WO2018225858A1 - Ｄｎａが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット - Google Patents

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竹田　潤二
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    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing eukaryotic cells, animals, and plants whose DNA has been edited, and a kit used in the method.
  • Bacteria and archaea have an adaptive immune mechanism that specifically recognizes and eliminates organisms such as phages that are going to enter from outside.
  • This system called the CRISPR-Cas system, first imports genome information of foreign organisms into its own genome (adaptation). When the same foreign organism tries to enter again, the foreign genome is cleaved using the complementarity of the information incorporated into the self genome and the genome sequence (interference).
  • Non-patent Document 1 genome editing (DNA editing) technology has been developed using the above-mentioned CRISPR-Cas system as a “tool for DNA editing” (Non-patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 reports a class 2 CRISPR-Cas system that cleaves DNA using Cas9.
  • CRISPR-Cas3 system class 1 CRISPR-Cas system
  • Cas3 class 1 CRISPR-Cas system
  • Non-Patent Documents 2 and 3 simply using the CRISPR-Cas3 system, the target DNA was completely degraded in a cell-free system, and specific E. coli strains could be selectively removed.
  • these do not imply a success in genome editing and have not been demonstrated in eukaryotic cells.
  • Patent Document 1 since the CRISPR-Cas3 system degrades the target DNA in E.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to establish a CRISPR-Cas3 system in a eukaryotic cell.
  • the present inventors have finally succeeded in establishing the CRISPR-Cas3 system in eukaryotic cells.
  • the most widely used CRISPR-Cas9 system has succeeded in genome editing in various eukaryotic cells, but in this system, mature crRNA is usually used as crRNA.
  • mature crRNA is usually used as crRNA.
  • pre-crRNA pre-crRNA that is not used as a component of the system. For the first time, efficient genome editing was possible.
  • the cleavage of crRNA by a protein constituting the cascade is important for the function of the CRISPR-Cas3 system in eukaryotic cells.
  • the CRISPR-Cas3 system using this pre-crRNA could be widely applied not only to the type IE system but also to the type IF and type IG systems.
  • a nuclear translocation signal particularly a bipartite translocation signal
  • the present inventor has found that, according to the CRISPR-Cas3 system, unlike the CRISPR-Cas9 system, it can contain a PAM sequence or can cause a large deletion in the upstream region. It came to be completed.
  • the present invention relates to the CRISPR-Cas3 system in eukaryotic cells, and more specifically, provides the following inventions.
  • a method for producing a eukaryotic cell in which DNA is edited comprising introducing a CRISPR-Cas3 system into the eukaryotic cell, wherein the CRISPR-Cas3 system includes the following (A) to (C): Method.
  • A Cas3 protein, a polynucleotide encoding the protein, or an expression vector containing the polynucleotide
  • B a cascade protein, a polynucleotide encoding the protein, or an expression vector comprising the polynucleotide
  • C crRNA, a polynucleotide encoding the crRNA, or an expression vector comprising the polynucleotide
  • a method of producing an edited animal (except human) or plant comprising introducing a CRISPR-Cas3 system into an animal (except human) or plant, wherein the CRISPR-Cas3 system comprises the following (A ) To (C).
  • A Cas3 protein, a polynucleotide encoding the protein, or an expression vector containing the polynucleotide
  • B Cascade protein, polynucleotide encoding the protein, or expression vector containing the polynucleotide
  • C crRNA, polynucleotide encoding the crRNA, or expression vector containing the polynucleotide
  • A Cas3 protein, a polynucleotide encoding the protein, or an expression vector including the polynucleotide
  • B a cascade protein, a polynucleotide encoding the protein, or an expression vector including the polynucleotide [8] crRNA
  • polynucleotide means a polymer of nucleotides, and is used synonymously with the terms “gene”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule”.
  • a polynucleotide can exist in the form of DNA (eg, cDNA or genomic DNA) or in the form of RNA (eg, mRNA).
  • RNA eg, mRNA
  • protein is used interchangeably with “peptide” or “polypeptide”.
  • DNA can be edited in eukaryotic cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing a CCR5 gene (clone 4) from which a part of the base sequence is deleted by the CRISPR-Cas3 system.
  • (A) is a schematic diagram showing the structure of a cascade plasmid.
  • (B) is a schematic diagram showing the structure of the Cas3 plasmid.
  • (C) is a schematic diagram showing the structure of a pre-crRNA plasmid.
  • (D) is a schematic diagram showing the structure of a reporter vector (including a target sequence). It is the schematic showing the position of the target sequence in EMX1 gene. It is a figure showing EMX1 gene (clone 1) which deleted a part of base sequence by CRISPR-Cas3 system. It is a figure showing EMX1 gene (clone 2) which deleted other part of the base sequence by CRISPR-Cas3 system.
  • FIG. 6 is a diagram showing the effect of PAM sequences on the DNA cleavage activity of the CRISPR-Cas3 system.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of a single spacer mismatch on the DNA cleavage activity of the CRISPR-Cas3 system. It is a figure showing the effect of the mutation of Cas3 in HD nuclease domain (H74A), SF2 helicase domain motif 1 (K320A), and motif 3 (S483 / T485A).
  • H74A HD nuclease domain
  • K320A SF2 helicase domain motif 1
  • S483 / T485A motif 3
  • FIG. 2 is a diagram showing a comparison of DNA cleavage activity of type IE, type IF, and type IG CRISPR-Cas3 systems. It is a figure showing the magnitude
  • size of the deletion by CRISPR-Cas3 system detected by the sequence of the TA cloning sample of PCR product. It is a figure showing the position of the deletion by the CRISPR-Cas3 system detected by the mass processing sequence of TA clone (n 49). It is a figure showing the number detected for every deletion size by the CRISPR-Cas3 system using a microarray-based capture sequence of 1000 kb or more around the targeted EMX1 locus.
  • FIG. 4 is a diagram showing the number detected for each deletion size by the CRISPR-Cas3 system using a microarray-based capture sequence of 1000 kb or more around the targeted CCR5 locus.
  • the method of the present invention includes introducing a CRISPR-Cas3 system into a eukaryotic cell, and the CRISPR-Cas3 system comprises the following (A): (C).
  • C) crRNA, a polynucleotide encoding the crRNA, or an expression vector comprising the polynucleotide CRISPR- Cas systems are classified into type I and type III. Furthermore, type I is classified into type IA, type, depending on the type of protein constituting the cascade (hereinafter simply referred to as “cascade” or “cascade protein”).
  • Type IB Type IC, Type ID, Type IE, and Type IF, and Type IG, which is a subtype of Type IB (for example, [ van der Ost J et al. (2014) Unrav llling the structural and mechanical basis of CRISPR-Cas systems, Nature Reviews Microbiology, Vol. 12 (No. 7), pp. 479-492, [Jackson Rit. Tree, Current Opinion in Structural Biology, Vol. 24, pp. 106-114].
  • the type I CRISPR-Cas system has a function of cleaving DNA by the cooperation of Cas3 (protein having nuclease activity and helicase activity), cascade and crRNA. Since Cas3 is used as a nuclease, it is referred to as “CRISPR-Cas3 system” in the present invention.
  • crRNA used in the CRISPR-Cas3 system generally recognizes a target sequence of 32 to 37 bases (Ming Li et al., Nucleic Acids Res. 2017 May 5; 45 (8): 4642- 4654).
  • crRNA used in the CRISPR-Cas9 system generally recognizes target sequences of 18 to 24 bases. For this reason, it is considered that the CRISPR-Cas3 system can recognize the target sequence more accurately than the CRISPR-Cas9 system.
  • the PAM sequence of the CRISPR-Cas9 system which is a class 2 type II system
  • N is an arbitrary base
  • the PAM sequence of the CRISPR-Cpf1 system which is a class 2 type V system
  • AA adjacent to the 5 ′ side of the target sequence.
  • the PAM sequence of the CRISPR-Cas3 system of the present invention has an “AAG” adjacent to the 5 ′ side of the target sequence or a similar base sequence (for example, “AGG”, “GAG”, “TAC”, "ATG”, “TAG”, etc.) (FIG. 12). Therefore, using the CRISPR-Cas3 system of the present invention, it is considered that regions that could not be recognized by the conventional method can be targeted for DNA editing.
  • the CRISPR-Cas3 system causes DNA breaks at multiple locations. For this reason, when the CRISPR-Cas3 system of the present invention is used, a wide range of deletion mutations of 100 to several thousand bases and possibly more can be generated (FIGS. 3, 6, 16 to 18). This function can be used to knock out a long genomic region or to knock in a long DNA. When knocking in, donor DNA is usually used, and the donor DNA is also a molecule constituting the CRISPR-Cas3 system of the present invention.
  • the CRISPR-Cas3 system of the present invention includes all six subtypes of type I. That is, the proteins constituting the CRISPR-Cas3 system may differ slightly depending on the subtype (for example, the proteins constituting the cascade are different), but the present invention encompasses all of these proteins. . In fact, in this example, it was found that genome editing is possible not only in type IE but also in type 1-G and type IF systems (FIG. 15).
  • a type IE CRISPR-Cas3 system which is common among type I CRISPR-Cas3 systems, has crRNA cooperating with Cas3 and cascades (Cse1 (Cas8), Cse2 (Cas11), Cas5, Cas6, and Cas7). To cleave the DNA.
  • Cas8a1, Csa5 (Cas11), Cas5, Cas6, and Cas7 are constituent elements as cascades
  • Cas8b1, Cas5, Cas6, and Cas7 are constituent elements as cascades
  • Cas8c, Cas5, and Cas7 are constituent elements as cascades.
  • Cas10d, Csc1 (Cas5), Cas6, and Csc2 (Cas7) are constituent elements in cascade, and in Type IF , Csy1 (Cas8f), Csy2 (Cas5), Cas6, and Csy3 (Cas7) as components, and in a type IG system, Cst1 (Cas8a1), Cas5, Cas6, and Cst2 a (Cas7) as a constituent element.
  • Cas3 and the cascade are collectively referred to as “Cas protein group”.
  • the Cas protein group is introduced into a eukaryotic cell in the form of a protein, in the form of a polynucleotide encoding the protein, or in the form of an expression vector containing the polynucleotide.
  • the Cas protein group is introduced into a eukaryotic cell in the form of a protein, the amount of each protein and the like can be appropriately adjusted, which is excellent in terms of handling. Further, in consideration of intracellular cleavage efficiency and the like, a Cas protein group complex can be first formed and then introduced into a eukaryotic cell.
  • a nuclear translocation signal to the Cas protein group.
  • the nuclear localization signal can be added to the N-terminal side and / or the C-terminal side of the Cas protein group (the 5′-terminal side and / or the 3′-terminal side of the polynucleotide encoding each Cas protein group).
  • the above-mentioned nuclear translocation signal is a peptide sequence composed of several to several tens of basic amino acids, and the sequence is not particularly limited as long as the protein is translocated into the nucleus.
