu Gly Glu Phe Asp Thr Gln Lys Ile Arg Val Phe

130 135 140

Glu Ile Gly Phe Ile Lys Arg Trp Leu Asn Asn Met Pro Leu Leu Gln

145 150 155 160

Thr Thr Asn Tyr Met Val Leu Pro Ala Asn Tyr Lys Ala Lys Val Cys

165 170 175

Thr Ile Ala Val Gly Glu Leu Ala Leu Ala Ser Leu Cys Val Asp Glu

180 185 190

Ser Thr Val Ser Leu Tyr His Asp Ser Asn Gly Ser Gln Asp Gly Val

195 200 205

Leu Val Val Thr Met Gly Ile Phe Gly Ala Thr Ser Met Asp Gln Val

210 215 220

Glu Glu Val Ile Pro Val Ala His Pro Leu Val Glu Lys Ile His Ile

225 230 235 240

Thr Asn His Arg Gly Ile Ile Lys Asp Ser Ile Val Thr Trp Met Val

245 250 255

Pro Ala Leu Val Ser Glu Lys Gln Glu Glu Gln Lys Asn Cys Leu Glu

260 265 270

Ser Ala Cys Gln Arg Lys Ser Tyr Pro Met Cys Asn Gln Thr Ser Trp

275 280 285

Glu Pro Phe Gly Gly Gly Gln Leu Pro Ser Tyr Gly Arg Leu Thr Leu

290 295 300

Pro Leu Asp Pro Ser Ile Asp Leu Gln Leu Asn Ile Ser Phe Thr Tyr

305 310 315 320

Gly Pro Ile Ile Leu Asn Gly Asp Gly Met Asp Tyr Tyr Glu Ser Pro

325 330 335

Leu Leu Asp Ser Gly Trp Leu Thr Ile Pro Pro Lys Asn Gly Thr Val

340 345 350

Leu Gly Leu Ile Asn Lys Ala Ser Arg Gly Asp Gln Phe Thr Val Ile

355 360 365

Pro His Val Leu Thr Phe Ala Pro Arg Glu Ser Ser Arg Asn Cys Tyr

370 375 380

Leu Pro Ile Gln Thr Ser Gln Ile Met Asp Lys Asp Val Leu Thr Glu

385 390 395 400

Ser Asn Leu Val Val Leu Pro Thr Gln Asn Phe Arg Tyr Val Val Ala

405 410 415

Thr Tyr Asp Ile Ser Arg Asp Asp His Ala Ile Val Tyr Tyr Val Tyr

420 425 430

Asp Pro Ile Arg Thr Ile Ser Tyr Thr Tyr Pro Phe Arg Leu Thr Thr

435 440 445

Lys Gly Arg Pro Asp Phe Leu Arg Ile Glu Cys Phe Val Trp Asp Asp

450 455 460

Asp Leu Trp Cys His Gln Phe Tyr Arg Phe Glu Ala Asp Ile Thr Asn

465 470 475 480

Ser Thr Thr Ser Val Glu Asn Leu Val Arg Met Ser Phe Ser Cys Asn

485 490 495

Arg Ser Lys Pro

500

<210> 2

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccacagaaac tgaacgaaat taaacaattc atcttgcaga aaacaaattt cttcaaccct 60

