KR101925465B1 - 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 dna를 접종할 수 있는 감염성 클론 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 유전자를 포함하는 감염성 클론 및 이를 이용한 식물체 감염 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA를 포함하는 재조합 플라스미드 및 형질전환 균주를 이용해, 기존에 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA에 감염된다고 알려진 고추 외에도 박과 또는 콩과 등 다양한 작물에도 쉽게 질병을 유발시킬 수 있다. 따라서, 본 발명을 이용하여 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 기주 범위 및 기주와의 상관관계 등 다양한 연구에 응용할 수 있으며, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 사전에 방지할 수 있다.

Description

크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA를 접종할 수 있는 감염성 클론 및 이의 용도{Infectious clone of Croton yellow vein mosaic alpha-satellite DNA and uses thereof}
본 발명은 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 유전자를 포함하는 감염성 클론 및 이를 이용한 식물체 감염 시스템에 관한 것이다.
생명공학 연구를 위해서는 수많은 기술들이 필요한데, 그 중에서도 형질전환 기술은 기본적으로 없어서는 안 될 중요한 기술 중 하나이다. 형질전환이란, 말 그대로 본래 가지고 있지 않은 형질(유전자)을 도입하거나 본래 가지고 있는 형질을 제거하는 것이다. 이를 통해서 그 형질에 대한 기능을 분석할 수 있다.
특히, 식물의 형질전환 기술은 식물유전자의 기능 또는 발현 분석에 매우 유용하게 활용할 수 있는 중요한 기술로서 식물의 발달, 분화에 관여하는 여러 가지 현상을 규명하거나 유용유전자의 도입을 통한 신 기능성 품종을 개발하는 기술로 활용되어 왔다. 일반적으로 식물의 형질전환은 조직배양 기술을 바탕으로 발달해 왔으나 조직배양을 이용한 경우 재분화(regeneration) 기간이 길어 시간과 노력이 많이 요구되는 단점이 있고, 재분화 과정에서의 체세포변이 또는 자연적인 기형 형성이 나타나는 등의 심각한 문제점이 제기되었다. 따라서, 조직 배양을 거치지 않는 식물 형질전환 기술이 개발되었는데, 이는 조직배양을 거치지 않고 식물이 생장하는 상태 그대로 생장점 부위에 위치하는 세포들을 형질전환시킨 후, 형질전환된 세포로부터 재분화하는 줄기에서 형질전환된 종자를 획득하여, 유전적으로 안정된 형질전환 식물체를 획득할 수 있는 기술이다. 이 기술에서 파생된 것이 아그로박테리움 균주(Agrobacterium strain)를 이용한 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration) 방법이다.
아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)는 많은 쌍자엽 식물들에서 근두암종병(Crown gall disease)을 일으키는 토양 세균으로서 오랫동안 알려져 왔다. 1970년대에는, 아그로박테리움의 Ti 플라스미드가 병원성과 관련되어 있으며, Ti 플라스미드의 일부인 T-DNA는 식물 게놈 내로 통합된다는 것이 밝혀졌다. 이후에는 T-DNA가 근두암종의 형성에 필요한 호르몬 합성 유전자들(시토키닌 및 옥신)을 포함하며, 이들 유전자들은 세균으로부터 유도되지만, 식물 내에서 발현된다는 것이 밝혀졌다. Ti 플라스미드의 독성영역(Vir 영역)내에 위치된 일군의 유전자들은 T-DNA의 절제 및 이들의 식물로의 이동에 필요하며, 또한 T-DNA의 반대쪽 말단들에 위치한 오른쪽 경계(border) 서열 및 왼쪽 경계 서열로 명명되는 경계 서열들이 그 절제에 요구된다는 것도 밝혀졌다.
크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA(Croton yellow vein mosaic alpha-satellite DNA)는 제미니바이러스 DNA-A와 함께 식물체에 감염되어 DNA-A의 도움을 받아 자가복제를 진행하고 병증을 심화시키는 유전자이다. 그러나, 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 감염성 클론을 바이너리 벡터(binary vector)에 담아 식물체에 아그로-인필트레이션으로 도입하여, 식물체에 감염성 활성을 재현시키는 기술은 아직까지 연구가 미흡한 실정이다.