  • a specific example of such a nuclear translocation signal is, for example, [Wu J et al. (2009) The Intracellular Mobility of Nuclear Import Receptors and NLS Cargoes, Biophysical journal, Vol. 96 (Issue 9), pp. 3840-3849], and any nuclear translocation signal commonly used in the art can be used in the present invention.
  • the nuclear translocation signal can be, for example, PKKKRKV (SEQ ID NO: 52) (encoded by the base sequence CCCAAGAAGAAGCGGAAGGTG (SEQ ID NO: 53)).
  • PKKKRKV SEQ ID NO: 52
  • CCCAAGAAGAAGCGGAAGGTG SEQ ID NO: 53
  • the nuclear translocation signal can be, for example, KRTADGSEFEPKKKKRKVE (SEQ ID NO: 54) (base sequence AAGCGGAACTGCTGGATGGCAGGTGAATTTGAGTCCCCCAAAAGAGAAGAGAAAGGTGGAA (SEQ ID NO: 55)).
  • SEQ ID NO: 54 base sequence AAGCGGAACTGCTGGATGGCAGGTGAATTTGAGTCCCCCAAAAGAGAAGAGAAAGGTGGAA (SEQ ID NO: 55)
  • placing a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 55 at both ends of each polynucleotide encoding the Cas protein group ie, “bipartite nuclear translocation signal (bpNLS)”.
  • Such modification is important for efficient expression and function of the CRISPR-Cas3 system of the present invention in eukaryotic cells in combination with the use of pre-crRNA described later.
  • Cas protein group used in the present invention is as follows. Cas3; protein Cse1 (Cas8) encoded by a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 7; protein Cse2 encoded by a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 8 (Cas11); protein Cas5 encoded by a polynucleotide consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 9; protein Cas6 encoded by a polynucleotide consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10; Protein Cas7 encoded by a polynucleotide consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 11; Protein encoded by a polynucleotide consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 12
  • each protein of the Cas protein group used in the present invention is a protein encoded by a base sequence having 90% or more sequence identity with the base sequence of the Cas protein group.
  • Another embodiment of each protein of the Cas protein group used in the present invention is encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of the Cas protein group.
  • Each of the above proteins has a DNA-cleaving activity when formed into a complex with other proteins constituting the Cas protein group. The meaning of terms such as “sequence identity” and “stringent conditions” will be described later.
  • the polynucleotide encoding the wild-type protein constituting the type IE CRISPR-Cas system includes a polynucleotide modified so as to be efficiently expressed in a eukaryotic cell. That is, a modified polynucleotide encoding the Cas protein group can be used.
  • One preferred embodiment of the modification of the polynucleotide is a modification to a base sequence suitable for expression in eukaryotic cells, for example, optimization of codons to express in eukaryotic cells.
  • polynucleotide encoding the Cas protein group used in the present invention is as follows.
  • Polynucleotide Cas5 consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10; polynucleotide Cas6 consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 11; 6 or a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12
  • the artificial modification of the above polynucleotide is to modify the nucleotide sequence suitable for expression in a eukaryotic cell and to add a nuclear translocation signal.
  • the modification of the base sequence and the addition of the nuclear translocation signal are as described above. Thereby, a sufficient increase in the expression level of the Cas protein group and an increase in function can be expected.
  • Another embodiment of the polynucleotide encoding the Cas protein group used in the present invention is a wild-type Cas protein group consisting of a base sequence having 90% or more sequence identity with the base sequence of the Cas protein group.
  • a protein expressed from each of these polynucleotides has a DNA-cleaving activity when formed into a complex with a protein expressed from another polynucleotide constituting the Cas protein group.
  • the sequence identity of the base sequence is at least 90% or more, more preferably 95% or more (for example, 95%, 96%, etc.) in the entire base sequence (or a region encoding a portion necessary for the function of Cse3). 97%, 98%, 99% or more).
  • the identity of the base sequence can be determined using a program such as BLASTN ([Altschul SF (1990) Basic local alignment search tool, Journal of Molecular Biology, Vol. 215, Issue 403, Issue 3). -410]).
  • “having DNA cleavage activity” means that the polynucleotide chain can be cleaved at at least one location.
  • the CRISPR-Cas3 system of the present invention preferably cleaves DNA by specifically recognizing a target sequence. Whether or not the CRISPR-Cas3 system specifically recognizes the target sequence can be determined, for example, by the dual-Luciferase assay described in Example A-1.
  • polynucleotide encoding the Cas protein group used in the present invention is a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of the Cas protein group. is there.
  • a protein expressed from each of these polynucleotides has a DNA-cleaving activity when formed into a complex with a protein expressed from another polynucleotide constituting the Cas protein group.
  • the “stringent condition” is a condition in which two polynucleotide strands form a double-stranded polynucleotide specific to a base sequence, but do not form a non-specific double-stranded polynucleotide.
  • “hybridizes under stringent conditions” means that the temperature is 15 ° C. lower, preferably 10 ° C. lower than the melting temperature (Tm value) of nucleic acids having high sequence identity (for example, perfectly matched hybrids). It can also be said that the conditions allow hybridization in a temperature range, more preferably in a temperature range up to 5 ° C.
  • An example of stringent conditions is as follows. First, in a buffer solution (pH 7.2) composed of 0.25M Na 2 HPO 4 , 7% SDS, 1 mM EDTA, 1 ⁇ Denhardt solution at 60 to 68 ° C. (preferably 65 ° C., more preferably 68 ° C.). , Hybridize the two polynucleotides for 16-24 hours. Thereafter, washing is performed for 2 minutes at 60 to 68 ° C. (preferably 65 ° C., more preferably 68 ° C.) in a buffer solution (pH 7.2) comprising 20 mM Na 2 HPO 4 , 1% SDS and 1 mM EDTA. Do it once.
  • Normal conditions Washed at about 37 ° C. using 1 ⁇ SSC and 0.1% SDS as a washing solution. Severe conditions; Wash at about 42 ° C. as 5 ⁇ SSC and 0.1% SDS washing solution. More severe conditions: Wash at about 65 ° C. using 0.2 ⁇ SSC and 0.1% SDS as a washing solution.
  • the more severe the washing conditions for hybridization the more specific hybridization is achieved.
  • the combination of the above SSC, SDS and temperature conditions is merely an example. It is possible to achieve the same stringency as described above by appropriately combining the above-mentioned factors that determine the stringency of hybridization, or other factors (for example, probe concentration, probe length, hybridization reaction time, etc.). it can. For example, [Joseph Sambrook & David W. Russell, Molecular cloning: a laboratory manual 3rd Ed. , New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001].
  • an expression vector for expressing the Cas protein group can be used.
  • the substrate vector various commonly used vectors can be used as the substrate vector, and can be appropriately selected depending on the cell to be introduced or the introduction method. Specifically, plasmids, phages, cosmids and the like can be used.
  • the specific type of vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in a host cell may be appropriately selected.
  • Examples of the expression vectors described above include phage vectors, plasmid vectors, viral vectors, retroviral vectors, chromosomal vectors, episomal vectors and viral vectors (bacterial plasmids, bacteriophages, yeast episomes, etc.), yeast chromosomal elements and viruses (baculo And vectors derived from viruses, papovaviruses, vaccinia viruses, adenoviruses, tripox viruses, pseudorabies viruses, herpes viruses, lentiviruses, retroviruses, and the like, and combinations thereof (cosmids, phagemids, etc.).
  • the expression vector further includes sites for transcription initiation and transcription termination, and a ribosome binding site in the transcription region.
  • the coding portion of the mature transcript in the vector will contain a transcription start codon AUG at the beginning of the polypeptide to be translated and a stop codon appropriately located at the end.
  • the expression vector for expressing the Cas protein group may include a promoter sequence.
  • the promoter sequence may be appropriately selected according to the type of eukaryotic cell serving as a host.
  • the expression vector may contain a sequence for enhancing transcription from DNA, for example, an enhancer sequence.
  • Enhancers include, for example, the SV40 enhancer (which is located 100-270 bp downstream of the origin of replication), the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer and adenovirus enhancer located downstream of the origin of replication. Can be mentioned.
  • the expression vector may contain a sequence for stabilizing the transcribed RNA, for example, a poly A addition sequence (polyadenylation sequence, polyA).
  • poly A addition sequences examples include growth hormone gene-derived poly A addition sequences, bovine growth hormone gene-derived poly A addition sequences, human growth hormone gene-derived poly A addition sequences, SV40 virus-derived poly A addition sequences, human or An example is a poly A addition sequence derived from a rabbit ⁇ -globin gene.
  • the number of polynucleotides encoding the Cas protein group incorporated in the same vector is not particularly limited as long as the function of the CRISPR-Cas system can be exhibited in the host cell into which the expression vector has been introduced.
  • a design in which a polynucleotide encoding a cascade protein is mounted on one (identical) vector and a polynucleotide encoding Cas3 is mounted on another vector is possible.
  • a method of mounting polynucleotides encoding each Cas protein group on six different types of vectors is used.
  • a plurality of polynucleotides encoding the same protein may be mounted in the same vector for the purpose of adjusting the expression level.
  • the cell includes a plurality of base sequences encoding Cas protein group, and a base sequence encoding an amino acid sequence (such as 2A peptide) cleaved by intracellular protease is inserted between the plurality of base sequences.
  • Expression vectors may be used (see, for example, the vector structure of FIG. 8).
  • a polynucleotide having such a base sequence is transcribed and translated, a polypeptide chain linked together in the cell is expressed. Thereafter, the Cas protein group is separated by the action of intracellular protease, and after forming individual proteins, forms a complex and functions. Thereby, the quantity ratio of Cas protein group expressed in a cell can be adjusted.
  • Cas3 and Cse1 (Cas8) will be expressed in equal amounts from “an expression vector containing one base sequence encoding Cas3 and one base sequence encoding Cse1 (Cas8)”.
  • an expression vector containing one base sequence encoding Cas3 and one base sequence encoding Cse1 (Cas8)”.
  • a plurality of Cas protein groups can be expressed with one type of expression vector, it is advantageous in terms of excellent handling properties.
  • the embodiment in which the Cas protein group is usually expressed by different expression vectors is superior.
  • the expression vector used in the present invention can be prepared by a known technique. Examples of such methods include the methods described in various manuals in addition to the methods described in the implementation manual attached to the kit for preparing the vector. For example, [Joseph Sambrook & David W. Russell, Molecular cloning: a laboratory manual 3rd Ed. , New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001] is a comprehensive guide.
  • the CRISPR-Cas3 system of the present invention includes crRNA, a polynucleotide encoding crRNA, or an expression vector containing the polynucleotide for targeting to DNA for genome editing.
  • CrRNA is RNA that forms part of the CRISPR-Cas system and has a base sequence complementary to the target sequence.
  • the CRISPR-Cas3 system of the present invention makes it possible to specifically recognize a target sequence by cRNA and cleave the sequence.
  • mature crRNA has usually been used as cRNA so far.
  • pre-crRNA instead of mature crRNA. This fact is clear from a comparison experiment between mature crRNA and pre-crRNA (FIG. 10). Therefore, it is particularly preferable to use pre-crRNA as the crRNA of the present invention.
