CN115595330A

CN115595330A - 一种CRISPR-Cas3系统及其在抗植物病毒方面的应用

Info

Publication number: CN115595330A
Application number: CN202110784769.7A
Authority: CN
Inventors: 叶健; 尹策策; 徐爽
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2021-07-12
Filing date: 2021-07-12
Publication date: 2023-01-13

Abstract

本发明公开了提高植物病毒抗性的方法，包括利用CRISPR‑Cas3系统来提高植物对病毒的抗性，所述CRISPR‑Cas3系统包括表达Cas蛋白和表达靶向病毒基因的crRNA的重组表达载体，所述Cas蛋白由Cas3蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas7蛋白和Cas8蛋白组成。本发明提供的CRISPR‑Cas3系统能够抑制斯里兰卡木薯花叶病毒(SLCMV)、印度木薯花叶病毒(ICMV)、番茄黄叶卷曲病毒(TYLCV)和泽兰黄脉病毒(EpYVV)的侵染，具有一定的广谱性；同时相较于CRISPR‑Cas9，本发明提供的CRISPR‑Cas3系统能够在较长的时间内赋予植物病毒抗性。

Description

一种CRISPR-Cas3系统及其在抗植物病毒方面的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及CRISPR-Cas3系统及其在抗植物病毒方面的应用。

背景技术

CRISPR-Cas系统指RNA指导的防御外源噬菌体或病毒入侵的一种适应性免疫系统，可分为两大类(class 1和class 2)，及六个型(type I–typeⅥ)。目前，П型CRISPR-Cas9系统的应用最为广泛，可以用于植物基因编辑和调控。实际上，1类I型是自然界中分布最广的类型，它们是通过多个Cas蛋白形成级联复合物来发挥功能的，其核酸内切酶被称为Cas3，能够以逐渐降解的方式对靶DNA进行大片段的删除。最近报道了I型CRISPR-Cas3系统在真核生物基因编辑方面的应用，在动物细胞和植物细胞中造成了一系列基因组DNA成百上千碱基对的大片段删除。

植物病毒是仅次于真菌的第二严重危害植物的病原，在全世界广泛流行和爆发，每年造成上千亿美元的损失。由于病毒经常在植物上复合侵染，且经常发生重组与突变，给治疗和防控带来了更大的困难。虽然，CRISPR-Cas9能够用于赋予植物对病毒的抗性，但是仍然无法克服病毒因重组和突变产生的免疫逃逸。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物对病毒的抗性，如双生病毒科病毒。

本发明提供一种提高植物病毒抗性的方法，包括利用CRISPR-Cas3系统来提高植物对病毒的抗性，所述CRISPR-Cas3系统包括表达Cas蛋白和表达靶向病毒基因的crRNA的重组表达载体，所述Cas蛋白由Cas3蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas7蛋白和Cas8蛋白组成。

所述CRISPR-Cas3系统可为1类(class 1)I-B亚型。

进一步地，所述病毒可为DNA病毒。

进一步地，所述DNA病毒可为双链DNA病毒和/或单链DNA病毒。

进一步地，所述DNA病毒可为双生病毒科病毒。

进一步地，所述双生病毒科病毒可为下述5种、4种、3种、2种或1种病毒：

V2)、木薯花叶病毒；

V3)、斯里兰卡木薯花叶病毒；

V4)、印度木薯花叶病毒；

V5)、番茄黄叶卷曲病毒；

V6)、泽兰黄脉病毒。

上述方法中，所述植物可为双子叶植物和/或单子叶植物。

进一步地，所述双子叶植物可为烟草。

进一步地，所述烟草可为本氏烟草。

如上所述的方法中，所述crRNA的靶标序列如SEQ ID No.7所示。所述靶标对应的crRNA是核苷酸序列为5’-AGAUCCAAAAGCGGCCAUCCGUAUAAUAUUACCGGAU-3’的单链RNA。

进一步地，所述靶标序列的上游是5’-TTG-3’或5’-TCG-3’或5’-TCA-3’的PAM序列；

进一步地，上述方法中：

所述Cas3蛋白可选自下述任一种蛋白质：

A1)、氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的蛋白质；

A2)、将A1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有Cas3蛋白活性的蛋白质；

A3)、在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

所述Cas5蛋白可选自下述任一种蛋白质：

B1)、氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的蛋白质；

B2)、将B1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有Cas5蛋白活性的蛋白质；

B3)、在B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

所述Cas6蛋白可选自下述任一种蛋白质：

C1)、氨基酸序列如SEQ ID No.10所示的蛋白质；

C2)、将C1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有Cas6蛋白活性的蛋白质；

C3)、在C1)或C2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

所述Cas7蛋白可选自下述任一种蛋白质：

D1)、氨基酸序列如SEQ ID No.11所示的蛋白质；

D2)、将D1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有Cas7蛋白活性的蛋白质；

D3)、在D1)或D2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

所述Cas8蛋白可选自下述任一种蛋白质：

E1)、氨基酸序列如SEQ ID No.12所示的蛋白质；

E2)、将E1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有Cas8蛋白活性的蛋白质；

E3)、在E1)或E2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

进一步地，上述方法中所述重组表达载体由表达所述Cas3蛋白的载体、表达所述Cas5蛋白的载体、表达所述Cas6蛋白的载体、表达所述Cas7蛋白的载体、表达所述Cas8蛋白的载体和表达所述crRNA的载体组成。

所述表达所述Cas3蛋白的载体含有所述Cas3蛋白的编码基因；所述表达所述Cas5蛋白的载体含有所述Cas5蛋白的编码基因；所述表达所述Cas6蛋白的载体含有所述Cas6蛋白的编码基因；所述表达所述Cas7蛋白的载体含有所述Cas7蛋白的编码基因；所述表达所述Cas8蛋白的载体含有所述Cas8蛋白的编码基因。

提高植物病毒抗性的CRISPR-Cas3系统也是本发明的保护内容。

与所述的CRISPR-Cas3系统相关的生物材料也属于本发明的保护范围。所述与CRISPR-Cas3系统相关的生物材料可为下述N1)至N16)中的任一种：

N1)、编码权利要求1-6中任一所述的Cas蛋白的核酸分子和编码权利要求1-6中任一所述的crRNA的核酸分子；

N2)、含有N1)所述核酸分子的表达盒；

N3)、含有N1)所述核酸分子的重组载体

N4)、含有N2)所述表达盒的重组载体；

N5)、含有N1)所述核酸分子的重组受体微生物

N6)、含有N2)所述表达盒的重组受体微生物

N7)、含有N3)所述重组载体的重组受体微生物；

N8)、含有N4)所述重组载体的重组受体微生物；

N9)、含有N1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

N10)、含有N2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

N11)、含有N3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

N12)、含有N4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

N13)、含有N1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

N14)、含有N2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

N15)、含有N3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

N16)、含有N4)所述重组载体的转基因动物细胞系；

进一步地，上述生物材料中编码所述的Cas蛋白的核酸分子可为所述Cas3蛋白的编码基因、所述Cas5蛋白的编码基因、所述Cas6蛋白的编码基因、所述Cas7蛋白的编码基因和所述Cas8蛋白的编码基因；

所述Cas3蛋白的编码基因可选自如下任一种：

a1)、编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；

a2)、与a1)限定的DNA分子具有80％以上的同一性且编码具有Cas3功能的蛋白质的DNA分子；

所述Cas5蛋白的编码基因可选自如下任一种：

b1)、编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

b2)、与b1)限定的DNA分子具有80％以上的同一性且编码具有Cas5功能的蛋白质的DNA 分子；

所述Cas6蛋白的编码基因可选自如下任一种：

c1)、编码序列是SEQ ID No.3第8-904位所示的DNA分子；

c2)、与c1)限定的DNA分子具有80％以上的同一性且编码具有Cas6功能的蛋白质的DNA分子；

所述Cas7蛋白的编码基因可选自如下任一种：

d1)、编码序列是SEQ ID No.4所示的DNA分子；

d2)、与d1)限定的DNA分子具有80％以上的同一性且编码具有Cas7功能的蛋白质的DNA 分子；

所述Cas8蛋白的编码基因可选自如下任一种：

e1)、编码序列是SEQ ID No.4所示的DNA分子；

e2)、与e1)限定的DNA分子具有80％以上的同一性且编码具有Cas8功能的蛋白质的DNA分子。

上述DNA分子中，所述DNA的“同一性”或是“序列同一性的百分比”是通过在比较窗口比较两个最优比对的序列来确定的，其中最优比对提供最高级别的配对并且能够在检验或参照的序列当中引入核苷酸添加。同一性百分比是通过计算测试序列和参考序列在整条序列中的每一个位置上一致的核苷酸的百分比来确定的。最佳的序列比对和百分比同一性可以手工测定，或是更优选的通过计算机的运算法则，其包括但不限于TBLASTN，FASTA，GAP，BESTFIT，和CLUSTALW(Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215(3)：403-10；Pearsonand Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)：2444-8；Thompson，et al.，1994，Nucleic Acids Res.22(22)：4673-80；Devereux et al.，1984，Nuc.Acids.Res.12：387-395；Higgins，et al.，1996，Methods Enzymol.266：383-402)。优选的，设置在默认的参数的NCBI Blast Server(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)用于搜索多个数据库来寻找同源的序列。