이에 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA(Croton yellow vein mosaic alpha-satellite DNA)의 감염활성을 식물체에서 재현시킬 수 있는 재조합 플라스미드, 이로 형질전환된 아그로박테리아를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 재조합 플라스미드 및 아그로박테리아를 이용하여 식물체에 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA를 감염시켜 병증을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명에서는 서열번호 1로 표시되는 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA(Croton yellow vein mosaic alpha-satellite DNA)의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다. 상기 재조합 플라스미드는 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 유전자를 식물체에 형질전환시키기 위한 발현 벡터, 즉 재조합 발현벡터일 수 있다.
본 발명의 발명자들은 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA를 다양한 식물체에 감염시키는 방법을 연구하던 중, 서열번호 1로 표시되는 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하였다. 본 발명의 발명자들은 상기 재조합 플라스미드를 사용하여 형질전환된 대장균 및 아그로박테리아를 제조하였으며, 이러한 형질전환된 아그로박테리아 균주를 식물체에 감염시키면, 식물체에 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 병증이 현저하게 나타나는 놀라운 발견을 하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 재조합 플라스미드는 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 유전자를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 유전자는 이량체로 구성될 수 있으며, 이는 각기 다른 제한효소를 사용하여 분리된 단량체를 재조합 플라스미드에서 연결하여 제조될 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 유전자 동등물을 포함할 수 있다. 상기 유전자 동등물에는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자와 상동성을 갖는 상동 유전자를 포함할 수 있다. 상기 "상동 유전자"란 서열번호 1의 염기서열과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 유전자로서 본 발명의 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 유전자와 실질적으로 동질의 기능을 나타내는 유전자를 의미할 수 있다. 서열 상동성은 당업계에 공지된 방법으로 분석될 수 있다.
또한, 상기 본 발명에 따른 형질전환 유전자로는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자뿐만 아니라, 서열번호 1의 일부 염기가 치환, 결실 또는 부가된 변형서열로서, 본 발명의 서열번호 1의 염기서열로부터 암호화되는 단백질의 활성과 동등한 정도의 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기서열이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균(Escherichia coli) 및 이를 포함하는 대장균 혼합물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens) 및 이를 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스 혼합물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 아그로박테리움 튜머페이션스는 기탁번호 KACC 95133P로 기탁된 것이 사용될 수 있으며, 이는 KACC(농업미생물 자원센터)에 2016년 10월 12일자로 기탁되었다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질전환되어 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 감염 활성이 나타난 식물체를 제공한다. 본 발명의 재조합 플라스미드가 도입되는 식물 세포는 세포가 식물로 재생될 수 있는 한 특정한 형태로 특별히 제한되는 것은 아니다. 이들 세포는, 예를 들면, 배양된 세포 부유물, 원형질체(protoplast), 잎 절편(leaf section) 또는 캘러스(callus) 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 대상 식물체로는 고추과, 박과 또는 콩과 식물 등을 포함할 수 있으며, 그 밖에 담배, 벼, 옥수수, 사탕수수, 보리, 또는 밀 등을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명에 따른 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA 감염 식물체는 서열번호 1의 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 식물체를 형질전환한 다음, 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정을 통해 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 재조합 플라스미드를 이용해 식물체에 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA를 감염시켜 병증을 유도하는 방법을 제공한다. 상기 재조합 플라스미드의 식물체로의 도입은 당분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움 매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 히트 쇼크법(heat shock), 전기천공법(electroporation) 또는 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등이 사용될 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 있어서 식물체에 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 병증을 유도하기 위해 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용하는 방법이 사용될 수 있다. 이러한 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration) 방법은 식물체 내로 유전자를 도입하여 발현시키거나 식물체 내에서 원하는 단백질을 생산하기 위한 방법을 의미할 수 있다. 아그로-인필트레이션은 이동시키고자 하는 유전자를 가진 아그로박테리움의 현탁액을 바늘이 없는 주사기를 사용해서 압력을 줌으로써 식물의 잎에 주입하여 식물체 세포로 원하는 유전자를 이동시키는 방법일 수 있다. 이는 전통적인 식물 형질전환과 비교하면 신속하고 편리하다는 장점이 있다.
본 발명에서 사용되는 '형질전환'이란 용어는 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 의미할 수 있다. 숙주세포는 이에 제한되는 것은 아니나, 식물세포, 원핵세포, 효모세포 또는 곤충세포 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 ‘발현벡터’는 본 발명에 따른 유전자가 삽입 또는 도입될 수 있는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체 등을 의미할 수 있다. 본 발명에 따른 유전자는 발현조절서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현조절서열은 선택 마커 및 복제 개시점을 같이 포함하고 있는 하나의 발현벡터 내에 포함될 수 있다.