  • the pre-crRNA used in the present invention typically has a structure of “leader sequence-repeat sequence-spacer sequence-repeat sequence (LRSR structure)” or “repeat sequence-spacer sequence-repeat sequence (RSR structure)”.
  • the leader sequence is an AT-rich sequence and functions as a promoter for expressing pre-crRNA.
  • the repeat sequence is a sequence that repeats via a spacer sequence, and the spacer sequence is a sequence designed in the present invention as a sequence complementary to the target DNA (originally, a foreign sequence incorporated in the adaptation process). DNA-derived sequence).
  • a pre-crRNA becomes a mature crRNA when cleaved by a protein constituting a cascade (for example, Cas6 for type IA, B, and D, and Cas5 for type IC).
  • the leader sequence has a chain length of 86 bases
  • the repeat sequence has a chain length of 29 bases.
  • the chain length of the spacer sequence is, for example, 10 to 60 bases, preferably 20 to 50 bases, more preferably 25 to 40 bases, and typically 32 to 37 bases. Therefore, the length of the pre-crRNA used in the present invention is, for example, 154 to 204 bases, preferably 164 to 194 bases, more preferably 169 to 184 bases, typically 176 to 181 bases in the case of the LRSR structure. It is. In the case of the RSR structure, for example, it is 68 to 118 bases, preferably 78 to 108 bases, more preferably 83 to 98 bases, and typically 90 to 95 bases.
  • a preferred embodiment of the method of the present invention thus includes a step in which crRNA is cleaved by a protein constituting a cascade after introducing the CRISPR-Cas3 system into a eukaryotic cell.
  • the mature crRNA produced by cleaving the pre-crRNA has a structure of “5 ′ handle sequence-spacer sequence-3 ′ handle sequence”.
  • the 5 'handle sequence is composed of 8 bases at positions 22 to 29 of the repeat sequence and is held in Cas5.
  • the 3 'handle sequence is composed of 21 bases from the 1st to 21st positions of the repeat sequence, and forms a stem loop structure at the 6th to 21st bases and is held in Cas6. Therefore, the length of mature crRNA is usually 61 to 66 bases.
  • some mature crRNAs do not have a 3 'handle sequence, so in this case, the chain length is shortened by 21 bases.
  • RNA sequence may be appropriately designed according to the target sequence for which DNA editing is desired.
  • RNA synthesis can be performed using any method known in the art.
  • eukaryotic cells examples include animal cells, plant cells, algal cells, and fungal cells.
  • animal cells include cells of fish, birds, reptiles, amphibians and insects in addition to mammalian cells.
  • Animal cells include, for example, cells constituting individual animals, cells constituting organs / tissues extracted from animals, cultured cells derived from animal tissues, and the like. Specifically, for example, germ cells such as oocytes and sperm; embryonic cells of each stage embryo (eg, 1-cell stage embryo, 2-cell stage embryo, 4-cell stage embryo, 8-cell stage embryo, 16-cell stage) Embryos, morulas, etc.); stem cells such as induced pluripotent stem (iPS) cells and embryonic stem (ES) cells; fibroblasts, hematopoietic cells, neurons, muscle cells, bone cells, hepatocytes, pancreatic cells And somatic cells such as brain cells and kidney cells.
  • germ cells such as oocytes and sperm
  • embryonic cells of each stage embryo eg, 1-cell stage embryo, 2-cell stage embryo, 4-cell stage embryo, 8-cell stage embryo, 16-cell stage
  • Embryos eg. 1-cell stage embryo, 2-cell stage embryo, 4-cell stage embryo
  • an oocyte used for producing a genome-edited animal an oocyte before and after fertilization can be used, and an oocyte after fertilization, that is, a fertilized egg is preferable.
  • the fertilized egg is that of a pronuclear stage embryo.
  • the oocyte can be used after thawing a cryopreserved one.
  • mammal is a concept encompassing human and non-human mammals.
  • non-human mammals include cattle, wild boar, pigs, sheep, goats and other cloven-hoofed animals, horses and other odd-hoofed animals, mice, rats, guinea pigs, hamsters, squirrels and other rodents, and rabbits such as rabbits And meat such as dogs, cats and ferrets.
  • the non-human mammal described above may be a domestic animal, a companion animal (come animal), or a wild animal.
  • plant cells include cells of cereals, oil crops, feed crops, fruits and vegetables.
  • the “plant cell” includes, for example, a cell constituting an individual plant, a cell constituting an organ or tissue separated from a plant, a cultured cell derived from a plant tissue, and the like.
  • plant organs and tissues include leaves, stems, shoot tips (growth points), roots, tubers, and calluses.
  • plants include rice, corn, banana, peanut, sunflower, tomato, rape, tobacco, wheat, barley, potato, soybean, cotton, carnation, etc., and their propagation materials (eg seeds, tuberous roots, tubers, etc.) ) Is also included.
  • editing eukaryotic DNA may be a step of editing eukaryotic DNA in vivo or a step of performing in vitro.
  • editing DNA intends operations (including combinations thereof) exemplified in the following types.
  • the DNA used in the above context includes not only DNA existing in the cell nucleus but also DNA existing outside the cell nucleus such as mitochondrial DNA, and exogenous DNA.
  • 1. Cleave the DNA strand at the target site. 2. The base of the DNA strand at the target site is deleted. 3. A base is inserted into the DNA strand at the target site. 4). Replace the base of the DNA strand at the target site. 5). Modify the base of the DNA strand at the target site. 6). Regulates transcription of DNA (gene) at the target site.
  • a protein having an enzyme activity that modifies target DNA is used by a method other than introducing DNA cleavage.
  • This aspect can be achieved, for example, by fusing Cas3 or a cascade with a heterologous protein having a desired enzyme activity to form a chimeric protein.
  • “Cas3” and “cascade” in the present invention include such fusion proteins.
  • Examples of the enzyme activity of the protein to be fused include deaminase activity (eg, cytidine deaminase activity, adenosine deaminase activity), methyltransferase activity, demethylase activity, DNA repair activity, DNA damage activity, dismutase activity, alkylation activity, Examples include, but are not limited to, depurination activity, oxidation activity, pyrimidine dimer formation activity, integrase activity, transposase activity, recombinase activity, polymerase activity, ligase activity, light recovery enzyme activity, and glycosylase activity.
  • Cas3 is a mutant in which a part or all of these activities are deleted (for example, a mutant of D domain H74A (dnCas3)), A mutant of K320N of SF2 domain motif 1 (dhCas3) and a double mutant of S483A / T485A of SF2 domain motif 3 (dh2Cas3)) can be used.
  • dnCas3 D domain H74A
  • dhCas3 A mutant of K320N of SF2 domain motif 1
  • dh2Cas3 double mutant of S483A / T485A of SF2 domain motif 3
  • gene transcription at the binding site of the system is regulated without DNA cleavage.
  • This aspect can be achieved, for example, by fusing Cas3 or a cascade with a desired transcription regulatory protein to form a chimeric protein.
  • Cas3 and cascade in the present invention include such fusion proteins.
  • the transcription regulatory protein include, but are not limited to, a light-induced transcription control factor, a small molecule / drug-responsive transcription control factor, a transcription factor, and a transcription repression factor.
  • Cas3 is a mutant in which a part or all of these activities are deleted (for example, a mutant of D domain H74A (dnCas3)), A mutant of K320N of SF2 domain motif 1 (dhCas3) and a double mutant of S483A / T485A of SF2 domain motif 3 (dh2Cas3)) can be used.
  • Techniques for applying transcriptional regulatory proteins to the CRISPR-Cas system are known to those skilled in the art.
  • a protein having another nuclease activity may be fused with Cas3 or the cascade. Good. Such an embodiment is also included in the present invention.
  • DNA editing may be performed on DNA contained in specific cells within an individual. Such DNA editing can be performed, for example, by targeting a specific cell among cells constituting an individual of an animal or plant.
  • the method for introducing a molecule constituting the CRISPR-Cas3 system of the present invention into a eukaryotic cell in the form of a polynucleotide or an expression vector containing the polynucleotide is not particularly limited.
  • electroporation method calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method, microinjection method, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection using virus vector, and the like.
  • electroporation method calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method, microinjection method, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection using virus vector, and the like.
  • Such a method is described in many standard laboratory manuals such as “Leonard G. Daviset al., Basic methods in molecular biology, New York: Elsevier, 1986”.
  • the method for introducing the CRISPR-Cas3 system of the present invention into a eukaryotic cell in the form of a protein is not particularly limited.
  • electroporation, cationic lipid-mediated transfection, microinjection and the like can be mentioned.
  • the DNA editing according to the present invention can be applied to various fields. Applications include, for example, gene therapy, breed improvement, production of transgenic animals or cells, production of useful substances, life science research and the like.
  • a method for producing a non-human individual from cells a known method can be used.
  • non-human individuals are produced from cells in animals, germ cells or pluripotent stem cells are usually used.
  • a molecule constituting the CRISPR-Cas3 system of the present invention is introduced into an oocyte, and the resulting oocyte is then transplanted into the uterus of a female non-human mammal that has been put into a pseudopregnant state, after which the litter is obtain.
  • Transplantation can be performed in fertilized eggs of 1-cell stage embryo, 2-cell stage embryo, 4-cell stage embryo, 8-cell stage embryo, 16-cell stage embryo, or morula stage embryo.
  • Oocytes can be cultured under appropriate conditions until transplanted, if necessary.
  • Oocyte transplantation and culture can be performed based on conventionally known methods (Nagy A. et al., Manipulating the Mouse Embry. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor 3). From the obtained non-human individual, offspring and clones in which the desired DNA is edited can also be obtained.
  • somatic cells have totipotency, and methods for regenerating plant bodies from plant cells have been established in various plants. Therefore, for example, by introducing a molecule constituting the CRISPR-Cas3 system of the present invention into a plant cell and regenerating the plant body from the obtained plant cell, a plant body in which a desired DNA is knocked in can be obtained. . From the obtained plant body, a progeny, a clone, or a propagation material in which a desired DNA is edited can be obtained.
  • Kit used for CRISPR-Cas3 system includes the following (A) and (B).
  • A Cas3 protein, a polynucleotide encoding the protein, or an expression vector containing the polynucleotide
  • B a cascade protein, a polynucleotide encoding the protein, or an expression vector containing the polynucleotide.
  • CrRNA A polynucleotide encoding the crRNA or an expression vector containing the polynucleotide may be included.
  • the components of the kit of the present invention may be in a mode in which all or part of them are mixed, or in a mode in which each is independent.
  • the kit of the present invention can be used, for example, in fields such as pharmaceuticals, food, livestock, fisheries, industry, biotechnology, and life science research.
  • kit of the present invention will be described assuming a drug (drug).
  • drug drug
  • it can implement by replacing suitably the following description based on the technical common sense of the said field
  • a pharmaceutical for editing DNA of animal cells including humans using the CRISPR-Cas3 system of the present invention can be prepared by a conventional method. More specifically, the molecule constituting the CRISPR-Cas3 system of the present invention can be prepared by, for example, blending with a pharmaceutical additive.
