PL201420B1 - Białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina - Google Patents

Abstract

Przedmiotami wynalazku s a bia lko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka ro slinna, spo- sób otrzymywania bia lka chimerycznego, transgenicznej ro sliny, transgeniczna ro slina. Ogólnie wyna- lazek dotyczy sposobu wywo lywania odpowiedzi immunologicznej, obejmuj acego podawanie materia- lu ro slinnego zawieraj acego bia lko o w la sciwo sciach immunogennych drog a pokarmow a. Przedmioty wynalazku s luza do otrzymywania szczepionek doustnych przeciwko klasycznemu pomorowi swi n (Classical Swine Fever Virus CSFV). PL PL PL PL

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201420 (13) B1 ^{(21) Numer zgłoszenia: 357518} _{(51) Int.Cl.}

C12N 15/82 (2006.01) A61K 39/00 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 04.12.2002 ^{A01H 5/00 (2006.01)}

C07K 16/18 (2006.01)

C07K 14/435 (2006.01)

C12N 15/12 (2006.01)

Białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina (73) Uprawniony z patentu:

Instytut Chemii Bioorganicznej PAN, Poznań,PL Instytut Biotechnologii i Antybiotyków, Warszawa,PL

Uniwersytet Gdański,Gdańsk,PL (43) Zgłoszenie ogłoszono:

14.06.2004 BUP 12/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.04.2009 WUP 04/09 (72) Twórca(y) wynalazku:

Andrzej B. Legocki,Poznań,PL

Józef Kapusta,Poznań,PL

Tomasz Pniewski,Poznań,PL

Olesia Lisowa,Poznań,PL

Katarzyna Miedzińska,Rawicz,PL

Magdalena Czaplińska,Łęczyca,PL

Iwona Femiak,Poznań,PL

Andrzej Płucienniczak,Warszawa,PL

Małgorzata Kęsik,Warszawa,PL

Anna Porębska,Warszawa,PL

Bogusław Szewczyk,Gdańsk,PL

Monika Gut-Winiarska,Gdynia,PL

Jolanta Tyborowska,Gdańsk,PL

Jolanta Ficińska,Gdańsk,PL

Krystyna Bieńkowska-Szewczyk,Gdańsk,PL

Jacek Wojciechowicz,Poznań,PL (74) Pełnomocnik:

Aleksandra Twardowska,

JAN WIERZCHOŃ & PARTNERZY ⁽⁵⁷⁾ Przedmiotami wynalazku są białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina. Ogólnie wynalazek dotyczy sposobu wywoływania odpowiedzi immunologicznej, obejmującego podawanie materiału roślinnego zawierającego białko o właściwościach immunogennych drogą pokarmową. Przedmioty wynalazku służą do otrzymywania szczepionek doustnych przeciwko klasycznemu pomorowi świń (Classical Swine Fever Virus CSFV).

PL 201 420 B1

Opis wynalazku

Przedmiotami wynalazku są białko chimeryczne, sekwencja, konstrukt, komórka roślinna, sposób otrzymywania białka chimerycznego, transgenicznej rośliny, transgeniczna roślina. Ogólnie wynalazek dotyczy sposobu wywoływania odpowiedzi immunologicznej, obejmującego podawanie drogą pokarmową materiału roślinnego zawierającego białko o właściwościach immunogennych. Przedmioty wynalazku służą do otrzymywania szczepionek doustnych przeciwko klasycznemu pomorowi świń (Classical Swine Fever Virus CSFV).

Klasyczny pomór świń zaliczany jest do chorób, których czynnikami etiologicznymi są pestiwirusy, należące do rodziny Flaviviridae. Pestiwirusy atakują zwierzęta z rodziny Suidae (świnie) oraz niektóre gatunki przeżuwaczy (krowy, owce, kozy) a także szereg dzikich gatunków. Klasyczny pomór świń po raz pierwszy został opisany w 1833 roku w Ohio. Od tego czasu drastycznie zwiększył swój zasięg na całym świecie, stając się jednym z najbardziej ograniczających czynników ekonomicznych w hodowli ś wiń . Ś wiatowa organizacja Office International des Epizooties wymienia tę chorobę na swojej liście A jako jedną z piętnastu najgroźniejszych chorób zwierząt. Tej choroby dotąd nie stwierdzono tylko w 16 krajach na świecie.

W zależności od stopnia wirulencji wirusa choroba może występować w trzech postaciach: ostrej, umiarkowanej i łagodnej. Ostry atak choroby objawia się u zwierząt wysoką gorączką, biegunką, leukopenią, (apoptozą leukocytów), wybroczynami skórnymi, silną immunosupresją i w większości przypadków prowadzi do śmierci zwierzęcia.

Łagodna postać może przebiegać bezobjawowo, ponadto choroba ma dość długi - od 2 do 14 dni - okres inkubacyjny, co utrudnia kontrolowanie epidemii. Wirus klasycznego pomoru jest niezwykle odporny ma warunki środowiskowe - może on przetrwać poza organizmem żywiciela nawet przez jeden miesiąc. Najczęściej przenoszony jest przez kontakt zwierzęcia chorego ze zdrowym, ale może być także przenoszony fizycznie przez ludzi, ptaki lub owady, przez narzędzia rolnicze, paszę, pojazdy, odzież, itp. Jak dotąd nie ma leku na tę chorobę. Po wykryciu obecności patogena, wszystkie stada w promieniu 25 km od ogniska epidemii muszą być zlikwidowane. Podjęto wiele prób wyprodukowania szczepionki. Obecnie istnieją trzy rodzaje szczepionki - oparta na zatenuowanym żywym szczepie C, na zmodyfikowanym infekcyjnym klonie cDNA [Meyers 1996, J.Virol. 70, 1588-1595], oraz na glikoproteinie E2 [van Rijn 1999, Vaccine 17:433-440], jednak w żadnym kraju europejskim nie stosuje się masowych szczepień, przede wszystkim ze względu na relatywnie wysoki koszt dawki szczepionki.

Białko wirusowe E2 jest głównym antygenem neutralizującym w przebiegu infekcji wirusem gorączki świń. Oznacza to, iż przeciwciała, skierowane przeciwko epitopom tego białka najskuteczniej neutralizują infekcyjność patogena.

Możliwości aplikacyjne roślin zmodyfikowanych genetycznie są bardzo szerokie i obejmują wiele dziedzin gospodarki. Najczęściej rośliny transgeniczne znajdują zastosowanie w rolnictwie jako odmiany odporne na herbicydy, choroby i szkodniki lub rozmaite warunki stresowe, takie jak: susza, chłód, zasolenie. W ostatnich latach coraz większego znaczenia nabiera wykorzystanie transgenicznych roślin jako bioreaktorów produkujących użyteczne białka znajdujące zastosowanie w terapii, diagnostyce i analityce medycznej a także w przemyśle.

W porównaniu do przemysłowych fermentatorów lub bioreaktorów układ roślinny jest o wiele ekonomiczniejszy jeśli chodzi o koszty eksploatacji czy transportu (koszty te mogą być zredukowane nawet 10-krotnie) [Kusnadi 1997, Biotechnol. Bioeng. 56, 473-484]. Dla porównania, koszt produkcji przeciwciała IgG w lucernie transgenicznej, rosnącej w szklarni jest 10-krotnie niższy, niż koszt wytwarzania w komórkach hybrydomy. Technologia zbioru i obróbki roślin na wielką skalę jest od dawna znana i stosowana, a w przypadku użycia transgenicznych tkanek roślinnych do bezpośredniej konsumpcji (np. szczepionki podawane drogą pokarmową) wymagana obróbka materiału jest zbędna. W roś linach moż liwe jest kierowanie produkowanego biał ka do przedział ów komórkowych, w których wykazuje ono większą stabilność. Przy czym ilość produkowanego w roślinach białka może być bardzo duża, sięgać nawet poziomu wielkiej skali przemysłowej. Takie rośliny jak tytoń, kukurydza, soja czy lucerna mogą wytwarzać ponad 20 kg białka heterologicznego z hektara uprawy [Khoudi 1999, Biotechnol. Bioeng. 64, 135-143]. W przeciwieństwie do bakterii natomiast, rośliny produkują białka wielopodjednostkowe (na przykład przeciwciała), posiadają system fałdowania oraz glikozylacji polipeptydów, przez co białka strukturalnie złożone mogą osiągnąć poprawną konformację przestrzenną. Równocześnie w przypadku roślin ryzyko związane z zanieczyszczeniem produktu ubocznymi składPL 201 420 B1 nikami procesu technologicznego jest niewielkie. W przeciwieństwie do układów zwierzęcych rośliny nie mogą być gospodarzami dla ludzkich patogenów, takich jak HIV, priony, wirusy zapalenia wątroby, itd. Nie zawierają one również sekwencji onkogennych [Fischer 2000, J. Biol. Regul.

Homeost. Agents 14, 421-477; Fischer 2000, Transgenic Res. 9, 279-299].

Poziom syntezy białka użytecznego w roślinach można zwiększyć przez zastosowanie organospecyficznych promotorów kontrolujących ekspresję transgenów. Promotory aktywne w rozwijających się organach spichrzowych roślin takich jak nasiona czy bulwy pozwalają na syntezę obcych białek w ściśle określonej fazie rozwoju rośliny. Geny biał ek heterologicznych moż na wyposaż yć w sekwencje kierujące do określonych przedziałów komórkowych, które z jednej strony izolują białka od reszty komórki, a z drugiej umożliwiają ich większą kumulację. Przykładem sekwencji kierującej jest motyw aminokwasowy KDEL warunkujący retencje białek w retikulum endoplazmatycznym [Doran P. M. 2000, Curr. Opin. Biotechnol. 11, 199-204].

Genom CSFV stanowi pojedyncza nic RNA o wielkości 12,5 tysięcy zasad i dodatniej polarności. Cząsteczka RNA zawiera jedna ramkę odczytu kodującą jedną poliproteinę zbudowana, z około 4 tys. aminokwasów, która ulega ko- i postranslacyjnej obróbce do białek strukturalnych: C, E0, E1, E2 i niestrukturalnych np. wirusowych proteaz. Struktura wirionu nie jest jeszcze szczegółowo poznana. Wiadomo, że wiriony są prawdopodobnie ikozaedralnymi cząsteczkami o średnicy około 50 nm i składają się ze sferycznego nukleokapsydu i otoczki. Nukloeokapsyd zbudowany jest z wielu cząsteczek białka C, natomiast w skład otoczki wchodzą fosfolipidy błonowe i glikoproteiny powierzchniowe E0, E1 i E2. Białka otoczki tworzą homo- (E0 i E2) i heterodimery (E1-E2) za pośrednictwem mostków dwusiarczkowych. Dopiero takie dimery budują otoczkę wirusa. Białka E1 i E2 zawierają domeny transbłonowe, zapewniające ich zakotwiczenie w błonach [Meyers G. et al. 1996, J.Virol. 70, 1588-1595; van Rijn P. A. et al. 1993, Vaccine 17, 433-440]. Wszystkie glikoproteiny otoczkowe maja właściwości immunogennne. Sądzi się, że białko E2 jest najsilniejszym immunogenem, silniejszym od E0 i E1.