上述DNA分子中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述CRISPR-Cas3系统或上述的生物材料在提高植物病毒抗性中的应用或在防治(预防和/或治疗)病毒感染植物中的应用也属于本发明的保护内容。

上述应用中，所述病毒可为DNA病毒。

进一步地，所述病毒可为双链DNA病毒和/或单链DNA病毒。

进一步地，所述DNA病毒可为双生科病毒。

所述双生科病毒可为下述5种、4种、3种、2种或1种病毒：

V2)、木薯花叶病毒；

V3)、斯里兰卡木薯花叶病毒；

V4)、印度木薯花叶病毒；

V5)、番茄黄叶卷曲病毒；

V6)、泽兰黄脉病毒。

上述应用中，所述植物可为双子叶植物和/或单子叶植物。

进一步地，所述双子叶植物可为烟草。

进一步地，所述烟草可为本氏烟草。

I型CRISPR-Cas3系统能够通过广泛的DNA降解来降低病毒的重组频率，且能够以较高的突变容忍度识别更长的靶标，还能够识别更多的原间隔子相邻的基序(PAM)序列进行多重靶向。基于CRISPR-Cas3系统的这些优点，本发明开发了针对双生病毒的有效防控策略。本发明的CRISPR-Cas3系统可以有效地防控双生科病毒感染，可以防治(预防和/或治疗)木薯花叶病毒感染、斯里兰卡木薯花叶病毒感染、印度木薯花叶病毒感染、番茄黄叶卷曲病毒感染和泽兰黄脉病毒感染。

附图说明

图1为重组载体的载体图谱，其中，图1中(a)为重组表达载体pMDC32-Cas3、重组表达载体pMDC32-Cas5、重组表达载体pMDC32-Cas6、重组表达载体pMDC32-Cas7和重组表达载体pMDC32-Cas8这5种pCRISPR-Cas重组载体的图谱；图1中(b)为pMDC32-LRR的图谱；图1中(c)为pCRISPR-RNA重组载体pMDC32-crRNA的图谱；图1中(d)为pCRISPR-Cas9的图谱。

图2为pCRISPR-Cas和pCRISPR-RNA抑制斯里兰卡木薯花叶病毒(SLCMV)侵染的实验结果，其中实验组注射表达pCRISPR-Cas和pCRISPR-RNA的根癌农杆菌混悬液，对照组注射表达pCRISPR-Cas和pMDC32-LRR的根癌农杆菌混悬液；图2中(a)为本氏烟草生长状态，图2中(b)为本氏烟草体内SLCMV的病毒滴度测定结果。

图3a为pCRISPR-Cas和pCRISPR-RNA抑制印度木薯花叶病毒(ICMV)、番茄黄叶卷曲病毒(TYLCV)、泽兰黄脉病毒(EpYVV)侵染的本氏烟草生长状态，其中实验组注射表达pCRISPR-Cas和pCRISPR-RNA的根癌农杆菌混悬液，对照组注射表达pCRISPR-Cas和pMDC32-LRR的根癌农杆菌混悬液。

图3b为pCRISPR-Cas和pCRISPR-RNA抑制印度木薯花叶病毒(ICMV)、番茄黄叶卷曲病毒(TYLCV)、泽兰黄脉病毒(EpYVV)侵染的本氏烟草体内ICMV、TYLCV、EpYVV的病毒滴度测定结果，其中实验组注射表达pCRISPR-Cas和pCRISPR-RNA的根癌农杆菌混悬液，对照组注射表达pCRISPR-Cas和pMDC32-LRR的根癌农杆菌混悬液。

图4为pCRISPR-Cas3和pCRISPR-RNA组合物与pCRISPR-Cas9抑制斯里兰卡木薯花叶病毒(SLCMV)侵染的对比实验结果，图4中(a)为本氏烟草生长状态，图4中(b)为本氏烟草体内SLCMV的病毒滴度测定结果。

图5为pCRISPR-Cas3和pCRISPR-RNA组合物处理组、pCRISPR-Cas9处理组以及对照组处理26天后本氏烟草的生长状态。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的斯里兰卡木薯花叶病毒(SLCMV)本实验室构建，在文献“D.Wang,X.M.Yao,G.X.Huang,T.Shi,G.F.Wang,and J.Ye.First report of Sri Lankan cassavamosaic virus infected cassava in China.Plant Disease.2019 103:6,1437请添加期刊具体信息”中公开；印度木薯花叶病毒(ICMV)在文献“Gang Wang,YanWei Sun,RuiRuiXu,Jing Qu,ChuanSia Tee,XiYuan Jiang&Jian Ye.DNA-Aof a highly pathogenicIndian cassava mosaic virus isolated from Jatropha curcas causes symptoms inNicotiana benthamiana.Virus Genes(2014)48:402–405”中公开；番茄黄叶卷曲病毒(TYLCV)由中国农业科学院植物保护研究所周雪平教授赠予，在文章“Wu JB,Dai FM,ZhouXP.First Report of Tomato yellow leaf curl virus in China.Plant Disease,200690:10,1359-1359请添加期刊号.2006.”中公开；泽兰黄脉病毒(EpYVV)由本实验室参考NCBI序列AB007990；AJ438938，由金唯智生物科技有限公司合成。公众可从野外采集，也可从申请人处获得，以重复本申请实验。

质粒pMDC32-3xFlag由中国农业大学李大伟教授赠予，在文献“Xuan Zhang,Xueting Wang,Kai Xu,Zhihao Jiang,Kai Dong,Xialin Xie,He Zhang,Ning Yue,Yongliang Zhang,Xian-Bing Wang,Chenggui Han,Jialin Yu,Dawei Li.The serine/threonine/tyrosine kinase STY46 defends against hordeivirus infection byphosphorylating cb protein.Plant Physiology.2021Feb 12；186(1):715-730.”中公开。

质粒pHSN401购买于武汉淼灵生物科技有限公司。

高保真DNA聚合酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase采购于Vazyme公司。

PCR产物回收试剂盒

PCR Purification Kit采购于TransGen公司。

非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒

II One Step Cloning Kit采购于Vazyme公司。

实施例1：CRISPR-Cas3抗植物病毒载体的构建

1.1、pCRISPR-Cas重组质粒构建

通过全基因组测序在由本实验室分离纯化的噬几丁质细菌Chitinophagasp.Ae27中发现了完整的I-B型CRISPR-Cas3系统，以菌株Ae27的基因组DNA为模板，设计含末端同源序列的引物(表1)，使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme)扩增Cas3的编码基因(编码序列是SEQ ID No.1)、Cas5的编码基因(编码序列是SEQ IDNo.2)、Cas6的编码基因(编码序列是SEQ ID No.3)、Cas7的编码基因(编码序列是SEQ IDNo.4)和Cas8的编码基因(编码序列是SEQ ID No.5)，并使用

PCR PurificationKit(TransGen)回收PCR产物。使用KpnI和SpeI双酶切pMDC32-3xFlag载体骨架，切胶回收相应条带，使用

II One Step Cloning Kit(Vazyme)通过同源重组将Cas蛋白编码基因连接到表达载体，得到的连接产物为重组表达载体pMDC32-Cas3、重组表达载体pMDC32-Cas5、重组表达载体pMDC32-Cas6、重组表达载体pMDC32-Cas7和重组表达载体pMDC32-Cas8。将上述重组载体分别转化到大肠杆菌DH5α感受态，挑取单克隆测序成功后提取质粒保存。测序结果表明：

重组表达载体pMDC32-Cas3是用SEQ ID No.1所示的核酸分子替换pMDC32-3xFlag的KpnI识别位点和SpeI识别位点间的片段(KpnI识别位点间和SpeI识别位点间的小片段)，保持pMDC32-3xFlag的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质Cas3的重组表达载体。pMDC32-Cas3含有核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的核酸分子，表达氨基酸序列是序列8的Cas3蛋白。

