KR102256363B1

KR102256363B1 - 토마토잎말림뉴델리바이러스 dna-a 및 dna-b를 접종할 수 있는 감염성 클론 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102256363B1
Application number: KR1020190049719A
Authority: KR
Inventors: 길의준; 이석찬; 티 비치 투이 보; 빠렐라 쥬세페
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2019-04-29
Filing date: 2019-04-29
Publication date: 2021-05-27
Also published as: KR20200126454A

Abstract

본 발명은 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B를 접종할 수 있는 감염성 클론 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B(ToLCNDV DNA-A 및 DNA-B)의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드 및 이를 포함하는 대장균 및 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용 시, 매개충(insect vector) 없이도 효과적으로 작물에 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B의 감염을 유발시킬 수 있다. 따라서, 본 발명을 이용하여 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B의 기주 범위 및 기주와의 상관관계 등 다양한 연구에 응용할 수 있으며, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 사전에 방지할 수 있어, 관련 분야에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B를 접종할 수 있는 감염성 클론 및 이의 용도{Infectious clone of Tomato leaf curl New Delhi virus DNA-A and DNA-B and uses thereof}

본 발명은 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B를 접종할 수 있는 감염성 클론 및 이의 용도에 관한 것이다.

제미니바이러스(Geminivirus)는 한 개 혹은 두 개의 단일가닥 원형 DNA를 게놈(genome)으로 갖는 식물바이러스로 전 세계적으로 토마토, 카사바, 밀 등의 주요 경제작물에 피해를 입힌다고 알려져 있다. 감염되는 기주의 특성 상 주로 열대와 아열대 지역에서 보고되었으며 국내의 경우 현재까지 5종의 제미니바이러스가 발견되어 토마토, 고구마 등의 재배농가에 피해를 입히고 있다.

2000년대에 들어서면서 국가 간 자유무역 협정이 체결되고 농산물의 교역이 활발해짐에 따라 수입 농산물과 함께 이에 감염될 수 있는 다양한 병원체 및 해충들이 유입되고 있는 상황이며 지구 온난화에 따른 기온 상승으로 유입된 바이러스가 확산되기 쉬운 환경이 만들어지고 있다. 따라서 국내에 유입되었을 시 큰 피해를 일으킬 수 있는 식물바이러스, 그 중에서도 최근 세계적으로 피해가 증가하고 있는 제미니바이러스에 대해 사전에 연구하여 유입과 발생을 예방하는 시스템을 확립할 필요가 있다.

제미니바이러스는 기계적인 전염이 불가능하며 오로지 특정 매개충(insect vector)과 감염된 종자에 의해서만 전염된다고 알려져 있다. 현재 국내에 서식하고 있는 제미니바이러스 매개충으로는 담배가루이(Bemisia tabaci)가 있는데 그 자체로도 작물에 피해를 끼치는 해충인데다 크기가 작고 방제가 어려워 접종 실험 등에 이용하기 까다롭다는 단점이 존재한다. 이를 극복하고 비교적 손쉽게 제미니바이러스를 접종하는 방법이 바로 아그로박테리아(Agrobacterium tumefaciens)를 이용해 감염성 클론을 식물 세포에 직접 집어넣는 것이 알려져 있다.

