KR102351198B1 - 자운영위축바이러스 dna-r 및 dna-s를 접종할 수 있는 감염성 클론 및 이의 용도 - Google Patents
자운영위축바이러스 dna-r 및 dna-s를 접종할 수 있는 감염성 클론 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 자운영위축바이러스 DNA-R 및 DNA-S를 접종할 수 있는 감염성 클론 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 자운영위축바이러스 DNA-R 및 DNA-S(MVDV DNA-R 및 DNA-S)의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드 및 이를 포함하는 대장균 및 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용 시, 매개충(insect vector) 없이도 효과적으로 작물에 자운영위축바이러스 DNA-R 및 DNA-S의 감염을 유발시킬 수 있다. 따라서, 본 발명을 이용하여 자운영위축바이러스 DNA-R 및 DNA-S의 기주 범위 및 기주와의 상관관계 등 다양한 연구에 응용할 수 있으며, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 사전에 방지할 수 있어, 관련 분야에 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은, 자운영위축바이러스(Milk vetch dwarf virus) DNA-R 및 DNA-S를 접종할 수 있는 감염성 클론 및 이의 용도에 관한 것이다.
나노바이러스(Nanovirus)는 단일가닥의 원형 DNA를 게놈(genome)으로 갖는 식물바이러스로 전 세계적으로 콩과 식물의 주요 경제작물에 피해를 입힌다고 알려져 있다. 감염되는 기주의 특성 상 주로 열대와 아열대 지역에서 보고되었으며 국내의 경우 2017년 발생이 보고되기 전까지 나노바이러스 감염에 의한 피해 사례가 보고된 바는 없었다.
2000년대에 들어서면서 국가 간 자유무역 협정이 체결되고 농산물의 교역이 활발해짐에 따라 수입 농산물과 함께 이에 감염될 수 있는 다양한 병원체 및 해충들이 유입되고 있는 상황이며 지구 온난화에 따른 기온 상승으로 유입된 바이러스가 확산되기 쉬운 환경이 만들어지고 있다. 따라서 국내에 유입되었을 시 큰 피해를 일으킬 수 있는 식물바이러스, 그 중에서도 최근 세계적으로 피해가 증가하고 있는 나노바이러스에 대해 사전에 연구하여 유입과 발생을 예방하는 시스템을 확립할 필요가 있다.
나노바이러스는 기계적인 전염이 불가능하며 오로지 특정 매개충(insect vector)과 감염된 종자에 의해서만 전염된다고 알려져 있다. 현재 국내에 서식하고 있는 나노바이러스 매개충으로는 진딧물(Acyrthosiphon pisum 및 Aphis craccivora)이 있는데 그 자체로도 작물에 피해를 끼치는 해충인데다 크기가 작고 방제가 어려워 접종 실험 등에 이용하기 까다롭다는 단점이 존재한다. 이를 극복하고 비교적 손쉽게 나노바이러스를 접종하는 방법이 바로 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)를 이용해 감염성 클론을 식물 세포에 직접 집어넣는 것이 알려져 있다.