重组表达载体pMDC32-Cas5是用SEQ ID No.2所示的核酸分子替换pMDC32-3xFlag的KpnI识别位点和SpeI识别位点间的片段(KpnI识别位点间和SpeI识别位点间的小片段)，保持pMDC32-3xFlag的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质Cas5的重组表达载体。pMDC32-Cas5含有核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的核酸分子，表达氨基酸序列是序列9的Cas5蛋白。

重组表达载体pMDC32-Cas6是用SEQ ID No.3所示的核酸分子替换pMDC32-3xFlag的KpnI识别位点间和SpeI识别位点间的片段(KpnI识别位点间和SpeI识别位点间的小片段)，保持pMDC32-3xFlag的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质Cas6的重组表达载体。pMDC32-Cas6含有核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的核酸分子，表达氨基酸序列是序列10的Cas6蛋白。

重组表达载体pMDC32-Cas7是用SEQ ID No.4所示的核酸分子替换pMDC32-3xFlag的KpnI识别位点间和SpeI识别位点间的片段(KpnI识别位点间和SpeI识别位点间的小片段)，保持pMDC32-3xFlag的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质Cas7的重组表达载体。pMDC32-Cas7含有核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的核酸分子，表达氨基酸序列是序列11的Cas7蛋白。

重组表达载体pMDC32-Cas8是用SEQ ID No.5所示的核酸分子替换pMDC32-3xFlag的KpnI识别位点间和SpeI识别位点间的片段(KpnI识别位点间和SpeI识别位点间的小片段)，保持pMDC32-3xFlag的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质Cas8的重组表达载体。pMDC32-Cas8含有核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的核酸分子，表达氨基酸序列是序列12的Cas8蛋白。

将上述重组载体分别电击转化根癌农杆菌EHA105，得到携带重组质粒pMDC32-Cas3的根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas3、携带重组质粒pMDC32-Cas5的根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas5、携带重组质粒pMDC32-sCas6的根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas6、携带重组质粒pMDC32-Cas7的根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas7和携带重组质粒pMDC32-Cas8的根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas8，将上述根癌农杆菌保藏备用。

质粒构建示意图如图1中(a)所示。

表1

1.2、pCRISPR-RNA重组质粒构建

在天一辉远生物科技公司人工合成了291bp的DNA片段用于靶标序列的插入，如SEQ ID No.6所示，第1至6位核苷酸为XbaI酶切位点，第7至211位核苷酸为前导序列，第212至241位和第256至285位核苷酸为重复序列，第237至240位和257至261位核苷酸为BsaI酶切位点，第286至291位核苷酸为SacI酶切位点。使用XbaI和SacI双酶切上述SEQ ID No.6片段和预先去除BsaI酶切位点的pMDC32-3xFlag(名称为pMDC32-3xFlag-DEL BsaI)，使用全式金

Quick Gel Extraction Kit回收相应大小的条带，再通过T4DNA连接酶连接该两个片段，生成crRNA表达骨架载体pMDC32-LRR(图1(b))，通过测序验证序列并电击转化根癌农杆菌EHA105，得到携带重组质粒pMDC32-LRR的农杆菌EHA105/pMDC32-LRR，保存备用。

其中，pMDC32-3xFlag-DEL BsaI与pMDC32-3xFlag在核苷酸序列上的区别仅在于，pMDC32-3xFlag-DEL BsaI中无BsaI识别位点，其它核苷酸序列完全相同。pMDC32-3xFlag-DEL BsaI是将pMDC32-3xFlag的BsaI识别位点gagacc突变成gggccc从而去除，保持pMDC32-3xFlag的其它核苷酸不变得到的载体。

以斯里兰卡木薯花叶病毒(SLCMV)为例，在其基因间区域(IR)茎环序列处设计了SLCMV-crRNA1靶标(核苷酸序列是SEQ ID No.7)，合成了退火引物SLCMV-crRNA1-F:5’-GAAATAGATCCAAAAGCGGCCATCCGTATAATATTACCGGATG-3’，SLCMV-crRNA1-R:5’-ATGACATCCGGTAATATTATACGGATGGCCGCTTTTGGATCTA-3’，通过引物退火的方法生成粘性末端双链片段，使用T4连接酶连接到BsaI酶切后的载体pMDC32-LRR上，生成crRNA表达载体pMDC32-crRNA (图1中(c))，通过测序验证序列，测序结果表明pMDC32-crRNA是用SEQ ID No.7所示的核酸分子替换pMDC32-LRR的两个BsaI识别位点间的片段，保持pMDC32-LRR的其它核苷酸序列不变，得到的含有如SEQ ID No.7所示的核酸分子的重组载体pMDC32-crRNA。将重组载体pMDC32-crRNA电击转化根癌农杆菌EHA105，得到含有重组质粒pMDC32-crRNA的根癌农杆菌EHA105/pMDC32-crRNA，保存备用。

引物退火：配制10x退火缓冲液(100mM Tris,500mM NaCl,10mM EDTA)，将引物用灭菌水稀释到100μM，按照5μl F引物，5μl R引物，5μl 10x退火缓冲液，35μl灭菌水的体系混合均匀，在95℃水浴锅加热10分钟，然后自然降温冷却到室温。

实施例2：利用pCRISPR-Cas和pCRISPR-RNA能抑制SLCMV的侵染

2.1、根癌农杆菌培养及接种

(1)将实施例1得到的携带重组质粒pMDC32-LRR的根癌农杆菌EHA105/pMDC32-LRR、携带重组质粒pMDC32-crRNA的根癌农杆菌EHA105/pMDC32-crRNA、携带重组质粒pMDC32-Cas3的根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas3、携带重组质粒pMDC32-Cas5的根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas5、携带重组质粒pMDC32-Cas6的根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas6、携带重组质粒pMDC32-Cas7的根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas7和携带重组质粒pMDC32-Cas8的根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas8分别涂布于含有50ug/ml卡那霉素和50ug/ml利福平的LB固体培养基，28℃过夜培养。用重悬液(溶质为10mM MES-KOH，pH 5.6，10mM MgCl₂，100μM乙酰丁香酮；溶剂为水)重悬至OD600nm＝1.0，室温静置3小时，分别得到根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas3菌液，根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas5菌液、根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas6菌液、根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas7菌液、根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas8菌液、根癌农杆菌EHA105/pMDC32-crRNA菌液和根癌农杆菌EHA105/pMDC32-LRR菌液。

(2)根癌农杆菌接种烟草

设置处理组和对照组。

处理组(Cas3)：用1ml除去针头的注射器吸取根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas3菌液、根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas5菌液、根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas6菌液、根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas7菌液、根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas8菌液和根癌农杆菌EHA105/pMDC32-crRNA菌液按照等体积比例混合均匀后注射在5–6叶期的本氏烟草的同一片叶片上，避开叶脉缓慢注入叶片背面，直至浸润整个叶片，每株烟草注射4片叶片。共注射8株本氏烟草。

对照组(Mock)：用1ml除去针头的注射器吸取根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas3菌液、根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas5菌液、根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas6菌液、根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas7菌液、根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas8菌液和根癌农杆菌EHA105/pMDC32-LRR菌液按照等体积比例混合均匀后注射在5–6叶期的本氏烟草的叶片上，避开叶脉缓慢注入叶片背面，直至浸润整个叶片，每株烟草注射4片叶片。共注射8株本氏烟草。

(3)浸润后的植物于22℃长日照(16小时光照，8小时黑暗)温室中培养，2天后使用同样的接种方法将重悬至OD＝0.8的SLCMV侵染克隆分别注射到处理组和对照组先前注射过的叶片。继续于温室中培养，持续观察烟草的发病症状。12天后对照组植物产生明显的叶片卷曲和皱缩的症状，而处理组植物生长良好(图2中(a))。

OD_600nm＝0.8的SLCMV重悬液的制备方法为：将含SLCMV的农杆菌分别涂布于含有50ug/ml卡那霉素和50ug/ml利福平的LB固体培养基，28℃过夜培养。用重悬液(溶质为10mMMES-KOH，pH 5.6，10mM MgCl2，100μM乙酰丁香酮；溶剂为水)重悬至OD_600nm＝0.8，室温静置3小时后注射烟草。

2.2、病毒滴度检测

使用CTAB法提取经过步骤(3)处理的所有植物的注射后的叶片的总DNA，使用实时定量聚合酶链反应(qPCR)对SLCMV的基因组DNA拷贝数进行定量分析，使用烟草的延长因子-1α的基因为内参。qPCR引物如表2所示，SLCMV的特异引物为表2中的SLCMV-q-F和SLCMV-q-F，延长因子-1α的基因特异引物为表2中的Nb-EF1α-F和Nb-EF1α-R。