제미니바이러스가 기주로 삼는 식물과 다른 식물로 전염시키는 매개충의 서식지가 열대 환경에 가깝기 때문에 인도 아대륙을 포함한 동남아시아에서 많이 발견되고 있는데 그 중에서도 토마토에 감염되어 잎말림 증상을 유발해 식물의 성장을 저해하고 수확량을 감소시키는 제미니바이러스로 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B(Tomato leaf curl New Delhi virus DNA-A and DNA-B, ToLCNDV DNA-A and DNA-B)가 알려져 있다. 해당 바이러스는 현재 이탈리아, 스페인 등 지중해 연안 국가로도 확산되어 쥬키니, 멜론 등과 같은 박과작물에 감염되어 수확량 감소 등의 경제적 피해를 주고 있다. 이에 대한 연구를 위해선 해당 바이러스에 대한 감염성 클론 제작 및 이를 통한 인위적 감염시스템의 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B(ToLCNDV DNA-A and DNA-B)의 감염성 클론을 바이너리 벡터(binary vector)에 담아 식물체에 아그로-인오큘레이션으로 도입하여, 식물체에 감염성 활성을 재현시키는 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A(Tomato leaf curl New Delhi virus DNA-A, ToLCNDV DNA-A)의 염기서열 및 서열번호 2로 표시되는 ToLCNDV DNA-B의 염기서열로 이루어진 군에서 1종 이상을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균을 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스를 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 식물체를 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 식물체에 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B를 감염시켜 병증을 유도하는 방법을 제공할 수 있다.

상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A의 염기서열 및 서열번호 2로 표시되는 ToLCNDV DNA-B의 염기서열로 이루어진 군에서 1종 이상을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 식물체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 대장균 또는 상기 아그로박테리움 튜머페이션스를 식물체 내에 감염시키는 단계;를 포함하는 식물체에 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B를 감염시켜 병증을 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명의 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B(ToLCNDV DNA-A 및 DNA-B)의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드 및 이를 포함하는 대장균 및 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용 시, 매개충(insect vector) 없이도 효과적으로 작물에 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B(ToLCNDV DNA-A 및 DNA-B)의 감염을 유발시킬 수 있다. 따라서, 본 발명을 이용하여 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B의 기주 범위 및 기주와의 상관관계 등 다양한 연구에 응용할 수 있으며, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 사전에 방지할 수 있어, 관련 분야에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A(ToLCNDV DNA-A)의 감염성 클론으로 이용할 수 있는 재조합 플라스미드의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-B(ToLCNDV DNA-B)의 감염성 클론으로 이용할 수 있는 재조합 플라스미드의 제조 과정을 나타낸 것이다
도 3은 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B(ToLCNDV DNA-A 및 DNA-B)의 감염성 클론을 실험 기주인 토마토에 접종시켜 병증 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B(ToLCNDV DNA-A 및 DNA-B)가 접종된 토마토로부터 추출한 DNA를 중합효소연쇄반응을 이용해 검정함으로써 감염 여부를 확인한 결과이다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A(Tomato leaf curl New Delhi virus DNA-A, ToLCNDV DNA-A)의 염기서열 및 서열번호 2로 표시되는 ToLCNDV DNA-B의 염기서열로 이루어진 군에서 1종 이상을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다.

토마토잎말림뉴델리바이러스는 DNA-A와 DNA-B 라는 두 개의 분리된 게놈을 갖는 바이파타이트(bipartite) 베고모바이러스로 두 개의 게놈이 모두 존재할 때 정상적인 바이러스의 복제 및 병징 발현이 유도되는 것으로 알려져 있다. DNA-A 상에는 DNA 복제, 유전자 발현 조절, 기주 방어 기작 및 인캡시데이션(encapsidation) 등과 관련된 바이러스 단백질이 암호화되어 있으며, DNA-B에는 세포 내 및 세포 간 이동과 관련된 두 개의 단백질이 암호화되어 있다.

상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 서열번호 1 및 2의 염기서열은 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 서열번호 1 및 2의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 서열번호 1 및 2의 염기서열과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 및 2의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 염기서열 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 염기 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 서열번호 2로 표시되는 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-B의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하였다. 본 발명의 발명자들은 상기 재조합 플라스미드를 사용하여 형질전환된 대장균 및 아그로박테리아를 제조하였으며, 이러한 형질전환된 아그로박테리아 균주를 식물체에 감염시키면, 식물체에 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B(ToLCNDV DNA-A 및 DNA-B)의 병증이 현저하게 나타나는 놀라운 발견을 하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 재조합 플라스미드는 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B(ToLCNDV DNA-A 및 DNA-B)의 유전자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B(ToLCNDV DNA-A 및 DNA-B)의 유전자는 이량체로 구성될 수 있으며, 이는 각기 다른 제한효소를 사용하여 분리된 단량체를 재조합 플라스미드에서 연결하여 제조될 수 있다.

