CN115975950A

CN115975950A - 田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆及其构建方法

Info

Publication number: CN115975950A
Application number: CN202211100083.2A
Authority: CN
Inventors: 汤亚飞; 何自福; 李正刚; 佘小漫; 张丽; 于琳; 蓝国兵
Original assignee: Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-09-09
Filing date: 2022-09-09
Publication date: 2023-04-18

Abstract

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种田阳番茄曲叶病毒，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。以及由含有该序列的病毒侵染性克隆、重组菌，由本发明提供的田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌具有较强的病毒侵染性和致病性，可以充分应用于大果番茄、樱桃番茄等番茄种质资源和品种抗性的评价及抗病材料的筛选、以及田阳番茄曲叶病毒基因组结构、致病机制解析等研究，为该病毒的深入研究提供重要工具。

Description

田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆及其构建方法

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆及其构建方法。

背景技术

番茄黄化曲叶病是番茄生产上一种毁灭性病害，已给我国造成严重的经济损失。引起番茄黄化曲叶病的病毒种类繁多，全球已报道的病毒至少有80多种，其中我国已报道的病毒至少有16种，这些病毒均属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)(http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp)。

菜豆金色黄花叶病毒属病毒不能通过机械摩擦传播，通过注射接种侵染性克隆是该类病毒致病性等相关研究的一项简便可行的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种引起番茄黄化曲叶病的病毒侵染性克隆及其构建方法，还提供包含番茄黄化曲叶病病毒侵染性克隆的重组菌，及其相关应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种田阳番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Tianyang virus,ToLCTyV，除了这里的翻译外，为了和由包含该病毒序列具有侵染性的重组菌区别，涉及到该病毒的均以中文田阳番茄曲叶病毒表示)，该病毒的基因组大小分别为2750nt，为单链闭合环状，推导编码6个开放阅读框(open reading frames，ORFs)，其中病毒链编码2个蛋白，AV1编码CP蛋白(293-1066nt)，AV2编码CP前体蛋白(133-483nt)，互补链编码4个蛋白，AC1编码复制酶(1515-2603nt)，AC2编码转录激活蛋白(1208-1615nt)，AC3编码复制增强蛋白(1063-1467nt)，AC4编码复制或转录调控因子(2189-2446nt)，基因间隔区含有与双生病毒复制起始有关的9碱基核苷酸“TAATATT/AC”基序。利用软件SDT 1.2的MUSCLE alignment程序分析结果表明，所获的田阳番茄曲叶病毒与胜红蓟黄脉病毒(ageratum yellow vein virus，AYVV)中国台南分离物Tainan的相似性最高(90.5％)，根据最新分类标准(Brown et al.,2015)，田阳番茄曲叶病毒是一个菜豆金色花叶病毒属新种，所述病毒的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.一种田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆，所述田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆中含有田阳番茄曲叶病毒的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：将两个田阳番茄曲叶病毒基因组DNA片段构建到经SmaⅠ单酶切处理的植物表达载体上，得到田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆，所述田阳番茄曲叶病毒基因组DNA序列如SEQ IDNo.1所示。

进一步，田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的构建方法中，所述植物表达载体为pGreenⅡ0229载体。

进一步，田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的构建方法中，田阳番茄曲叶病毒基因组DNA片段可以由以下2种方法制备得到：

a.由田阳番茄曲叶病毒侵染发病植株中提取总DNA，以总DNA为模板，进行PCR扩增，获得病毒基因组DNA片段；PCR扩增的引物对如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，或PCR扩增的引物对如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；

b.人工合成如SEQ ID No.1所示序列，获得病毒基因组DNA片段。

3.由上述构建方法制备得到的田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆。

4.含有上述田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌。

进一步，所述田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌中，将田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆导入农杆菌感受态细胞GV3101中，得到具有田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌。

进一步，所述田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌中，所述重组菌名称为ToLCTyV，种属为Agrobacterium tumefaciens，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期2022年6月8日，保藏号为GDMCC No.62527。