나노바이러스는 다양한 지역에서 현재 산발적으로 발생이 계속 보고되고 있다. 그 중 자운영위축바이러스는 콩과식물에 감염되어 식물의 괴사 및 황화현상을 유발해 식물의 성장을 저해하고 수확량을 감소시키는 나노바이러스로 일본과 중국에서 보고된 바 있으며, 자운영위축바이러스의 DNA-R 및 DNA-S(Milk vetch dwarf virus DNA-R and DNA-S, MVDV DNA-R and DNA-S)가 주요 감염인자로 알려져 있다. 해당 바이러스는 2017년 충남 예산의 노지에서 재배 중이던 파파야에서 발생이 처음으로 확인되었으며, 이후 대만과 베트남의 병징을 보이는 파파야에서도 감염이 확인되었다. 이에 대한 연구를 위해선 해당 바이러스에 대한 감염성 클론 제작 및 이를 통한 인위적 감염시스템의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 자운영위축바이러스 DNA-R 및 DNA-S(MVDV DNA-R and DNA-S)의 감염성 클론을 바이너리 벡터(binary vector)에 담아 식물체에 아그로-인오큘레이션으로 도입하여, 식물체에 감염성 활성을 재현시키는 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 자운영위축바이러스 DNA-R(Faba bean necrotic yellows virus, MVDV DNA-R)의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2로 표시되는 MVDV DNA-S의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 MVDV 감염 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 MVDV DNA-R 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 MVDV DNA-S를 검출하는 제제를 포함하는 자운영위축바이러스의 감염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 MVDV DNA-R 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 MVDV DNA-S를 검출하는 단계;를 포함하는 식물체 내 MVDV의 감염 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 재조합 플라스미드를 식물체 내에 감염시키는 단계;를 포함하는 식물체에 MVDV를 감염시켜 병증을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 자운영위축바이러스 DNA-R(Faba bean necrotic yellows virus, MVDV DNA-R)의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 MVDV DNA-S의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 MVDV 감염 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 MVDV DNA-R 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 MVDV DNA-S를 검출하는 제제를 포함하는 MVDV의 감염 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 MVDV DNA-R 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 자운영위축바이러스 DNA-S를 검출하는 단계;를 포함하는 식물체 내 MVDV의 감염 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 재조합 플라스미드를 식물체 내에 감염시키는 단계;를 포함하는 식물체에 MVDV를 감염시켜 병증을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 자운영위축바이러스 DNA-R 및 DNA-S의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드 및 이를 포함하는 대장균 및 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용 시, 매개충(insect vector) 없이도 효과적으로 작물에 자운영위축바이러스 DNA-R 및 DNA-S(MVDV DNA-R 및 DNA-S)의 감염을 유발시킬 수 있다. 따라서, 본 발명을 이용하여 자운영위축바이러스 DNA-R 및 DNA-S의 기주 범위 및 기주와의 상관관계 등 다양한 연구에 응용할 수 있으며, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 사전에 방지할 수 있어, 관련 분야에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 자운영위축바이러스 DNA-R(MVDV DNA-R)의 감염성 클론으로 이용할 수 있는 재조합 플라스미드의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 자운영위축바이러스 DNA-S(MVDV DNA-S)의 감염성 클론으로 이용할 수 있는 재조합 플라스미드의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 자운영위축바이러스 DNA-S(MVDV DNA-S)의 감염성 클론으로 이용할 수 있는 재조합 플라스미드의 제조 과정을 나타낸 것이다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 자운영위축바이러스 DNA-R(Milk vetch dwarf virus, MVDV DNA-R)의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 MVDV DNA-S의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다.
MVDV는 DNA-R과 DNA-S 라는 두 개의 분리된 게놈을 포함하여 최소 8개의 게놈을 갖는 멀티파타이트(multipartite) 나노바이러스로 8 개의 게놈이 모두 존재할 때 정상적인 바이러스의 복제 및 병징 발현이 유도되는 것으로 알려져 있다. DNA-R 상에는 DNA 복제 등과 관련된 Rep 단백질이 암호화되어 있으며, DNA-S에는 외피 단백질이 암호화되어 있다.
상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 서열번호 1 및 2의 염기서열은 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 서열번호 1 및 2의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 서열번호 1 및 2의 염기서열과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 및 2의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 염기서열 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 염기 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 MVDV DNA-R 및 서열번호 2로 표시되는 MVDV DNA-S의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하였다. 본 발명의 발명자들은 상기 재조합 플라스미드를 사용하여 형질전환된 대장균 및 아그로박테리아를 제조하였으며, 이러한 형질전환된 아그로박테리아 균주를 식물체에 감염시키면, 식물체에 MVDV DNA-R 및 DNA-S의 병증이 현저하게 나타나는 놀라운 발견을 하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 재조합 플라스미드는 MVDV DNA-R 및 DNA-S의 유전자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 MVDV DNA-R 및 DNA-S의 유전자는 이량체로 구성될 수 있으며, 이는 각기 다른 제한효소를 사용하여 분리된 단량체를 재조합 플라스미드에서 연결하여 제조될 수 있다.
