CN1844136A - 兔病毒性出血症病毒感染性cDNA及其制备方法及感染性RNA - Google Patents

Abstract

本发明主要涉及兔出血症病毒感染性cDNA及其制备方法，特别是中国株JX/97病毒感染性cDNA的构建方法、从该感染性cDNA转录的RNA、包含该感染性cDNA的宿主细胞等。主要是以兔病毒性出血症病毒RNA为模板，以特异引物通过逆转录扩增基因组，并将扩增后的基因组组装克隆到载体中，得到的cDNA的5’末端上游具有强启动子，3’末端具有单一的限制性酶切位点及尾部的poly(A)序列，且该感染性cDNA与病毒基因组天然序列相差不超过50个核苷酸。兔病毒性出血症病毒感染性cDNA可用于了解基因的功能、了解病毒的致病机理和基因组的复制、表达调控机制、通过基因缺失技术制备减毒株疫苗和开发新型兔病毒性出血症疫苗等。

Description

兔病毒性出血症病毒感染性cDNA及其制备方法 及感染性RNA

技术领域

本发明主要涉及兔出血症病毒感染性cDNA及其制备方法，特别是中国株JX/97病毒感染性cDNA的构建方法、从该感染性cDNA转录的RNA、包含该感染性cDNA的宿主细胞等。

背景技术

建立感染性cDNA技术已成为现代病毒学研究中最重要的工具之一，该研究工具的发明及应用极大地推动了RNA病毒的研究进程。因为有了感染性cDNA，我们就可以在DNA分子水平上，应用基因工程技术对RNA病毒进行研究，如通过对病毒基因组进行定点突变以产生特定的突变体病毒，也可以缺失或替换基因组的任意部分以产生突变体。使得我们可以在分子水平上直接观察特定的病毒基因对病毒的复制、毒力及免疫等生物学功能等的影响。另外，从cDNA得到的感染性转录本，也将为研究病毒适应细胞及其致弱的分子基础提供帮助，借此可以制造有效的减毒疫苗而没有毒力回复的危险，进而为研制新型的基因工程苗提供一个新的思路。

兔病毒性出血症病毒是一种能引起青、壮年兔急性死亡的烈性病毒，其致死率可高达100％，能给养兔业造成严重的经济损失，目前它已被国际兽疫局(OIE)列为B类传染病。

目前，国内外尚未成功构建兔病毒性出血症病毒感染性cDNA，严重制约了兔病毒性出血症病毒的致病机理，分子免疫机制以及新型疫苗的研究等许多领域的发展。

发明内容

为了解决上述瓶颈，我们开展了RHDV感染性cDNA的研制工作，并提供以下技术方案。

兔病毒性出血症病毒感染性cDNA，其特征在于该cDNA的5’末端上游具有强启动子，3’末端具有单一的限制性酶切位点及尾部的poly(A)序列，且该感染性cDNA与病毒基因组天然序列相差不超过50个核苷酸。优选尾部的poly(A)序列具有18～70个A。更优选18～56个A，更优选25～50个A。例如36个A。

优选该感染性cDNA与病毒基因组天然序列相差不超过20个核苷酸。更优选不超过15个，更优选不超过10个，更优选不超过8个、7个、6个、5个，更优选不超过4个、3个、2个，最优选不超过1个核苷酸。特别优选该兔病毒性出血症病毒感染性cDNA包含如图5所示的SEQ ID NO：1所示的序列或在严谨条件与该序列杂交的序列。

制备兔病毒性出血症病毒感染性cDNA的方法，包括：

(a)以兔病毒性出血症病毒RNA为摸板，以特异引物通过逆转录PCR方法获得兔病毒性出血症病毒基因组其它部分的各片段，应用3’RACE方法扩增基因组的3’末端序列片段，包括poly(A)结构；

(b)将所扩增的PCR片段组装克隆到载体中，获得全长克隆cDNA，其中，全长克隆cDNA可操作地与启动子连接，全长克隆cDNA 3’末端具有单一的限制性酶切位点。