본 발명에서 용어, '형질전환'은 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 의미할 수 있다. 숙주세포는 이에 제한되는 것은 아니나, 식물세포, 원핵세포, 효모세포 또는 곤충세포 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어, "아그로박테리움"은 흙 속에 사는 운동성을 가진 토양미생물의 하나로, 암을 유발하는 플라스미드(Ti(Tumer induced) plasmid)를 가지고 있어 식물체의 상처 따위를 통하여 감염하여 조직 세포의 이상 증식을 유발한다.

본 발명에 있어서, 상기 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A를 발현하는 아그로박테리움 튜머페이션스는 기탁번호 (KACC 95141P)로 기탁된 것이 사용될 수 있으며, 이는 농업생명공학연구원(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 2019년 2월 22일자로 기탁되었다.

또한, 상기 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-B를 발현하는 아그로박테리움 튜머페이션스는 기탁번호 (KACC 95142P)로 기탁된 것이 사용될 수 있으며, 이는 농업생명공학연구원(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 2019년 2월 22일자로 기탁되었다.

본 발명의 재조합 플라스미드가 도입되는 식물 세포는 세포가 식물로 재생될 수 있는 한 특정한 형태로 특별히 제한되는 것은 아니다. 이들 세포는, 예를 들면, 배양된 세포 부유물, 원형질체(protoplast), 잎 절편(leaf section) 또는 캘러스(callus) 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 대상 식물체로는 쥬키니, 호박, 멜론 등을 포함하는 박과 등을 포함할 수 있으며, 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B가 감염되는 식물이라면, 이에 제한되지 않는다.

상기 재조합 플라스미드의 식물체로의 도입은 당분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움 매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 히트 쇼크법(heat shock), 전기천공법(electroporation) 또는 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게, 본 발명에 있어서 식물체에 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B의 DNA의 병증을 유도하기 위해 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용하는 방법이 사용될 수 있다. 이러한 아그로-인오큘레이션 (Agro-inoculation) 방법은 식물체 내로 유전자를 도입하여 발현시키거나 식물체 내에서 원하는 단백질을 생산하기 위한 방법을 의미할 수 있다. 아그로-인오큘레이션은 접종하고자 하는 식물의 정단부에 곤충핀을 이용하여 상처를 낸 후 이동시키고자 하는 유전자를 가진 아그로박테리움의 현탁액을 주입하여주는 방법이다.

또한 본 발명은 상기 대장균 또는 상기 아그로박테리움 튜머페이션스를 식물체 내에 감염시키는 단계;를 포함하는 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B 감염 식물체의 제조 방법을 제공한다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

실시예 1. 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 및 DNA-B(ToLCNDV DNA-A and DNA-B) 유전자 확보

1-1. 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A의 유전자 확보

이탈리아 National Research Council of Italy (CNR)의 도움을 받아 이탈리아 나폴리 지역의 농가에서 제미니바이러스에 감염된 것으로 추정되는 쥬키니 호박의 시료의 DNA를 확보하였다. GE Healthcare의 TempliPhi?? 100 Amplification Kit를 이용해 회전환 증폭법(Rolling circle amplification)을 수행하여 전달 받은 DNA로부터 원형 DNA만을 특이적으로 증폭시키고 제한효소 XhoI을 처리한 뒤 아가로즈 겔에 전기영동을 하여 제미니바이러스로 예상되는 DNA를 분리하였다. 그 후 pGEM-3zf(+) vector에 T4 DNA 연결 효소(ligase)를 이용해 붙이고 대장균(Escherichia coli) DH5α strain에 형질 전환하여 37℃에서 배양했다. 바이오니아(BIONEER Inc.)의 AccuPrep® Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit를 이용해 DH5α로부터 플라스미드를 추출하여 마크로젠(Macrogen Inc.)에 시퀀싱 분석을 의뢰하여 염기 서열을 확보하였다. 염기 서열은 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI)에서 제공하는 생물체 핵산 정보 검색 도구인 BLAST(Basic Local Alignmeent Search Tool)을 이용해 토마토잎말림뉴델리바이러스의 DNA-A임이 확인되었다.