본 발명에서 용어, '형질전환'은 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 의미할 수 있다. 숙주세포는 이에 제한되는 것은 아니나, 식물세포, 원핵세포, 효모세포 또는 곤충세포 등이 포함될 수 있다.
삭제
또한 본 발명은 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스를 제공한다.
삭제
본 발명에서 용어, "아그로박테리움"은 흙 속에 사는 운동성을 가진 토양미생물의 하나로, 암을 유발하는 플라스미드(Ti(Tumer induced) plasmid)를 가지고 있어 식물체의 상처 따위를 통하여 감염하여 조직 세포의 이상 증식을 유발한다.
본 발명에 있어서, 상기 MVDV DNA-R을 발현하는 아그로박테리움 튜머페이션스는 기탁번호 (KACC 95146P)로 기탁된 것이 사용될 수 있으며, 이는 농업생명공학연구원(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 2019년 12월 4일자로 기탁되었다.
또한, 상기 MVDV DNA-S을 발현하는 아그로박테리움 튜머페이션스는 기탁번호 (KACC 95147P)로 기탁된 것이 사용될 수 있으며, 이는 농업생명공학연구원(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 2019년 12월 4일자로 기탁되었다.
또한, 본 발명은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 대장균 벡터; 아그로박테리움 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 세균 또는 바이러스 벡터 등을 포함될 수 있으며, 바람직하게는 대장균이다.
또한, 본 발명은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 MVDV 감염 식물체를 제공한다.
본 발명의 재조합 플라스미드가 도입되는 식물 세포는 세포가 식물로 재생될 수 있는 한 특정한 형태로 특별히 제한되는 것은 아니다. 이들 세포는, 예를 들면, 배양된 세포 부유물, 원형질체(protoplast), 잎 절편(leaf section) 또는 캘러스(callus) 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 대상 식물체로는 잠두, 렌틸콩, 강낭콩, 등을 포함하는 콩과 등을 포함할 수 있으며, MVDV DNA-R 및 DNA-S가 감염되는 식물이라면, 이에 제한되지 않는다.
삭제
상기 재조합 플라스미드의 식물체로의 도입은 당분야에 공지된 방법을 사용 할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움 매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 히트 쇼크법(heat shock), 전기천공법(electroporation) 또는 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게, 본 발명에 있어서 식물체에 MVDV DNA-R 및 DNA-S의 DNA의 병증을 유도하기 위해 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용하는 방법이 사용될 수 있다. 이러한 아그로-인오큘레이션 (Agro-inoculation) 방법은 식물체 내로 유전자를 도입하여 발현시키거나 식물체 내에서 원하는 단백질을 생산하기 위한 방법을 의미할 수 있다. 아그로-인오큘레이션은 접종하고자 하는 식물의 정단부에 곤충핀을 이용하여 상처를 낸 후 이동시키고자 하는 유전자를 가진 아그로박테리움의 현탁액을 주입하여주는 방법이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 MVDV DNA-R 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 MVDV DNA-S를 검출하는 제제를 포함하는 MVDV의 감염 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “조성물”은 목적하는 병증의 원인균을 검출하기 위한 프라이머, DNA 폴리머라제, dNTP 및 버퍼와 같은 DNA검출 및 증폭용 시약을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 바이러스를 검출하는 제제는 MVDV에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 또한 상기 조성물은 반응 증폭 혼합물을 더 포함할 수 있으며, 반응 증폭 혼합물은 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 중합 효소, 데옥시뉴클레오티드, 뉴클레아제가 없는 멸균수 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액 등을 지칭하며, 바람직하게는 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드, DNA 중합효소를 포함할 수 있다.
상기 프로브의 말단에는 형광 물질 등의 리포터를 표지(labeling)할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기 서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명의 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 MVDV DNA-R 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 MVDV DNA-S를 검출하는 단계;를 포함하는 식물체 내 MVDV의 감염 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 MVDV 감염 진단 방법은 식물체 내 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 MVDV DNA-R 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 바이러스 유전자의 존재를 확인함으로써 MVDV 감염 여부를 진단하는 방법을 말한다. 더욱 구체적으로 본 발명의 MVDV를 진단하기 위한 프라이머를 이용한 증폭 반응을 수행하여 MVDV의 MVDV DNA-R 또는 DNA-S를 특이적으로 검출할 수 있는 방법일 수 있다.