其中，优选步骤(a)和(b)以高保真的方式进行。高保真PCR的方法是本领域熟知的，包括例如利用高保真Taq酶等，可参见例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor，NY，1989。

优选的方案是：步骤(a)中所有片段两端都有适当的限制性酶切位点，所有这些限制性酶切位点是通过突变病毒基因组天然序列不超过20个核苷酸，优选不超过15个，更优选不超过10个，更优选不超过8个、7个、6个、5个，更优选不超过4个、3个、2个，最优选不超过1个核苷酸，或利用天然的限制性酶切位点而获得的；步骤(b)中采用限制性内切酶克隆方法将所扩增的PCR片段组装克隆到质粒(例如pBluescript SK(-))中，并通过在兔病毒性出血症病毒基因组5’端片断的5’端PCR扩增引物中包含启动子序列或将兔病毒性出血症病毒全长cDNA克隆在载体中启动子下游来给兔病毒性出血症病毒cDNA引入可操作地连接的启动子。

制备兔病毒性出血症病毒感染性cDNA的方法，优选应用高保真方式进行。

在优选的方案中，其中的特异引物为：

AB+：5’-GGTGATATC*ACACCTGTGCGCAAA-3’(SEQ ID NO：2)

AB-：5’-AGCTCTAGA GCGGCCGC TCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO：3

C+：5’-CTCTGTCCCCACGGGCCCAAC-3’(SEQ ID NO：4)

C-：5’-TTTGCGCACAGGTGTGATATCACC-3’(SEQ ID NO：5)

D+：5’-CGGGGTACCCATACGATTTAGGTGACACTATAGGTGAAAATTATGGCGGCTATD-3’(SEQ

       ID NO：6)

D-：5’-CATGAAGATGAGGCAGCCAGCA-3’(SEQ ID NO：7)

将含有兔病毒性出血症病毒感染性cDNA的质粒线性化，利用体外转录系统转录，可得到感染性RNA。

感染性cDNA构建的基本原理是以病毒的基因组RNA为模板，通过反转录和聚合酶链式扩增反应，得到其全长互补链cDNA，再应用分子克隆技术将其克隆到合适的载体中，该载体要具备能进行体(内)外转录的高效启动子，并能稳定、忠实地增殖病毒基因组cDNA。构建好病毒基因组的全长cDNA以后，利用体内(外)转录系统，对其进行转录反应，得到转录本RNA，再用它转染敏感细胞系，可产生感染性的病毒克隆，最后以其他手段鉴定所产生的病毒的感染性，如果所做的各项鉴定实验都能证实其感染性，就表明我们已经成功得到了具有感染性的cDNA。这样我们就可以在DNA分子水平上，根据研究者的意愿对病毒基因组进行操作，并应用现代分子技术开展许多领域的研究。

构建兔病毒性出血症病毒的感染性cDNA的技术关键有以下几点：

1)病毒基因组在分子克隆过程中要确保其真实性；

2)要保证所构建的感染性cDNA含有足够长度的尾巴结构，即poly(A)序列。

3)所构建的感染性cDNA要含有强的启动子，并能使转录反应正确终止。

在本发明中，优选的兔病毒性出血症病毒是只有一个血清型的病毒。例如中国株JX/97。

4)所构建的感染性cDNA要含有特定的基因“标签”，以便于与自然毒区别。

由于通过突变，例如基因缺失技术，可以从本发明感染性cDNA制备减毒株疫苗，因此，本发明另一方面也涉及上述感染性cDNA通过突变，例如基因缺失技术而衍生的兔病毒性出血症病毒感染性cDNA。

另外，本发明的感染性cDNA转化的宿主细胞，包括原核细胞如大肠杆菌细胞，和真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞动物细胞，尤其是哺乳动物的细胞。优选所述转化是稳定转化。

本发明兔病毒性出血症病毒感染性cDNA具有如下特点：

1)我们所选用的毒株为我国的毒株(JX/97株)，分离自兔体，反映了我国兔病毒性出血症病毒的特点，因此本研究产品的研制对我国兔病毒性出血症的研究更具有针对性。

2)RHDV基因组中自然存在的限制性内切酶识别位点，不需要改变基因组的真实序列，可操作性强。

3)本发明中的兔病毒性出血症病毒感染性cDNA，尤其是包含SEQ ID NO：1所示的序列的3’末端至少含有27个A，这一长度的poly(A)结构也能够保证病毒感染性的需要。