1-2. 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-B의 유전자 확보

이탈리아 National Research Council of Italy (CNR)의 도움을 받아 이탈리아 나폴리 지역의 농가에서 제미니바이러스에 감염된 것으로 추정되는 쥬키니 호박의 시료의 DNA를 확보하였다. GE Healthcare의 TempliPhi?? 100 Amplification Kit를 이용해 회전환 증폭법(Rolling circle amplification)을 수행하여 전달 받은 DNA로부터 원형 DNA만을 특이적으로 증폭시키고 제한효소 KpnI을 처리한 뒤 아가로즈 겔에 전기영동을 하여 제미니바이러스로 예상되는 DNA를 분리하였다. 그 후 pGEM-3zf(+) vector에 T4 DNA 연결 효소(ligase)를 이용해 붙이고 대장균(Escherichia coli) DH5α strain에 형질 전환하여 37℃에서 배양했다. 바이오니아(BIONEER Inc.)의 AccuPrep® Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit를 이용해 DH5α로부터 플라스미드를 추출하여 마크로젠(Macrogen Inc.)에 시퀀싱 분석을 의뢰하여 염기 서열을 확보하였다. 염기 서열은 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI)에서 제공하는 생물체 핵산 정보 검색 도구인 BLAST(Basic Local Alignmeent Search Tool)을 이용해 토마토잎말림뉴델리바이러스의 DNA-B임이 확인되었다.

실시예 2. ToLCNDV DNA-A 및 DNA-B 감염성 클론 제작 및 검정용 프라이머 세트 제작

2-1. 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A의 감염성 클론 제작 및 검정용 프라이머 세트 제작

ToLCNDV DNA-A의 감염성 클론 제작에 필요한 프라이머와 이후 ToLCNDV DNA-A가 감염된 식물을 검정하기 위해 필요한 프라이머를 제작하였다. 제미니바이러스 감염성 클론 제작을 위해서는 총 4개의 프라이머(F1, R1, F2, R2)가 필요하며 바이러스 검정법으로 활용되는 중합효소연쇄반응법(Polymerase chain reaction; PCR)의 프라이머는 2개가 필요하다. 시퀀싱으로 확인한 ToLCNDV 염기 서열을 바탕으로 제한효소를 붙이기 위해 HindIII(AAGCTT), XhoI (CTCGAG), SpeI(ACTAGT)를 추가한 프라이머 4종을 제작, 주문하였으며 프라이머 서열 목록은 표 1 에 기재하였다. 바이러스 진단 시에는 표 1에 기재된 프라이머 세트 중 ToLCNDV-A-IC1-F과 ToLCNDV-A-IC1-R를 이용하였다.

서열번호	프라이머 명칭	프라이머 서열	제한효소
3	ToLCNDV-A-IC1-F	AAGCTT AAAACGTGTCGTTTCGATCTGG	HindIII
4	ToLCNDV-A-IC1-R	CTCGAG TAACATCACTAACACAC	XhoI
5	ToLCNDV-A-IC2-F	CTCGAG GCACCGGACTCAC	XhoI
6	ToLCNDV-A-IC2-R	ACTAGT GTTTGTGGATCCAAACTTGGTGAG	SpeI

2-2. 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-B의 감염성 클론 제작 및 검정용 프라이머 세트 제작