5.还提供上述的田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆、重组菌在研究番茄黄化曲叶病病毒和/或番茄对番茄黄化曲叶病病毒抗性、番茄抗病材料的筛选中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明发现一个病毒新种，通过滚环扩增得到2.7kb大小的产物，测序分析得到该病毒的基因组大小2750nt，为单链闭合环状。进一步分别设计扩增两个1.0倍的田阳番茄曲叶病毒病毒基因组的引物，再将两个病毒基因组DNA片段构建到经SmaⅠ单酶切处理的植物表达载体上，可得到引起番茄黄化曲叶病的病毒侵染性克隆，导入农杆菌后，得到具有较强的病毒侵染性和致病性的重组菌。本发明制备的田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌注射接种于番茄植株、本生烟后，均表现出较强的病症状态。可应用于研究和种植番茄的抗病品种，种植抗病品种是防治番茄黄化曲叶病最经济、环保、有效的措施之一。通过本发明构建了田阳番茄曲叶病毒的侵染性克隆及重组菌，为评价番茄品种的抗性水平、以及番茄抗病育种奠定了基础，更进一步为生产上防控番茄黄化曲叶病提供了科学依据；也为研究引起我国番茄黄化曲叶病的病毒种类演变、田阳番茄曲叶病毒基因组结构、致病性以及病毒-寄主-介体三者之间的互作奠定了基础。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为采集的番茄病样；

图2为5份采集番茄病样的PCR检测结果；

图3为采集番茄病样的RCA产物酶切电泳结果；

图4为两个1.0倍的田阳番茄曲叶病毒基因组的PCR产物电泳结果；

图5为所获的10个重组质粒的酶切鉴定结果；

图6为所获的10个重组质粒的PCR鉴定结果；

图7为田阳番茄曲叶病毒的侵染性克隆构建示意图；

图8为5个田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌单克隆接种本生烟和番茄的症状表现；

图9为5个田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌单克隆接种植株中病毒PCR检测结果；

图10为田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的1号重组菌单克隆接种本生烟、大果番茄、樱桃番茄的症状表现；

图11为接种植株中田阳番茄曲叶病毒PCR检测结果；

图12为田阳番茄曲叶病毒基因组示意图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

如图1所示，2021年从广西壮族自治区百色市田阳县番茄田间发现疑似菜豆金色黄花叶病毒病毒感染的番茄病样，田间症状表现叶片卷曲、叶片边缘轻微发紫等。

测样品总DNA提取：取待测番茄病样叶片100mg，利用北京全式金生物技术有限公司的植物DNA提取试剂盒(Easypure Plant Genomic DNA Kit)抽提其总DNA，具体操作按试剂盒说明书进行。DNA沉淀溶解于50μL TE溶液中，置于-20℃冰箱保存备用。

病毒PCR检测：利用扩增菜豆金色黄花叶病毒属病毒AV1基因部分序列的通用简并引物AV494：5′-GCCYATRTAYAGRAAGCCMAG-3′，CoPR5′-GANGSATGHGTRCADGCCATATA-3′，(注：M＝A/C，R＝A/G，S＝C/G，Y＝C/T，D＝A/G/T，H＝A/C/T，N＝A/C/G/T)(何自福等，2004；Wyattand Brown,1996)，对疑似病样进行PCR检测。反应体系为：待测样品总DNA 1μL(～20ng)，灭菌水9.5μL，ExTaq PCR MIXER 12.5μL(TaKaRa公司)，10μmol/L上、下游引物各1μL，总体积25μL。反应程序为：94℃4min；94℃45s；52℃45s；72℃45s，35个循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。凝胶电泳结果如图2所示，其中，M：2000bp DNA marker；1-5泳道：从田间采集的5份番茄病样；6泳道：健康番茄植株。结果显示5份疑似病样的总DNA中能扩增出一条大小为570bp的特异性条带，与预期大小一致，阴性对照中未扩出任何条带(图2)。这一结果表明广西百色田阳番茄病样中存在菜豆金色黄花叶病毒属病毒。