4)使用的载体是pBluescript SK(-)(Stratagene)

5)所构建的感染性cDNA含有一个特定的“标签”(EcoRV识别位点)

感染性cDNA的成功构建将为我们研究兔病毒性出血症提供一个有力的基因技术操作平台，可以方便人们对兔病毒性出血症病毒基因组的操作。具体应用主要有以下几个方面：

1)了解病毒的基因的功能。

2)了解病毒的致病机理和基因组的复制，表达调控机制。

3)研究病毒与宿主细胞的相互作用。

4)通基因工程缺失技术制备弱毒株疫苗，这种疫苗不会发生毒力返强现象。

5)研制并开发新型的兔病毒性出血症疫苗。

附图说明

图1是质粒pBluescript SK(+/-)的物理图谱。

图2是从pB1RHDV体外转录产生的RNA的变性凝胶电泳，其中，泳道1：体外转录产物；泳道M：RNA Marker。

图3是正常的RK-13细胞。

图4是用对照或从pB1RHDV体外转录产生的RNA转染细胞的结果。

图5是用RT-PCR技术区别鉴定从感染性cDNA衍生的兔出血症病毒与其母

本病毒(JX/97)的琼脂糖凝胶电泳图。

图6是用电子显微镜观察到的由感染性cDNA衍生的兔出血症病毒。

图7是实施例中构建的感染性cDNA的全序列SEQ ID NO：1。

图8是实施例中构建兔病毒性出血症病毒感染性cDNA的技术路线示意图。

具体实施方式

实施例1

我们所构建的感染性cDNA，是将兔病毒性出血症病毒基因组的全长cDNA克隆到质粒载体pBluescript SK(-)(Stratagene)中，包含了保证所合成的转录本具有感染性所要求的poly(A)序列。在全长cDNA的5’末端上游具有SP6启动子，3’末端具有单一的限制性酶切位点以保证转录正确终止。

在该实施方式中，本发明构建感染性cDNA的方法可以按如下进行：

1)兔病毒性出血症病毒的病料组织中抽提兔病毒性出血症病毒基因组RNA；

2)用所设计的特异引物(如表1所示)进行反转录反应(RT)，分为3段(AB、C、D)合成基因组RNA的cDNA第一链；

3)首先利用PCR技术，用高保真Taq酶扩增C、D两个片段。

4)应用3’RACE方法扩增基因组的3’末端序列(AB段)，包括poly(A)结构。

其具体操作过程是，首先用AB_(-)为反转录引物，以病毒RNA为模板合成cDNA第一链，再用AB₍₊₎，AB_(-)为扩增引物，以所合成的cDNA第一链为模板，进行PCR反应，得到含有poly(A)结构的3’末端序列AB片段，在其3’末端由AB_(-)引入Nru I酶切位点)。

5)根据各扩增片段中所含有的酶切位点，首先将AB片段克隆到pBluescritSK(-)(Stratagene)中(所使用的酶切位点为Nru I位点和EcoR V(此位点由AB(+)引物引入，同时也可以作为区别感染性cDNA衍生病毒与自然毒(JX/97)的一个遗传标签))，再以此重组质粒为载体，将D片段连到AB的上游(所使用的酶切位点为Kpn I和Apa I位点)，同样再将C片段插入到D与AB的中间(所使用的酶切位点为Apa I和EcoR V位点)，这样将所扩增的AB、C、D片段连接在一起，克隆到pBluescript SK(-)载体中，构成了pBIRHDV全长的重组质粒。