ToLCNDV DNA-B의 감염성 클론 제작에 필요한 프라이머와 이후 ToLCNDV DNA-B가 감염된 식물을 검정하기 위해 필요한 프라이머를 제작하였다. 제미니바이러스 감염성 클론 제작을 위해서는 총 4개의 프라이머(F1, R1, F2, R2)가 필요하며 바이러스 검정법으로 활용되는 중합효소연쇄반응법(Polymerase chain reaction; PCR)의 프라이머는 2개가 필요하다. 시퀀싱으로 확인한 ToLCNDV 염기 서열을 바탕으로 제한효소를 붙이기 위해 HindIII(AAGCTT), XhoI (CTCGAG), SpeI(ACTAGT)를 추가한 프라이머 4종을 제작, 주문하였으며 프라이머 서열 목록은 표 2 에 기재하였다. 바이러스 진단 시에는 표 2에 기재된 프라이머 세트 중 ToLCNDV-B-IC2-F과 ToLCNDV-B-IC2-R를 이용하였다.

서열번호	프라이머 명칭	프라이머 서열	제한효소
7	ToLCNDV-B-IC1-F	AAGCTT TTAGGGAGCGCAGCGACAC	HindIII
8	ToLCNDV-B-IC1-R	GGTACC CTATATGGCTATAGGT	KpnI
9	ToLCNDV-B-IC2-F	GGTACC CTTAACGATCTTGAAC	KpnI
10	ToLCNDV-B-IC2-R	ACTAGT CTACAAAAGATAACGAATGGCAAAT	SpeI

실시예 3. ToLCNDV DNA-A 및 DNA-B 감염성 클론 제작

3-1. 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A의 감염성 클론 제작

도 1에 나타낸 바와 같이, ToLCNDV-DNA-A-pGEM-3zf(+) vector와 ToLCNDV DNA-A 염기 서열을 바탕으로 제작된 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 말단에 제한효소 HindIII와 XhoI, SpeI과 XhoI을 각각 갖는 ToLCNDV DNA-A 단량체를 증폭하였다. 각각의 ToLCNDV DNA-A 단량체를 pGEM T-easy vector에 클로닝하여 DH5α 에서 양을 늘린 뒤 플라스미드를 추출하였다. 제한효소 HindIII, XhoI, SpeI을 처리하여 2개의 ToLCNDV DNA-A 단량체를 분리하고 마찬가지의 방법으로 제한효소 HindIII와 SpeI을 처리한 pCAMBIA1303 vector를 얻어낸 뒤 3개의 유전자를 T4 DNA ligase로 이어 붙였다. 이렇게 만들어진 ToLCNDV-DNA-A-pCAMBIA1303 플라스미드를 다시 대장균 DH5α strain에서 양을 늘린 뒤 추출하고, 제한효소 처리를 통해 정상적으로 플라스미드가 만들어 졌는지 확인했다. 마지막으로 확인된 플라스미드를 아그로박테리아(Agrobacterium tumafaciens) GV3101 strain에 형질 전환하여 감염성 클론을 완성했다.

상기 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A의 감염성 클론은 기탁번호 (KACC 95141P)로 기탁된 것이며, 이는 농업생명공학연구원(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 2019년 2월 22일자로 기탁되었다.