aaccgggagt tcgattttag agacctgcat tggtgtataa atcccccatc aaagatcaaa 120

gtgaatttta caaattactg cgatacaatc ggcatcagaa aatccatcgc tagcgccgct 180

aatccagtac tcttgtctgc tttgtctgga gggagggggg atattttccc accctatcgc 240

tgtaatggtg cgacgatctc agttggcaag atttttccac tgtcagtaag tctcagtatg 300

agcctcatca gcaggactag cgagatcatc aatatgttga ccgcaattag cggcggcgtg 360

tatggaaaaa catatctgct gatgccagat tacacagagg gggagttcga tacccagaaa 420

attagagtct tcgagatcgg cttcatcaaa cgatggctga ataatatgcc actcctgcag 480

actactaact atatggtgct cccagcaaat tataaggcca aggtttgcac aatcgctgtg 540

ggtgagctcg cactcgcctc actctgtgtg gatgagtcca cagtgagtct gtatcacgac 600

agcaacggaa gccaagatgg tgttctcgtt gtcactatgg ggatattcgg cgctacatcc 660

atggaccagg tcgaggaggt gatcccagtt gcccacccac ttgtggaaaa aatccatata 720

actaatcata gaggtatcat caaggactcc atcgtgacct ggatggtgcc agccctcgtg 780

agcgagaaac aggaagaaca gaaaaactgc ctggagagcg cctgtcagcg gaagtcatat 840

ccaatgtgta atcagacatc atgggaacct ttcgggggcg gacagctgcc ttcttacgga 900

aggcttacac tgcctctgga cccctcaatt gacctgcagc tcaacatctc cttcacatac 960

gggcccatca tcctcaacgg agacggtatg gactactacg agtcacctct cctggatagc 1020

ggatggctta ccattcctcc taagaatggg accgtccttg gcctgatcaa taaggcgagc 1080

cggggcgacc agttcacagt gattcctcat gtgcttacat tcgcgcccag agaatcttct 1140

aggaactgtt acctgcccat acagacttcc cagatcatgg ataaggacgt gcttacggag 1200

tctaatcttg tggtgctccc tacgcagaac ttccgctacg tcgtggcaac ctatgatatc 1260

tcacgagacg accacgcaat tgtgtattac gtgtacgatc caattaggac tatcagctat 1320

acctaccctt tccgcctgac tacgaaaggt aggccagatt tcctccgcat cgagtgcttc 1380

gtgtgggacg acgatctgtg gtgtcaccag ttctaccggt tcgaggcaga tataaccaat 1440

tctacaacga gtgtggagaa tctcgttcgc atgagttttt cttgcaatcg cagcaagcca 1500

caccaccacc atcatcac 1518

<210> 3

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Pro Asn Arg Glu Phe Asp Phe Arg Asp Leu His Trp Cys Ile Asn Pro

1 5 10 15

Pro Ser Lys Ile Lys Val Asn Phe Thr Asn Tyr Cys Asp Thr Gly Ser

20 25 30

Ala Gly Ser Ala Ala Gly Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro

35 40 45

Asp Ala Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Gly

50 55 60

Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Leu Thr Ala Ile Ser Gly Gly Val Tyr

65 70 75 80

Gly Lys Thr Tyr Leu Leu Met Pro Asp Tyr Thr Glu Gly Glu Phe Asp

85 90 95

Thr Gln Lys Ile Arg Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Thr Tyr Gly

100 105 110

Pro Ile Ile Leu Asn Gly Asp Gly Met Asp Tyr Tyr Glu Ser Pro Leu

115 120 125

Leu Asp Ser Gly Trp Leu Thr Ile Pro Pro Lys Gly Ser Ala Gly Ser

130 135 140

Ala Ala Gly Arg Thr Ile Ser Tyr Thr Tyr Pro Phe Arg Leu Thr Thr

145 150 155 160

Lys Gly Arg Pro Asp Phe Leu Arg Ile Glu Cys Phe Val Trp Asp Asp

165 170 175

Asp Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Pro Gly Val Gln Lys Asn Arg

180 185 190

Gly Glu Val Gln Asp Lys Glu Thr Ser His His His His His His

195 200 205

<210> 4

<211> 621

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctaatagag aatttgactt ccgggacctg cattggtgta tcaatccccc aagtaaaatc 60

aaagtgaatt ttacaaatta ctgtgacact ggatcagctg gcagcgccgc agggtttaag 120

agaaagcact ttagaccaac cccagacgcc tgtagggccg cctacaactg gaagatggct 180

ggggatcctg gcagcgccgg ctccgcagca ggactcaccg ccatctcagg cggcgtgtat 240

ggcaagacat accttctgat gcccgactat accgaaggtg agttcgacac gcagaagatt 300

cgggggagcg caggttccgc cgcaggcacg tacggcccca tcatattgaa tggagatggt 360

atggactact acgagagtcc tcttctggat agcgggtggc ttacaatccc tcccaagggc 420

tccgccggaa gcgccgcagg gaggacaatc agctatacgt accccttcag actgactaca 480

aaggggagac ctgacttcct gaggatagag tgtttcgtgt gggacgatga tggttcagca 540

gggagcgcag cgggtcctgg agtgcagaaa aatagagggg aggtgcagga caaggagacg 600

agccatcacc atcatcacca c 621

Claims

1.一种疫苗，其特征在于，所述的疫苗同时含有犬瘟热病毒H蛋白重组蛋白和犬瘟热病毒H蛋白融合蛋白，所述的犬瘟热病毒H蛋白重组蛋白和犬瘟热病毒H蛋白融合蛋白的质量比为1:1，所述的犬瘟热病毒H蛋白重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的犬瘟热病毒H蛋白融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。