본 발명은 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA를 포함하는 재조합 플라스미드 및 형질전환 균주를 이용해, 기존에 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA에 감염된다고 알려진 고추 외에도 박과 또는 콩과 등 다양한 작물에도 쉽게 질병을 유발시킬 수 있다.
따라서, 본 발명을 이용하여 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 기주 범위 및 기주와의 상관관계 등 다양한 연구에 응용할 수 있으며, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 사전에 방지할 수 있다.
도 1은 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 감염성 클론으로 이용할 수 있는 재조합 플라스미드의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA 및 pCAMBIA1303 벡터를 사용하여 만든 재조합 플라스미드에 제한효소를 처리하고, 중합효소연쇄반응을 이용해 검출된 산물을 나타낸 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA(CYVMA) 유전자 확보
농우시드 인디아(Nongwoo seed India PVT. LTD)의 도움을 받아, 인도 방갈로르 지역의 농가에서 제미니바이러스에 감염된 것으로 추정되는 고추(Capsicum annuum) 시료의 DNA를 확보하였다. GE 헬스케어의 TempliPhiTM 100 증폭 키트를 이용해 회전환 증폭법(Rolling circle amplification)을 수행하여, 전달 받은 DNA로부터 원형 DNA만을 특이적으로 증폭시키고 제한효소 SacI을 처리한 뒤 아가로즈 겔에 전기영동을 하여 제미니바이러스로 예상되는 DNA를 분리하였다. 그 후 pGEM-3zf(+) vector에 T4 DNA 연결효소를 이용해 붙이고 대장균(Escherichia coli) DH5α 균주에 형질 전환하여 37℃에서 배양했다. 바이오니아(BIONEER Inc.)의 AccuPrep® Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit를 이용해 DH5α로부터 플라스미드를 추출하여 마크로젠(Macrogen Inc.)에 시퀀싱 분석을 의뢰하여 염기 서열을 확보하였다. 염기서열은 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI)에서 제공하는 생물체 핵산 정보 검색 도구인 BLAST(Basic Local Alignmeent Search Tool)를 이용해 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA(Croton yellow vein mosaic alpha-satellite DNA; CYVMA)임을 확인하였다.
실시예 2: 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 감염성 클론 및 검정용 프라이머 세트 제작
CYVMA의 감염성 클론 제작에 필요한 프라이머, 및 식물의 감염 여부를 검정하기 위해 필요한 프라이머를 제작하였다. 제미니바이러스 감염성 클론 제작을 위해서는 총 4개의 프라이머(F1, R1, F2, R2)가 필요하다. 또한, 제미니바이러스 검정법으로 활용되는 중합효소연쇄반응법(Polymerase chain reaction; PCR)의 프라이머는 2개가 필요하다. 시퀀싱으로 확인한 CYVMA의 염기서열을 바탕으로, 제한효소를 붙이기 위해 HindIII(AAGCTT), BamHI(GGATCC) 및 SpeI(ACTAGT)를 추가한 프라이머 4종(표 1), 및 감염 여부를 확인할 수 있는 검정용 프라이머 2종(표 2)을 제작 및 주문하였다.
Figure 112016128958846-pat00001
Figure 112016128958846-pat00002
실시예 3: CYVMA 감염성 클론의 제작
CYVMA-pGEM-3zf(+) vector와 CYVMA 염기 서열을 바탕으로 제작된 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 말단에 제한효소 HindIII와 SacI, SpeI과 SacI을 각각 갖는 CYVMA 단량체를 증폭하였다. 각각의 CYVMA 단량체를 pGEM T-easy vector에 클로닝하여 DH5α 에서 양을 늘린 뒤 플라스미드를 추출하였다. 제한효소 HindIII, SacI, SpeI을 처리하여 2개의 CYVMA 단량체를 분리하였다.
동일한 방법으로 제한효소 HindIII와 SpeI을 처리한 pCAMBIA1303 벡터를 얻어낸 뒤 3개의 유전자를 T4 DNA 연결효소로 이어 붙였다. 이렇게 만들어진 CYVMA-pCAMBIA1303 플라스미드를 다시 대장균 DH5α 균주에서 양을 늘린 뒤 추출하고, 제한효소 처리를 통해 정상적으로 플라스미드가 만들어 졌는지 확인했다.