Przygotowując wektory do transformacji roślin najczęściej wykorzystywana jest sekwencja promotora 35S CaMV, ze względu na ekspresję genu w roślinie. Jest to promotor 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora. Ma on charakter konstytutywny - ekspresja genu pod jego kontrolą zachodzi we wszystkich organach rośliny. Uważa się, iż promotor ten wykazuje optymalne cechy jeśli chodzi o produkcję białka heterologicznego w roślinie. Silniejszy promotor, jak się sądzi, powodowałby z dużym prawdopodobień stwem posttranskrypcyjne wyciszenie genu [Weising 1988, Annu. Rev. Genet. 22, 421-477], słabszy natomiast nie pozwalałby na uzyskanie odpowiedniego poziomu ekspresji białka heterologicznego.

Promotory nasieniowo-specyficzne wykorzystywano głównie w badaniach nad ekspresją heterologicznych białek podnoszących wartość pokarmową nasion. Wykorzystane sekwencje najczęściej pochodziły z innych roślin niż groch. Wcześniej promotory fazeoliny z fasoli i β-konglycininy z soi zastosowano do kontroli ekspresji białka bogatego w lizynę w nasionach tytoniu [Keeler 1997, Plant Mol. Biol., 34: 15-29]. Dotychczasowe prace dotyczące transformacji roślin (głównie tytoniu) z wykorzystaniem nasieniewo-specyficznych promotorów grochu-legumin i pozostałych białek zapasowych, lektyn oraz innych białek koncentrowały się głównie nad rozpoznaniem funkcji i mechanizmów działania sekwencji promotorowych [Bottcher B. et al. 1997, Nature, 386:88-91; Brennan F. et al. 1999, Journal of Viroly, 73:930-938; Calgene Pacyfic PTY Ltd 1994].

Do celów selekcji roślin transgenicznych przeważnie wykorzystywane są geny warunkujące oporność na antybiotyki. Organizacja Food and Drug Administration (FDA) z USA zbadała stosowanie oporności na kanamycynę dla trzech roślin transgenicznych: pomidora, bawełny i rzepaku [Danieli 1999, Trends Plant Sci. 4, 467-469]. Kanamycyna i neomycyna są toksycznymi antybiotykami, dlatego ich użycie w klinice jest ograniczone. Leki te są stosowane wyłącznie w sytuacjach gdy pacjenci nie spożywają jedzenia, zaś w jedzeniu nie ma dostatecznej ilości kofaktora ATP, aby rozłożyć znaczącą ilość antybiotyku. FDA zaznacza, iż nie znany jest dotychczas żaden mechanizm przenoszenia genów z chromosomu roślinnego do mikroorganizmu.

Przy konstrukcji wektorów do transformacji roślin wykorzystywany jest również gen bar warunkujący oporność na herbicyd Basta [D'Halluin 1990, Crop Sci. 30, 866-871]. Jest to gen pochodzący z bakterii Streptomyces hygroscopicus kodujący enzym acetylotransferazę fosfinotricyny. Enzym ten przeprowadza acetylację aktywnego składnika herbicydu, czyli glufosynatu (jest to syntetyczna fosfinotricyna). Fosfinotricyna jest analogiem strukturalnym glutaminianu i hamuje syntazę glutaminianową, co w efekcie powoduje gromadzenie się toksycznego dla komórek roślinnych amoniaku. Opisane w literaturze doświadczenia wykazały brak toksycznego wpływu fosfinotricyny oraz jej acetylowej po4

PL 201 420 B1 chodnej na organizmy zwierzęce oraz potwierdziły, iż substancja ta dość szybko ulega rozkładowi w glebie i wodach powierzchniowych. Dodatkową zaletą tego markera selekcyjnego jest fakt, iż w porównaniu z genem oporności na kanamycynę stosowanie genu bar podnosi wydajność transformacji [Tabe 1995, J. Animal Sci. 73, 2752-2759]. Herbicyd Basta jest również bardzo skutecznym czynnikiem selekcji. Udowodniono, iż oporność na herbicyd była zachowana po 2 miesiącach hodowania kalusa lucerny bez selekcji.

Opis patentowy US6084156 (opublikowany 2000.07.04) opisuje rozwiązanie dotyczące roślin wytwarzających peptydy lityczne. Poza opisem US6084156 rozwiązanie dotyczące stabilizującego połączenia polipeptydów z peptydem litycznym ubikwityny oraz sposobu wytwarzania poprzez subklonowanie kwasu nukleinowego kodującego sekwencje peptydów litycznych do wektora plazmidu zawierającego promotor i sekwencję kodującą polipeptyd ubikwitynę, w którym sekwencja polipeptydu ubikwityny jest połączona z 5' końcem sekwencji kwasu nukleinowego peptydu litycznego ulegającego translacji jako polipeptyd fuzyjny przedstawione jest także w opisach patentowych US 6448391 (opublikowany 2002.09.10) oraz US6018102 (opublikowany 2000.01.25) i US5955573 (opublikowanym 1999.09.21). Przy czym opisy US6018102 i US5955573 opisują ponadto rozwiązania dotyczące konstruktów genowych połączenia peptydulitycznego ubikwityny, produktów białkowych z nich otrzymywanych oraz ich wytwarzania i zastosowania.

Opis patentowy US6306663 (opublikowany 2001.10.23) opisuje rozwiązanie dotyczące nowych związków zawierających element rozpoznania ubikwityny oraz białkowy czynnik wiążący. Wynalazek dotyczy także zastosowania tych związków w celu zmodulowania poziomu i/lub aktywności białka docelowego. Związki te są przydatne w zastosowaniu przeciwko infekcjom, stanach zapalnych, nowotworach i chorobach genetycznych, a także jako herbicydy i insektycydy.

Opis patentowy US6068994 (opublikowany 2000.05.30) opisuje wynalazek dotyczący ekspresji ubikwityny. Rozwiązanie przedstawia system przyłączenia ubikwityny w ekspresji genu, umożliwiający możliwy do regulowania wysoki poziom wytwarzania heterologicznych białek posiadających destabilizujące reszty aminokwasowe w pozycji terminalnej. Białka fuzyjne ubikwityny ulegające ekspresji w droż d ż ach są cię te precyzyjnie in vivo przez hydrolazy endogeniczne specyficzne dla ubikwityny do heterologicznych białek drożdży takich jak ludzka alfa-1-antytrypsyna, ludzki gamma-interferon i ludzkie białko wirusa HIV, wszystkich, które inicjują z resztami destabilizującymi. Wektor ekspresji zawierający syntetyczny gen monomerycznej ubikwityny drożdży został skonstruowany i ulegał ekspresji pod kontrolą drożdżowego promotora regulatorowego dla glukozy. System ten może być zastosowany do podwyższenia poziomu ekspresji w przypadku białek wykazujących niski poziom ekspresji oraz do wytwarzania białek posiadających destabilizujące reszty aminokwasowe w pozycji terminalnej.

W opisach patentowych US 5847097 (opublikowanym 1998.12.08) oraz US5646017 (opublikowanym 1997.07.08) przedstawiony jest sposób tworzenia lub modyfikowania struktury białka na poziomie białka bądź genu w celu wytwarzania specyficznych amino-końców in vivo lub in vitro. Sposoby te opierają się na nienaturalnym wprowadzeniu połączenia białko-ubikwityna oraz stwierdzeniu, że czas pół-rozpadu białka in vivo jest funkcją N-końcowego aminokwasu białka.

Opis patentowy US5620923 (opublikowany 1997.04.15) opisuje sposób wytwarzania syntetycznych produktów białkowych zawierających do około czterdziestu reszt aminokwasowych powiększonych o ubikwitynę na końcu karboksylowym ulegających ekspresji w komórkach prokariotycznych takich jak E.coli. Proces ten można zastosować do wytwarzania peptydów zawierających od 2 do ok. 40 reszt aminokwasowych i jest w szczególności dostosowany do produkcji peptydów zawierających oddo 40 reszt aminokwasowych.

Opis patentowy US 5494818 (opublikowany 1996.02.27) dotyczy klasy genetycznej ubikwityno-specyficznych proteaz, które specyficznie rozcinają grupy przy grupie C-końcowej reszty ubikwityny w biał ku fuzyjnym ubikwityny, niezależ nie od jego wielkoś ci.

Dokładniej wynalazek dotyczy proteaz ubikwityno-specyficznych z klasy wyizolowanej z komórki oraz wyizolowanych sekwencji DNA kodujących białka tej klasy.

Stabilność białka heterologicznego i aranżacja wielopodjednostkowych struktur zależy od biochemicznego otoczenia w komórce roślinnej, a co się z tym wiąże, od lokalizacji subkomórkowej ekspresji. Strukturami, gdzie ulokowanie ekspresji białka heterologicznego wydają się być najkorzystniejsze, są: powierzchnia komórki, retikulum endoplazmatyczne oraz aparat Golgiego [Haq 1995, Science 268, 714-716].

KDEL jest to sekwencja czterech aminokwasów (lizyna (K), asparagina (D), kwas glutaminowy (E), leucyna (L)), która, gdy znajduje się na C-końcu białka, powoduje jego retencję w retikulum endoplaPL 201 420 B1 zmatycznym. Badania Wandelta i wsp. wykazały, iż dołączenie sekwencji KDEL powoduje znaczny wzrost poziomu ekspresji białka heterologicznego w roślinach transgenicznych [Wandelt 1992, The Plant Journal, 2:181-182]. Okazało się, iż najwyższy poziom ekspresji obserwowano w przypadku kierowania białka do ER. Retencja białka w ER może zwiększyć poziom ekspresji w stopniu bardzo znaczącym - od 10 do 100-krotnym. Poziom ekspresji może wynieść od 0,35% do 2% całkowitego rozpuszczalnego białka, a niekiedy nawet osiągnąć jeszcze wyższy poziom [Fischer 2000, J. Biol. Regul. Homeost. Agents 14, 421-477; Fischer 2000, Transgenic Res. 9, 279-299].

Opis patentowy US6207165 (opublikowany 2001.03.27) opisuje rozwiązanie dotyczące szczepionki chroniącej świnie przed patologiami związanymi z chorobami układu oddechowego i rozrodczego. W rozwiązaniu tym przedstawiona jest kompozycja immunogeniczna indukująca odpowiedź immunologiczną przeciwko CSFV, zawierająca plazmid kodujący białko E2 (wcześniejsza nazwa E1) i ulegają cy ekspresji w warunkach in vivo w komórkach gospodarza.

W opisach patentowych US61363 (opublikowany 2000.10.24), US6034298 (opublikowany 2000.03.07), US5914123 (opublikowany 1999.07.22), US5484719 (opublikowany 1996.01.16) przedstawiona jest szczepionka ulegająca ekspresji w roślinach. Opisana antywirusowa szczepionka wytwarzana jest w roślinach transgenicznych i dostarczana jest do organizmu w dwojaki sposób - albo standardową metodą wprowadzenia szczepionki albo poprzez konsumpcję porcji takiej rośliny, zwłaszcza w formie soku jarzynowego lub owocowego. Sekwencja DNA odpowiedzialna za kodowanie antygenu patogennego wirusa i jego ekspresję jest izolowana i podłączana do promotora, który może regulować ilość wytwarzanego antygenu w roślinie transgenicznej. Gen ten jest następnie transferowany do komórki roślinnej z zastosowaniem procedur umożliwiających jego wbudowanie do genomu roślinny, z wykorzystaniem Agrobacterium tumenfaciens. Przy czym wirusowym immunogenem jest białko pochodzące z wirusa wybranego z grupy zawierającej wirus gastroenteritis lub hepatitis. Rozwiązanie US6034298 dotyczyło ziemniaków i pomidorów.