6)用Nru I将含有全长cDNA的质粒线性化，利用SP6体外转录系统(Stratagene)进行体外转录，合成转录本RNA。

7)在有甲醛的凝胶上进行RNA电泳，检测RNA的大小和完整性；

8)将转录本RNA用脂质体DMRIE-C(Invitrogen)转染RK-13细胞，检查其感染性。

9)利用所构建的感染性cDNA中的基因”标签”(EcoRV)，区别鉴定由感染性cDNA衍生的兔出血症病毒与自然的兔出血症病毒(JX/97株)。

10)用电子显微镜鉴定由感染性cDNA衍生的兔出血症病毒。

11)以上鉴定结果表明我们回收到了由感染性cDNA衍生的兔出血症病毒，这也就证明我们成功构建了兔出血症病毒的感染性cDNA。

参见图8(构建兔病毒性出血症病毒感染性cDNA的技术路线示意图)进行下列试验。

1)用RNeasy Mini kit(Qiagen)，从兔病毒性出血症病毒(GenBank中的登陆号为：DQ205345)感染的病料中抽提兔病毒性出血症病毒基因组RNA，具体操作按试剂盒操作说明书进行。

2)用所设计的特异性引物：AB_(-)、D_(-)、C_(-)为反转录引物，使用AMV反转录酶(TakaRa)进行反转录反应(RT)，分3段(AB、C、D)合成基因组RNA的cDNA第一链，具体操作按照商家说明书进行。

3)用PCR技术，用高保真Taq酶(TakaRa)，分段扩增AB、C、D三个片段。

其具体操作过程是：

应用3’RACE方法扩增基因组的3’末端序列(AB段)，包括poly(A)结构：首先用AB_(-)为反转录引物，以病毒RNA为模板合成cDNA第一链，再用AB₍₊₎，AB_(-)为扩增引物，以所合成的cDNA第一链为模板，进行PCR反应。扩增片段AB的反应体系(50μl)为：10×缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl₂ 3μl，cDNA 1μl，上游引物AB₍₊₎1μl，下游引物AB_(-)1μl，TaqDNA聚合酶(Promega)0.5μl，H₂O34.5μl。PCR反应程序：首先94℃变性5min，再按以下参数进行30个循环：94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 5min，最后于72℃延伸10min，PCR产物约为4500bp。取少量PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，EB染色，鉴定PCR产物，得到含有poly(A)结构的3’末端序列AB片段，(在其3’末端由AB(-)引入Nru I位点)。将PCR产物电泳分离纯化(按照Takara公司Agarose Gel DNA Purification Kit操作说明进行)，然后将纯化后的PCR产物连接到pMD18-T Vector SystemI(Takara)中，再将连接产物按照氯化钙方法转化大肠杆菌DH5α菌株(TakaRa)。挑取可能的阳性菌落，扩增培养，用碱裂解法小量提取质粒。分别用PCR扩增法和限制酶完全消化法(EcoRV(TakaRa))鉴定阳性质粒。测序结果表明，该片段含有兔病毒性出血症病毒基因组的3’端编码区和部分poly(A)结构(至少含有27个A)，这是成功构建感染性cDNA所必需的。

以下C、D各片段的PCR反应、克隆、鉴定方法与此相同。C段：PCR引物为C₍₊₎、C_(-)，PCR反应程序：首先94℃变性5min，再按以下参数进行30个循环：94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 2min，最后于72℃延伸10min，PCR产物约为1800bp。D段：PCR引物为D₍₊₎、D_(-)，PCR反应程序：首先94℃变性5min，再按以下参数进行30个循环：94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 2min，最后于72℃延伸10min，PCR产物约为1100bp。

4)各扩增片段中所含有的酶切位点，首先用XbaI(TakaRa)和EcoR v(TakaRa)将AB片段从pMD18-T Vector(Promega)中切下来，再用同样的限制性内切酶(XbaI和EcoR V)消化pBluescript SK(-)(Stratagene)，用T4 DNA连接酶(TakaRa)将二者相连接，再将连接产物按照氯化钙方法转化大肠杆菌DH5α菌株。挑取可能的阳性菌落，扩增培养，用碱裂解法小量提取质粒。分别用PCR扩增法和限制酶完全消化法(XbaI(TakaRa)和EcoRV(TakaRa))鉴定阳性质粒，并将此重组质粒命名为pB1-AB。用Apa IITakaRa)和Kan I(TakaRa)消化pB1-AB和D段PCR纯化产物，按照上述连接和克隆方法将D片段连到AB的上游，并将重组质粒命名为pB1-ABD，用EcoRV(TakaRa)和Apa I(TakaRa)同时消化C片段PCR纯化产物和pB1-ABD，按照上述的连接和克隆方法将C片段插入到片段AB与片段D的中间，构建成含有RHDV全长cDNA的重组质粒，并将重组质粒命名为pBIRHDV。