实施例2

病毒基因组全长扩增及克隆：以PCR检测为阳性的4号病样总DNA为模板，利用TempliPhi^TM RCA Kit(GE Healthcare)进行滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)。具体操作步骤为：1μL总DNA样品(～20ng)加入5μL样品缓冲液(Sample Buffer)，混匀，95℃变性3min；立即置于冰上冷却；随后加入5μL反应缓冲液(Reaction Buffer)和0.2μLphi29 DNA聚合酶，在30℃反应16h以上；最后在65℃下孵育10min使酶失活终止反应。RCA产物保存于-20℃备用。随后将RCA扩增产物分别用BamHⅠ限制性内切酶(Thermo公司)进行酶切。酶切反应体系为：RCA产物2μL、内切酶1μL、10×反应缓冲buffer 1μL，加灭菌水至反应总体系10μL。在37℃条件下酶切反应1h后进行电泳分析。凝胶电泳结果如图3所示，其中，M：5000bp DNA marker；1泳道：代表病样的RCA产物酶切结果。图3结果显示：限制性内切酶BamHⅠ从切出一条大小约为2.7kb的条带，回收该条带，经克隆、测序，获得该分离物的病毒全长，大小分别为2750nt，通过NCBI Blast和生物软件SDT1.2的MUSCLE alignment对该序列与已报道的病毒序列相似性比较分析发现，获得的病毒序列与已报道的病毒序列相似性均小于91％，与胜红蓟黄脉病毒(ageratum yellow vein virus，AYVV)中国台南分离物Tainan的相似性最高，90.5％。根根据双生病毒最新分类标准(Brown et al.,2015)，该病毒分离物是一个菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)新种。根据双生病毒命名规则(Fauquet et al.,2008；洪健等，2020)，将其命名为田阳番茄曲叶病毒(tomato leaf curlTianyang virus，ToLCTyV，除了这里的翻译外，为了区别于由包含该病毒序列具有侵染性的重组菌，涉及到该病毒的均以中文田阳番茄曲叶病毒表示)，田阳番茄曲叶病毒的全长序列如的SEQ ID No.1所示。