表2

病毒滴度结果显示，与仅表达Cas蛋白的对照组相比，在共表达Cas蛋白和SLCMV-crRNA1的处理组中，系统叶片的SLCMV基因组的积累量显著减少了(图2中(b))。这表明Cas3系统可以有效介导植物细胞中的病毒干扰。

实施例3：利用pCRISPR-Cas和pCRISPR-RNA也能抑制印度木薯花叶病毒(ICMV)，番茄黄叶卷曲病毒(TYLCV)，泽兰黄脉病毒(EpYVV)的侵染

参照实施例2中SLCMV抗性测试的方法进行ICMV测试，除将实施例2中步骤(3)中的SLCMV侵染克隆替换为ICMV侵染克隆，和将2.2中的SLCMV的特异引物替换为ICMV的特异引物外，其它操作与实施例2完全相同。其中，ICMV的特异引物为表3中的ICMV-q-F和ICMV-q-R。

参照实施例2中SLCMV抗性测试的方法进行TYLCV测试，除将实施例2中步骤(3)中的SLCMV侵染克隆替换为TYLCV侵染克隆，和将2.2中的SLCMV的特异引物替换为TYLCV的特异引物外，其它操作与实施例2完全相同。其中，TYLCV的特异引物为表3中的TYLCV-q-F和TYLCV-q-R。

参照实施例2中SLCMV抗性测试的方法进行EpYVV测试，除将实施例2中步骤(3)中的SLCMV侵染克隆替换为EpYVV侵染克隆，和将2.2中的SLCMV的特异引物替换为EpYVV的特异引物外，其它操作与实施例2完全相同。其中，EpYVV的特异引物为表3中的EpYVV-q-F和EpYVV-q-R。

结果发现Cas3系统也能够抑制印度木薯花叶病毒(ICMV)，番茄黄叶卷曲病毒(TYLCV)，泽兰黄脉病毒(EpYVV)的侵染。如图3a，在病毒侵染12天后，处理组明显降低了病毒发病症状，与此一致的是病毒滴度也明显降低(图3b)。

表3

实施例4：Cas9和Cas3系统抗病毒效率比较

为了评估CRISPR-Cas3系统在植物中的抗病毒性能，我们研究了同一靶点处Cas9和Cas3系统的抗病毒效率。

4.1、制备根癌农杆菌及接种

(1)、制备根癌农杆菌

设计了靶向IR的sgRNA靶点(5'-GGCCATCCGTATAATATTAC-3')，并基于质粒pHSN401构建了pCRISPR-Cas9载体。引物SLCMV-sgRNA1-F:5’-ATTGGGCCATCCGTATAATATTAC-3’和SLCMV-sgRNA1-R:5’-AAACGTAATATTATACGGATGGCC-3’通过退火生成有粘性末端的双链DNA片段并通过T4连接酶连接到BsaI酶切后的pHSN401质粒上，生成sgRNA表达载体pCRISPR-Cas9(图1中(d))。

将重组载体pCRISPR-Cas9转化根癌农杆菌EHA105，得到含有重组质粒的根癌农杆菌EHA105/pCRISPR-Cas9，保存备用。

将根癌农杆菌EHA105/pCRISPR-Cas9涂布于含有50ug/ml卡那霉素和50ug/ml利福平的LB固体培养基，28℃过夜培养。用重悬液(溶质为：10mM MES-KOH，pH 5.6，10mM MgCl₂，100μM乙酰丁香酮；溶剂为水)重悬至OD600nm＝1.0，室温静置3小时，分别得到根癌农杆菌EHA105/pCRISPR-Cas9菌液。

(2)、浸润

设置Cas3处理组(简称Cas3)、Cas9处理组(简称Cas9)和对照组。

Cas3处理组(简称Cas3)：用1ml除去针头的注射器吸取实施例2的根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas3菌液、根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas5菌液、根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas6菌液、根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas7菌液、根癌农杆菌EHA105/pMDC32-Cas8菌液和根癌农杆菌EHA105/pMDC32-crRNA菌液按照等体积比例混合均匀后注射在5–6叶期的本氏烟草叶片上，避开叶脉缓慢注入叶片背面，直至浸润整个叶片，每株烟草注射4片叶片。共注射8株本氏烟草。

Cas9处理组(简称Cas9)：用1ml除去针头的注射器吸取根癌农杆菌EHA105/pCRISPR-Cas9菌液，注射在5–6叶期的本氏烟草的叶片上，避开叶脉缓慢注入叶片背面，直至浸润整个叶片，每株烟草注射4片叶片。共注射8株本氏烟草。

对照组(Mock)：用1ml除去针头的注射器吸取重悬液(溶质为10mM MES-KOH，pH5.6，10mM MgCl₂，100μM乙酰丁香酮；溶剂为水)注射在5–6叶期的本氏烟草的叶片上，避开叶脉缓慢注入叶片背面，直至浸润整个叶片，每株烟草注射4片叶片。共注射8株本氏烟草。

(3)、浸润后的植物于22℃长日照(16小时光照，8小时黑暗)温室中培养，2天后使用同样的接种方法将重悬至OD_600nm＝0.8的SLCMV(SLCMV悬液的制备方法同实施例2)侵染克隆分别注射到Cas3处理组(简称Cas3)、Cas9处理组(简称Cas9)和对照组的浸润后的叶片。继续于温室中培养，持续观察烟草的发病症状。12天后对照组植物产生明显的叶片卷曲和皱缩的症状，而Cas3处理组(简称Cas3)、Cas9处理组(简称Cas9)的植物生长良好(图4中(a))。

4.2、病毒滴度检测

使用CTAB法提取经过步骤3处理的所有植物的浸润后的叶片的总DNA，使用实时定量聚合酶链反应(qPCR)对SLCMV的基因组DNA拷贝数进行定量分析，使用烟草的延长因子-1α的基因为内参。qPCR引物如表2所示，SLCMV的特异引物为表2中的SLCMV-q-F和SLCMV-q-F，延长因子-1α的基因特异引物为表2中的Nb-EF1α-F和Nb-EF1α-R。结果表明在发病早期(12天)，Cas9处理组和Cas3处理组的Cas9和Cas3系统都能延迟和降低病毒的发病症状(见图4中(a))，而且明显降低了病毒在植物体内的积累(图4中(b))，相比于Cas9系统Cas3系统更明显抑制了病毒的复制。在发病晚期(26天)Cas3系统的表达仍然保留一定的保护作用，而Cas9不能赋予植物对SLCMV的抗性(图5)。本实例证明了相较于Cas9系统，Cas3系统是抵抗病毒的更佳的工具。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种CRISPR-Cas3系统及其在抗植物病毒方面的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2298