Opis patentowy US5965134 (opublikowany 1999.10.12) opisuje immunogenne polipeptydy pestiwirusów, zwłaszcza CSFV, a w szczególności niestrukturalne białko p10 oraz szczepionki i diagnozowanie z zastosowaniem opisanych polipeptydów lub cząsteczek kwasu nukleinowego.

Pomimo opisanych powyżej badań poświęconych dostarczeniu szczepionki przeciwko CSFV istnieje ciągła potrzeba uzyskania skutecznych narzędzi pozwalających na łatwe uzyskiwanie skutecznych szczepionek uodparniających przed tym wirusem.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie środków, które mogłyby być wykorzystane do otrzymywania szczepionki przeciwko CSFV. Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie białek chimerycznych, które zawierałyby wybrane antygeny i mogłyby być wykorzystane do szczepień przeciwko CSFV, a także narzędzi pozwalających na ich ekspresję, zwłaszcza w układach roślinnych. Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie środków pozwalających otrzymać transgeniczną roślinę, która mogłaby być zastosowana do produkowania jadalnych szczepionek przeciwko CSFV.

Nieoczekiwanie realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych z białkami powstającymi w komórkach na bazie egzogennego DNA zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest białko chimeryczne charakteryzujące się tym, że zawiera sekwencję aminokwasową białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV lub jej fragment, połączoną z co najmniej jedną spośród następujących sekwencji: sekwencją VTS, sekwencją KDEL, sekwencją ubikwityny. Korzystnie, zawiera ono jedną z następujących sekwencji: sekwencję aminokwasową białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją VTS oraz sekwencją KDEL albo sekwencję aminokwasową białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją KDEL albo skróconą sekwencję aminokwasową białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją ubikwityny.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja kodująca białko chimeryczne, charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję kodującą białko E2 szczepu Brescia wirusa CSFV lub jej fragment, połączoną z co najmniej jedną sekwencją wybraną spośród następujących: sekwencją kodującą VTS, sekwencją kodującą KDEL, sekwencją kodującą sekwencję markerową bar, sekwencją kodującą ubikwityny. Korzystnie zawiera ona jedną z następujących sekwencji: sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą VTS, sekwencją kodującą KDEL oraz sekwencją kodującą sekwencję markerową bar albo sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą KDEL oraz sekwencją kodującą sekwencję markerową bar albo sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą sekwencję markerową bar albo skróconą sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa

PL 201 420 B1

CSFV połączoną z sekwencją kodującą ubikwityny. Korzystnie sekwencja według wynalazku zawiera sekwencję wybraną spośród sekwencji przedstawionych na fig. 18 - fig. 20.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest konstrukt zawierający sekwencję kodującą białko chimeryczne według wynalazku zdefiniowaną po wyżej. Korzystnie, w konstrukcje według wynalazku, sekwencja kodująca białko chimeryczne jest połączona z sekwencją promotora 35SCaMV albo nasieniowo-specyficznego promotora legA. Korzystne konstrukty według wynalazku przedstawiono na fig. 1-4.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka roślinna, charakteryzująca się tym, że zawiera zdefiniowany powyżej konstrukt według wynalazku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania białka chimerycznego, charakteryzujący się tym, że obejmuje wprowadzenie wektora do komórek Agrobacterium tumefaciens metodą elektroporacji, transformację roślin szczepem bakteryjnym zawierającym ten wektor i uzyskiwanie ekspresji białka chimerycznego, przy czym wektor zawiera zdefiniowany powyżej konstrukt według wynalazku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania transgenicznej rośliny, charakteryzujący się tym, że obejmuje wprowadzanie wektora do komórek Agrobacterium tumefaciens metodą elektroporacji, transformację roślin szczepem bakteryjnym zawierającym ten wektor, i regenerację roślin, przy czym wektor zawiera konstrukt według wynalazku zdefiniowany powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest transgeniczna roślina, charakteryzująca się tym, że posiada komórki transformowane konstruktem według wynalazku zdefiniowanym powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie transgenicznej rośliny posiadającej komórki transformowane konstruktem według wynalazku zdefiniowanym powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka, zawierającego sekwencję aminokwasową białka E2 Brescia wirusa CSFV, lub jej fragment, połączoną korzystnie z co najmniej jedną sekwencją wybraną spośród następujących: sekwencją VTS, sekwencją KDEL, sekwencją ubikwityny, do otrzymywania szczepionki przeciwko klasycznemu pomorowi świń (CSFV). Korzystnie stosowane białko zawiera jedną z następujących sekwencji: sekwencję aminokwasową białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją VTS oraz sekwencją KDEL albo sekwencję aminokwasową białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją KDEL albo sekwencję aminokwasową białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV albo skróconą sekwencję aminokwasową białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją ubikwityny. Załączone figury pozwalają na lepsze wyjaśnienie istoty wynalazku.

Figura 1 przedstawia przygotowanie wektora pP35SBE2BAR do transformacji roślin, przy czym materiałem wyjściowym były plazmidy: pCSFVE2, zawierający sekwencję kodującą E2 Brescia, pGEM-T, pMG2A, pP35SGIB.

Figura 2 przedstawia wektor binarny pP35SBE2RBAR, zawierający sekwencję kodującą E2 z sygnałem retencji białka w ER, pod kontrolą promotora 35SCaMV oraz sekwencję markerową bar warunkującą oporność na fosfinotricynę.

Figura 3 przedstawia roślinny plazmid ekspresyjny ROK2, gdzie: NosPRO - promotor Nos, NPT II (Kanamycyna R) - gen oporności na kanamycynę, NosTER - terminator Nos, CaMV 35S - promotor wirusa mozaiki kalafiora, XX - wklonowywana sekwencja nukleotydowa stanowi skróconą sekwencję aminokwasową białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją ubikwityny.

Figura 4a i b przedstawia konstrukcję wektorów pP35SVBE2RBAR i pPLAVBE2RBAR.

Figura 5 przedstawia schemat cząsteczki VTS. Konstrukcja dwuniciowej oligocząsteczki DNA obejmowała syntezę chemiczną pojedynczych, komplementarnych oligodeoksynukleotydów nazwanych VTS1 i VTS2, a następnie ich hybrydyzację w cząsteczkę VTS. Dwa jednoniciowe oligodeoksynukleotydy zaprojektowano w ten sposób, żeby po hybrydyzacji stanowiły dwuniciową cząsteczkę o takich „lepkich końcach, jakie powstałyby po trawieniu enzymami restrykcyjnymi Xba l i Pst I.

Figura 6a przedstawia porównanie sekwencji promotora leguminy A z Banku Genów, nr X02982 (legA) i sekwencji wyizolowanego promotora genu leguminy A.

Figura 6b przedstawia całkowitą sekwencję zsyntetyzowanej dwuniciowej VTS.

Figura 7 przedstawia analizę PCR genomowego DNA sałaty w celu wykrycia obecności sekwencji kodującej E2 Brescia, gdzie M-marker wielkości DNA λ/EcoRI, Hind III, W-kontrola negatywna, woda, jako matryca, 1-7 - reakcja PCR na matrycy DNA genomowego roślin transformowanych,

K+ - reakcja PCR na matrycy plazmidu p35SBE2BAR, K- -kontrola negatywna, reakcja PCR na matrycy DNA genomowego rośliny nietransgenicznej.

PL 201 420 B1

Figura 8 przedstawia potwierdzenie obecności transgenu w roślinach sałaty pokolenia T l metodą PCR, przy czym: M-marker wielkości DNA λ/EcoRI, Hind III, W- kontrola negatywna, woda, jako matryca, K- -kontrola negatywna, reakcja PCR na matrycy DNA genomowego rośliny nietransformowanej, 1-8 - reakcja PCR na matrycy DNA genomowego roślin transformowanych, K+ - reakcja PCR na matrycy plazmidu p35SBE2BAR.

Figura 9 przedstawia analizę antygenów metodą Western blotting ekstraktów białkowych sałaty pokolenia T0 transformowanej wektorem pP35SBE2BAR, gdzie: K+ - kontrola pozytywna, oczyszczone białko E2 Brescia wyprodukowane w układzie bakulowirusowym, 1-6 - preparaty białkowe roślin transgenicznych, K- - preparat białkowy rośliny kontrolnej.

Figura 10 przedstawia analizę antygenów metodą Western blotting ekstraktów białkowych sałaty pokolenia T1 transformowanej wektorem pP35SBE2BAR, gdzie: K+ - kontrola pozytywna, oczyszczone białko E2 Brescia, wyprodukowane w układzie bakulowirusowym, 1-8 - preparaty białkowe roślin transgenicznych, K- - preparat białkowy rośliny kontrolnej.

Figura 11 przedstawia analizę PCR genomowego DNA sałaty w celu wykrycia obecności sekwencji kodującej E2 Brescia, przy czym: W- kontrola negatywna, woda, jako matryca, K- -kontrola negatywna, reakcja PCR na matrycy DNA genomowego rośliny nietransgenicznej, 1-10 - reakcja PCR na matrycy DNA genomowego roślin transformowanych, K+ - reakcja PCR na matrycy plazmidu p35SBE2RBAR, M-marker wielkości DNA λ/EcoRI, Hind III.

Figura 12 przedstawia analizę antygenów metodą Western blotting ekstraktów białkowych sałaty transformowanej wektorem pP35SBE2RBAR, przy czym: K+ - kontrola pozytywna, oczyszczone białko E2 Brescia wyprodukowane w układzie bakulowirusowym, 1-8 -preparaty białkowe roślin transgenicznych, K- - preparat białkowy rośliny kontrolnej.

Figura 13 przedstawia potwierdzenie obecności transgenu w roślinach lucerny metodą PCR, gdzie: W- kontrola negatywna, woda, jako matryca, K- - kontrola negatywna, reakcja PCR na matrycy DNA genomowego rośliny nietransgenicznej, 1-10 - reakcja PCR na matrycy DNA genomowego roślin transformowanych, K+ - reakcja PCR na matrycy plazmidu p35SBE2RBAR, M - marker wielkości DNA λ/EcoRl, Hind III.

Figura 14 przedstawia analizę immunoenzymatyczną testem ELISA w celu oceny ekspresji białka E2 w lucernie RR.

Figura 15 przedstawia analizę metodą PCR potwierdzającą obecność transgenu w komórkach A.tumefaciens, gdzie: 1-10 -produkty reakcji PCR, M-marker wielkości masy, K„+ kontrola pozytywna, plazmid pP35SE2BUBIROK.