田阳番茄曲叶病毒的全长序列，SEQ ID No.1：

ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTTAAAGTGGTCCCCACCACTAACAAATGTCCTCCACTAAAAACGCTCCCTCAAAGCTTATTTAATTCAAATCCACTATAAATACTTGGTCCCCAAGTATTAAAGCTAAACATGTGGGATCCTCTTTTGAACGAGTTTCCCGAAACCGTACACGGTTTTAGGTGTATGTTAGCCATTAAGTATTTGCAATTAGTTGAAAATACATACTCTCCTGATACATTAGGGTACGATTTGCTTCGTGATTTAATTTCAGTTATTCGTGCTAGAGATTATGTCGAAGCGTCCCGCCGATATAGTCATTTCCACTCCCGCATCCAAGGTGCGTCGCCGGCTGAATTTCGACAGCCCGTATGTCAGCCGTGCTGCTGCCCCCACTGTCCTCGTCACAAACAAAAGGAGGTCATGGGTGAATCGGCCCATGTACCGAAAGCCCAGGATGTACAGGATGTACAAAAGCCCTGATGTGCCCAAAGGTTGTGAAGGCCCATGTAAGGTCCAATCGTATGAACAGAAGCATGACATATCCCATGTTGGTAAAGTATTATGTGTTAGTGATGTCACTCGTGGTAGTGGGCTTACCCATCGTGTTGGTAAGAGATTCTGTGTGAAGTCCGTTTATGTATTGGGTAAAATATGGATGGATGAAAATATCAAAACGAAGAACCATACGAACACTGTGATGTTTTATCTTGTTCGTGATAGAAGGCCCTTTGGTACTGCTATGGACTTTGGTCAGGTGTTTAACATGTATGATAATGAGCCCAGTACTGCTACTATCAAGAATGATCTTCGAGATCGTTATCAAGTTTTAAGGAAATTCACTTCAACAGTCACAGGTGGTCAATATGCTTCTAAGGAACAGTCGTTGGTTAGGAAATTTATGAAGATAAATAATTATGTAGTTTATAATCATCAAGAAGCTGCTAAGTATGACAATCATACTGAGAATGCCTTGTTATTGTATATGGCATGTACTCATGCCAGTAATCCAGTGTATGCTACTTTGAAGATCAGGATCTATTTTTATGATTCTGTTCAGAATTAATAAAGTTTGAATTTTATTATATTTGAATGTGTTACATATTCTGTGTTTTCCAATACATCCCATAATACATGATTACATGCTCTAATTACATTATTAATACTAATTACACCCAAATTATCTAAATATTTCATACATTGAACCCTAAATACTCTTAAGAAACGCCAAGTCTGAGGTTGTAAGCGAGTCCAGATCTGGAAGATCAGAAAACACTGGTGTATTCCCAACGCTTTCCTCAGGTTGTGGTTGAATTGTATTTGGATCGTTATGATGTCGTGGTTGGTGTTGAATGGTCTCTCGTGGTGCTTGGTTATCTTGAAATATAGGGGATTTTTGATCGTCCAGGTATACACGCCACTCTCGCATTGAGTTGCAGTGAGTAATTCCCCTGTGCGTGAATCCATGAGATGCGCAGTCAATCCCGAAGTAGTAAGAACAGCCGCAAGGAAGATCAACTCTCCGTCTGCGAATTGGCTTCTTCTTGGCTATTCTGTGTTGTACCTTGATTGGTACTAGAGTACAATGGCTCTTTGAGGGTGATGAATTCTGCATTCTTTAATGCCCAGTCCTTGAGTGCTGAGTTCTTATCCTCATCCAAGTACTCTTTATATGATGATGTTGGGCCTGGATTGCAAAGGAAGATAGTTGGGATTCCACCTTTAATTTGAATTGGTTTCCCGTATTTCGTGTTGCTTTGCCAGTCCCTTTGGGCCCCCATGAATTCTTTAAAGTGCTTTAGATAGTGGGGGTCTACGTCATCAATGACGTTATACCAGGCATCATTACTGTACACCTTTGGACTAAGGTCAAGGTGCCCACATAAATAATTATGTGGACCCAATGATCTGGCCCACATTGTCTTACCCGTACGACTATCACCTTCTATGACTATACTTTTGGGTCTCCAAGGCCGCGCAGCGGCATCCCTTACATTCTCAGAAACCCACTCTTCAAGTTCTTCTGGAACTTGATCAAAAGAAGAAGATAAAAATGGACAAACAAAAACCTCTAATGGACGTGCAAAAATCCTATCTAAATTACTACTTAAATTATGATATTGAAAAATAAAATCTTTTGGGAGTTTCTCCCTTATTATTGCTAATGCTGCGTCTTTGGAGCCTGCATTTAAGGCCTCTGCAGCTGCATCATTAGCCGTCTGTTGACCTCCTCTAGCAGATCTTCCGTCGATCTGAAAATCACCCCAGTCGACGTAATCACCGTCCTTCTCGATGTAGGACTTGACATCAGAGCTGGACTTAGCTCCCTGGAAATTAGGGTGGAATTGGGTGGAGGTGTTGGGGTGTGTAATGTCGAAGTGTCTGGGATTTCTGAACTGGGCTTTACCTTTGAATTGGATGAGGGCATGGAGATGCAGAGTCCCATCGGAGTGTTTTTCCTGTGCGACTCTTATGAATAATTTATCAGAAGGGCACTGGATAGATTTAATTAATTCGAGTGCTTCTTCTTTGGGAATTGGGCATTTAGGATATGTGAGAAATATATTTTTGGCTTTAACTTGGAATGAATTAGAACGAGGCATTTTGACTTGGTCAATTGGGTGCTCTCAAACTTCTGAGGAATGGGGGGCTTTGGGGGCTTATTTATACCGAGCACCCAAATGGCATTCTCGTAATTCTTCATAGAAATTCAAAATTCGAATTGGTAAAGCGGCCATCCGTATAATATT

田阳番茄曲叶病毒的基因组大小分别为2750nt，为单链闭合环状，图12为田阳番茄曲叶病毒基因组示意图，推导编码6个开放阅读框(open reading frames，ORFs)，其中病毒链编码2个蛋白，AV1编码CP蛋白(293-1066nt)，AV2编码CP前体蛋白(133-483nt)，互补链编码4个蛋白，AC1编码复制酶(1515-2603nt)，AC2编码转录激活蛋白(1208-1615nt)，AC3编码复制增强蛋白(1063-1467nt)，AC4编码复制或转录调控因子(2189-2446nt)，基因间隔区含有与双生病毒复制起始有关的9碱基核苷酸“TAATATT/AC”基序。