<212> DNA

<213> Chitinophaga sp

<400> 1

atgagtaagc agtattttga tcaattttgg gcaaagggtg atggtgtaac cactcttgag 60

atgcatacca gacatgttat tacagcggct ataaatttat tgaagtcgct tcctttaaat 120

gagtctgaga gagaatattg ggagcggaaa atggtgaggt gcgctgtttt acacgatttg 180

ggtaaaattc ataaggagtt tgtggaaaag ttgaaaggcc ataaggaggg aggcattagg 240

cacgagttgg tgtcgctgct gttgtgtatt aattatttgc agctggataa tgatgagcta 300

ttcgcgattg cgacacatca caaagggatt gtagatacgc atggtctgaa agggagcttt 360

ttgcttaacc aaataattga atatattgaa cagtggtata attcagactc ttcgattttt 420

caaagtagac atatccttga ctggttacag atcttcgggc tgagtatgcc gatagttgaa 480

caagagcctg tgaaaaagtt gcccaaagaa atgataatgc tgttaaatgt aggatatcaa 540

gctaaagcat taccagatcc cgagcatagg aggcagcttt ctatgacccg ggctttgttg 600

atggcttcgg accatttagg ctctgcaaga aaggaaaacg atataccgca atataaacag 660

ctggaactgc gcgattttca accgggtaag gatggggaat atcttccatt tcgtccattt 720

caggatcggt taagaggaat aaaaacagat gttatcctgc atgcacccac agggtcaggg 780

aagacggaag ccgcgttgaa ttggatattt gcgaatcaaa ctaaaaattc aagggtgttt 840

tatttgctac cttatacagc aagtattaat gcaatggttt cccgattaca aatgcattat 900

aatgagaatg ttgtaaccgc tttacattct aaaacaatag attttttcta tgaacagatt 960

tctggtgaat ataacaatct agagaaggat tatagaaaga ttgagttgga agcaagagat 1020

agaaaatcgc tttccaggga gttattctac ccaataaagg tcgcgacgtt gcatcagatt 1080

ctgaaaacgt cccttaaggg caggggatgg gagttggctt tgttcgatta taaaaatgcg 1140

ttatttgtta ttgatgaatt tcacacctat gatgctttat tgacgggcat gttgttggca 1200

acaataaagc tcttcaaaag aatgttcaat gctaagtttt tctttttgtc agctaccatt 1260

cctgatttta tgctgaacct tatcattgac gaaatttatg cgggtgatca gtcaatgctt 1320

gttcggccag acaggacaaa ggagcaagac cgggatgtgt tagataaaaa aaggcaccgc 1380

ttgtattgta agagtaccgc tacaattgaa gatgaaatag gcctggttaa gaagtatttg 1440

gacgcgggaa gatcggtttt aattgttgtg aataatgtga agactgcgca aaagctgtat 1500

agggaaattg atattggttg tacagtacaa cttttgcaca gcggtttaaa tagaagggac 1560

agaactgcca ttgagaaatt gattgttggc aaggatattt cgctgcgtcc tcaattgtta 1620

attgctactc aagctgtaga agttagcctg gatatcgatt atgacgttgc ttttatagaa 1680

aatgccccca ttgatgcttt aatacagcga tttggaagag tcaatagagc tggaaagaag 1740

atgattcctc caatagatgg aaaactgggt tttaatacta ctagcgttcc cgtttacttg 1800

tttgaaaatt caattggggt tacaccattc tatgatgtga aggttttgaa agacacctgg 1860

agtgaattga gccgcttcaa tcattgcgaa ctgggagaag atgagctaat tggcgtgtgt 1920

aacaatgttt acagggatgg ttataatgag gagcagcaaa aagactttaa gaatggatta 1980

catcattcag tcatcaatca gtttgaagaa gaatggatcg ccggacattg gcgagattgg 2040

gttgaagata tactgaagaa taataatcaa aagattgagg tgctttgttt taacctcatt 2100

gaagaatacc aggaaaaggt atcccaaaga agatttttag aagccaatca attattggtt 2160

caggtttatg cttacgaagc aaagatatcc agaaacaaaa tgatgggaga tgttttgatt 2220

gctgttaacc tggaatacaa tccgatgatt ggatatatag aaaagaagat aacggttgac 2280

gatcagatat gggattag 2298

<210> 2

<211> 681

<212> DNA

<213> Chitinophaga sp

<400> 2

atggataaat tactggaagt gcgattttca ggatggacgt ctactccccg gttaccgttt 60

attctgtcag gaaatgctct ttgtatgcat acaccgagct actccctggt tttaggaatt 120

atcgggtgct gtcttggaag ggtcgttttg cctaaagaag tcaggatcgg atttaaatat 180

tcttacgaca ctgttgcgca ggacctggag acgaggcaac gtcttgagtt taatgggagg 240

aagataaaac aacatagcga gggtacagat gcttatatac gggaatttca cacatctccc 300

aggctgctaa tttggattga caggattgac tggatggagt attttgaaaa tccagtggga 360

actccatctc tggggcgatc acaagatatt ctaaaaatag agaacgtctc aatagttgaa 420

gtcgaaaagg tgggtaaagg aaatatgggt ggctcgttat tgccattctc tgctggacta 480

cgtgcaggtg ggcagttggt gcaattagcc gaatctttcc ttgaaaatga agaagtgggt 540

tctggtagaa gacctcaggc gtccagggta tttatttcta taccacatga caatgatgat 600

gtagtagagt taaataacat ttatcaaaag aaatcggaag aaccagtatc attttatttg 660

cacgagttta ttaatgagta a 681

<210> 3

<211> 904

<212> DNA

<213> Chitinophaga sp

<400> 3

cttgattatg cgcagctgct ggtttaaaaa cgctgcgctt tttataggaa aaattgtaca 60

cttgtatata gaaacaccaa aatcacccca ccgtttagct tttctgttga tgagatttaa 120

aatactactt tacagtactg aaaatagagg tactataccg gtaaattatc agcacccctt 180

aagtgcagct ttgtataaga tcattgcaaa aggtgatgcg cagtatgcta cctttcttca 240

tgaaacaggc tatggaaaag gtattaagtt gtttactttt tcacagctaa atgtcccttt 300

taaaattgag ggtgacagat tgaaattact tggaaatgag gtagattttc aggtgacatt 360

ccatttgccc caaacggcag aaaattttat aaagggattg ttccagagtg aacagctgga 420

gatcgcagat atgagaagcc gctgccggtt tatcctgaaa tcgattacaa gtctgcccaa 480

cttgttggag tcgtttcgtg acagcgaagt tatcacttcg acccttcagc cactttctcc 540

tgttgtggct ggtttgcgta atgaaaaaga ccagtatgaa tttttatcgc ctgaagatcc 600

tcgttttatt gagagcctga tatataactg gcgaagtaaa atttcctctt gttataacga 660

tgttattgcc gctgctgcgg tgttaatagc agaagttaaa ccggcaaaaa gaccctataa 720

gtccagactt attactataa aatacgggaa accagaagaa accaaaattc ggggatggct 780

aaatttgtat ataaaggtaa ttgcagagaa aaggtttgtg gagttgcttt taaactcggg 840

tattggcgta tatagctcac agggaatggg atgtgtgcaa ctcgctaata actggttcga 900

ttga 904

<210> 4

<211> 1029

<212> DNA

<213> Chitinophaga sp

<400> 4

atgtcaaatt tgaataatat tgcaggcgca ctgttaattg atgcaaccgc gaccttcctt 60

aacggagcag gtctgggagt tcaggaggat aaaaaccgtg taatacctaa aacctataga 120

gagaaagtga acgacagggt ggaagaggtg ccctatgtgt ctgcccagtc atggagaagg 180

tggctaaggg atacagccaa tgaggagaac aactggaatc ccagcgaatt acgggctata 240

ggagaaggtt ctgaaaaggg aaataccaat aaaatagcga ctgagttaaa tcccattgat 300

tttcctgaag atgatttatt tggttatatg aaagccggag ccaagggtga agaaagcatt 360

caaagaactt ccccttttaa atcatctatt ttgaagggga taaaaaatat gcgtacagta 420

aatatagatg aggcatttgt tcacctgaaa gaaggaaccc cattacctta ttccacaaag 480

ttctactcaa cacatctgga aggttttttt aacctggaat attatcgttt aggtgtatat 540

gacaatcttg ggagtagaca ggaattatct tctgaattgg tggagaaaca cgcggataaa 600

tttaacaaat ctgatttagg aggtaaattt aagcggtatg aactgaaaaa tggagccgaa 660

gtcagaaagg agcatgctgc gggattgttg aaaggattgg cttatttgag aggtggggca 720

aaacaagcgg catttggcgc tgatgtatct cctaaagttt taatttttgc cgggctggga 780

tcggcaaacc caatttttaa taatttattt attggaacgg gagaaagacc aattttgaat 840

attgatttgt tgctggagtt atcaaatgac tataaaagca ggctggcaac tccaatttat 900

gttggattaa gaaaaggtta tctgcaaaat gaagaggaag ttacaaaaag attagaggag 960

ggttttgtac tggcctcccc aatagaaata gtaaaccaat tcaccaaagc ctatttaacg 1020