상기 “증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미하며, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로, 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭 (transcription-mediatedamplification; TMA) (WO88/10315), 자가유지염기서열복제(self sustained sequence replication) (WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산염기서열 기반 증폭 (nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭 (loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 등의 증폭 방법일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기의 재조합 플라스미드를 식물체 내에 감염시키는 단계;를 포함하는 식물체에 MVDV를 감염시켜 병증을 유도하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을, 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것 일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
<실시예 1> MVDV DNA-R 및 DNA-S 유전자 확보
충남 예산 지역의 농가에서 MVDV에 감염된 것으로 확인된 파파야 시료의 DNA를 확보하였다. GE Healthcare의 TempliPhi™ 100 Amplification Kit를 이용해 회전환 증폭법(Rolling circle amplification)을 수행하여 전달 받은 DNA로부터 원형 DNA만을 특이적으로 증폭시키고 제한효소 EcoRI과 PstI을 각각 처리한 뒤 아가로즈 겔에 전기영동을 하여 약 1kb 길이의 나노바이러스(Nanovirus)로 예상되는 DNA를 분리하였다. 그 후 pGEM-3zf(+) vector에 T4 DNA 연결 효소(ligase)를 이용해 붙이고 대장균(Escherichia coli) DH5α strain에 형질 전환하여 37℃에서 배양했다. 바이오니아(BIONEER Inc.)의 AccuPrep® Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit를 이용해 DH5α로부터 플라스미드를 추출하여 마크로젠(Macrogen Inc.)에 시퀀싱 분석을 의뢰하여 염기 서열을 확보하였다. 염기 서열은 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) GenBank에 각각 등록하였다(MK726377, MK726376).
<실시예 2> MVDV DNA-R 및 DNA-S 감염성 클론 제작 및 검정용 프라이머 세트 제작
<2-1> MVDV DNA-R 및 DNA-S 감염성 클론 제작용 프라이머 세트 제작
MVDV DNA-R 및 DNA-S의 감염성 클론 제작에 필요한 프라이머를 제작하였다. 나노바이러스에 대한 감염성 클론 제작을 위해서는 각각 4개의 프라이머(F1, R1, F2, R2)가 필요하다. 시퀀싱으로 확인한 MVDV 염기 서열을 바탕으로 제한효소를 붙이기 위해 DNA-R에는 KpnI(GGTACC), EcoRI (GAATTC), SpeI(ACTAGT)를 추가하고 DNA-S에는 BamHI(GGATCC), PstI(CTGCAG), KpnI(GGTACC)을 추가하여 프라이머 8종을 제작하였으며 프라이머 서열 목록은 서열번호3 내지 10에 기재하였다.
<2-2> MVDV DNA-R 및 DNA-S 감염성 클론 제작
MVDV-DNA-R-pGEM-3zf(+), MVDV-DNA-S-pGEM-3zf(+)와 MVDV DNA-R 및 DNA-S 염기 서열을 바탕으로 제작된 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 말단에 제한효소 KpnI와 EcoRI, SpeI과 EcoRI 자리를 각각 갖는 MVDV DNA-R DNA 절편과 BamHI와 PstI, PstI과 KpnI 자리를 각각 갖는 MVDV DNA-S DNA 절편을 각각 증폭하였다. 각각의 MVDV DNA-R과 MVDV DNA-S에 대한 절편들을 pGEM T-easy vector에 클로닝하여 DH5α 에서 양을 늘린 뒤 플라스미드를 추출하였다. DNA-R에 대해 제한효소 KpnI, EcoRI 및 SpeI을 처리하여 2개의 MVDV DNA-R 단량체를 분리하고 마찬가지의 방법으로 제한효소 KpnI과 SpeI을 처리한 pCAMBIA1303 vector를 얻어낸 뒤 3개의 유전자를 T4 DNA ligase로 이어 붙였다. DNA-S의 경우, 제한효소 BamHI, PstI 및 KpnI을 처리하여 2개의 MVDV DNA-R DNA절편을 분리하고 마찬가지의 방법으로 제한효소 BamHI와 KpnI을 처리한 pCAMBIA1303 vector를 얻어낸 뒤 3개의 유전자를 T4 DNA ligase로 이어 붙였다. 이렇게 만들어진 MVDV-DNA-R-pCAMBIA1303 및 MVDV-DNA-S-pCAMBIA1303 플라스미드를 다시 대장균 DH5α strain에서 양을 늘린 뒤 추출하고, 제한효소 처리를 통해 정상적으로 플라스미드가 만들어 졌는지 확인했다. 마지막으로 확인된 플라스미드를 각각 아그로박테리움 (Agrobacterium tumafaciens) GV3101 strain에 형질 전환하여 감염성 클론을 완성했다.