Figura 16 przedstawia analizę metodą PCR genomowego DNA w celu potwierdzenia obecności transgenu E2 Brescia, gdzie: Kn - tytoń nietransformowany (kontrola negatywna), M - marker wielkości fragmentów DNA, Tt6-1 itd.- rośliny transformowane wektorem pPLAVBE2RBAR, Tt7-1 itd.- rośliny transformowane wektorem pP35SVBE2RBAR, W - woda (kontrola negatywna), Kp - plazmid pPLAVBE2RBAR (kontrola pozytywna).

Figura 17 przedstawia analizę immunoenzymatyczną metodą ELISA na potwierdzenie ekspresji glikoproteiny E2 w liściach tytoniu, przy czym: K- 1 ng, 5 ng, 10 ng - roślina kontrolna z dodatkiem antygenu E2 w ilościach 1, 5, 10 ng, 7/2 - 7/20-rośliny tytoniu transformowanego wektorem pP35SVBE2RBAR, K- roślina kontrolna, nietransgeniczna, „- E2 - kontrola negatywna bez dodatku czystego antygenu E2, „- II przeciwciało -kontrola negatywna, układ bez dodatku II przeciwciała Mab anti-E2.

Figura 18 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe ubikwityna::fragment antygenu E2 wirusa pomoru świń. Fragment włączono do wektora PBS w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną EcoRl i Hindlll.

Figura 19 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe ubikwityna::fragment antygenu E2 wirusa pomoru świń. Fragment włączono do wektora pIGCmT7 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazą restrykcyjną Ndel i Hindlll.

P r z y k ł a d 1. Konstrukcja wektorów do transformacji roślin

Pierwszy wariant dotyczył konstrukcji wektora binarnego pP35SBE2BAR do transformacji roślin zawierających sekwencję kodującą białko E2 szczepu Brescia wirusa CSFV.

Materiałem wyjściowym były plazmidy: pCSFVE2, zawierający sekwencję kodującą E2 Brescia, pGEM-T, pMG2A, pP35SGIB. Przygotowanie wektora obejmowało następujące etapy [fig. 1]:

PL 201 420 B1

Na matrycy pCSFVE2 metodą PCR przy pomocy specjalnie zaprojektowanych starterów oligonukleotydowych namnożono odcinek kodujący E2 o długości ok. 1,2 kpz, z równoczesnym wprowadzeniem miejsc restrykcyjnych XbaI i Pstl na końcach 5' i 3'.

Dodatkowo, aby zapewnić właściwą ramkę odczytu, wprowadzono na 5' końcu sekwencji E2 kodon ATG.

Namnożony fragment wprowadzono do plazmidu pGEM-T, uniwersalnego plazmidu do klonowania produktów PCR. Powstał plazmid pGTBE2. Plazmid ten wykorzystano jako matrycę do dokładnego sekwencjonowania odcinka kodującego E2 Brescia.

Plazmid pGTE2B przecięto enzymami Xbal i Pstl w ten sposób otrzymano fragment zawierający sekwencję E2 w otoczeniu miejsc Xbal i Pstl. Odcinek kodujący E2 wprowadzono do plazmidu pMG2A. Powstał plazmid pMG2ABE2. Z plazmidu pMG2ABE2 wycięto przy pomocy enzymów Xbal i Hindlll odcinek zawierają cy sekwencję E2 wraz z terminatorem Nt.

Wektor pP35SGIB został przecięty enzymami Xbal i Hindlll w celu usunięcia genu gus z intronem oraz terminatora Nt. Następnie do przeciętego wektora pP35SGIB wprowadzono odcinek zawierający sekwencję E2 wraz z terminatorem Nt. Powstał plazmid do transformacji roślin pP35SBE2BAR, zawierający sekwencję kodującą E2 Brescia pod kontrolą promotora 35SCaMV oraz sekwencję markerową bar warunkującą oporność na fosfinotricynę.

Wariant drugi dotyczył konstrukcji wektora binarnego pP35SBE2RBAR zawierającego sekwencje kodującą E2 Brescia z sekwencją KDEL kierującą białko E2 do ER [fig. 2].

Materiałem wyjściowym były plazmidy: pCSFVE2, zawierający sekwencję kodującą E2 Brescia, pGEM-T, oraz pP35SBE2RBAR. Przygotowanie wektora obejmowało następujące etapy:

Na matrycy pCSFVE2 metodą PCR namnożono odcinek kodujący N-końcowy odcinek E2 o długości ok. 670 kpz. Aby zapewnić właściwą ramkę odczytu, wprowadzony został na 5' końcu sekwencji E2 kodon ATG. Natomiast na 3'-końcu wprowadzono sekwencję AAA G AT G AA CTT kodującą cztery aminokwasy - KDEL. Sekwencja ta warunkuje retencję białka w ER. Całość zaopatrzono w odpowiednie miejsca cięcia -Xbal na 5'-końcu, XhoI na 3'-końcu. Wszystkie te elementy wprowadzono przy pomocy specjalnie zaprojektowanych starterów oligonukleotydowych. Następnie namnożony fragment wprowadzono do pGEM-T, uniwersalnego plazmidu do klonowania produktów PCR. Powstał plazmid pGTBE2KR. Plazmid ten posłużył jako matryca do sekwencjonowania odcinka kodującego E2R. Z plazmidu pGTBE2KR wyci ę to sekwencję kodują c ą E2KR przy pomocy enzymów Xbal i XhoI. Jednocześnie przy pomocy enzymów

Xbal i XhoI został przecięty plazmid pP35SBE2KRBAR. W ten sposób, po oczyszczeniu, wyeliminowano sekwencję kodującą E2. W miejsce odcinka E2 w wyniku ligacji wprowadzono sekwencję E2R. Powstał plazmid pP35SBE2RBAR, zawierający sekwencję kodującą E2 z sygnałem retencji białka w ER, pod kontrolą promotora 35SCaMV oraz sekwencję markerową bar warunkującą oporność na fosfmotricynę.

Trzecim wariantem była konstrukcja wektora pP35SE2BUBIROK zawierającego skróconą sekwencję glikoproteiny E2 połączoną z sekwencją ubikwityny.

Transfer wektora binarnego pP35SE2BUBIROK do komórek A. tumefaciens metodą elektroporacji.

Schemat otrzymywania fragmentu Ubi_BresciaE2_ŚR_w_PBS włączonego do wektora PBS(-)

Etap I Klonowanie ubikwityny w wektorze PBS(+) i pBuescripcie SK(-).

Gen kodujący ubikwitynę powielono w reakcji PCR na matrycy pełnego genomowego DNA drożdży Saccharomyces cerevisiae z wykorzystaniem primera wiodącego UB1 i odwrotnego UBK1. Primery zaprojektowano na podstawie sekwencji DNA kodującego białko ubikwityny od pozycji 767 do 995. Primer wiodący wydłuża powielaną cząsteczkę DNA na końcu 5', wprowadzając miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne EcoRl i Ndel oraz zmianę w sekwencji nukleotydowej, przy zachowaniu sekwencji aminokwasowej. Zmieniana jest guanina w pozycji 785 na adeninę. Primer odwrotny wprowadza na końcu 3' cząsteczki DNA zmiany w sekwencji nukleotydowej przy zachowaniu sekwencji aminokwasowej. Zmieniane są:

• guanina w pozycji 977 na cytozynę , • cytozyna w pozycji 978 na tyminę , • guanina w pozycji 983 na adeninę, • adenina w pozycji 986 na cytozynę , • adenina w pozycji 987 na cytozynę , • adenina w pozycji 989 na cytozynę .

PL 201 420 B1

W wyniku wprowadzonych z uż yciem primera UBK1 zmian w sekwencji nukleotydowej powielanego genu, pojawiają się miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne Aflll i Sacll. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektro foretycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment DNA o długości 240 pz wyeluowano z żelu poliakryloamidowego³. Uzyskany fragment DNA powielono metodą PCR z wykorzystaniem primera wiodącego UB1 i primera odwrotnego UBK2. Primer UBK2 wydłuża powielany fragment DNA na końcu 3', wprowadzając kodon terminacyjny TAA i miejsce rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną BamHl. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym, z którego następnie wyeluowano powielony fragment DNA o długości 259 pz. Wyeluowany fragment trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRl i BamHl, i odbiałczono³. Otrzymany fragment DNA ligowano z plazmidami:

1. PBS(+) trawionym tymi samymi nukleazami restrykcyjnymi

2. pBluescript SK(-) trawionym tymi samymi nukleazami restrykcyjnymi.

Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczepu NM522. Po izolacji DNA plazmidowego z kolonii transformowanych E. coli potwierdzono w wyniku analizy restrykcyjnej obecność wstawki DNA kodującej ubikwitynę. Poprawność sekwencji genu zweryfikowano sekwencjonowaniem. Do sekwencjonowania użyto primery SEQBLT3 i M1. Wektor PBS(+) z wklonowanym genem kodującym ubikwitynę trawiono nukleazami restrykcyjnymi Aflll i Hindlll. Mieszaninę po trawieniu rozdzielono elektroforetycznie w żelu agarozowym z którego wycięto, a następnie eluowano liniowe DNA plazmidowe.

Etap II Klonowanie antygenu E2

Z plazmidu zawierającego pełną sekwencję nukleotydową antygenu E2 CSFV powielono w reakcji PCR primerami UBIBRES1 i UBIBREK1 fragment o długości 660 pz od pozycji 2428 do 3087. Primery UBIBRES1 i UBIBREK1 zaprojektowano na podstawie sekwencji genu kodującego fragment antygenu E2 CSFV. Primer wiodący UBIBRES1 wprowadza na końcu 5' cząsteczki DNA zmiany w sekwencji nukleotydowej, przy zachowaniu nie zmienionej sekwencji aminokwasowej. Wprowadzone zmiany:

• guanina w pozycji 2430 na tyminę , • adenina w pozycji 2452 na cytozynę , • guanina w pozycji 2454 na cytozynę .

Primer odwrotny (UBIBREK1) wydłuża koniec 3' cząsteczki powielanego DNA i wprowadza kodon stop oraz miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne XhoIi Hindlll. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment DNA o długości 680 pz wyeluowano z żelu poliakryloamidowego. Uzyskany fragment DNA użyto jako matrycę w reakcji PCR z wykorzystaniem primera wiodącego UBIBRE2 i odwrotnego UBIBREK1. Primer wiodący UBIBRE2 wydłuża koniec 5' cząsteczki DNA wprowadzając sekwencję komplementarną o długości 16 pz do końca 3' fragmentu kodującego C-końcową część ubikwityny. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment DNA o długości 700 pz wyeluowano z żelu poliakryloamidowego³, a następnie trawiono nukleazami restrykcyjnymi Aflll i Hindlll, i odbiałczono. Otrzymany fragment DNA ligowano z wektorem będącym końcowym produktem Etapu I. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczepu NM522. Po izolacji DNA plazmidowego z transformowanych komórek E. coli potwierdzono obecność wstawki Ubi_BresciaE2_SR_wPBS w wyniku analizy restrykcyjnej. Poprawność sekwencji fragmentu Ubi_BresciaE2_ŚR_wPBS wklonowanego w wektorze PBS(+) zweryfikowano przez sekwencjonowanie z użyciem primerów SEQBLT3 i M1.