aatggataa 1029

<210> 5

<211> 2013

<212> DNA

<213> Chitinophaga sp

<400> 5

atgactgttg aagctttggc aaagctgaag agtgtttcag agattactcc ttcattgtta 60

aaagaattgt atgacaaagt aaatctgaaa gagattaaca aacggctgaa aagttataca 120

atggtgtttc tgaataaccc tttggttaat cctgccaaga aagctaatgg agctggagaa 180

agtacttatc accatttatt aaatgccatt atggatagtt ttgaatccga aggcgataat 240

gtgtgcgaaa tttcaggttt acgatttagt aaaactttcg agaattttta tgaggaggaa 300

atagaacgcc aaaaagaatt acttataaga gacattaaag acgagaagca actcaaaaaa 360

gagataagga atattgaaaa aacagacacg cacgtgaatc gatcctggtt tcctttgatt 420

ggaggtttag gttcagatgc acaagctttg ccccaggcaa agtttacagt gcacatacat 480

ccaatatgtg ttcctattct tcaattttta ccgttgtctg cgttgttgta taaacgaggg 540

gttttattgg tggattcggc caattttgag ttgtcaagag cgatggtggc tgaaaatgcg 600

agggtagtag cagaaaaaat tcaaactatt cctacaaagg agcgagtaga gaatgtcaga 660

aatttttcta ggggagatta tatgattaag gtattggagg tcctaaatag gaaggagtat 720

ttcgaagaga cttactcaga tttgaatatg tggagttttt ccaatttcgg caatgatgca 780

agttgtaaaa tagacagact acccaattcc tttatcagaa aactccaacg gctatataag 840

aacgctaaaa ttgaaagaga gctcagagaa attttatcca acaatgaaat agcttttaac 900

ttccttgaat gcctggaaga gaatagtgat tggtccttgc tctatcctgg tgtatttgga 960

agtgggaaaa agaaaatgga atatgagggt gtttcccctg aatttttgga agcctattat 1020

gaagagatag gcagaagcca ttttgtttct atagcaaaat atattgcagg attaatcgaa 1080

aaatacaaat cccatacatt cgaaaaaata ttgaataaaa aatatggatg gaatgatccc 1140

gaatatcggg tagaactgtt taaagtgttt gttaaggcta cggaaaatgg tgaatggagt 1200

atggcagatc atattaccat tcttgataac aaggaggagt tgcccgttaa aaataactat 1260

tatcaactac ataaattaat ccatttcttt acgcaaaaga agatttatag taatgtgctg 1320

tggaagattg atgtgtcaaa agcaagagtt tataaagcat gtacctggat aataggtctg 1380

atccagaatg attcaaaaat caatacaata aagtctaatc tgattaatcc gaatgaatat 1440

actaaagttg gatatgacag agttattttt gatgctattg ataattttga agtggaaatt 1500

gaaaatgtca tagaagtact atatgacaat gcctttactt ttaagaagtt tgggttgaat 1560

gaacttttga gaatattctt ttctcaacct caacaagaag tgttttcggt tttaccttgg 1620

gaaagtagat tgaaagaaga tcatagtttc aaaaaatggc ttgataggat tcgacgtttt 1680

tcagacgatt atcggaatta ctattatatg aaatatcaaa aatcgaccga agacagggcg 1740

ccatacaata aatttattaa gacagttagt agtatcgtaa aggagaatga tcaattttat 1800

tctttgctta acgaaatgat ttataatacc aatcagttta taaaagaaaa tgaacgaata 1860

aaaagcgata agtggagggt agaggatctg ttgactaatc cacttggaaa taatacgtgg 1920

aacatctgtg tgctggcgat taaattttta ttgagacaat cggccgtaaa acctttaaca 1980

gaaaaagata tcgttaacaa aaaccaaaac taa 2013

<210> 6

<211> 291

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctagattgt cgaatattat gttatttgta atttgggatc cgtcctttaa tacaggtact 60

ttgtaagttg ttgactatca gtgtggtgca aggttgtcgg tgctaggaca aaatccaggt 120

atttcgcatc gacaactttt tgtaggaaat agcttcttct tatgagttat aaagctttga 180

aaatgagctt tttttgtcgt cgatttggcg ggtcataatc gaaccatagt ggaattgaaa 240

tgagaccaag gtctcgtcat aatcgaacca tagtggaatt gaaatgagct c 291

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agatccaaaa gcggccatcc gtataatatt accggat 37

<210> 8

<211> 765

<212> PRT

<213> Chitinophaga sp

<400> 8

Met Ser Lys Gln Tyr Phe Asp Gln Phe Trp Ala Lys Gly Asp Gly Val

1 5 10 15

Thr Thr Leu Glu Met His Thr Arg His Val Ile Thr Ala Ala Ile Asn

20 25 30

Leu Leu Lys Ser Leu Pro Leu Asn Glu Ser Glu Arg Glu Tyr Trp Glu

35 40 45

Arg Lys Met Val Arg Cys Ala Val Leu His Asp Leu Gly Lys Ile His

50 55 60

Lys Glu Phe Val Glu Lys Leu Lys Gly His Lys Glu Gly Gly Ile Arg

65 70 75 80

His Glu Leu Val Ser Leu Leu Leu Cys Ile Asn Tyr Leu Gln Leu Asp

85 90 95

Asn Asp Glu Leu Phe Ala Ile Ala Thr His His Lys Gly Ile Val Asp

100 105 110

Thr His Gly Leu Lys Gly Ser Phe Leu Leu Asn Gln Ile Ile Glu Tyr

115 120 125

Ile Glu Gln Trp Tyr Asn Ser Asp Ser Ser Ile Phe Gln Ser Arg His

130 135 140

Ile Leu Asp Trp Leu Gln Ile Phe Gly Leu Ser Met Pro Ile Val Glu

145 150 155 160

Gln Glu Pro Val Lys Lys Leu Pro Lys Glu Met Ile Met Leu Leu Asn

165 170 175

Val Gly Tyr Gln Ala Lys Ala Leu Pro Asp Pro Glu His Arg Arg Gln

180 185 190

Leu Ser Met Thr Arg Ala Leu Leu Met Ala Ser Asp His Leu Gly Ser

195 200 205

Ala Arg Lys Glu Asn Asp Ile Pro Gln Tyr Lys Gln Leu Glu Leu Arg

210 215 220

Asp Phe Gln Pro Gly Lys Asp Gly Glu Tyr Leu Pro Phe Arg Pro Phe

225 230 235 240

Gln Asp Arg Leu Arg Gly Ile Lys Thr Asp Val Ile Leu His Ala Pro

245 250 255

Thr Gly Ser Gly Lys Thr Glu Ala Ala Leu Asn Trp Ile Phe Ala Asn

260 265 270

Gln Thr Lys Asn Ser Arg Val Phe Tyr Leu Leu Pro Tyr Thr Ala Ser

275 280 285

Ile Asn Ala Met Val Ser Arg Leu Gln Met His Tyr Asn Glu Asn Val

290 295 300

Val Thr Ala Leu His Ser Lys Thr Ile Asp Phe Phe Tyr Glu Gln Ile

305 310 315 320

Ser Gly Glu Tyr Asn Asn Leu Glu Lys Asp Tyr Arg Lys Ile Glu Leu

325 330 335

Glu Ala Arg Asp Arg Lys Ser Leu Ser Arg Glu Leu Phe Tyr Pro Ile

340 345 350

Lys Val Ala Thr Leu His Gln Ile Leu Lys Thr Ser Leu Lys Gly Arg

355 360 365

Gly Trp Glu Leu Ala Leu Phe Asp Tyr Lys Asn Ala Leu Phe Val Ile

370 375 380

Asp Glu Phe His Thr Tyr Asp Ala Leu Leu Thr Gly Met Leu Leu Ala

385 390 395 400

Thr Ile Lys Leu Phe Lys Arg Met Phe Asn Ala Lys Phe Phe Phe Leu

405 410 415

Ser Ala Thr Ile Pro Asp Phe Met Leu Asn Leu Ile Ile Asp Glu Ile

420 425 430

Tyr Ala Gly Asp Gln Ser Met Leu Val Arg Pro Asp Arg Thr Lys Glu

435 440 445

Gln Asp Arg Asp Val Leu Asp Lys Lys Arg His Arg Leu Tyr Cys Lys

450 455 460

Ser Thr Ala Thr Ile Glu Asp Glu Ile Gly Leu Val Lys Lys Tyr Leu

465 470 475 480

Asp Ala Gly Arg Ser Val Leu Ile Val Val Asn Asn Val Lys Thr Ala

485 490 495

Gln Lys Leu Tyr Arg Glu Ile Asp Ile Gly Cys Thr Val Gln Leu Leu

500 505 510

His Ser Gly Leu Asn Arg Arg Asp Arg Thr Ala Ile Glu Lys Leu Ile

515 520 525

Val Gly Lys Asp Ile Ser Leu Arg Pro Gln Leu Leu Ile Ala Thr Gln

530 535 540

Ala Val Glu Val Ser Leu Asp Ile Asp Tyr Asp Val Ala Phe Ile Glu

545 550 555 560

Asn Ala Pro Ile Asp Ala Leu Ile Gln Arg Phe Gly Arg Val Asn Arg

565 570 575

Ala Gly Lys Lys Met Ile Pro Pro Ile Asp Gly Lys Leu Gly Phe Asn

580 585 590

Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Leu Phe Glu Asn Ser Ile Gly Val Thr