마지막으로 확인된 플라스미드를 아그로박테리아(Agrobacterium tumafaciens) GV3101 균주에 형질 전환하여 감염성 클론을 완성했다. 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 감염성 클론을 사용하여 재조합 플라스미드를 제조하는 과정을 도 1에 나타내었다.
실시예 4: CYVMA 감염성 클론의 확인
제작된 CYVMA 감염성 클론에 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 존재 여부를 확인하기 위해, 재조합 플라스미드에 제한효소를 처리하고 PCR을 수행하였다. 도 2에 나타난 실험 결과를 볼 때, 재조합 플라스미드로부터 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA의 1량체 및 2량체가 검출되었다. 이를 통해, 제작된 CYVMA 감염성 클론은 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA을 명백하게 포함하는 것을 확인하였다.
농업생명공학연구원 KACC95133P 20161012
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Infectious clone of Croton yellow vein mosaic alpha-satellite DNA and uses thereof <130> P16-284 / 2016-0490-10-A <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1355 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Croton yellow vein mosaic alpha-satellite DNA <400> 1 acccgcgtcc agaaaaaaga ccctcttaat tctctctgaa ataccccccc ccttgtaatg 60 gctgctatta agtctgtctt ctggtgtttc accattttct tcactacttc ttctccccct 120 gatttaattc ctttgttcga aaacacccac gttagttatg cctgctggca agaggaagag 180 tctcccacga ctcgacgtcg ccacctgcag ggatatctcc agtgtaaggg tcagaggacc 240 ctgaaacagg tgaaatctct ctttggggac ctgaatcccc atctggagaa acagcgagct 300 cgtaagacag acgaagctcg cgattactgc atgaaagagg aatctagggt ttccggtccc 360 tttgaatttg gggaatattg tcctcatggt tctaataaac gcaaactgga ggaattattg 420 ggtaattccg ataatgagat agaagaaccc caaaaataca gaagagccat ggcgatgaag 480 atgacgaagg agtcacatca gtgggcccta aataatccct ttccatttga attaaaggaa 540 tggcaggagc gtctgtctgc agatctgaat tcaaatccag atgaccgcgc gattttttgg 600 gtttacggtc ccactggtgg ggaagggaag tcccagtttg ccaagtacct gggtttaaac 660 aaaaattggt tgtacttacc tggtggcaag gttaatgata tgatgtatat gtattgtaag 720 aagccccaga gtaatttagt tatagattat cctaggtgta ataaagattt tattaattat 780 gcatttttag agatggttaa gaataggaca gtttatagtt ataagtacga gccagttggg 840 tttatagacc ctacttgtaa tgtacatgtt gtagttatgg ctaatttcct tcctgattat 900 gaaaggatta gtcaggatcg aataaaatta attgatttgt cctaattaat tgtcttccta 960 acaattatta atttgaaaaa gaacaagacc gcgcatcggc atataaataa aataattttg 1020 cttcttgaat acaagaagga atgaaatgga aaaaaaatga ataattgcct tcctcttatt 1080 tcatttgaaa atcaagtgcc gcgcagcggc attcaaaaaa aataaaaaat aaaataaata 1140 ataaataata ttaaaatggt tgaataaaac gacgtcgttg tgttatattg actggtcaac 1200 tcattaatgg cattttggta atttcttatc ttcacacgct taaacttcta gaccctctgg 1260 gatatccgta cgctctcacg tgccagcttc tagaccagga gagagaaaca tgtagaccct 1320 ataaatagaa atgctctgga cgcggcctta gtatt 1355

Claims (4)

  1. 서열번호 1로 표시되는 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 DNA(Croton yellow vein mosaic alpha-satellite DNA)의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드.
  2. 제1항의 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균(Escherichia coli).
  3. 제1항의 재조합 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens).
  4. 제3항에 있어서, 상기 아그로박테리움 튜머페이션스는 기탁번호 KACC 95133P인 것을 특징으로 하는 아그로박테리움 튜머페이션스.
KR1020160182082A 2016-12-29 2016-12-29 크로톤황화잎맥모자이크바이러스 알파 위성 dna를 접종할 수 있는 감염성 클론 및 이의 용도 KR101925465B1 (ko)

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