实施例3

侵染性克隆的构建

以4号病样总DNA为模板，根据菜豆金色黄花叶病毒属病毒的侵染性克隆构建要求，分别设计扩增两个1.0倍的田阳番茄曲叶病毒基因组的引物，引物具体为(下划线为载体序列)：

F1:5′-ATATCGAATTCCTGCAGCCCGGATCCTCTTTTGAACGAGT-3′，SEQ ID No.2；

R1:5′-AAGAGGATCCCACATGTTTAGCTTTAATACTTGGG-3′，SEQ ID No.3；

F2:5′-TAAACATGTGGGATCCTCTTTTGAACGAGTTTCC-3′，SEQ ID No.4；

R2:5′-CTAGAACTAGTGGATCCCCCCACATGTTTAGCTTTAATA-3′，SEQ ID No.5。

反应体系为：待测样品总DNA 1μL(～20ng)，灭菌水20.0μL，LA Taq PCR MIXER25.0μL(TaKaRa公司)，10μmol/L上、下游引物各2μL，总体积50.0μL。反应程序为：94℃4min；94℃1min；52℃1min；72℃3min，35个循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。凝胶电泳结果如图4所示，其中，M：5000DNA marker；1泳道：利用引物F1/R1扩增的电泳结果；2泳道：利用引物F2/R2扩增的电泳结果。PCR结果显示，引物F1/R1、F2/R2均能扩增获两个1.0倍的DNA-A，大小2750bp(图4)。

测序验证无误后，利用同源重组技术将两个1.0倍的DNA-A构建到经SmaⅠ单酶切处理的植物表达载体pGreenⅡ0229上，获得重组质粒。利用KpnⅠ对所获重组质粒进行酶切鉴定，图5为所获的10个重组质粒的酶切鉴定结果，其中M：10000DNA marker；1-10泳道：重组质粒。结果显示：其中重组质粒6号和10号切出目的大小的条带(～9.9kb)。

同时设计能扩增出2.0倍病毒基因组序列衔接部分的特异引物：

TY01-F:5′-ACCGAGCACCCAAATGGCATTC-3′，位于2669-2690nt，SEQ ID No.6；

TY01-R:5′-ATACATAAACGGACTTCACACAG-3′，位于644-622nt，SEQ ID No.7。

对10个重组质粒进行PCR扩增鉴定，图6为所获的10个重组质粒的PCR鉴定结果，结果显示重组质粒6号和10号能扩增出目的大小的条带(725bp)，其中M：2000DNA marker；1-10泳道：重组质粒。进一步将重组质粒6号和10号委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证无误。最终确定，所获得重组质粒6号和10号为田阳番茄曲叶病毒的侵染性克隆pGreenⅡ0229-2.0A，图7为田阳番茄曲叶病毒的侵染性克隆构建示意图。

也可以人工合成SEQ ID No.1所示田阳番茄曲叶病毒的全长序列片段，同上述步骤再用同源重组技术将其构建到植物表达载体pGreenⅡ0229上，获得具有田阳番茄曲叶病毒的侵染性克隆。