595 600 605

Pro Phe Tyr Asp Val Lys Val Leu Lys Asp Thr Trp Ser Glu Leu Ser

610 615 620

Arg Phe Asn His Cys Glu Leu Gly Glu Asp Glu Leu Ile Gly Val Cys

625 630 635 640

Asn Asn Val Tyr Arg Asp Gly Tyr Asn Glu Glu Gln Gln Lys Asp Phe

645 650 655

Lys Asn Gly Leu His His Ser Val Ile Asn Gln Phe Glu Glu Glu Trp

660 665 670

Ile Ala Gly His Trp Arg Asp Trp Val Glu Asp Ile Leu Lys Asn Asn

675 680 685

Asn Gln Lys Ile Glu Val Leu Cys Phe Asn Leu Ile Glu Glu Tyr Gln

690 695 700

Glu Lys Val Ser Gln Arg Arg Phe Leu Glu Ala Asn Gln Leu Leu Val

705 710 715 720

Gln Val Tyr Ala Tyr Glu Ala Lys Ile Ser Arg Asn Lys Met Met Gly

725 730 735

Asp Val Leu Ile Ala Val Asn Leu Glu Tyr Asn Pro Met Ile Gly Tyr

740 745 750

Ile Glu Lys Lys Ile Thr Val Asp Asp Gln Ile Trp Asp

755 760 765

<210> 9

<211> 198

<212> PRT

<213> Chitinophaga sp

<400> 9

Met His Thr Pro Ser Tyr Ser Leu Val Leu Gly Ile Ile Gly Cys Cys

1 5 10 15

Leu Gly Arg Val Val Leu Pro Lys Glu Val Arg Ile Gly Phe Lys Tyr

20 25 30

Ser Tyr Asp Thr Val Ala Gln Asp Leu Glu Thr Arg Gln Arg Leu Glu

35 40 45

Phe Asn Gly Arg Lys Ile Lys Gln His Ser Glu Gly Thr Asp Ala Tyr

50 55 60

Ile Arg Glu Phe His Thr Ser Pro Arg Leu Leu Ile Trp Ile Asp Arg

65 70 75 80

Ile Asp Trp Met Glu Tyr Phe Glu Asn Pro Val Gly Thr Pro Ser Leu

85 90 95

Gly Arg Ser Gln Asp Ile Leu Lys Ile Glu Asn Val Ser Ile Val Glu

100 105 110

Val Glu Lys Val Gly Lys Gly Asn Met Gly Gly Ser Leu Leu Pro Phe

115 120 125

Ser Ala Gly Leu Arg Ala Gly Gly Gln Leu Val Gln Leu Ala Glu Ser

130 135 140

Phe Leu Glu Asn Glu Glu Val Gly Ser Gly Arg Arg Pro Gln Ala Ser

145 150 155 160

Arg Val Phe Ile Ser Ile Pro His Asp Asn Asp Asp Val Val Glu Leu

165 170 175

Asn Asn Ile Tyr Gln Lys Lys Ser Glu Glu Pro Val Ser Phe Tyr Leu

180 185 190

His Glu Phe Ile Asn Glu

195

<210> 10

<211> 280

<212> PRT

<213> Chitinophaga sp

<400> 10

Met Tyr Ile Glu Thr Pro Lys Ser Pro His Arg Leu Ala Phe Leu Leu

1 5 10 15

Met Arg Phe Lys Ile Leu Leu Tyr Ser Thr Glu Asn Arg Gly Thr Ile

20 25 30

Pro Val Asn Tyr Gln His Pro Leu Ser Ala Ala Leu Tyr Lys Ile Ile

35 40 45

Ala Lys Gly Asp Ala Gln Tyr Ala Thr Phe Leu His Glu Thr Gly Tyr

50 55 60

Gly Lys Gly Ile Lys Leu Phe Thr Phe Ser Gln Leu Asn Val Pro Phe

65 70 75 80

Lys Ile Glu Gly Asp Arg Leu Lys Leu Leu Gly Asn Glu Val Asp Phe

85 90 95

Gln Val Thr Phe His Leu Pro Gln Thr Ala Glu Asn Phe Ile Lys Gly

100 105 110

Leu Phe Gln Ser Glu Gln Leu Glu Ile Ala Asp Met Arg Ser Arg Cys

115 120 125

Arg Phe Ile Leu Lys Ser Ile Thr Ser Leu Pro Asn Leu Leu Glu Ser

130 135 140

Phe Arg Asp Ser Glu Val Ile Thr Ser Thr Leu Gln Pro Leu Ser Pro

145 150 155 160

Val Val Ala Gly Leu Arg Asn Glu Lys Asp Gln Tyr Glu Phe Leu Ser

165 170 175

Pro Glu Asp Pro Arg Phe Ile Glu Ser Leu Ile Tyr Asn Trp Arg Ser

180 185 190

Lys Ile Ser Ser Cys Tyr Asn Asp Val Ile Ala Ala Ala Ala Val Leu

195 200 205

Ile Ala Glu Val Lys Pro Ala Lys Arg Pro Tyr Lys Ser Arg Leu Ile

210 215 220

Thr Ile Lys Tyr Gly Lys Pro Glu Glu Thr Lys Ile Arg Gly Trp Leu

225 230 235 240

Asn Leu Tyr Ile Lys Val Ile Ala Glu Lys Arg Phe Val Glu Leu Leu

245 250 255

Leu Asn Ser Gly Ile Gly Val Tyr Ser Ser Gln Gly Met Gly Cys Val

260 265 270

Gln Leu Ala Asn Asn Trp Phe Asp

275 280

<210> 11

<211> 342

<212> PRT

<213> Chitinophaga sp

<400> 11

Met Ser Asn Leu Asn Asn Ile Ala Gly Ala Leu Leu Ile Asp Ala Thr

1 5 10 15

Ala Thr Phe Leu Asn Gly Ala Gly Leu Gly Val Gln Glu Asp Lys Asn

20 25 30

Arg Val Ile Pro Lys Thr Tyr Arg Glu Lys Val Asn Asp Arg Val Glu

35 40 45

Glu Val Pro Tyr Val Ser Ala Gln Ser Trp Arg Arg Trp Leu Arg Asp

50 55 60

Thr Ala Asn Glu Glu Asn Asn Trp Asn Pro Ser Glu Leu Arg Ala Ile

65 70 75 80

Gly Glu Gly Ser Glu Lys Gly Asn Thr Asn Lys Ile Ala Thr Glu Leu

85 90 95

Asn Pro Ile Asp Phe Pro Glu Asp Asp Leu Phe Gly Tyr Met Lys Ala

100 105 110

Gly Ala Lys Gly Glu Glu Ser Ile Gln Arg Thr Ser Pro Phe Lys Ser

115 120 125

Ser Ile Leu Lys Gly Ile Lys Asn Met Arg Thr Val Asn Ile Asp Glu

130 135 140

Ala Phe Val His Leu Lys Glu Gly Thr Pro Leu Pro Tyr Ser Thr Lys

145 150 155 160

Phe Tyr Ser Thr His Leu Glu Gly Phe Phe Asn Leu Glu Tyr Tyr Arg

165 170 175

Leu Gly Val Tyr Asp Asn Leu Gly Ser Arg Gln Glu Leu Ser Ser Glu

180 185 190

Leu Val Glu Lys His Ala Asp Lys Phe Asn Lys Ser Asp Leu Gly Gly

195 200 205

Lys Phe Lys Arg Tyr Glu Leu Lys Asn Gly Ala Glu Val Arg Lys Glu

210 215 220

His Ala Ala Gly Leu Leu Lys Gly Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Gly Ala