  • pharmaceutical additives means substances other than active ingredients contained in pharmaceuticals.
  • a pharmaceutical additive is a substance contained in a pharmaceutical for the purpose of facilitating formulation, stabilizing quality, enhancing usefulness, and the like.
  • the pharmaceutical additive includes an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant, a fluidizing agent (a solid preventing agent), a colorant, a capsule film, a coating agent, a plasticizer, a corrigent, a sweetener, Flavoring agent, solvent, solubilizer, emulsifier, suspending agent (adhesive), thickener, pH adjuster (acidifying agent, alkalizing agent, buffering agent), wetting agent (solubilizing agent), antibacterial And preservatives, chelating agents, suppository bases, ointment bases, hardeners, softeners, medical water, propellants, stabilizers, preservatives.
  • These pharmaceutical additives can be readily selected by those skilled in the art
  • the pharmaceutical product for editing the DNA of animal cells using the CRISPR-Cas3 system of the present invention may further contain an active ingredient.
  • the additional active ingredient is not particularly limited and can be appropriately designed by those skilled in the art.
  • active ingredients and pharmaceutical additives described above can be found, for example, according to standards established by the US Food and Drug Administration (FDA), the European Medicines Agency (EMA), the Japanese Ministry of Health, Labor and Welfare.
  • FDA US Food and Drug Administration
  • EMA European Medicines Agency
  • Examples of a method for delivering a pharmaceutical product to a desired cell include, for example, a virus vector (such as an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a lentivirus vector, or a Sendai virus vector) that targets the cell, and specifically recognizes the cell.
  • a virus vector such as an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a lentivirus vector, or a Sendai virus vector
  • the medicine can take any dosage form depending on the purpose.
  • the said pharmaceutical is prescribed suitably by a doctor or a medical worker.
  • the kit of the present invention preferably further comprises instructions for use.
  • the target sequence was a human CCR5 gene-derived sequence (SEQ ID NO: 19) and a CRISPR spacer sequence (SEQ ID NO: 22) of Escherichia coli.
  • a polynucleotide (SEQ ID NO: 21) was prepared.
  • a synthetic polynucleotide (SEQ ID NO: 23) comprising a target sequence (SEQ ID NO: 22) derived from the CRISPR spacer sequence of E. coli, and a synthetic polynucleotide (SEQ ID NO: 22) comprising a sequence complementary to the target sequence (SEQ ID NO: 22) Number 24) was prepared. All the above synthetic polynucleotides were obtained from Hokkaido System Science Co., Ltd.
  • the above-mentioned polynucleotide is [Sakuma T et al. (2013) Efficient TALEN construction and evaluation methods for human cell and animal applications, Genes to Cells, Vol. 18 (Issue 4), pp. 315-326] and inserted into a reporter vector.
  • the outline is as follows. First, polynucleotides having sequences complementary to each other (the polynucleotide of SEQ ID NO: 20 and the polynucleotide of SEQ ID NO: 21; the polynucleotide of SEQ ID NO: 23 and the polynucleotide of SEQ ID NO: 24) were heated at 95 ° C for 5 minutes. Thereafter, the mixture was cooled to room temperature and hybridized. A block incubator (BI-515A, Astech) was used for the above steps. Next, the polynucleotide that had been hybridized to form a double-stranded structure was inserted into a substrate vector to obtain a reporter vector.
  • the sequences of the prepared reporter vectors are shown in SEQ ID NO: 31 (reporter vector containing a target sequence derived from human CCR5 gene) and SEQ ID NO: 32 (reporter vector containing a target sequence derived from the CRISPR spacer sequence of E. coli).
  • the structure of the reporter vector is shown in FIG.
  • Cse1 (Cas8), Cse2 (Cas11), Cas5, Cas6, Cas7 and crRNA expression vectors [Insert amplification and preparation] Polynucleotides having modified base sequences encoding Cse1 (Cas8), Cse2 (Cas11), Cas5, Cas6 and Cas7 (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively) ), First, a polynucleotide (Cse1 (Cas8) -Cse2 (Cas11) -Cas7-Cas5-Cas6) linked in the order of SEQ ID NO: 2-SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 6-SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 5 , Polynucleotides in which the base sequences encoding each of them were linked) were outsourced to Genscript and obtained.
  • the base sequence encoding the 2A peptide was slightly different depending on each Cas protein linking part and was as follows. Sequence between Cse1 (Cas8) and Cse2 (Cas11): GGAAGCGGAGCAACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGGATGGGAGGAGAATCCAGGCCCCC (SEQ ID NO: 59). Sequence between Cse2 (Cas11) and Cas7: GGCTCCGGGCGCCACCAATTTTTCTCTGCTGAAGCAGGCAGGCGATGTGGAGGAGAACCCAGGACCT (SEQ ID NO: 60).
  • Sequence between Cas7 and Cas5 GGATCTGAGCCCCAATTTTCACGCTTGCTGAAGCAAGCAGGCGACCGTGGAAGAAAAACCCGAGACCA (SEQ ID NO: 61). Sequence between Cas5 and Cas6: GGATCTGGGGCTACTAATTTTTCTCTGCTGAAGCAAGCCGGCGAGCGTGGAAGGAATCCAGGACCG (SEQ ID NO: 62).
  • each polynucleotide was amplified under the PCR conditions (primers and time course) shown in the following table.
  • 2720 Thermal cycler applied biosystems
  • a polynucleotide having the following complementary sequence was obtained as a polynucleotide having a base sequence for expressing crRNA.
  • Polynucleotide for expressing crRNA corresponding to the sequence derived from human CCR5 gene (SEQ ID NOs: 25 and 26, obtained from Hokkaido System Science) 2.
  • Polynucleotide for expressing crRNA corresponding to CRISPR spacer sequence of E. coli (SEQ ID NOs: 27 and 28, obtained from Hokkaido System Science) 3.
  • a polynucleotide for expressing crRNA corresponding to a sequence derived from the human EMX1 gene SEQ ID NOs: 29 and 30, obtained from Fasmac).
  • PPB-CAG-EBNXN (provided by Sanger Center) was used as a substrate plasmid.
  • NEB buffer 1.6 ⁇ g of the base plasmid, 1 ⁇ l of restriction enzyme BglII (New England Biolabs) and 0.5 ⁇ l of XhoI (New England Biolabs) were mixed and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
  • the cleaved substrate plasmid was purified with a Gel extraction kit (Qiagen).
  • the base material plasmid thus prepared and the above insert were ligated using a Gibson Assembly system. Ligation was performed according to the protocol of Gibson Assembly system so that the ratio of the base plasmid to the insert was 1: 1 (total volume of reaction solution: 8 ⁇ L at 50 ° C. for 25 minutes).
  • transformation was performed by a usual method using 6 ⁇ L of the plasmid solution (ligation reaction solution) obtained above and a competent cell (manufactured by Takeda Laboratory).
  • the plasmid vector was purified from the transformed E. coli by the alkali prep method. Briefly, the plasmid vector was recovered using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), and the recovered plasmid vector was purified by ethanol precipitation and prepared to a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ L in TE buffer. .
  • each plasmid vector is shown in (a) to (c) of FIG.
  • the base sequence of the expression vector for pre-crRNA is expressed by SEQ ID NO: 33 (expression vector for expressing crRNA corresponding to the sequence derived from human CCR5 gene) and SEQ ID NO: 34 (crRNA corresponding to the spacer sequence of CRISPR of E. coli) Expression vector) and SEQ ID NO: 35 (expression vector for expressing crRNA corresponding to a sequence derived from human EMX1 gene).
  • the above vector was cleaved with the restriction enzyme NotI.
  • 2 U of Klenow Fragment (Takara Bio Inc.) and 1 ⁇ L of 2.5 mM dNTP Mixture (Takara Bio Inc.) were used to smooth the fragments.
  • the above fragment was purified using Gel extraction (Qiagen).
  • the purified fragment was further cleaved with a restriction enzyme XhoI, and purified using Gel extraction (Qiagen).
  • the purified fragment was ligated using a substrate plasmid (pTL2-CAG-IRES-NEO vector, produced by Takeda Lab) and a ligation kit (Mighty Mix, Takara Bio Inc.). Ligated. Then, transformation and purification were performed by the same operation as [2].
  • the recovered plasmid vector was prepared to a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ L in TE buffer.
  • disconnection location by BgIII sequence which provided the cutting
  • the pMK vector incorporating the above sequence was cleaved with restriction enzymes BgIII and XhoI, and purified using Gel extraction (Qiagen).
  • the purified fragment was ligated using a substrate plasmid (pPB-CAG-EBNXN, provided by Sanger Center) and a ligation kit (Mighty Mix, Takara Bio Inc.). Then, transformation and purification were performed by the same operation as [2].
  • the recovered plasmid vector was prepared to a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ L in TE buffer.
  • NLS-Cse1 (Cas8): SEQ ID NO: 2) -2A- (NLS-Cse2 (Cas11): SEQ ID NO: 3) -2A- (NLS-Cas7: SEQ ID NO: 6) -2A- (NLS An expression vector arranged in the order of -Cas5: SEQ ID NO: 4) -2A- (NLS-Cas6: SEQ ID NO: 5) was prepared (see FIG. 8).
  • the amino acid sequence of NLS is PKKKRKV (SEQ ID NO: 52), and the base sequence is CCCAAGAAGAAGCGGAAGGTG (SEQ ID NO: 53).
  • the amino acid sequence of the 2A peptide is GSGATNFSLLKQAGDVEENGPP (SEQ ID NO: 58) (corresponding base sequences are SEQ ID NOs: 59 to 62, respectively).
  • a polypeptide having the above base sequence was obtained from GenScript.
  • PUC57 vector incorporating the above sequence was cleaved with restriction enzyme EcoRI-HF and purified using Gel extraction (Qiagen).
  • the purified fragment was ligated using a substrate plasmid (pTL2-CAG-IRES-Puro vector, produced by Takeda Laboratory) and a ligation kit (Mighty Mix, Takara Bio Inc.). Then, transformation and purification were performed by the same operation as [2].
  • the recovered plasmid vector was prepared to a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ L in TE buffer.
  • Example A-1 Cas3, Cse1 (Cas8), Cse2 (Cas11), Cas5, Cas6 and Cas7 and crRNA modified with the base sequence and added with nuclear translocation signal are expressed in HEK (human embroidic kidney) 293T cells, and the exogenous DNA The cleavage activity of the target sequence was evaluated.
  • HEK293T cells Prior to transfection, HEK293T cells were cultured in 10 cm dishes. HEK293T cells were cultured in EF medium (GIBCO) at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere. Density of HEK293T cells in EF medium was prepared in 3 ⁇ 10 4 / 100 ⁇ L.
  • the conditions using a reporter vector having a CCR5-derived target sequence as the reporter vector correspond to 1 in FIG. 1, and the conditions using a reporter vector having a CRISPR spacer sequence of E. coli correspond to 10 in FIG.