5)用Nru I将pBIRHDV线性化，利用SP6体外转录系统(Stratagene)进行体外转录，合成转录体RNA；具体操作按照试剂盒说明书进行。

6)在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳，检测RNA的大小和完整性。检测结果表明，通过体外转录反应可以得到全长RNA，电泳图见图2。

7)将转录本RNA用脂质体DMRIE-C(Invitrogen)转染RK-13细胞，检查其感染性；具体操作步骤如下(以6孔细胞培养板为例)：

A接种前一天，在6孔板或35mm培养皿中，在2ml添加有血清的DMEM中接种2×10⁵-3×10⁵细胞，使转染日细胞达到60-80％的融合。

B每孔使用2mlDMEM培养基清洗细胞(室温)。

C制备RNA-阳离子脂质体试剂复合物。

D在每个无菌管中加入1.0ml DMEM培养基(室温)。

E在含有DMEM培养基的试管中分别加入0、2、3、4、6、8或12μl DMRIE-C试剂，成分混匀。

F在每管中加入2.5-5.0μgRNA，稍微震荡。

G立刻将C中的复合物加入清洗过的细胞中。

H5％CO₂，37℃培养4h，然后使用完全培养基替换转染培养基。注意：对不同的细胞类型，要调整细胞与复合物接触的时间以及加入RNA的量。

I转染16-72h后，在光学显微镜下观察细胞形态的变化。

转染结果：在24h出现细胞病变，48h细胞病变达到80％。(参见图4)

8)回收上述细胞培养物，反复冻-融3次后，按前文提取病毒RNA的方法，提取病毒的基因组。然后用所设计的一对特异性鉴定引物(SEQ ID NO：8；SEQID NO：9)扩增目的基因片段。该对鉴定引物的序列如下：

JD+：5’-CCAACTGCACAATTCAAATCC(SEQ ID NO：8)

JD-：5′-TGAACATGACGGAGTCCTGGT-3′(SEQ ID NO：9)扩增片段JD的反应体系(50μl)为：10×缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl₂3μl，cDNA 1μl，上游引物JD₍₊₎1μl，下游引物JD_(-)1μl，Taq DNA聚合酶(Promega)0.5μl，H₂O 34.5μl。PCR反应程序：首先94℃变性5min，再按以下参数进行30个循环：94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，最后于72℃延伸5min，PCR产物约为443bp。取少量PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，EB染色，鉴定PCR产物。然后在37℃恒温水浴锅中，用EcoRV进行酶切消化1.5h，最后将消化产物用2％的琼脂糖凝胶电泳分析。结果可看到片段JD被切割成大小分别为262bp和180bp的两个小片段，而自然兔出血症病毒(JX/97)相应的扩增产物则没有被EcoRV切开(参见图5)，证明从RK-13细胞中回收到的病毒是从感染性cDNA衍生而来的兔出血症病毒。

9)用差速离心法纯化兔出血症病毒，然后与10×稀释的兔出血症病毒抗血清等量混合，37℃感作2h，3000rpm离心20min，用PBS重悬沉淀后，做常规负染色，然后于JEM-1200EX电子显微镜下观察病毒粒子，并拍照，结果可以看到直径约34nm的圆形病毒颗粒(图6)。

10)以上鉴定结果表明我们回收到了由感染性cDNA衍生的兔出血症病毒，这也就证明我们成功构建了兔病毒性出血症病毒的感染性cDNA。

11)通过对全长cDNA序列的测定，结果表明我们得到了本发明感染性cDNA的全基因序列(SEQ ID NO：1)，该序列在图7中给出。

Claims (11)