Schemat otrzymywania fragmentu Ubi_BresciaE2_ŚR_w_PIG włączonego do wektora pIGCmT7

Wektor PBS(+) ze wstawką Ubi_BresciaE2_ŚR_wPBS trawiono enzymami restrykcyjnymi Ndel i Hindlll. Mieszaninę po trawieniu rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Wytrawiony fragment DNA o długości 906 pz wyeluowano z żelu poliakryloamidowego³. Otrzymany w ten sposób fragment DNA ligowano z wektorem pIGCmT7 trawionym enzymami restrykcyjnymi Ndel i Hindlll, i odbiał czonym. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczepu NM522. Po izolacji DNA plazmidowego z kolonii transformowanych E. coli potwierdzono obecność wklonowanej wstawki Ubi_BresciaE2_ŚR_w_PIG w wyniku analizy restrykcyjnej. Poprawność sekwencji fragmentu Ubi_BresciaE2_ŚR_w_PIG wklonowanego w plazmid pIGCmT7 zweryfikowano przez sekwencjonowanie.

Schemat otrzymywania fragmentu Ubi_BresciaE2_ŚR_w_ROK2 włączonego do wektora ROK2

Z plazmidu pIGCmT7 awierającego wstawkę Ubi_BresciaE2_ŚR_w_PIG powielono metodą PCR z użyciem primera wiodącego UBIROCK i odwrotnego BREROCK fragment DNA. Primery UBI10

PL 201 420 B1

ROCK i BREROCK zaprojektowane zostały na podstawie sekwencji powielonego fragmentu. Primer UBIROCK wprowadza zmiany w sekwencji końca 5' powielanego fragmentu DNA, likwidując miejsce rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną Ndel i wprowadzając miejsce rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną Xbal. Primer BREROCK wprowadza zmiany na końcu 3' powielanego fragmentu DNA, likwidując miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne Xhol i Hindlll, i wprowadzając miejsce rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną BamHl. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment DNA o długości 911 pz wyeluowano z żelu poliakryloamidowego³, a następnie trawiono enzymami restrykcyjnymi BamHl i Xbal, i odbiałczono. Otrzymany fragment DNA ligowano z wektorem pBluescript SK(-) trawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi i odbiałczonym po trawieniu. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczep NM522. Po izolacji DNA plazmidowego z kolonii transformowanych E. coli potwierdzono obecność wstawki Ubi_BresciaE2_ŚR_w_Blue w wyniku analizy restrykcyjnej, a poprawność sekwencji zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Do sekwencjonowania użyto primery SEQBLT3, M13, UBIROCK, CGLYVK2. Wektor pBluescript SK(-) zawierający wklonowaną wstawkę Ubi_BresciaE2_ŚR_w_Blue trawiono enzymami restrykcyjnymi XbaI i BamHl. Mieszaninę po trawieniu rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Wytrawiony fragment DNA o długości 905 pz wyeluowano z żelu poliakryloamidowego³. Otrzymany w ten sposób fragment DNA ligowano z wektorem ROK2 trawionym enzymami restrykcyjnymi Xbal i BamHl, i odbiał czonym po trawieniu. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczep NM522. Po izolacji DNA plazmidowego z kolonii transformowanych E. coli potwierdzono w wyniku analizy restrykcyjnej obecność wstawki Ubi_BresciaE2_ŚR_w_ROK2 w plazmidzie ROK2. [fig.3]

Czwarty i piąty wariant doświadczenia obejmował Konstrukcja wektorów: pP35SVBE2RBAR zawierającego promotor 35S, sekwencję VTS oraz sekwencję KDEL kierującą białko E2 do ER oraz pPLAVBE2RBAR zawierającego promotor legA, sekwencję VTS oraz sekwencję KDEL kierującą białko E2 do ER [fig. 4a i b].

Wszystkie wektory użyte w pracy przygotowano w oparciu o plazmid binarny pGPTF-BAR. Przygotowane wektory zawierały zatem gen bar jako marker selekcji dla roślin transgenicznych. Gen bar kodujący specyficzną fosfotransferazę unieczynniającą fosfoinotricynę, substancję aktywną herbicydów takich jak Basta lub Glyfosat. W wektorze pGPTV-BAR i pochodnych wymieniony gen markerowy znajduje się pod kontrolą konstytutywnego promotora syntazy nopalinowej (NOS). Plazmid pGPTV-BAR zawiera ponadto gen uid kodujący β-glukuronidazę (GUS) wraz z terminatorem syntazy nopalinowej (NOSt) w obrębie miejsc restrykcyjnych EcoR I, Xba I, Sma I i Hind III. Po usunięciu sekwencji uid i NOSt, w miejsce te można wprowadzić dowolne kasety ekspresyjne.

Konstrukcja wektorów binarnych obejmowała kilka etapów:

a) przygotowanie promotorów nasieniowo-specyficznych białek zapasowych grochu

Fragmenty DNA obejmujące sekwencje promotorowe wraz z fragmentami sekwencji kodujących białka zapasowe grochu wyodrębniono z puli całkowitego DNA grochu poprzez amplifikację na matrycy genomowego DNA przy użyciu odpowiednich starterów. W oparciu o sekwencje dostępne w Banku Genów (BG) zaprojektowano startery specyficzne do promotora białka zapasowego- leguminy A (legA), (oznaczenie w BG -X02982, dl fragmentu DNA - 1388pz). Reakcję PCR wykonano na matrycy genomowego DNA grochu wyizolowanego z odmian Feltham First (legA) i Greenfeast. Odmiany te były pierwotnym źródłem sekwencji zamieszczonych w Banku Genów. Nasiona tych genotypów uzyskano z angielskiej kolekcji w Norwich oraz polskiej kolekcji w Stacji Hodowli Roślin w Wiatrowie. Otrzymany produkt reakcji amplifikacji rozdzielono w żelu agarozowym a następnie oczyszczono. Wykorzystując wprowadzone w reakcjach PCR sekwencje miejsc restrykcyjnych, fragment DNA wklonowano do wektora plazmidowego pBluscriptSK otrzymując wektor pBSKlegA.

Przeprowadzona analiza sekwencyjna wykazała niemal całkowitą identyczność - 99,7% sklonowanego fragmentu DNA z sekwencją promotora legA dostępną w Banku Genów. Otrzymana sekwencja legA zawierała typowe dla promotorów eukariotycznych elementy TATA-box oraz charakterystyczną sekwencję legumin-box decydującą o specyficznej aktywności promotora w rozwijających się nasionach. Sklonowana sekwencja zawierała także część sekwencji kodujących, obejmujące kodony inicjacyjne i peptydy sygnalne (SP) białek zapasowych.

b) przygotowanie dwuniciowej oligocząsteczki DNA dla potrzeb konstrukcji wektorów binarnych

Konstrukcja dwuniciowej oligocząsteczki DNA obejmowała syntezę chemiczną pojedynczych, komplementarnych deoksyoligomerów nazwanych VTS1 i VTS2, a następnie ich hybrydyzację w cząsteczkę VTS.

PL 201 420 B1

Syntezę pojedynczych oligomerów przeprowadzono w Pracowni Chemii Biokoniugatów IChB PAN.

Dwa jednoniciowe deoksyoligomery zaprojektowano w ten sposób, żeby po hybrydyzacji stanowiły dwuniciową cząsteczkę o takich „lepkich końcach, jakie powstałyby po trawieniu enzymami restrykcyjnymi Xba l i Pst I [fig. 5].

Dzięki temu otrzymany dwuniciowy fragment DNA po ufosforylowaniu 5'-końców cząsteczki mógł być bezpośrednio klonowany do wektora plazmidowego przeciętego wymienionymi enzymami.

c) przygotowanie wektorów:

1. wprowadzenie za pomocą PCR miejsc restrykcyjnych EcoR l i Xba I do sekwencji obejmującej promotor legA (PlegA) i peptyd sygnalny (SP) leguminy A oraz wklonowanie zmodyfikowanego promotora do pUC18 - otrzymując plazmid p18PlegAEX i następnie zsekwencjonowanie.

2. Wprowadzenie za pomocą PCR miejsc restrykcyjnych Spe I i Xho I oraz kodonu TAA (STOP) do sekwencji E2 oraz dodatkowo sygnałową sekwencję motywu aminokwasowego KDEL. Zmodyfikowany odcinek E2 wklonowano do pGEM-T - otrzymując pGTE2 oraz pGTBE2R. Poprawność sekwencji E2 potwierdzono przez sekwencjonowanie.

3. Wprowadzenie za pomocą PCR miejsc restrykcyjnych Pst I, Xho I Hind III do sekwencji terminatora NOS (NOSt). Terminator wklonowano następnie do pUC18 - otrzymując p18NOSt oraz zsekwencjonowano.

4. Przygotowano dwuniciową oligocząsteczkę DNA zawierającą sygnałową sekwencję kierującą białka do wakuoli (vacuolar targeting sequence - VTS), wklonowano ją do pUC18 - otrzymując p18VTS i potwierdzono poprawność sekwencji poprzez sekwencjonowanie.

5. Adaptowano wcześniej sklonowany promotor 35S CaMV w wektorze pBluescriptKS poprzez usunięcie miejsca restrykcyjnego Pst l - otrzymano pKSP35SGI.

Po przygotowaniu sekwencji VTS przystąpiono do zestawienia kaset ekspresyjnych i wektorów binarnych.

6. Przeklonowano NOSt do p18VTS-otrzymujac wektor p18VNt.

7. Do plazmidu p18VNt wprowadzono sekwencję E2Alfort.

8. Gotowa kasetę ekspresyjną : VTS-E2Alfort-NOSt przeniesiono do wektora pGPTV-BAR w miejsce GUS-NOSt, otrzymując pVE2BAR

9. Do pVE2BAR wklonowano promotor legA wraz z sekwencją SP otrzymując wektor binarny pPLAVE2BAR

Pozostałe wektory przenosząc sekwencję kodującą antygen E2 przygotowano przez modyfikacje wektora pPLAVE2BAR:

10. W miejsce PlegA wprowadzono promotor 35S otrzymując wektor pP35SVE2BAR.

11. W plazmidzie pPLAVE2BAR w miejsce sekwencji E2Alfort wklonowano zmodyfikowaną sekwencję E2Brescia otrzymując pPLAVBE2RBAR.

12. W wektorze pP35SVE2BAR w miejsce sekwencji E2Alfort wklonowano zmodyfikowaną sekwencję E2Brescia otrzymując pP35SVBE2RBAR.

P r z y k ł a d 2. Transformacja i otrzymywanie roślin transgenicznych

Pierwszy wariant doświadczenia obejmował transfer wektora binarnego pP35SBE2BAR do komórek A tumefaciens metodą elektroporacji [fig. 2].

Bakterie zawieszone w glicerolu i przechowywane w ultrazamrażarce (temperatura -70°C) rozmrażano w łaźni lodowej. Do tak przygotowanych bakterii dodawano 1 - 20 ng DNA plazmidowego, lekko mieszano i inkubowano w lodzie 2-6 min Następnie bakterie przenoszono do schłodzonej kuwety do elektroporacji. Kuwetę umieszczano w aparacie do elektroporacji i włączano łuk elektryczny. Parametry elektroporacji wynosiły 25 μF i 2500 V.