  • Lipofectamine 2000 1.5 ⁇ L and OptiMEM (Thermo Fisher Scientific) 25 ⁇ L were mixed and incubated at room temperature for 5 minutes. Then, said plasmid + OptiMEM mixture and Lipofectamine2000 + OptiMEM mixture were mixed, and it incubated at room temperature for 20 minutes. The obtained mixture was mixed with 1 mL of the EF medium containing HEK293T cells and seeded in a 96-well plate (one well for each vector combination was seeded in a total of 12 wells).
  • a plasmid that expresses crRNA corresponding to the spacer sequence of CRISPR of E. coli is mixed (8 in FIG. 1), and when targeting the spacer sequence of CRISPR of E. coli, A plasmid for expressing crRNA corresponding to the sequence derived from the CCR5 gene was mixed and expressed (11 in FIG. 1). 3.
  • a negative control only a reporter vector having a target sequence derived from CCR5 (9 in FIG. 1) and only a reporter vector having a CRISPR spacer sequence of E. coli (12 in FIG. 1) were expressed.
  • CCR5-target and “spacer-target” represent the CCR5-derived target sequence and the CRISPR spacer sequence of E. coli, respectively.
  • CCR5-crRNA and “spacer-crRNA” represent a sequence complementary to the CCR5-target and a sequence complementary to spacer-target, respectively.
  • FIG. 1 a system in which a Cas3 plasmid, a Cse1 (Cas8) plasmid, a Cse2 (Cas11) plasmid, a Cas5 plasmid, a Cas6 plasmid, and a Cas7 plasmid, and a crRNA plasmid complementary to a target sequence are introduced,
  • a Cas3 plasmid a Cse1 (Cas8) plasmid, a Cse2 (Cas11) plasmid
  • Cas5 plasmid a Cas6 plasmid
  • Cas7 plasmid a crRNA plasmid complementary to a target sequence
  • the cleavage activity was the same level as that of the negative control in the system expressing crRNA that was not complementary to the target sequence. That is, it was suggested that the CRISPR-Cas3 system of the present invention can specifically cleave a sequence complementary to crRNA in mammalian cells.
  • Example A-2 Using the same method as in Example A-1, an experiment was conducted to evaluate whether or not endogenous DNA of human cells can be cleaved by the type I CRISPR-Cas system.
  • Cas3, Cse1 (Cas8), Cse2 (Cas11), Cas5, Cas6, and Cas7 modified with a base sequence in a human cell and added with a nuclear translocation signal, and pre-crRNA are expressed, and the endogenous of the cell is expressed. It was evaluated whether the sequence of the sex CCR5 gene was cleaved.
  • Example A-1 The same HEK239T cells as in Example A-1 were seeded in a 24-well plate at a density of 1 ⁇ 10 5 cells / well and cultured for 24 hours.
  • the medium was exchanged with 1 mL of EF medium. 48 hours after transfection (24 hours after medium change), cells were collected and adjusted to a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / 5 ⁇ L in PBS.
  • the cells were heated at 95 ° C. for 10 minutes. Next, 10 mg of proteinase K was added and incubated at 55 ° C. for 70 minutes. Furthermore, what was heat-treated at 95 ° C. for 10 minutes was used as a PCR template.
  • dA was added to the 3 ′ end of the obtained purified DNA.
  • the purified DNA was electrophoresed in a 2% agarose gel, and a band of about 500 to 700 bp was excised. Then, the DNA was extracted from the excised gel and purified using Gel extraction kit (QIAGEN). Next, TA cloning was performed using pGEM-T easy vector Systems (Promega) to clone the DNA. Finally, DNA cloned by the alkali prep method was extracted and analyzed by Sanger sequencing. For analysis, BigDye (registered trademark) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) and Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (ThermoFisher) were used.
  • a sequence in the CCR5 gene located in the third chromosome short arm (P) 21 region was targeted (FIG. 2; SEQ ID NO: 46 shows the full length of the base sequence of CCR5).
  • the sequence in exon 3 of the CCR5 gene was used as the target sequence.
  • the target sequence of Cas9 was also arranged at almost the same position. That is, the entire underlined sequence is the target sequence of the type I CRISPR-Cas system (AAG followed by 32 bases), and the double underlined sequence is the target sequence of Cas9 (CGG followed by 20 bases) .
  • the sequence of the crRNA was designed to allow guidance to the target sequence of the type I CRISPR-Cas system (AAG followed by 32 bases).
  • Example A-3 Using the same method as in Example A-1, an experiment was conducted to evaluate whether the endogenous DNA of human cells can be cleaved by the CRISPR-Cas3 system.
  • Cas3, Cse1 (Cas8), Cse2 (Cas11), Cas5, Cas6, and Cas7 modified with a base sequence in a human cell and added with a nuclear translocation signal, and pre-crRNA are expressed, and the endogenous of the cell is expressed. It was evaluated whether the sequence of the sex EMX1 gene was cleaved.
  • Example A-1 The same HEK293T cells as in Example A-1 were seeded in a 24-well plate at a density of 1 ⁇ 10 5 cells / well and cultured for 24 hours.
  • Cas3 plasmid 500 ng, Cse1 (Cas8) plasmid 500 ng, Cse2 (Cas11) plasmid 1 ⁇ g, Cas5 plasmid 1 ⁇ g, Cas6 plasmid 1 ⁇ g, Cas7 plasmid 3 ⁇ g, and crRNA plasmid 500 ⁇ g were mixed in Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific 50). 4 ⁇ L of Lipofectamine (registered trademark) 2000 (Thermo Fisher Scientific) and 50 ⁇ L of Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) were further added to the above mixture and mixed. The resulting mixture was incubated at room temperature for 20 minutes and then added to the HEK293T cells.
  • FIG. 7 shows the structure of the expression vector of the Cas protein group used in Example A-3.
  • the expression vector is obtained by sandwiching the sequence encoding the Cas protein group before and after BPNLS (bipartite NLS) ([Suzuki K et al. (2016) In vivo gene editing). via CRISPR / Cas9, mediate homology-independent, targeted integration, Nature, Vol. 540 (Issue 7631), pp. 144-149].
  • the amino acid sequence of BPNLS is KRTADGSSEFESPKKKKRKVE (SEQ ID NO: 54), and the base sequence is AAGCGGACTGCTGGATGCAGTGAATTTGAGTCCCCCAAAGAAGAGAGAAAAGGTGGAA (SEQ ID NO: 55).
  • the HEK293T cells were cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 24 hours, and then the medium was exchanged with 1 mL of EF medium (1 mL per well). 48 hours after transfection (24 hours after medium change), cells were collected and adjusted to a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / 5 ⁇ L in PBS.
  • the cells were heated at 95 ° C. for 10 minutes. Next, 10 mg of proteinase K was added and incubated at 55 ° C. for 70 minutes. Furthermore, what was heat-treated at 95 ° C. for 10 minutes was used as a PCR template.
  • Example A-3 a sequence in the EMX1 gene located in the second chromosome short arm (P) 13 region was targeted (FIG. 5; SEQ ID NO: 49 shows the full length of the base sequence of EMX1). Specifically, the sequence in exon 3 of the EMX1 gene was used as the target sequence. As a control, the target sequence of Cas9 was also arranged at almost the same position. That is, the underlined sequence at the upstream is the target sequence (AAG followed by 32 bases) of the type I CRISPR-Cas system, and the downstream sequence at the downstream is the target sequence for Cas9 (TGG and preceding it) 20 bases).
  • the crRNA sequence used in Example A-3 was designed to allow guidance to the target sequence (AAG followed by 32 bases) of the CRISPR-Cas3 system.
  • Example A-3 the result of Example A-3 more strongly supports the suggestion obtained from Example A-2.
  • Example A-4 The CRISPR-Cas3 system in which the base sequence was modified and the base sequence encoding the cascade protein was linked was expressed in HEK293T cells, and the cleavage activity of the target sequence of exogenous DNA was evaluated.
  • the conditions using a reporter vector having a target sequence derived from CCR5 as the reporter vector correspond to 1 in FIG. 9B, and the conditions using a reporter vector having a CRISPR spacer sequence of E. coli are shown in FIG. 6).
  • reporter vector two types of reporter vectors produced in [Production Example] [1] (that is, vectors having the structure shown in FIG. 4D) were used.
  • the cascade (2A) plasmid used was the expression vector prepared in [4] of [Production Example] (that is, the vector having the structure shown in FIG. 8).
  • a dual-Luciferase assay was performed in the same manner as in Example A-1, except that the above expression vector was used.
  • the same experiment was performed under the following conditions. 1. Instead of either the Cas3 plasmid or the cascade (2A) plasmid, the same amount of pBluescriptII KS (+) vector (Agilent Technologies) was mixed and expressed (2 and 3 in FIG. 9). 2. Instead of the crRNA plasmid used in the above procedure, a plasmid that expresses crRNA that is not complementary to the target sequence was mixed. That is, for a target sequence derived from the CCR5 gene, a plasmid expressing crRNA corresponding to the spacer sequence of CRISPR of E. coli is mixed (4 in FIG. 9), and when targeting the spacer sequence of CRISPR of E.
  • a plasmid for expressing gRNA corresponding to the sequence derived from the CCR5 gene was mixed and expressed (7 in FIG. 9). 3.
  • a negative control only a reporter vector having a target sequence derived from CCR5 (5 in FIG. 9) and only a reporter vector having a CRISPR spacer sequence of E. coli (8 in FIG. 9) were expressed.
  • CCR5-target and “spacer-target” represent the target sequence derived from CCR5 and the spacer sequence of CRISPR of E. coli, respectively.
  • CCR5-crRNA and “spacer-crRNA” represent a sequence complementary to the CCR5-target and a sequence complementary to spacer-target, respectively.
  • the system in which both the Cas3 plasmid and the cascade (2A) plasmid and the crRNA plasmid complementary to the target sequence were introduced had a significantly higher cleavage activity than the other systems. (Compare 1 and 2 to 5, 6 and 7 to 8, respectively).
  • a sequence complementary to crRNA is expressed in mammalian cells. It was suggested that it can cleave specifically.
  • Cas3 mutants such as H74A (dead nickase; dn), K320N (dead helicase; dh), double mutants of S483A and T485A (dead helicase ver. 2; dh2) self-ligate PCR products of PrimeSTAR MAX. It was made with.
  • the crRNA expression plasmid a crRNA sequence having two BbsI restriction enzyme sites at the position of the spacer under the U6 promoter was synthesized. All crRNA expression plasmids were prepared by inserting a 32-base pair double-stranded oligo of the target sequence into the BbsI restriction enzyme site.
  • the Cas9-sgRNA expression plasmid pX330-U6-Chemeric_BB-CBh-hSpCas9 was obtained from Addgene.
  • CRISPR web tool, CRISPR design tool, and / or CRISPRdirect which predict a unique target site in the human genome were used.
  • the target sequence was cloned into the sgRNA scaffold of pX330 according to the protocol of the Feng Zhang laboratory.
  • the SSA reporter plasmid containing two BsaI restriction enzyme sites was donated by Professor Takashi Yamamoto of Hiroshima University.
  • the target sequence of the genomic region was inserted into the BsaI site.