1、兔病毒性出血症病毒感染性cDNA，其特征在于该cDNA的5’末端上游具有强启动子，3’末端具有单一的限制性酶切位点及尾部的poly(A)序列，在基因组2907nt-2912nt处含有一个基因”标签”：EcoRV识别位点，且该感染性cDNA与病毒基因组天然序列相差不超过50个核苷酸。

2、如权利要求1所述的兔病毒性出血症病毒感染性cDNA，其特征在于尾部的poly(A)序列具有18～70个A。

3、如权利要求2所述的兔病毒性出血症病毒感染性cDNA，其特征在于尾部的poly(A)序列具有25～50个A。

4、如权利要求1所述的兔病毒性出血症病毒感染性cDNA，其特征在于该感染性cDNA与病毒基因组天然序列相差不超过20个核苷酸。

5、如权利要求4所述的兔病毒性出血症病毒感染性cDNA，其特征在于该感染性cDNA与病毒基因组天然序列相差不超过1个核苷酸。

6、如权利要求1所述的兔病毒性出血症病毒感染性cDNA，其特征在于该兔病毒性出血症病毒感染性cDNA包含SEQ ID NO：1所示的序列或在严谨条件与该序列杂交的序列。

7、制备兔病毒性出血症病毒感染性cDNA的方法，包括：

(a)以兔病毒性出血症病毒RNA为摸板，以特异引物通过逆转录PCR方法获得兔病毒性出血症病毒基因组其它部分的各片段，应用3’RACE方法扩增基因组的3’末端序列片段，包括poly(A)结构；

(b)将所扩增的PCR片段组装克隆到载体中，获得全长克隆cDNA，其中，全长克隆cDNA可操作地与启动子连接，全长克隆cDNA 3’末端具有单一的限制性酶切位点。

8、如权利要求7所述的制备兔病毒性出血症病毒感染性cDNA的方法，其特征在于应用高保真DNA聚合酶扩增方式进行。

9、如权利要求7所述的制备兔病毒性出血症病毒感染性cDNA的方法，其特征在于其中的特异引物为：

AB+：5’-GGT GATATCACACCTGTGCGCAAA-3’(EcoRV，SEQ ID NO：2)

AB-：5’-AGCTCTAGA GCGGCCGC TCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO：3

C+：5’-CTCTGTCCCCACGGGCCCAAC-3’(SEQ ID NO：4)

C-：5’-TTTGCGCACAGGTGTGATATCACC-3’(SEQ ID NO：5)

D+：5’-CGGGGTACCCATACGATTTAGGTGACACTATAGGTGAAAATTATGGCGGCTATD-3’(SEQID NO：6)

D-：5’-CATGAAGATGAGGCAGCCAGCA-3’(SEQ ID NO：7)

10、权利要求7所述的制备兔病毒性出血症病毒感染性cDNA的方法，其特征在于步骤(a)中所有片段两端都有适当的限制性酶切位点，所有这些限制性酶切位点是通过突变病毒基因组天然序列不超过20个核苷酸，优选不超过15个，更优选不超过10个，更优选不超过8个、7个、6个、5个，甚至更优选不超过4个、3个、2个，最优选不超过1个核苷酸，或利用天然的限制性酶切位点而获得的；本感染性cDNA的基因“标签”(EcoRV识别位点)由引物AB+引入，该位点是通过突变自然病毒JX/97株的1个核苷酸获得(T₂₉₁₀→A)。步骤(b)中采用限制性内切酶克隆方法将所扩增的PCR片段组装克隆到质粒中，并通过在兔病毒性出血症病毒基因组5’端片断的5’端PCR扩增引物中包含启动子序列或将兔病毒性出血症病毒全长cDNA克隆在载体中启动子下游来给兔病毒性出血症病毒cDNA引入可操作地连接的启动子。

11、将含有如权利要求1所述的兔病毒性出血症病毒感染性cDNA的质粒线性化，利用体外转录系统转录，可得到感染性RNA。

Images