实施例4

侵染性克隆的接种

利用液氮冻融法将实施例3构建的侵染性克隆(质粒)pGreenⅡ0229-2.0A(～0.5μg)导入农杆菌感受态细胞GV3101(含pSoup)，得到具有田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌，28℃培养48h，挑选5个含有pGreenⅡ0229-2.0A质粒的单菌落接种于5mL LB液体培养基中(100μg·mL^-1Kan、25μg·mL^-1Rif)，28℃条件下，220r/min培养过夜，4000r/min离心10min，弃上清，收集沉淀，用农杆菌悬浮缓冲液(10mmol·L^-1MES，10mmol·L^-1MgCl₂，150μmol·L^-1AS)重悬，将菌液OD600值调至～1.0。在室温静置3h后，将5个含pGreenⅡ0229-2.0A单菌落的分别注射接种4～5叶期本生烟、3-4叶期大果番茄接种植株置于26℃、16h光照/8h黑暗条件下培养。图8为5个田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌单克隆接种本生烟和番茄的症状表现，结果显示，5个重组菌单克隆均能引起本生烟和大果番茄发病，症状表现无明显差异。症状具体表现为：接种5天，本生烟新叶上表现出轻微的曲叶症状；14dpi时，叶片表明典型皱缩、卷曲等症状。随着时间的推移，接种植株症状愈发明显；番茄接种后20天，大果番茄植株均明显叶片卷曲症状。进一步扩增菜豆金色黄花叶病毒属病毒AV1基因部分序列的通用简并引物AV494/CoPR(何自福等，2004；Wyatt and Brown,1996)，对接种植株进行PCR检测，图9为5个田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌单克隆接种植株中病毒PCR检测结果，其中M：2000DNA marker；1-5泳道：接种本生烟植株；6-10泳道：注射接种大果番茄植株；11泳道：未注射接种的植株。结果显示：接种田阳番茄曲叶病毒显症的本生烟、大果番茄可以检测到田阳番茄曲叶病毒。这些结果说明所构建田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌具有较强侵染性和致病性。挑选其中田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的1号重组菌单克隆进行了保藏；命名为ToLCTyV，种属为Agrobacterium tumefaciens。保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编510070；保藏日期2022年6月8日，保藏号为GDMCC No.62527。

进一步将挑选田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的1号重组菌单克隆，分别注射接种4～5叶期本生烟、3-4叶期大果番茄和樱桃番茄植株，接种植株置于26℃、16h光照/8h黑暗条件下培养。图10为田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的1号重组菌单克隆接种本生烟、大果番茄、樱桃番茄的症状表现，结果显示，接种5棵本生烟全部发病，发病率为100％，叶片表现典型皱缩、卷曲等症状；接种11棵大果番茄全部发病，发病率为100％，叶片表现明显卷曲症状；接种11棵樱桃番茄有9棵病，发病率为81.82％，叶片表现明显卷曲症状。进一步利用检测田阳番茄曲叶病毒特异引物(TY01-F:5′-ACCGAGCACCCAAATGGCATTC-3′，TY01-R:5′-ATACATAAACGGACTTCACACAG-3′)，对接种植株进行PCR检测，图11为接种植株中田阳番茄曲叶病毒PCR检测结果，其中M：2000DNA marker；1、3、5泳道：注射接种田阳番茄曲叶病毒的植株；2、4、6泳道：未注射接种田阳番茄曲叶病毒的植株结果显示：接种田阳番茄曲叶病毒显症的本生烟、大果番茄、樱桃番茄均可以检测到田阳番茄曲叶病毒。这些结果说明本发明所构建田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌ToLCTyV具有较强侵染性和致病性，可以充分应用于大果番茄、樱桃番茄抗性的评价及茄科抗病材料的筛选、以及田阳番茄曲叶病毒病毒基因组结构、致病机制解析等研究。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种田阳番茄曲叶病毒，其特征在于，所述田阳番茄曲叶病毒的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.一种田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆，其特征在于，所述田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆中含有田阳番茄曲叶病毒的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

将两个田阳番茄曲叶病毒基因组DNA片段构建到经SmaⅠ单酶切处理的植物表达载体上，得到田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆，所述田阳番茄曲叶病毒基因组DNA序列如SEQ IDNo.1所示。

4.根据权利要求3所述田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，所述植物表达载体为pGreenⅡ0229载体。

5.根据权利要求3所述田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，田阳番茄曲叶病毒基因组DNA片段可以由以下2种方法制备得到：

b.人工合成如SEQ ID No.1所示序列，获得病毒基因组DNA片段。

6.利用权利要求3-5任一项所述构建方法制备得到的田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆。

7.含有权利要求6所述田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌。

8.根据权利要求7所述田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌，其特征在于，将田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆导入农杆菌感受态细胞GV3101中，得到具有田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌。

9.一种田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆的重组菌，其特征在于，所述重组菌名称为ToLCTyV，种属为Agrobacterium tumefaciens，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期2022年6月8日，保藏号为GDMCC No.62527。

10.权利要求6所述的田阳番茄曲叶病毒侵染性克隆、权利要求7-9任一项所述的重组菌在研究番茄黄化曲叶病病毒和/或番茄对番茄黄化曲叶病病毒抗性、番茄抗病材料的筛选中的应用。