  • PRL-TK Promega was obtained as a Renilla luciferase vector. All plasmids were prepared by the midiprep or maxiprep method using the PureLink HiPure Plasmid Purification Kit (Thermo Fisher).
  • HEK293T cells 2.5 x 10 24 hours after seeding 4 cells into wells of a 24-well plate, Cas3, Cse1, Cse2, Cas7, Cas5, Cas6, crRNA expression plasmids (250 ng each) HEK293T cells were transfected using lipofectamine 2000 and OptiMEM (Life Technologies) according to a slightly modified protocol. Two days after transfection, total DNA was extracted from the collected cells using a Tissue XS kit (Takara-bio) according to the protocol. The target locus was amplified using Gflex (Takara bio) or Quick Taq HS DyeMix (TOYOBO) and electrophoresed on an agarose gel.
  • Gflex Takara bio
  • TOYOBO Quick Taq HS DyeMix
  • SURVEYOR Mutation Detection Kit Integrated DNA Technologies
  • TA cloning pCR4 Blunt-TOPO plasmid vector (Life Technologies) was used according to the protocol.
  • BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit and ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer were used.
  • a DNA library of PCR amplification products was prepared using TruSeq Nano DNA Library Prep Kit (Illumina), and amplicon sequencing was performed with MiSeq (2 x 150 bp) according to the standard procedure of Macrogen. It was. The raw reads of each sample were mapped to hg38 of the human genome by BWA-MEM. Coverage data was visualized with Integrative Genomics Viewer (IGV), and a histogram in the target area was extracted.
  • IGV Integrative Genomics Viewer
  • Reporter HEK293T cells with mCherry-P2A-EGFP c321C> G for detection of SNP-KI (snip knock-in) in mammalian cells were donated by Professor Shinichiro Nakata. Reporter cells were cultured with 1 ⁇ g / ml puromycin. 500 ng donor plasmid or single stranded DNA was co-introduced with CRISPR-Cas3 as described above. All cells were collected 5 days after transfection, and FACS analysis was performed using AriaIIIu (BD). GFP positive cells were sorted and total DNA was extracted by the method described above. SNP exchange in the genome was detected by PCR amplification using HiDi DNA polymerase (myPOLS Biotec).
  • Type IE RISPR off-target candidates were detected using GGGenome in two different procedures in hg38 of the human genome.
  • PAM candidate sequences include those already reported (Leenay, RT, et al. Mol. Cell 62, 137-147 (2016), Jung, et al. Mol. Cell. 2017 Jung et al., Cell 170, 35-47). (2017)), AAG, ATG, AGG, GAG, TAG and AAC were selected. Since it was reported that multiple positions of 6 were not recognized as target sites (Kune et al., Molecular Cell 63, 1-13 (2016)), in the first approach, 32 Those with fewer mismatches with respect to base pairs were selected. In the next approach, regions that perfectly matched the 5 'end of the target sequence on the PAM side were detected and listed in descending order.
  • the Genome Analysis Toolkit BadMateFilter was used to remove read pairs mapped to different chromosomes. The total number of discordant read pairs or split reads in each 100 kb region was counted with Bedtools, and the error rate with the negative control was calculated.
  • SureSelectXT custom DNA probes were designed by SureDesign under moderately stringent conditions and produced by Agilent technologies. The target area was selected as follows. Probes near the target area covered 800 kb upstream and 200 kb downstream of the PAM.
  • Example B-1 Effect of crRNA and type of nuclear translocation signal on DNA cleavage activity
  • pre-RNA LRSR; leader sequence-repeat sequence-spacer sequence-repeat sequence
  • crRNA Using the CRISPR-Cas3 system, we succeeded in genome editing in eukaryotic cells.
  • LRSR leader sequence-repeat sequence-spacer sequence-repeat sequence
  • pre-crRNA pre-crRNA
  • RSR repeat sequence-spacer sequence-repeat sequence
  • mature crRNA 5 ′ handle sequence-spacer sequence-3 ′ handle sequence
  • the CRISPR-Cas3 system using mature crRNA showed no target DNA cleavage activity.
  • pre-crRNA LRSR, RSR
  • LRSR pre-crRNA
  • a very high target DNA cleavage activity was observed.
  • This result in the CRISPR-Cas3 system is in contrast to the CRISPR-Cas9 system where high DNA cleavage activity is observed by using mature crRNA.
  • mature crRNA has been used as one of the main reasons why the CRISPR-Cas3 system has not succeeded in genome editing in eukaryotic cells so far.
  • pre-crRNA LRSR
  • a bipartite nuclear transfer signal was used as a nuclear transfer signal.
  • Example B-2 Effect of PAM sequence on DNA cleavage activity
  • Fig. 12 the effect of various PAM sequences on DNA cleavage activity was examined.
  • 5'-AAG PAM showed the highest activity, and AGG, GAG, TAC, ATG, and TAG also showed remarkable activity.
  • Example B-3 Effect of crRNA and spacer sequence mismatch on DNA cleavage activity
  • a heteroduplex of 5 bases was formed between crRNA and spacer DNA. This is due to the fact that the base pairing breaks at every sixth position due to the thumb element of the Cas7 effector (FIG. 13).
  • the effect of crRNA and spacer sequence mismatch on DNA cleavage activity was evaluated (FIG. 1g). With the exception of the base that was not recognized as a target (position 6), any single mismatch in the seed region (positions 1-8) dramatically reduced the cleavage activity.
  • Example B-4 Verification of the necessity of each Cas3 domain for DNA cleavage activity
  • the N-terminal HD nuclease domain cleaves a single-stranded region of a DNA substrate. Subsequently, it was revealed that the C-terminal SF2 helicase domain unwinds in a 3 ′ to 5 ′ direction on the target DNA in an ATP-dependent manner.
  • Three Cas3 mutants a HD domain H74A mutant (dnCas3), a SF320 domain motif 1 K320N mutant (dhCas3), and a SF2 domain motif 3 S483A / T485A double mutant (dh2Cas3).
  • Example B-5 Verification of DNA cleavage activity in various types of CRISPR-Cas3 systems
  • the type 1 CRISPR-Cas3 systems are highly diversified (seven types A to G of type 1).
  • the DNA cleavage activity in eukaryotic cells in the type IE CRISPR-Cas3 system was verified.
  • other type 1 CRISPR-Cas3 systems type IF and type The DNA cleavage activity in IG
  • Cas I and Cas 5-7 of type IF Schwanella putrefaciens and Cas 5-8 of type I-G Pyrocox friosus were codon-optimized and cloned (FIG. 15).
  • DNA cleavage activity was also observed in these type 1 CRISPR-Cas3 systems in the SSA assay using 293T cells.
  • Example B-6 Verification of mutation introduced into endogenous gene by CRISPR-Cas3 system The mutation introduced into endogenous gene by CRISPR-Cas3 system was verified by using type IE system. EMX1 gene and CCR5 gene were selected as target genes, and a pre-crRNA (LRSR) plasmid was prepared. As a result of lipofecting 293T cells with a plasmid encoding pre-crRNA and 6 Cas (3,5-8,11) effectors, deletion of several hundred to several thousand base pairs by CRISPR-Cas3 mainly resulted in spacer sequences in the target region. It was revealed that this occurred in the upstream direction of 5′PAM (FIG. 16).
  • LRSR pre-crRNA
  • a 5-10 base pair microhomology at the repaired junction could be confirmed, possibly due to the annealing of the complementary strand through an annealing-dependent repair pathway.
  • genome editing in the EMX1 and CCR5 regions was not observed.
  • Cas3 was further characterized by next generation sequencing with PCR amplification products with primer sets in a broader region such as 3.8 kb of EMX1 gene and 9.7 kb of CCR5.
  • AAG was 38.2%
  • ATG was 56.4%
  • a wide range upstream of the PAM site compared to 86.4% for TTT and 86.4% for Cas9 targeting EMX1.
  • the coverage rate in the genomic region was greatly reduced. The decrease in coverage was the same when the CCR5 region was targeted.
  • a microarray-based capture sequence of 1000 kb or more around the targeted EMX1 and CCR5 loci was utilized (FIGS. 18A, B) .
  • a maximum of 24 kb deletion was observed at the EMX1 locus and a maximum of 43 kb deletion was observed at the CCR5 locus, but 90% of the mutations in EMX1 and 95% of the mutations in CCR5 were less than 10 kb.
  • the CRISPR-Cas3 system of the present invention can edit DNA of eukaryotic cells, it can be used in fields where genome editing is required, such as medicine, agriculture, forestry and fisheries, industry, life science, biotechnology, gene therapy, etc. Can be widely used in the field.