3-2. 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-B의 감염성 클론 제작

도 2에 나타낸 바와 같이, ToLCNDV-DNA-B-pGEM-3zf(+) vector와 ToLCNDV DNA-B 염기 서열을 바탕으로 제작된 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 말단에 제한효소 HindIII와 KpnI, SpeI과 KpnI을 각각 갖는 ToLCNDV DNA-B 단량체를 증폭하였다. 각각의 ToLCNDV DNA-B 단량체를 pGEM T-easy vector에 클로닝하여 DH5α 에서 양을 늘린 뒤 플라스미드를 추출하였다. 제한효소 HindIII, KpnI, SpeI을 처리하여 2개의 ToLCNDV DNA-B 단량체를 분리하고 마찬가지의 방법으로 제한효소 HindIII와 SpeI을 처리한 pCAMBIA1303 vector를 얻어낸 뒤 3개의 유전자를 T4 DNA ligase로 이어 붙였다. 이렇게 만들어진 ToLCNDV-DNA-B-pCAMBIA1303 플라스미드를 다시 대장균 DH5α strain에서 양을 늘린 뒤 추출하고, 제한효소 처리를 통해 정상적으로 플라스미드가 만들어 졌는지 확인했다. 마지막으로 확인된 플라스미드를 아그로박테리아(Agrobacterium tumafaciens) GV3101 strain에 형질 전환하여 감염성 클론을 완성했다.

상기 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-B의 감염성 클론은 기탁번호 (KACC95142P)로 기탁된 것이며, 이는 농업생명공학연구원(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 2019년 2월 22일자로 기탁되었다.

실시예 4. ToLCNDV DNA-A 및 DNA-B 감염성 클론의 감염성 확인

4-1. ToLCNDV DNA-A 감염성 클론의 감염성 확인

실시예 3에서 제작된 ToLCNDV DNA-A 감염성 클론의 감염성을 확인하기 위해 기주식물로 알려진 쥬키니 호박을 발아 후 2주간 재배하여 준비하였다. 준비된 토마토의 정단부에 핀으로 찔러서 상처를 낸 후 ToLCNDV DNA-A 감염성 클론을 포함하는 아그로박테리아 배양액을 ToLCNDV DNA-B 감염성 클론을 포함하는 아그로박테리아 배양액과 함께 주입시켜 ToLCNDV DNA-A를 감염시켰으며 이후 3주간 재배하면서 감염성 여부를 확인하였다. 3주 후 식물의 어린잎으로부터 게놈 DNA를 추출하여 PCR을 수행함으로써 바이러스가 식물 체내에 제대로 감염되었는지 확인하였다.

도 3에 나타난 바와 같이 감염된 식물에서는 건전 식물과 달리 잎이 노랗게 변하고 성장이 위축되는 병증이 확인되었으며 도 4에서 보이듯이 병증이 유발된 식물체 내에 ToLCNDV DNA-A가 제대로 감염되었다는 것을 확인하였다.

4-2. ToLCNDV DNA-B 감염성 클론의 감염성 확인

실시예 3에서 제작된 ToLCNDV DNA-B 감염성 클론의 감염성을 확인하기 위해 기주식물로 알려진 쥬키니 호박을 발아 후 2주간 재배하여 준비하였다. 준비된 토마토의 정단부에 핀으로 찔러서 상처를 낸 후 ToLCNDV DNA-B 감염성 클론을 포함하는 아그로박테리아 배양액을 ToLCNDV DNA-A 감염성 클론을 포함하는 아그로박테리아 배양액과 함께 주입시켜 ToLCNDV DNA-B를 감염시켰으며 이후 3주간 재배하면서 감염성 여부를 확인하였다. 3주 후 식물의 어린잎으로부터 게놈 DNA를 추출하여 PCR을 수행함으로써 바이러스가 식물 체내에 제대로 감염되었는지 확인하였다.

도 3에 나타난 바와 같이 감염된 식물에서는 건전 식물과 달리 잎이 노랗게 변하고 성장이 위축되는 병증이 확인되었으며 도 4에서 보이듯이 병증이 유발된 식물체 내에 ToLCNDV DNA-B가 제대로 감염되었다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서 제조된 ToLCNDV DNA-A 및 DNA-B 감염성 클론은 동시에 접종 시에 식물체에 ToLCNDV에 대한 효과적인 병증을 유발시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있다.