<실시예 3> MVDV DNA-R 및 DNA-S 감염성 클론의 감염성 확인
실시예 2에서 제작된 MVDV DNA-R 감염성 클론 및 MVDV DNA-S 감염성 클론의 감염성을 확인하기 위해 기주식물로 알려진 토마토를 발아 후 2주간 재배하여 준비하였다. 준비된 토마토의 정단부에 핀으로 찔러서 상처를 낸 후 MVDV DNA-R 감염성 클론 및 MVDV DNA-S 감염성 클론을 포함하는 아그로박테리움 배양액을 주입시켜 MVDV DNA-R 및 MVDV DNA-S를 감염시켰으며, 이후 3주간 재배하면서 감염성 여부를 확인하였다. 3주 후 식물의 어린잎으로부터 게놈 DNA를 추출하여 실시예 2-1의 프라이머로 PCR을 수행함으로써 바이러스가 식물체 내에 제대로 감염되었는지 확인하였다.
그 결과, 감염된 식물에서는 건전 식물과 달리 잎의 괴사 및 황화 현상이 일어나고, 성장이 위축되는 병증이 확인되었으며, 병증이 유발된 식물체 내에 MVDV DNA-R 및 MVDV DNA-S가 제대로 감염되었다는 것을 확인하였다.
<110> Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY
<120> Infectious clone of Milk vetch dwarf virus DNA-R and DNA-S and
uses thereof
<130> PN1911-699
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1002
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> MVDV DNA R
<400> 1
ctggggcggg gcttagtatt acccccgccc caggatcagc ggagtcatca cgtgacccgc 60
acatgccttt agtctatata tagcccaagt tgtaatattt tatcattcat caataaaata 120
tggctcggca agttatatgc tggtgcttta cattaaataa tcctctctct cctctagttc 180
ttcatgaatc aatgaagtac cttgtttatc aaagagaaca aggtgaagct ggaaatattc 240
atttccaggg ttatattgag atgaagaaac gcacgtctct tgcaggtatg aagcgattag 300
ttccaggagc ccattttgag aaaatgaggg taaaccaaga ccaggctaag gcttacgcta 360
tgaaggaaga cacccgtctt gaaggtccat gggagtatgg ggagttcatc cccaccattg 420
aagataagct cagggaagtt atgaacgaca tgaagattac aggtaagaga cctattgagt 480
atatagaaga gtgctgtaat acatacgata aatctgcaag tactctaagg gagttcagag 540
gtgagttgaa gaagaagaag gcaattttaa gttgggagtt gcagaggaag ccatggatgg 600
acgaggtcga taccttgctt caggagagag atggaagaag aatcatttgg gtgtatggcc 660
cacaaggtgg agaagggaaa acctcttacg ctaagcatct tgtgaaaacg cgtgatgctt 720
tttattcgac aggtggaaag acagccgaca ttgcttttgc gtgggaccac caagagttag 780
tgcttttcga ctttcctcga agcttcgagg agtatgttaa ttatggagta atagagcaat 840
taaagaatgg gattatccag tctggcaagt accaaagtgt aattaagtat agtgattatg 900
tggaggtgat tgtatttgct aattttactc cgcgtagcgg tatgtttagt gatgatagga 960
ttgtatatgt atatgcatga cgtcatatga tcccgtgctg ag 1002
<210> 2
<211> 994
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> MVDV DNA S
<400> 2
ctggggcggg gcttagtatt acccccgcac caggatcagc ggagtcattt agactcatta 60
taagccgtta gatgtgtaga cacgtggacg atcaggatct gtgattcgtg aagcgaatct 120
gacggaagat cgtccgaaac ttcgtggtag ggccctatgt tgctttatct ttactttatt 180
aaagtaaaga atgatgctgt cccctacttt ataccttttg agttgattac agctgtcttt 240
gcttcgtctc caagcaaagc atattttctc tctctataaa agctgagaaa tgtattcgtt 300
gtactcacaa cgaaaatggt aatgaattgg aattggaatg ggatgaagag acgacgaaca 360
cctcgtcgtg gttatgccag gccgttcaag cctgttgttc ctatcaccag ggtcgttgtt 420
catcaatctg ctttgttgaa gaaagatgaa gtcgttggat gtgagatcaa accagatggt 480