225 230 235 240

Lys Gln Ala Ala Phe Gly Ala Asp Val Ser Pro Lys Val Leu Ile Phe

245 250 255

Ala Gly Leu Gly Ser Ala Asn Pro Ile Phe Asn Asn Leu Phe Ile Gly

260 265 270

Thr Gly Glu Arg Pro Ile Leu Asn Ile Asp Leu Leu Leu Glu Leu Ser

275 280 285

Asn Asp Tyr Lys Ser Arg Leu Ala Thr Pro Ile Tyr Val Gly Leu Arg

290 295 300

Lys Gly Tyr Leu Gln Asn Glu Glu Glu Val Thr Lys Arg Leu Glu Glu

305 310 315 320

Gly Phe Val Leu Ala Ser Pro Ile Glu Ile Val Asn Gln Phe Thr Lys

325 330 335

Ala Tyr Leu Thr Asn Gly

340

<210> 12

<211> 670

<212> PRT

<213> Chitinophaga sp

<400> 12

Met Thr Val Glu Ala Leu Ala Lys Leu Lys Ser Val Ser Glu Ile Thr

1 5 10 15

Pro Ser Leu Leu Lys Glu Leu Tyr Asp Lys Val Asn Leu Lys Glu Ile

20 25 30

Asn Lys Arg Leu Lys Ser Tyr Thr Met Val Phe Leu Asn Asn Pro Leu

35 40 45

Val Asn Pro Ala Lys Lys Ala Asn Gly Ala Gly Glu Ser Thr Tyr His

50 55 60

His Leu Leu Asn Ala Ile Met Asp Ser Phe Glu Ser Glu Gly Asp Asn

65 70 75 80

Val Cys Glu Ile Ser Gly Leu Arg Phe Ser Lys Thr Phe Glu Asn Phe

85 90 95

Tyr Glu Glu Glu Ile Glu Arg Gln Lys Glu Leu Leu Ile Arg Asp Ile

100 105 110

Lys Asp Glu Lys Gln Leu Lys Lys Glu Ile Arg Asn Ile Glu Lys Thr

115 120 125

Asp Thr His Val Asn Arg Ser Trp Phe Pro Leu Ile Gly Gly Leu Gly

130 135 140

Ser Asp Ala Gln Ala Leu Pro Gln Ala Lys Phe Thr Val His Ile His

145 150 155 160

Pro Ile Cys Val Pro Ile Leu Gln Phe Leu Pro Leu Ser Ala Leu Leu

165 170 175

Tyr Lys Arg Gly Val Leu Leu Val Asp Ser Ala Asn Phe Glu Leu Ser

180 185 190

Arg Ala Met Val Ala Glu Asn Ala Arg Val Val Ala Glu Lys Ile Gln

195 200 205

Thr Ile Pro Thr Lys Glu Arg Val Glu Asn Val Arg Asn Phe Ser Arg

210 215 220

Gly Asp Tyr Met Ile Lys Val Leu Glu Val Leu Asn Arg Lys Glu Tyr

225 230 235 240

Phe Glu Glu Thr Tyr Ser Asp Leu Asn Met Trp Ser Phe Ser Asn Phe

245 250 255

Gly Asn Asp Ala Ser Cys Lys Ile Asp Arg Leu Pro Asn Ser Phe Ile

260 265 270

Arg Lys Leu Gln Arg Leu Tyr Lys Asn Ala Lys Ile Glu Arg Glu Leu

275 280 285

Arg Glu Ile Leu Ser Asn Asn Glu Ile Ala Phe Asn Phe Leu Glu Cys

290 295 300

Leu Glu Glu Asn Ser Asp Trp Ser Leu Leu Tyr Pro Gly Val Phe Gly

305 310 315 320

Ser Gly Lys Lys Lys Met Glu Tyr Glu Gly Val Ser Pro Glu Phe Leu

325 330 335

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340 345 350

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405 410 415

Lys Asn Asn Tyr Tyr Gln Leu His Lys Leu Ile His Phe Phe Thr Gln

420 425 430

Lys Lys Ile Tyr Ser Asn Val Leu Trp Lys Ile Asp Val Ser Lys Ala

435 440 445

Arg Val Tyr Lys Ala Cys Thr Trp Ile Ile Gly Leu Ile Gln Asn Asp

450 455 460

Ser Lys Ile Asn Thr Ile Lys Ser Asn Leu Ile Asn Pro Asn Glu Tyr

465 470 475 480

Thr Lys Val Gly Tyr Asp Arg Val Ile Phe Asp Ala Ile Asp Asn Phe

485 490 495

Glu Val Glu Ile Glu Asn Val Ile Glu Val Leu Tyr Asp Asn Ala Phe

500 505 510

Thr Phe Lys Lys Phe Gly Leu Asn Glu Leu Leu Arg Ile Phe Phe Ser

515 520 525

Gln Pro Gln Gln Glu Val Phe Ser Val Leu Pro Trp Glu Ser Arg Leu

530 535 540

Lys Glu Asp His Ser Phe Lys Lys Trp Leu Asp Arg Ile Arg Arg Phe

545 550 555 560

Ser Asp Asp Tyr Arg Asn Tyr Tyr Tyr Met Lys Tyr Gln Lys Ser Thr

565 570 575

Glu Asp Arg Ala Pro Tyr Asn Lys Phe Ile Lys Thr Val Ser Ser Ile

580 585 590

Val Lys Glu Asn Asp Gln Phe Tyr Ser Leu Leu Asn Glu Met Ile Tyr

595 600 605

Asn Thr Asn Gln Phe Ile Lys Glu Asn Glu Arg Ile Lys Ser Asp Lys

610 615 620

Trp Arg Val Glu Asp Leu Leu Thr Asn Pro Leu Gly Asn Asn Thr Trp

625 630 635 640

Asn Ile Cys Val Leu Ala Ile Lys Phe Leu Leu Arg Gln Ser Ala Val

645 650 655

Lys Pro Leu Thr Glu Lys Asp Ile Val Asn Lys Asn Gln Asn

660 665 670

Claims

1.提高植物对病毒抗性的方法，包括利用CRISPR-Cas3系统来提高植物对病毒的抗性，所述CRISPR-Cas3系统包括表达Cas蛋白和表达靶向病毒基因的crRNA的重组表达载体，所述Cas蛋白由Cas3蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas7蛋白和Cas8蛋白组成。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒为DNA病毒。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述DNA病毒为双链DNA病毒和/或单链DNA病毒。

4.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述crRNA的靶标序列如SEQ ID No.7所示。

5.如权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于，

所述Cas3蛋白选自下述任一种蛋白质：

A1)、氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的蛋白质；

所述Cas5蛋白选自下述任一种蛋白质：

B1)、氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的蛋白质；

所述Cas6蛋白选自下述任一种蛋白质：

C1)、氨基酸序列如SEQ ID No.10所示的蛋白质；

所述Cas7蛋白选自下述任一种蛋白质：

D1)、氨基酸序列如SEQ ID No.11所示的蛋白质；

所述Cas8蛋白选自下述任一种蛋白质：

E1)、氨基酸序列如SEQ ID No.12所示的蛋白质；

6.如权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体由表达所述Cas3蛋白的载体、表达所述Cas5蛋白的载体、表达所述Cas6蛋白的载体、表达所述Cas7蛋白的载体、表达所述Cas8蛋白的载体和表达所述crRNA的载体组成。

7.提高植物病毒抗性的CRISPR-Cas3系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas3系统为权利要求1-6中任一所述的方法中的所述CRISPR-Cas3系统。

8.与权利要求7所述的CRISPR-Cas3系统相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述N1)至N16)中的任一种：

N2)、含有N1)所述核酸分子的表达盒；

N3)、含有N1)所述核酸分子的重组载体；

N4)、含有N2)所述表达盒的重组载体；

N5)、含有N1)所述核酸分子的重组受体微生物；

N6)、含有N2)所述表达盒的重组受体微生物；

N7)、含有N3)所述重组载体的重组受体微生物；

N8)、含有N4)所述重组载体的重组受体微生物；

N9)、含有N1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

N10)、含有N2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

N11)、含有N3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

N12)、含有N4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

N13)、含有N1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

N14)、含有N2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

N15)、含有N3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

N16)、含有N4)所述重组载体的转基因动物细胞系。

9.如权利要求8所述的生物材料，其特征在于，编码权利要求1-6中任一所述的Cas蛋白的核酸分子为所述Cas3蛋白的编码基因、所述Cas5蛋白的编码基因、所述Cas6蛋白的编码基因、所述Cas7蛋白的编码基因和所述Cas8蛋白的编码基因；

所述Cas3蛋白的编码基因选自如下任一种：

a1)、编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；

所述Cas5蛋白的编码基因选自如下任一种：

b1)、编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

b2)、与b1)限定的DNA分子具有80％以上的同一性且编码具有Cas5功能的蛋白质的DNA分子；

所述Cas6蛋白的编码基因选自如下任一种：

c1)、编码序列是SEQ ID No.3第8-904位所示的DNA分子；

所述Cas7蛋白的编码基因选自如下任一种：

d1)、编码序列是SEQ ID No.4所示的DNA分子；

d2)、与d1)限定的DNA分子具有80％以上的同一性且编码具有Cas7功能的蛋白质的DNA分子；

所述Cas8蛋白的编码基因选自如下任一种：

e1)、编码序列是SEQ ID No.5所示的DNA分子；

10.权利要求7所述的CRISPR-Cas3系统，或权利要求8或9所述的生物材料在提高植物病毒抗性中的应用或在防治双生科病毒感染植物中的应用。