농업생명공학연구원

KACC95141P

20190222

농업생명공학연구원

KACC95142P

20190222

<110> Research&Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Infectious clone of Tomato leaf curl New Delhi virus DNA-A and DNA-B and uses thereof <130> PN1901-008 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tomato leaf curl New Delhi virus DNA-A <400> 1 gaggcaccgg actcacacat cgcgtaggca agcgattttg tgtgaaatct gtctatgtac 60 tgggaaaaat atggatggat gaaaatatca aaacgaaaaa tcatactaat agtgttatgt 120 tctttcttgt tcgtgactgg cgtccaacag gaacccctca ggattttggg gaagttttca 180 atatgtttga taatgaacct agcacagcca cggtgaagaa catgcatcgt gatcgttatc 240 aagtcttacg gaagtggcat gctactgtga cgggaggaac gtatgcatca agggagcaag 300 cattagtgag gaagtttgtt agggttaata attatgttgt ttacaatcaa caagaggccg 360 gcaagtatga gaatcatacc gaaaatgcat taatgttgta tatggcctgt actcatgcat 420 caaatcctgt atatgctact ttgaaaatcc ggatctattt ttatgattcg gtcacaaatt 480 aatatatatt gatccttaca tcatatgttg tccatacatc aatcgtttta ttcaagacat 540 tatctaaaac atgataaaca gctcttatta cattacaaat tccgactaca 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<213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ToLCNDV-A-IC1-R <400> 4 ctcgagtaac atcactaaca cac 23 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ToLCNDV-A-IC2-F <400> 5 ctcgaggcac cggactcac 19 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ToLCNDV-A-IC2-R <400> 6 actagtgttt gtggatccaa acttggtgag 30 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ToLCNDV-B-IC1-F <400> 7 aagcttttag ggagcgcagc gacac 25 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ToLCNDV-B-IC1-R <400> 8 ggtaccctat atggctatag gt 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ToLCNDV-B-IC2-F <400> 9 ggtaccctta acgatcttga ac 22 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ToLCNDV-B-IC2-R <400> 10 actagtctac aaaagataac gaatggcaaa t 31

Claims

서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머 쌍을 사용하여 중합효소연쇄반응으로 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 단량체를 증폭시킨 후,
Hind III 및 Xho I 제한효소를 사용하여 절단된 단량체 및 Xho I 및 Spe I 제한효소를 사용하여 절단된 단량체를 벡터에 연결시킴으로써 제조되는, 서열번호 1로 표시되는 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A(Tomato leaf curl New Delhi virus DNA-A, ToLCNDV DNA-A)의 이량체 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드.
제1항의 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균(Escherichia coli).
제1항의 재조합 플라스미드로 형질전환된 기탁번호 (KACC 95141P)의 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens).
삭제
제1항의 재조합 플라스미드로 형질전환된 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A 감염 식물체.
제2항의 대장균 또는 제3항의 아그로박테리움 튜머페이션스를 식물체 내에 감염시키는 단계;를 포함하는 식물체에 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-A를 감염시켜 병증을 유도하는 방법.
서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 프라이머 쌍을 사용하여 중합효소연쇄반응으로 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-B 단량체를 증폭시킨 후,
Hind III 및 Kpn I 제한효소를 사용하여 절단된 단량체 및 Kpn I 및 Spe I 제한효소를 사용하여 절단된 단량체를 벡터에 연결시킴으로써 제조되는, 서열번호 2로 표시되는 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-B(Tomato leaf curl New Delhi virus DNA-B, ToLCNDV DNA-B)의 이량체 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드.
제 7항의 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균(Escherichia coli).
제 7항의 재조합 플라스미드로 형질전환된 기탁번호 (KACC 95142P)의 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens).
제 7항의 재조합 플라스미드로 형질전환된 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-B 감염 식물체.
제 8항의 대장균 또는 제9항의 아그로박테리움 튜머페이션스를 식물체 내에 감염시키는 단계;를 포함하는 식물체에 토마토잎말림뉴델리바이러스 DNA-B를 감염시켜 병증을 유도하는 방법.