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ggagaattag tcaattacat catcgtcaag agcagttctc ccattgttaa ttggtctgca 600
gcttttaccg ctcctgctct gttagtgaaa gaaagttgcc aagacatgat atcaatcatt 660
gctaaaggca aggttgagtc caatggagtt gcaggtactg attgcacaaa gtccttcaat 720
aaatttatta gattgggagc cggtatcagc caaacccaac atttgtatgt tgttatgtac 780
actagtgttg ctttgaaggc tgtgttagaa catagagttt atattgaatt gtaatgtaat 840
gaagaacact atgaaataat gaaaccaagt atcatttaat cttaaaactc cgcgtagcgg 900
tatgtttccg tgtttttgtt tccaataatg cccttcatta atgaaggaga attgtcaaat 960
atgaccttgt gacgtcactt gatcccgtgc tgaa 994
<210> 3
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<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> MVDV DNA R primer F1
<400> 3
ggtacccgtc atttgatccc gtgct 25
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<211> 27
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> MVDV DNA R primer R1
<400> 4
gaattcgaat tcccttagag tacttgc 27
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> MVDV DNA R primer F2
<400> 5
gaattcagag gtgagttgaa gaaga 25
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<212> DNA
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<220>
<223> MVDV DNA R primer R2
<400> 6
actagtattt tattcaagaa tgataaaata ttacaacttg 40
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<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> MVDV DNA S primer F1
<400> 7
ggatcctgta atgaagaaca ctatgaaata atgaaacc 38
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> MVDV DNA S primer R1
<400> 8
ctgcagacca attaacaatg ggagaa 26
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> MVDV DNA S primer F2
<400> 9
ctgcagcttt taccgctcc 19
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> MVDV DNA S primer R2
<400> 10
ggtacctttc gttgtgagta caacgaatac 30
Claims (13)
- 서열번호 1로 표시되는 자운영위축바이러스 DNA-R(Milk vetch dwarf virus, MVDV DNA-R)의 염기서열을 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens) 및 서열번호 2로 표시되는 MVDV DNA-S의 염기서열을 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스를 포함하는 MVDV 감염용 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 MVDV DNA-R의 염기서열을 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스는 기탁번호 KACC95146P의 아그로박테리움 튜머페이션스이고, 상기 서열번호 2로 표시되는 MVDV DNA-S의 염기서열을 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스는 기탁번호 KACC95147P의 아그로박테리움 튜머페이션스인, MVDV 감염용 조성물.
- 삭제
- 제1항의 MVDV 감염용 조성물에 의해 감염된, 자운영위축바이러스 감염 식물체.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 MVDV 감염용 조성물을 이용하여 식물체 내에 MVDV(자운영위축바이러스)를 감염시키는 단계;를 포함하는 식물체에 자운영위축바이러스를 감염시켜 병증을 유도하는 방법.
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| Tatiana Timchenko 등. Virology. Vol. 274, No. 1, 페이지 189-195 (2000.)* |
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