Po elektroporacji bakterie zawieszano w 1 ml pożywki SOC i przenoszono do kolbki. Bakterie wytrząsano przez 1 - 2 godz. w 28°C, 50 - 60 rpm. Po inkubacji zawiesinę bakterii wysiewano na pożywki YEB z antybiotykami i hodowano 2 dni w 28°C. Wyrosłe agrobakterie posiewano na 10 ml płynnego podłoża YEB z czynnikami selekcyjnymi kanamycyna 50 mg/l rifampicyna 100 mg/l w kolbkach Erlenmayera i hodowano w temp. 28°C. Po 16 -20 godzinach hodowli zawiesiną agrobakterii inokulowano na świeżą pożywkę YEB ^K50'R100 1:100 i prowadzono dalej hodowlę w temp. 28°C do osiągnięcia przez bakterie logarytmicznej fazy wzrostu. Fazę wzrostu bakterii oceniano na podstawie pomiaru OD zawiesiny przy długości fali 600 nm. Optymalna wartość OD wynosiła około 1. W dalszym etapie doświadczenia hodowle wirowano przez 10 min przy 6 000 rpm, w temp. 4°C. Supernatant usuwano, a bakterie zawieszano w świeżej pożywce MSGA w ilości równej objętości hodowli. Gotową zawiesinę rozlewano na płytki Petriego. W tym samym czasie przygotowywano do transformacji materiał roślinny.

PL 201 420 B1

Kolejnym etapem pierwszego wariantu doświadczenia była transformacja roślin A.tumefaciens szczepem EHA105 zawierającym wektor binarny pP35SBE2BAR. Materiał wyjściowy do transformacji stanowiły nasiona sałaty odmiany Aramir. Materiał pobierano do kolby, następnie przez 2 min płukano w 70% etanolu. Następnie etanol usuwano a nasiona przepłukiwano sterylną wodą. W dalszym etapie nasiona inkubowano przez 20 min w 25% roztworze komercyjnego wybielacza Clorox z dodatkiem Tweenu (stężenie 0,01%). Po upływie wymaganego czasu sterylizacji materiał przemywano 4-5 razy po 23 minuty sterylną wodą destylowaną, aż do całkowitego wypłukania Clorox'u.

Wysterylizowane nasiona sałaty wykładano na szalki z 0,8% agarem. Nasiona kiełkowały w temp. 22 - 24°C, w warunkach sł abego oś wietlenia. Po upł ywie 2-3 dni odcinano liś cienie, umieszczano w zawiesinie A. tumefaciens i inkubowano przez 10 min, lekko mieszając. Po inokulacji liścienie wykładano stroną brzuszną na pożywkę LR3A. Kokulturę prowadzono przez 2-4 dni, w ciemnoś ci, w temp. 28°C. Po zakończeniu kokultury liś cienie przenoszono na poż ywkę selekcyjną LR3A zawierającą czynnik selekcyjny Bastę w stężeniu 2,5 mg/l oraz karbencilinę w stężeniu 500 mg/l. Liścienie, na których powstawał kalus, co 5 dni przeszczepiano na świeżą pożywkę LR3A zawierającą takie samo stężenie czynników selekcyjnych. Regenerujące roślinki odcinano od kalusa i przeszczepiano na pożywkę LR2A ze stałą zawartością czynników selekcyjnych. Gdy roślinki osiągały rozmiar około 2-3 cm, przenoszono je do słoików zawierających pożywkę 1/2SH z czynnikiem selekcyjnym Basta w stężeniu 2,5 mg/l oraz karbencilina w stężeniu 500 mg/l. Ukorzenione rośliny wysadzano do doniczek zawierających sterylny piasek zmieszany z perlitem w stosunku 1:1 i adaptowano do warunków in vivo.

Hodowla siewek sałaty pokolenia T1.

Zebrane z pierwotnych transformantów nasiona sterylizowano i wykładano na szalki Petriego zawierające 0,8% agar z dodatkiem herbicydu Basta w ilości 2,5 mg/l. Nasiona kiełkowały przez 1-2 dni w temperaturze 28°C w ciemności. Rozwijające się z nasion siewki przenoszono do doniczek oraz warunków in vivo.

Drugi wariant doświadczenia obejmował transfer wektora binarnego pP35SBE2RBAR do komórek A. tumefaciens metodą elektroporacji.

Bakterie zawieszone w glicerolu i przechowywane w ultrazamrażarce (temperatura -70°C) rozmrażano w łaźni lodowej. Do tak przygotowanych bakterii dodawano 1 - 20 ng DNA plazmidowego, lekko mieszano i inkubowano w lodzie 2-6 min Następnie bakterie przenoszono do schłodzonej kuwety do elektroporacji. Kuwetę umieszczano w aparacie do elektroporacji i włączano łuk elektryczny. Parametry elektroporacji wynosiły 25 μF i 2500 V. Po elektroporacji bakterie zawieszano w 1 ml pożywki SOC i przenoszono do kolbki.

Bakterie wytrząsano przez 1 - 2 godz. w 28°C, 50 - 60 rpm. Po inkubacji zawiesinę bakterii wysiewano na pożywki YEB z antybiotykami i hodowano 2 dni w 28°C. Wyrosłe agrobakterie posiewano na 10 ml płynnego podłoża YEB z czynnikami selekcyjnymi: kanamycyna w stężeniu 50 mg/l oraz rifampicyna 100 mg/l w 100 ml kolbkach Erlenmayera i hodowano w temp. 28°C. Po 16-20 godzinach hodowli zawiesiną agrobakterii inokulowano na świeżą pożywkę YEB z czynnikami selekcyjnymi o stężeniu jak wyżej w stosunku 1:100 i prowadzono dalej hodowlę w temp. 28°C do osiągnięcia przez bakterie logarytmicznej fazy wzrostu. Fazę wzrostu bakterii oceniano na podstawie pomiaru OD zawiesiny przy długości fali 600 nm. Optymalna wartość OD wynosiła około 1. W dalszym etapie doświadczenia hodowle wirowano przez 10 min przy 6 000 rpm, w temp. 4°C. Supernatant usuwano, a bakterie zawieszano w świeżej pożywce MSGA w ilości równej objętości hodowli. Gotową zawiesinę rozlewano na płytki Petriego. W tym samym czasie przygotowywano do transformacji materiał roślinny. Kolejnym etapem drugiego wariantu doświadczenia była transformacja roślin szczepem A.tumefaciens EHA105 zawierającym wektor binarny pP35SBE2RBAR.

Materiałem wyjściowym do transformacji stanowiły nasiona sałaty odmiany Bibb

Burple.

Materiał pobierano do kolby, następnie przez 2 min płukano w 70% etanolu. Następnie etanol usuwano a nasiona przepłukiwano sterylną wodą. W dalszym etapie nasiona inkubowano przez 20 min w 25% roztworze komercyjnego wybielacza Clorox z dodatkiem Tweenu 20 (stężenie 0,01%). Po upływie wymaganego czasu sterylizacji materiał przemywano 4-5 razy po 2-3 minuty sterylną wodą destylowaną, aż do całkowitego wypłukania Clorox'u.

Wysterylizowane nasiona sałaty wykładano na szalki z 0,8% agarem. Nasiona kiełkowały w temp. 22 - 24°C, w warunkach słabego oświetlenia. Po upływie 2-3 dni odcinano liścienie, umieszPL 201 420 B1 czano w zawiesinie A. tumefaciens i inkubowano przez 10 min, lekko mieszając. Po inokulacji liścienie wykładano stroną brzuszną na pożywkę LR3A.

Kokulturę prowadzono przez 2-4 dni, w ciemności, w temp. 28°C. Po zakończeniu kokultury liścienie przenoszono na pożywkę selekcyjną LR3A zawierającą czynnik selekcyjny Bastę w stężeniu

2,5 mg/l oraz karbencilinę w stężeniu 500 mg/l.

Liścienie, na których powstawał kalus, co 5 dni przeszczepiano na świeżą pożywkę LR3A zawierającą takie samo stężenie czynników selekcyjnych. Regenerujące roślinki odcinano od kalusa i przeszczepiano na pożywkę LR2A ze stałą zawartością czynników selekcyjnych. Gdy roślinki osiągały rozmiar około 2-3 cm, przenoszono je do słoików zawierających pożywkę 1/2SH z czynnikiem selekcyjnym Basta w stężeniu 2,5 mg/l oraz karbencilina w stężeniu 500 mg/l.

Ukorzenione rośliny wysadzano do doniczek zawierających sterylny piasek zmieszany z perlitem w stosunku 1 : 1 i adaptowano do warunków in vivo.

Łączna ilość użytych do transformacji eksplantatów wynosiła 148. W wyniku regeneracji na pożywkach selekcyjnych otrzymano 25 roślin, czyli wydajność transformacji stanowiła 16,9%.

Trzeci wariant doświadczenia pokrywał się proceduralnie do etapu transferu wektora binarnego pP35SBE2RBAR do komórek A. tumefaciens metodą elektroporacji, włącznie. Dalej obejmował on transformację roślin A. tumefaciens szczepem EHA105 zawierającym wektor binarny pP35SBE2RBAR oraz Adaptowanie metody regeneracji lucerny siewnej odmiany Rangelander i A2

Materiał wyjściowy stanowiły liście, liścienie lub ogonki liściowe lucerny siewnej odmiany Rangelander i A2. Odmiana Rangelander udostępniona przez Departement of Crop Science, Guelph University, Canada. Odmiana A2, udostępniona przez pracownię prof. A. Kondorosi, Institute des Sciences Vegetales CNRS, Gif-sur-Yvette, Francja. Materiał pobierano do kolby, następnie przez 2 min płukano w 70% etanolu. Następnie etanol usuwano a nasiona przepłukiwano sterylną wodą. W dalszym etapie nasiona inkubowano przez 20 min w 25% roztworze komercyjnego wybielacza Clorox z dodatkiem Tweenu 20 (stężenie 0,01%). Po upływie wymaganego czasu sterylizacji materiał przemywano 4-5 razy po 2-3 minuty sterylną wodą destylowaną, aż do całkowitego wypłukania Clorox'u.

Wysterylizowany materiał uszkadzano przez obcinanie krawędzi skalpelem, po czym umieszczano w zawiesinie A. tumefaciens i inkubowano przez godzinę, w ciemności, lekko mieszając. Po inokulacji eksplantaty osuszano na sterylnej bibule i wykładano na pożywkę do kokultury. Kokulturę prowadzono przez 1-2 dni w ciemności, w temperaturze 26°C. Po zakończeniu kokultury eksplantaty odpłukiwano od bakterii w sterylnej wodzie i wykładano na pożywkę selekcyjną. Przez pierwsze dni eksplantaty hodowano w fitotronie, w temperaturze +24°C, w ciemności, następnie przenoszono na światło do pokoju hodowlanego i na pożywkę z innym składem regulatorów rozwoju roślin.

Regenerujące eksplantaty przekładano na świeżą pożywkę co 14 dni. Powstające somatyczne embriony oddzielano od kalusa. Gdy somatyczne embriony osiągały stadium zaawansowanej torpedy, przenoszono je na pożywkę z innym składem regulatorów rozwoju. Ukorzenione rośliny wysadzano do doniczek zawierających wysterylizowaną mieszaninę piasku, z perlitem (1:1), inokulowano Rhizobium melilotti i adaptowano do warunków in vivo.

Adaptowanie metody regeneracji lucerny siewnej odmiany Rangelander i A2

Opierając się na doświadczeniach Pracowni Hodowli Roślin Uniwersytetu w Guelph (Kanada), gdzie od lat prowadzono prace nad transformacją lucerny siewnej odmiany Rangelander i gdzie stosowano poż ywki oparte na skł adzie SH [Shenk 1972] dla odmiany tej opracowano optymalny schemat postępowania (tab.1). Natomiast metodykę regeneracji odmiany A2 pozyskano z Instytutu Biologii Roś lin w Gif-sur-Yvette. Jednak zastosowana w postaci pierwotnej nie był a tak efektywna, jak po wprowadzeniu niektórych zmian (tab. 2). Zmiany dotyczyły stymulacji morfogenezy. Embriony somatyczne dopiero po zredukowaniu ilości makroelementów i sacharozy w pożywce o połowę rozwijały się w kompletne roślinki. Również nieznacznie podwyższono odczyn pożywki (o 0,1 jednostki), gdyż zauważono, że wyższy odczyn powoduje, iż pożywka jest nieco bardziej klarowna. Ponadto zauważono, iż stosowanie żelaza w postaci EDFS, zalecane przez badaczy francuskich, daje gorsze wyniki, niż stosowanie chelatu żelaza według pożywki MS.

PL 201 420 B1

T a b e l a 1

Schemat regeneracji odmiany Rangelander

Sumaryczny czas hodowli na pożywce*	Pożywka podstawowa	Dodatkowe składniki	Stężenie składników, mg/l pożywki
10 dni, w ciemności	SH	mioinozytol	200
		2,4-D	1
		kinetyna	0,2
20-40 dni	SH	moinozytol	100
		NAA	0,05
		BAP	0,5
20-40 dni	SH	makroelementy sacharoza	redukcja o połowę redukcja o połowę

*- eksplantaty przekładano na świeżą pożywkę średnio co 12-14 dni.

T a b e l a 2

Schemat regeneracji odmian A2

Sumaryczny czas hodowli na poż ywce*	Pożywka podstawowa	Dodatkowe składniki	Stężenie składników, mg/l pożywki
10 dni, w ciemności	UM	mioinozytol	100
		hydrolizat kazeiny	2000
		2,4-D	2
		kinetyna	0,25
30-40 dni	UM	mioinozytol	100
		hydrolizat kazeiny	2000
		NAA	0,05
		BAP	0,5
20-60 dni	UM	makroelementy	redukcja o połowę
		sacharoza	redukcja o połowę

*-eksplantaty przekładano na świeżą pożywkę średnio co 12-14 dni.

Czwartym wariantem była transformacja roślin szczepem A.tumefaciens LBA4404 zawierającym wektor binarny pP35SE2BUBIROK.

Materiał wyjściowy do transformacji stanowiły nasiona sałaty odmiany Aramir.

Materiał pobierano do kolby, następnie przez 2 min płukano w 70% etanolu. Następnie etanol usuwano a nasiona przepłukiwano sterylną wodą. W dalszym etapie nasiona inkubowano przez 20 min w 25% roztworze komercyjnego wybielacza Clorox z dodatkiem Tweenu 20 (stężenie 0,01%). Po upływie wymaganego czasu sterylizacji materiał przemywano 4-5 razy po 2-3 minuty sterylną wodą destylowaną, aż do całkowitego wypłukania Clorox'u.

Wysterylizowane nasiona sałaty wykładano na szalki z 0,8% agarem. Nasiona kiełkowały w temp. 22 - 24°C, w warunkach słabego oświetlenia. Po upływie 2-3 dni odcinano liścienie, umieszczano w zawiesinie A. tumefaciens i inkubowano przez 10 min, lekko mieszając. Po inokulacji liścienie wykładano stroną brzuszną na pożywkę LR3A. Kokulturę prowadzono przez 2-4 dni, w ciemności, w temp. 28°C. Po zakończeniu kokultury liścienie przenoszono na pożywkę selekcyjną LR3A zawierającą czynnik selekcyjny kanamycynę w stężeniu 200 mg/l oraz timentynę w stężeniu 300 mg/l. Liścienie, na których powstawał kalus, co 5 dni przeszczepiano na świeżą pożywkę LR3A zawierającą takie samo stężenie czynników selekcyjnych. Regenerujące roślinki odcinano od kalusa i przeszczepiano na pożywkę LR2A ze stałą zawartością czynników selekcyjnych. Gdy roślinki osiągały rozmiar około 2-3 cm, przenoszono je do słoików zawierających pożywkę 1/2SH z czynnikiem selekcyjnym kanamycyna w stężeniu 200 mg/l oraz timentyna w stężeniu 300 mg/l.

Piąty wariant obejmował transfer wektorów binarnych pP35SVBE2RBAR i pPLAVBE2RBAR do komórek, A. tumefaciens metodą elektroporacji.

Bakterie zawieszone w glicerolu i przechowywane w ultrazamrażarce (temperatura -70°C) rozmrażano w łaźni lodowej. Do tak przygotowanych bakterii dodawano 1 - 20 ng DNA plazmidowego, lekko mieszano i inkubowano w lodzie 2-6 min Następnie bakterie przenoszono do schłodzonej kuwePL 201 420 B1 ty do elektroporacji. Kuwetę umieszczano w aparacie do elektroporacji i włączano łuk elektryczny.

Parametry elektroporacj i wynosiły 25 μF i 2500 V.

Po elektroporacj i bakterie zawieszano w 1 ml pożywki SOC i przenoszono do kolbki. Bakterie wytrząsano przez 1 - 2 godz. w 28°C, 50 - 60 rpm. Po inkubacji zawiesinę bakterii wysiewano na pożywki YEB z antybiotykami i hodowano 2 dni w 28°C.

Wyrosłe agrobakterie posiewano na 10 ml płynnego podłoża YEB z czynnikami selekcyjnymi: kanamycyna w stężeniu 50mg/l oraz rifampicyna 100mg/l w 100 ml kolbkach Erlenmayera i hodowano w temp. 28°C. Po 16-20 godzinach hodowli zawiesiną agrobakterii inokulowano na świeżą pożywkę YEB z czynnikami selekcyjnymi o stężeniu jak wyżej w stosunku 1:100 i prowadzono dalej hodowlę w temp. 28°C do osiągnięcia przez bakterie logarytmicznej fazy wzrostu. Fazę wzrostu bakterii oceniano na podstawie pomiaru OD zawiesiny przy długości fali 600 nm. Optymalna wartość OD wynosiła około 1. W dalszym etapie doświadczenia hodowle wirowano przez 10 min przy 6 000 rpm, w temp. 4°C. Supernatant usuwano, a bakterie zawieszano w świeżej pożywce

MSGA w ilości równej objętości hodowli. Gotową zawiesinę rozlewano na płytki Petriego. W tym samym czasie przygotowywano do transformacji materiał roślinny. Wyrosłe agrobakterie posiewano na 10 ml płynnego podłoża YEB z czynnikami selekcyjnymi: kanamycyna w stężeniu 50 mg/l oraz rifampicyna 100 mg/l w 100 ml kolbkach Erlenmayera i hodowano w temp. 28°C. Po 16-20 godzinach hodowli zawiesiną agrobakterii inokulowano na świeżą pożywkę YEB z czynnikami selekcyjnymi o stężeniu jak wyżej w stosunku 1:100 i prowadzono dalej hodowlę w temp. 28°C do osiągnięcia przez bakterie logarytmicznej fazy wzrostu. Fazę wzrostu bakterii oceniano na podstawie pomiaru OD zawiesiny przy długości fali 600 nm. Optymalna wartość OD wynosiła około 1. W dalszym etapie doświadczenia hodowle wirowano przez min przy 6 000 rpm, w temp. 4°C. Supernatant usuwano, a bakterie zawieszano w świeżej pożywce MSGA w ilości równej objętości hodowli. Gotową zawiesinę rozlewano na płytki Petriego. W tym samym czasie przygotowywano do transformacji materiał roślinny oraz transformację roślin szczepem A.tumefaciens LBA4404 zawierający wektor pP35SVBE2RBAR i pPLAVBE2RBAR.

Materiałem wyjściowym były rośliny tytoniu odmiany Wisconsin 38 pochodzące z hodowli in vitro ICHB PAN Poznań.

Z hodowli in vitro 3-4 tygodniowych roślin wycinano eksplantaty - kawałki liści o powierzchni około 1-2 cm² zanurzano je w zawiesinie agrobakterii i inokulowano 10 -20 min, co jakiś czas lekko mieszając. Po inokulacji, fragmenty liści lekko osuszano na bibule i wykładano dolną stroną na pożywkę MS. Kokulturę prowadzono 2-3 dni, w ciemności, w temp. 28°C. Po zakończeniu kokultury, odpłukiwano agrobakterie w sterylnej wodzie, ekspalntaty lekko osuszano na bibule i wykładano je dolna strona na pożywkę regeneracyjno-selekcyjną MST z czynnikami selekcyjnymi Basta 20 mg/l i karbencylina 500 mg/l.

Hodowlę tytoniu in vitro prowadzono w temp. 22-24°C i fotoperiodzie 16/8 (16 godzin światła, 8 godzin ciemności). Po upływie 4-5 tygodni hodowli, rozwijające się grudki transgenicznego kalusa odcinano z transformowanych fragmentów liści i wykładano pojedynczo na pożywkę MST z taką samą zawartością czynnika selekcyjnego jak poprzednio. Regenerujące w ciągu następnych 3-5 tygodni roślinki tytoniu odcinano z kalusa i pasażowano ponownie na pożywkę MST (Basta 20 mg/l, karbencylina 250 mg/l). Roślinki wielkości około 2 cm przenoszono do słoików zawierających pożywkę 1/2MS (Basta 20 mg/l, karbencylina 250 mg/l). Rozwinięte i ukorzenione rośliny tytoniu przenoszono do warunków in vivo. Hodowle tytoniu in vivo prowadzono w szklarni. Ukorzenione transformanty tytoniu wysadzano do doniczek zawierających ziemię ogrodniczą zmieszaną z perlitem w stosunku 1:1 i hartowano odkrywając kloszowane rośliny na coraz dłuższe okresy czasu. Adaptację roślin do warunków in vivo prowadzono przez 3-7 dni. Rośliny podlewano odstałą wodą kranową, zależnie od ich wymagań.

P r z y k ł a d 3. Ekspresja i analiza

Uzyskany materiał roślinny z pierwszego wariantu doświadczenia został poddany analizom molekularnym:

a) analiza PCR genomowego DNA sałaty w celu wykrycia obecności sekwencji kodującej E2

Brescia [fig. 7].

Materiał do izolacji genomowego DNA stanowiły młode liście sałaty zarówno pokolenia T0 i T1.

Analiza PCR wykazała, iż nie wszystkie rośliny rosnące na selektywnym stężeniu fosfinotricyny cechowały się obecnością sekwencji transgenu. Uzyskany wynik może sugerować chimeryczny charakter roślin pokolenia T0. Analiza pokolenia T1 potwierdziła obecność transgenu E2 Brescia w genomach 97% roślin sałaty [fig. 8],

PL 201 420 B1

b) analiza hybrydyzacyjna typu Western ekstraktów białkowych sałaty pokolenia T0 transformowanej wektorem pP35SBE2BAR [fig. 9, 10].

Wynik tej analizy sugeruje, iż poziom ekspresji białka antygenowego E2 w roślinach sałaty jest stosunkowo niski. Można również zauważyć, iż poziom ekspresji antygenu w roślinach pokolenia T0 wydaje się być w znacznym stopniu zróżnicowany.

Uzyskany materiał roślinny z drugiego wariantu doświadczenia został poddany analizom molekularnym:

a) analiza PCR genomowego DNA sałaty w celu wykrycia obecności sekwencji kodującej E2 Brescia [fig. 11]

Materiał do izolacji genomowego DNA stanowiły młode liście sałaty pokolenia T0.

b) analiza hybrydyzacyjna typu Western ekstraktów białkowych sałaty transformowanej wektorem pP35SBE2RBAR [fig. 12].

Materiałem do izolacji białka stanowiły młode liście sałaty.

W trzecim wariancie - w przypadku obu odmian lucerny siewnej transformacja cechowała się niezwykle wysoką wydajnością. Na potrzeby analiz regenerowano po 50 roślin (osobnych genotypów) każdej odmiany. Otrzymane rośliny poddano analizom molekularnym:

a) analiza metodą PCR genomowego DNA w celu potwierdzenia obecności transgenu E2 Brescia [fig. 13].

Materiałem do izolacji DNA genomowego posłużyły liście transformowanych roślin lucerny, b) analiza immunoenzymatyczna testem ELISA

Materiałem do analizy było białko wyizolowane z roślin transgenicznych. W tym celu wybrano 22 z 50 roślin lucerny siewnej odmiany Rangelander transformowanej A.tumefaciens zawierającym wektor binarny pP35SBE2RBAR [fig. 14].

Płytkowy test immunoenzymatyczny ELISA

Materiałem do analizy było białko wyizolowane z liści lucerny. W większości przebadanych roślin ekspresja białka zachodzi na bardzo wysokim poziomie. Zawartość białka w gramie świeżej masy rośliny waha się w granicach 1300 - 1700 ng. Dzięki tak wysokiej ekspresji glikoproteiny E2 w materiale roślinnym może on zostać użyty do doświadczeń na zwierzętach laboratoryjnych w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej.

Płytkę Maxisorp opłaszczano przeciwciałami monoklonalnymi MabV8 anti-E2 zawieszonymi w buforze węglanowym pH=9,6 w rozcieńczeniu 1:5 tys. i inkubowano w 37°C przez 3 godziny. Następnie trzykrotne odpłukano buforem fosforanowym PBS o pH=7,4 z dodatkiem 0,05% Tween 20.

W dalszym etapie przeprowadzono blokowanie pł ytki 5% odtł uszczonym mlekiem rozpuszczonym w buforze PBS, w objętości 390 μΐ na dołek. Po 30 min odpłukano według wcześniejszego schematu i opłaszczono płytkę antygenem E2. Ten etap doświadczenia prowadzono przez noc w temp. 4°C. Następnie ponownie płytkę odpłukano i opłaszczono przeciwciałami monoklonalnymi MabV3 anti-E2 zawieszonymi w buforze PBS w objętości 100 μl/dołek w rozcieńczeniu 1:5 tys. Inkubowano w temp. 37°C przy 100 rpm przez 1 godzinę po czym odpłukano i opłaszczono płytkę przeciwciałami monoklonalnymi: anty-mysie IgG (cała cząsteczka) sprzężone z alkaliczną fosfatazą (Sigma) zawieszone w buforze PBS w objętości 100 μl/dołek w rozcieńczeniu 1:20 tys. Etap przeprowadzano w temp. 37°C przez 1 godzinę. Następnie wywołano reakcję barwną przez dodanie substratu (firma INC) - 2-amino-2metyl1,3 propan-diol (10-krotnie stężonego) i roztworu wodnego p-nitrofenylofosforanu (50-krotnie stężonego) i uzupełnienie do żądanej objętości wodą MQ. Objętość substratu na dołek wynosiła 100 gl. Inkubowano w ciemności przez 30 min. Odczyt reakcji wykonano przy długości fali λ=405 nm na czytniku firmy BioRad Model 550.

W czwartym wariancie otrzymane rośliny poddano analizom molekularnym:

a) analiza metodą PCR w celu sprawdzenia obecność transgenu w komórkach Agrobacterium tumefaciens potwierdzono metodą PCR [fig. 15].

W piątym wariancie otrzymane transgeniczne rośliny tytoniu pokolenia T0 analizowano pod kątem występowania w ich genomach sekwencji kodujących białko E2 CSFV. Do tego celu użyto metody molekularne:

a) analiza metodą PCR genomowego DNA w celu potwierdzenia obecności transgenu E2 Brescia [fig. 16].

Materiałem do analizy było DNA genomowe wyizolowane z fragmentów liści roślin transformowanych.

W przypadku transformacji wektorem pP35SVBE2RBAR uzyskano 100% wydajność transformacji, natomiast w przypadku transformacji wektorem pPLAVBE2RBAR wydajność osiągnęła 89,5%.

PL 201 420 B1

b) analiza immunoenzymatyczna ELISA w celu wykrycia ekspresji białka E2 Materiałem do analizy było białko wyizolowane z tkanki roślinnej tytoniu. W tym celu wybrano 18 z 20 roślin transformowanych A. tumefaciens zawierającym wektor pP35SVBE2RBAR [fig. 17].

Claims (17)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Biał ko chimeryczne, znamienne tym, ż e zawiera sekwencję aminokwasową biał ka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV lub jej fragment, połączoną z co najmniej jedną spośród następujących sekwencji: sekwencją VTS, sekwencją KDEL, sekwencją ubikwityny.
2. 2. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, ż e zawiera jedną z poniższych sekwencji:

   - sekwencję aminokwasową białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją VTS oraz sekwencją KDEL;

   - sekwencję aminokwasową białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją KDEL;

   - skróconą sekwencję aminokwasową białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją ubikwityny.
3. 3. Sekwencja kodująca białko chimeryczne, znamienna tym, że zawiera sekwencję kodując ą białko E2 szczepu Brescia wirusa CSFV lub jej fragment, połączoną z co najmniej jedną sekwencją wybraną spośród następujących: sekwencją kodującą VTS, sekwencją kodującą KDEL, sekwencją kodującą sekwencję markerową bar, sekwencją kodującą ubikwityny.
4. 4. Sekwencja według zastrz. 3, znamienna tym, ż e zawiera jedną z nastę pujących sekwencji:

   - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą VTS, sekwencją kodującą KDEL oraz sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

   - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą KDEL oraz sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

   - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

   - skróconą sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą ubikwityny.
5. 5. Sekwencja wedł ug zastrz. 3, znamienna tym, ż e zawiera sekwencję wybraną spoś ród sekwencji przedstawionych na fig. 18 - fig. 20.
6. 6. Konstrukt zawierają cy sekwencję kodują c ą biał ko chimeryczne, znamienny tym, ż e zawiera sekwencję kodująca białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV lub jej fragment, połączoną z co najmniej jedną sekwencją wybraną spośród następujących: sekwencją kodującą VTS, sekwencją kodującą KDEL, sekwencją kodującą sekwencję markerową bar, sekwencją kodującą ubikwityny.
7. 7. Konstrukt według zastrz. 6, znamienny tym, że sekwencja kodująca białko chimeryczne jest połączona z sekwencją promotora 35SCaMV albo nasieniowo-specyficznego promotora legA.
8. 8. Konstrukt wed ług zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera jedną z następujących sekwencji:

   - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą VTS, sekwencją kodującą KDEL oraz sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

   - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą KDEL oraz sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

   - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

   - skróconą sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą ubikwityny.
9. 9. Konstrukt według zastrz. 6, znamienny tym, że został wybrany spośród konstruktów w przedstawionych na fig. 1-4.
10. 10. Komórka roślinna, znamienna tym, że zawiera konstrukt zawierający sekwencję kodującą białko E2 szczepu Brescia wirusa CSFV, lub jej fragment, połączoną z co najmniej jedną sekwencją wybraną spośród następujących: sekwencją kodującą VTS, sekwencją kodującą KDEL, sekwencją kodującą sekwencję markerową bar, sekwencją kodującą ubikwityny.
11. 11. Komórka według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera konstrukt zawierający jedną z następujących sekwencji:

    - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą VTS, sekwencją kodującą KDEL oraz sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

    PL 201 420 B1

    - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą KDEL oraz sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

    - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

    skróconą sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą ubikwityny.
12. 12. Sposób otrzymywania białka chimerycznego, znamienny tym, że obejmuje wprowadzenie wektora do komórek Agrobacterium tumefaciens metodą elektroporacji, transformację roślin szczepem bakteryjnym zawierającym ten wektor i uzyskiwanie ekspresji białka chimerycznego, przy czym wektor zawiera konstrukt zawierający sekwencję kodującą białko E2 szczepu Brescia wirusa CSFV, lub jej fragment, połączoną z co najmniej jedną sekwencją wybraną spośród następujących: sekwencją kodującą VTS, sekwencją kodującą KDEL, sekwencją kodującą sekwencję markerową bar, sekwencją kodującą ubikwityny.
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że obejmuje wprowadzanie konstruktu zawierającego jedną z następujących sekwencji:

    - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą VTS, sekwencją kodującą KDEL oraz sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

    - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą KDEL oraz sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

    - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

    - skróconą sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą ubikwityny.
14. 14. Sposób otrzymywania transgenicznej rośliny, znamienny tym, że obejmuje wprowadzanie wektora do komórek Agrobacteium tumefaciens metodą elektroporacji. transformację roślin szczepem bakteryjnym zawierającym ten wektor, i regenerację roślin, przy czym wektor zawiera konstrukt zawierający sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV, lub jej fragment, połączoną z co najmniej jedną sekwencją wybraną spośród następujących: sekwencją kodującą VTS, sekwencją kodującą KDEL, sekwencją kodującą sekwencję markerową bar, sekwencją kodującą ubikwityny, do komórki roślinnej.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że obejmuje wprowadzanie konstruktu zawierającego jedną z następujących sekwencji:

    - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą VTS, sekwencją kodującą KDEL oraz sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

    - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą KDEL oraz sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

    - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

    - skróconą sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą ubikwityny.
16. 16. Transgeniczna roślina, znamienna tym, że posiada komórki transformowane konstruktem zawierającym sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV, lub jej fragment, połączoną z co najmniej jedną sekwencją wybraną spośród następujących: sekwencją kodującą VTS, sekwencją kodującą KDEL, sekwencją kodującą sekwencję markerową bar, sekwencją kodującą ubikwityny.
17. 17. Transgeniczna roślina według zastrz. 16, znamienna tym, że posiada komórki transformowane konstruktem zawierającym jedną z następujących sekwencji:

    - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą VTS, sekwencją kodującą KDEL oraz sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

    - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą KDEL oraz sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

    - sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą sekwencję markerową bar;

    - skróconą sekwencję kodującą białka E2 szczepu Brescia wirusa CSFV połączoną z sekwencją kodującą ubikwityny.