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Abstract

真核細胞においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを確立することに成功した。

Description

ＤＮＡが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット
　本発明は、ＤＮＡが編集された真核細胞、動物、および植物を製造する方法、ならびに当該方法に用いられるキットに関する。
　細菌、古細菌は、外来から侵入しようとするファージなどの生物を特異的に認識し、排除する適応免疫機構を有している。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと呼ばれるこのシステムは、まず、外来生物のゲノム情報を自己ゲノムに取り込む（アダプテーション）。そして、再度同じ外来生物が侵入しようとする際に、自己ゲノムに取り込まれた情報とゲノム配列の相補性を利用して外来ゲノムを切断し、排除する（インターフェアランス）。
　最近になって、上記のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを、「ＤＮＡ編集用の道具」として用いた、ゲノム編集（ＤＮＡ編集）技術が開発されるようになってきた（非特許文献１）。
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＤＮＡを切断する過程で働くエフェクターが、複数のＣａｓからなる「クラス１」と、単一のＣａｓからなる「クラス２」とに大別される。とりわけ、クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとしては、Ｃａｓ３およびカスケード複合体（カスケードとｃｒＲＮＡとの複合体を意味する。以下同様。）が関与する「タイプＩ」が広く知られており、クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとしては、Ｃａｓ９が関与する「タイプＩＩ」が広く知られている（以下、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに関して、「クラス１タイプＩ」および「クラス２タイプＩＩ」をそれぞれ単に「タイプＩ」および「タイプＩＩ」と称することもある。）。そして、これまでのＤＮＡ編集技術において広範に用いられていたのは、Ｃａｓ９が関与するクラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである（以下、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム」と呼ぶこともある。）。例えば、非特許文献１は、Ｃａｓ９を用いてＤＮＡを切断する、クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを報告している。
　一方、Ｃａｓ３およびカスケード複合体を用いてＤＮＡを切断する、クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（以下、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システム」と呼ぶこともある。）については、多くの努力にも拘らず、真核細胞においてゲノム編集の成功例の報告はなされていない。例えば、非特許文献２および３では、単に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを用いることにより、無細胞系で標的ＤＮＡが完全に分解されたことや、特定の大腸菌株を選択的に除去することができたことを報告しているが、これらはゲノム編集の成功を意味するものではなく、また、真核細胞では何ら実証されていない。また、特許文献１においては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムが、Ｃａｓ３のヘリカーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性により、大腸菌において標的ＤＮＡを分解してしまうことから（実施例５、図６）、真核細胞においては、Ｃａｓ３に代えて、ＦｏｋＩヌクレアーゼを用いてゲノム編集を行うことを提案している（実施例７、図７、図１１）。また、特許文献２では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムは、大腸菌において標的ＤＮＡを分解してしまうことから（図４）、ｃａｓ３を欠失させたり、不活性化されたＣａｓ３（Ｃａｓ３’とＣａｓ３’’）を使用することで、プログラム化可能な遺伝子抑制に再目的化することを提案している（例えば、実施例１５、請求項４（ｅ））。
特表２０１５－５０３５３５号公報 特表２０１７－５１２４８１号公報
Ｊｉｎｅｋ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．　（２０１２）　Ａ　Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｄｕａｌ－ＲＮＡ　Ｇｕｉｄｅｄ　ＤＮＡ　Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｉｎ　Ａｄａｐｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．３３７　（Ｉｓｓｕｅ　６０９６），　ｐｐ．８１６－８２１ Ｍｕｌｅｐａｔｉ　Ｓ　＆　Ｂａｉｌｅｙ　Ｓ　（２０１３）　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｒｅｖｅａｌｓ　Ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ，　ＡＴＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　Ｔａｒｇｅｔ，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｖｏｌ．２８８　（Ｎｏ．３１），　ｐｐ．２２１８４－２２１９２ Ａｈｍｅｄ　Ａ．　Ｇｏｍａａ　ｅｔ　ａｌ．　（２０１４）　Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｒｅｏｍｏｖａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｓｔｒａｉｎｓ　ｂｙ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　ｍｂｉｏ．　ａｓｍ．　ｏｒｇ，　Ｖｏｌｕｍｅ　５，　Ｉｓｓｕｅ　１，　ｅ００９２８－１３
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、真核細胞においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを確立することにある。
　本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、遂に、真核細胞においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを確立することに成功した。最も広く利用されているＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、様々な真核細胞においてゲノム編集に成功しているが、このシステムでは、通常、ｃｒＲＮＡとして成熟ｃｒＲＮＡが用いられている。しかしながら、驚くべきことに、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムでは、成熟ｃｒＲＮＡを用いた場合には、真核細胞においてゲノム編集が困難であり、通常、システムの構成要素としては用いられないプレｃｒＲＮＡを用いることで初めて、効率的なゲノム編集が可能であった。すなわち、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを真核細胞で機能させるためには、カスケードを構成するタンパク質によるｃｒＲＮＡの切断が重要であることが判明した。このプレｃｒＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムは、タイプＩ－Ｅのシステムのみならず、タイプＩ－ＦおよびタイプＩ－Ｇのシステムにも広く適用することが可能であった。また、Ｃａｓ３に核移行シグナル、特に、バイパルタイト核移行シグナルを付加することにより、真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムのゲノム編集効率をさらに向上させることができた。また、本発明者は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムによれば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと異なり、ＰＡＭ配列を含むか、その上流域において、大きな欠失をもたらすことが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムに関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
　［１]ＤＮＡが編集された真核細胞を製造する方法であって、真核細胞にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを導入することを含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムが以下の（Ａ）～（Ｃ）を含む方法。
　（Ａ）Ｃａｓ３タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
　（Ｂ）カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
　（Ｃ）ｃｒＲＮＡ、該ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
　［２］ＤＮＡが編集された動物（ただしヒトを除く）または植物を製造する方法であって、動物（ただしヒトを除く）または植物にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを導入することを含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムが以下の（Ａ）～（Ｃ）を含む方法。
　（Ａ）Ｃａｓ３タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
　（Ｂ）カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
　（Ｃ）ｃｒＲＮＡ、該ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
　［３］真核細胞にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを導入した後に、カスケードタンパク質を構成するタンパク質によりｃｒＲＮＡが切断される工程を含む、［１］または［２］に記載の方法。
　［４］ｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡである、［１］または［２］に記載の方法。
　［５］Ｃａｓ３タンパク質および／またはカスケードタンパク質に核移行シグナルが付加されている、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
　［６］核移行シグナルがバイパルタイト核移行シグナルである、［５］に記載の方法。
　［７］以下の（Ａ）および（Ｂ）を含む、［１］～［６］のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
　（Ａ）Ｃａｓ３タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
　（Ｂ）カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
　［８］ｃｒＲＮＡ、該ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチド含む発現ベクターをさらに含む、［７］に記載のキット。
　［９］ｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡである、［８］に記載のキット。
　［１０］Ｃａｓ３タンパク質および／またはカスケードタンパク質に核移行シグナルが付加されている、［７］～［９］のいずれかに記載のキット。
　［１１］核移行シグナルがバイパルタイト核移行シグナルである、［１０］に記載のキット。
　なお、本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」とはヌクレオチドの重合体を意図し、用語「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と同義で使用される。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）でも存在しうるし、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態でも存在しうる。また、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と同義で使用される。
　本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを用いることにより、真核細胞においてＤＮＡを編集することが可能となった。
外因性のＤＮＡに対する切断活性を測定したＳＳＡアッセイの結果である。 ＣＣＲ５遺伝子中における標的配列の位置を表す概略図である。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにより、塩基配列の一部を欠失したＣＣＲ５遺伝子（クローン１）を表す図である。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにより、塩基配列の一部を欠失したＣＣＲ５遺伝子（クローン２）を表す図である。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにより、塩基配列の一部を欠失したＣＣＲ５遺伝子（クローン３）を表す図である。 るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにより、塩基配列の一部を欠失したＣＣＲ５遺伝子（クローン４）を表す図である。 （ａ）は、カスケードプラスミドの構造を表す模式図である。（ｂ）は、Ｃａｓ３プラスミドの構造を表す模式図である。（ｃ）は、プレｃｒＲＮＡプラスミドの構造を表す模式図である。（ｄ）は、レポーターベクター（標的配列を含む）の構造を表す模式図である。 ＥＭＸ１遺伝子中における標的配列の位置を表す概略図である。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにより、塩基配列の一部を欠失したＥＭＸ１遺伝子（クローン１）を表す図である。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにより、塩基配列の他の一部を欠失したＥＭＸ１遺伝子（クローン２）を表す図である。 ｂｐＮＬＳを付加したＣａｓ３／カスケードプラスミドの構造を表す模式図である。 カスケード（２Ａ）プラスミドの構造を表す模式図である。 外因性のＤＮＡに対する切断活性を測定したＳＳＡアッセイの結果である。 本実施例に用いたプレｃｒＲＮＡ（ＬＲＳＲおよびＲＳＲ）と成熟ｃｒＲＮＡの構造を示す図である。図中のアンダーラインは、５’ハンドル（Ｃａｓ５ハンドル）を、二重アンダーラインは、３’ハンドル（Ｃａｓ６ハンドル）を示す。 プレｃｒＲＮＡ（ＬＲＳＲおよびＲＳＲ）と成熟ｃｒＲＮＡを用いてＳＳＡアッセイを行った結果を表す図である。 １つのＮＬＳまたは２つのＮＬＳ（ｂｐＮＬＳ）をＣａｓ３／カスケード遺伝子の発現のためにプラスミドに用いてＳＳＡアッセイを行った結果を表す図である。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムのＤＮＡ切断活性へのＰＡＭ配列の効果を表す図である。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムのＤＮＡ切断活性に対するスペーサーの単一ミスマッチの効果を表す図である。 ＨＤヌクレアーゼドメイン（Ｈ７４Ａ）、ＳＦ２ヘリケースドメインモチーフ１（Ｋ３２０Ａ）、モチーフ３（Ｓ４８３／Ｔ４８５Ａ）でのＣａｓ３の変異の効果を表す図である。 タイプＩ－Ｅ、タイプＩ－Ｆ、およびタイプＩ－ＧのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムのＤＮＡ切断活性の比較を表す図である。 ＰＣＲ産物のＴＡクローニングサンプルのシークエンスにより検出したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムによる欠失の大きさを表す図である。 ＴＡクローン（ｎ＝４９）の大量処理シークエンスにより検出したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムによる欠失の位置を表す図である。 標的にしたＥＭＸ１遺伝子座の周囲１０００ｋｂ以上のマイクロアレイベースのキャプチャーシークエンスを利用して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムによる欠失サイズごとの検出した数を表す図である。 標的にしたＣＣＲ５遺伝子座の周囲１０００ｋｂ以上のマイクロアレイベースのキャプチャーシークエンスを利用して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムによる欠失サイズごとの検出した数を表す図である。
　［１］ＤＮＡが編集された真核細胞、動物、植物を製造する方法
　本発明の方法は、真核細胞にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを導入することを含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムが以下の（Ａ）～（Ｃ）を含む方法である。
　（Ａ）Ｃａｓ３タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
　（Ｂ）カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
　（Ｃ）ｃｒＲＮＡ、該ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
　クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、タイプＩおよびタイプＩＩＩに分類され、さらに、タイプＩは、カスケードを構成するタンパク質（以下、単に「カスケード」または「カスケードタンパク質」と称する。）の種類によって、タイプＩ－Ａ、タイプＩ－Ｂ、タイプＩ－Ｃ、タイプＩ－Ｄ、タイプＩ－Ｅ、およびタイプＩ－Ｆの６種類、並びにタイプＩ－ＢのサブタイプであるタイプＩ－Ｇに分類される（例えば、［ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｏｏｓｔ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ．　（２０１４）　Ｕｎｒａｖｅｌｌｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ　ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｍ，　Ｖｏｌ．１２　（Ｎｏ．７），　ｐｐ．４７９－４９２］、［Ｊａｃｋｓｏｎ　ＲＮ　ｅｔ　ａｌ．　（２０１４）　Ｆｉｔｔｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｃａｓ３　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　Ｈｅｌｉｃａｓｅ　Ｆａｍｉｌｙ　Ｔｒｅｅ，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．２４，　ｐｐ．１０６－１１４］を参照）。
　タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ３（ヌクレアーゼ活性およびヘリカーゼ活性を有するタンパク質）、カスケードおよびｃｒＲＮＡが協同することにより、ＤＮＡを切断する機能を有する。ヌクレアーゼとしてＣａｓ３を用いることから、本発明において「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システム」と称する。
　本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを用いることにより、例えば、次の利点が得られる。
　まず、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムで使用されるｃｒＲＮＡは、一般的には、３２～３７塩基の標的配列を認識する（Ｍｉｎｇ　Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２０１７　Ｍａｙ　５；　４５（８）：　４６４２－４６５４）。これに対して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムで使用されるｃｒＲＮＡは、一般に１８～２４塩基の標的配列を認識する。このため、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムよりも、より正確に標的配列を認識できると考えられる。
　また、クラス２のタイプＩＩのシステムであるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムのＰＡＭ配列は、標的配列の３’側に隣接する「ＮＧＧ（Ｎは任意の塩基）」である。また、クラス２のタイプＶのシステムであるＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１システムのＰＡＭ配列は、標的配列の５’側に隣接する「ＡＡ」である。これに対して、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムのＰＡＭ配列は、標的配列の５’側に隣接する「ＡＡＧ」またはそれに類似した塩基配列（例えば、「ＡＧＧ」、「ＧＡＧ」、「ＴＡＣ」、「ＡＴＧ」、「ＴＡＧ」等）である（図１２）。したがって、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを用いれば、従来法では認識できなかった領域を、ＤＮＡ編集の対象にできると考えられる。
　さらに、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムは、上記クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと異なり、複数箇所にＤＮＡ切断を生じさせる。このため、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを用いれば、百～数千塩基、場合によりそれ以上の広範な欠失変異を生じさせることができる（図３、６、１６～１８）。この機能により、長いゲノム領域をノックアウトしたり、長いＤＮＡをノックインしたりすることに利用できると考えられる。ノックインを行う場合には、通常、ドナーＤＮＡが用いられ、当該ドナーＤＮＡも、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを構成する分子となる。
　なお、本明細書において、単に「Ｃａｓ３」と記載した場合は、「Ｃａｓ３タンパク質」を意味するものとする。カスケードタンパク質についても同様である。
　本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムは、タイプＩの６種類のサブタイプのすべてを包含する。すなわち、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを構成するタンパク質は、サブタイプにより、若干その構成などが異なる場合がある（例えば、カスケードを構成するタンパク質が異なる）が、本発明は、これらのタンパク質の全てを包含する。実際、本実施例において、タイプＩ－Ｅのみならず、タイプ１－ＧやタイプＩ－Ｆのシステムにおいても、ゲノム編集が可能であることが判明した（図１５）。
　タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムの中でも一般的であるタイプＩ－ＥのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムは、ｃｒＲＮＡがＣａｓ３およびカスケード（Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、およびＣａｓ７）と協同することにより、ＤＮＡを切断する。
　タイプＩ－Ａのシステムでは、カスケードとしてＣａｓ８ａ１、Ｃｓａ５（Ｃａｓ１１）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、およびＣａｓ７を構成要素とし、タイプＩ－Ｂでは、カスケードとしてＣａｓ８ｂ１、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、およびＣａｓ７を構成要素とし、タイプＩ－Ｃでは、カスケードとしてＣａｓ８ｃ、Ｃａｓ５、およびＣａｓ７を構成要素とし、タイプＩ－Ｄでは、カスケードとしてＣａｓ１０ｄ、Ｃｓｃ１（Ｃａｓ５）、Ｃａｓ６、およびＣｓｃ２（Ｃａｓ７）を構成要素とし、タイプＩ－Ｆでは、カスケードとしてＣｓｙ１（Ｃａｓ８ｆ）、Ｃｓｙ２（Ｃａｓ５）、Ｃａｓ６、およびＣｓｙ３（Ｃａｓ７）を構成要素とし、タイプＩ－Ｇのシステムでは、カスケードとしてＣｓｔ１（Ｃａｓ８ａ１）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、およびＣｓｔ２（Ｃａｓ７）を構成要素とする。本発明においては、Ｃａｓ３およびカスケードを総称して「Ｃａｓタンパク質群」と称する。
　以下、タイプＩ－ＥのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを代表例として説明するが、その他のタイプのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムについては、システムを構成するカスケードを、適宜、読み替えればよい。
　－Ｃａｓタンパク質群－
　本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにおいて、Ｃａｓタンパク質群は、タンパク質の形態で、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの形態で、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形態で、真核細胞に導入することができる。Ｃａｓタンパク質群をタンパク質の形態で真核細胞に導入する場合には、各タンパク質の量等を適宜調製することが可能であり、ハンドリングの観点で優れている。また、細胞内での切断効率等を考慮して、Ｃａｓタンパク質群の複合体を先に形成させた後に、真核細胞へ導入することもできる。
　本発明においては、Ｃａｓタンパク質群に、核移行シグナルを付加することが好ましい。核移行シグナルは、Ｃａｓタンパク質群のＮ末端側および／またはＣ末端側（各Ｃａｓタンパク質群をコードするポリヌクレオチドの５’末端側および／または３’末端側）に付加され得る。このように、Ｃａｓタンパク質群に核移行シグナルを付加することにより、細胞内で核への局在が促進され、その結果、ＤＮＡの編集が効率的に行われるという利点を有する。
　上記の核移行シグナルは、数個から数十個の塩基性アミノ酸からなるペプチド配列であり、タンパク質を核内へ移行させるものであれば、その配列は特段限定されない。このような核移行シグナルの具体例は、例えば［Ｗｕ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ．　（２００９）　Ｔｈｅ　Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍｏｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｉｍｐｏｒｔ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　ＮＬＳ　Ｃａｒｇｏｅｓ，　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　ｊｏｕｒｎａｌ　，　Ｖｏｌ．９６　（Ｉｓｓｕｅ　９），　ｐｐ．３８４０－３８４９］に記載されており、当該技術分野で通常使用される任意の核移行シグナルが、本発明において使用され得る。
　核移行シグナルは、例えば、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５２）（塩基配列ＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＴＧ（配列番号５３）によりコード）であり得る。上記核移行シグナルを用いる場合、例えば、Ｃａｓタンパク質群をコードする各ポリヌクレオチドの５’末端側に、配列番号５３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを配置することが好ましい。また、核移行シグナルは、例えば、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＥ（配列番号５４）（塩基配列ＡＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＧＡＡＴＴＴＧＡＧＴＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＡ（配列番号５５）によりコード）であり得る。上記核移行シグナルを用いる場合、例えば、Ｃａｓタンパク質群をコードする各ポリヌクレオチドの両端に、配列番号５５の塩基配列からなるポリヌクレオチドを配置すること（すなわち、「バイパルタイト核移行シグナル（ｂｐＮＬＳ）」を用いること）が好ましい。
　このような改変は、後述のプレｃｒＲＮＡの利用と相俟って、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを真核細胞内で効率的に発現および機能させる上で重要である。
　本発明に用いられるＣａｓタンパク質群の一つの好ましい態様は、以下である。
Ｃａｓ３；配列番号１または配列番号７で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質
Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）；配列番号２または配列番号８で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質
Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）；配列番号３または配列番号９で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質
Ｃａｓ５；配列番号４または配列番号１０で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質
Ｃａｓ６；配列番号５または配列番号１１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質
Ｃａｓ７；配列番号６または配列番号１２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質
　上記Ｃａｓタンパク質群は、（１）野生型大腸菌のＣａｓ３、Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７のＮ末端に、核移行シグナルとしてＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５２）を付加したタンパク質、または（２）野生型大腸菌のＣａｓ３、Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７のＮ末端およびＣ末端に、核移行シグナルとしてＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＥ（配列番号５４）を付加したタンパク質である。このようなアミノ酸配列のタンパク質とすることにより、上記Ｃａｓタンパク質群を真核細胞の核内へ移行させることができる。このようにして核内に移行した上記Ｃａｓタンパク質群は、標的のＤＮＡを切断する。また、ＣＲＩＳＰＡＲ－Ｃａｓ９システムでは困難であると考えられている、強固な構造を有するＤＮＡ領域（ヘテロクロマチンなど）においても、標的のＤＮＡの編集が可能となる。
　本発明に用いられるＣａｓタンパク質群の各タンパク質の他の一つの態様は、上記Ｃａｓタンパク質群の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列によりコードされるタンパク質である。本発明に用いられるＣａｓタンパク質群の各タンパク質の他の一つの態様は、上記Ｃａｓタンパク質群の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質である。上記の各タンパク質は、Ｃａｓタンパク質群を構成する他のタンパク質と複合体を形成したときにＤＮＡ切断活性を有するものである。なお、「配列同一性」、「ストリンジェントな条件」などの用語の意味は後述する。
　－Ｃａｓタンパク質群をコードするポリヌクレオチド－
　タイプＩ－ＥのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成する野生型のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、真核細胞内で効率的に発現するように改変を施したポリヌクレオチドを含む。すなわち、Ｃａｓタンパク質群をコードし、改変が施されたポリヌクレオチドを用いることができる。ポリヌクレオチドの改変の一つの好ましい態様は、真核細胞内での発現に適した塩基配列への改変であり、例えば、真核細胞内で発現するようにコドンを最適化することである。
　本発明に用いられるＣａｓタンパク質群をコードするポリヌクレオチドの一つの好ましい態様は、以下である。
Ｃａｓ３；配列番号１または配列番号７で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）；配列番号２または配列番号８で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）；配列番号３または配列番号９で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
Ｃａｓ５；配列番号４または配列番号１０で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
Ｃａｓ６；配列番号５または配列番号１１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
Ｃａｓ７；配列番号６または配列番号１２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
　これらは、大腸菌の野生型Ｃａｓタンパク質群をコードする塩基配列（Ｃａｓ３；配列番号１３、Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）；配列番号１４、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）；配列番号１５、Ｃａｓ５；配列番号１６、Ｃａｓ６；配列番号１７、Ｃａｓ７；配列番号１８）を、人工的に改変することにより、哺乳動物細胞において発現および機能できるようにしたポリヌクレオチドである。
　上記のポリヌクレオチドの人工的な改変は、真核細胞内での発現に適した塩基配列に改変し、かつ、核移行シグナルを付加することである。塩基配列の改変および核移行シグナルの付加については、上記した通りである。これにより、より十分なＣａｓタンパク質群の発現量の上昇、ならびに機能の増大が期待できる。
　本発明に用いられるＣａｓタンパク質群をコードするポリヌクレオチドの他の一つの態様は、上記Ｃａｓタンパク質群の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる、野生型のＣａｓタンパク質群をコードする塩基配列を改変したポリヌクレオチドである。これら各ポリヌクレオチドから発現したタンパク質は、Ｃａｓタンパク質群を構成する他のポリヌクレオチドから発現したタンパク質と複合体を形成したときにＤＮＡ切断活性を有するものである。
　塩基配列の配列同一性は、塩基配列全体（またはＣｓｅ３の機能に必要な部分をコードしている領域）において、少なくともは９０％以上、より好ましくは９５％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）でありうる。塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴＮなどのプログラムを利用して、決定することができる（［Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ　（１９９０）　Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．２１５　（Ｉｓｓｕｅ　３），　ｐｐ．４０３－４１０］を参照）。ＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合のパラメーターの一例としては、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２の設定が挙げられる。ＢＬＡＳＴＮによる解析を行うための具体的な手法は、当業者に知られている。比較対象の塩基配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（ギャップなど）を許容してもよい。
　また、「ＤＮＡ切断活性を有する」とは、ポリヌクレオチド鎖を少なくとも１箇所において切断できることを意図する。
　本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムは、標的配列を特異的に認識してＤＮＡを切断することが好ましい。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムが標的配列を特異的に認識しているか否かは、例えば、実施例Ａ－１に説明されているｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイによって知ることができる。
　本発明に用いられるＣａｓタンパク質群をコードするポリヌクレオチドの他の一つの態様は、上記Ｃａｓタンパク質群の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドである。これら各ポリヌクレオチドから発現したタンパク質は、Ｃａｓタンパク質群を構成する他のポリヌクレオチドから発現したタンパク質と複合体を形成したときにＤＮＡ切断活性を有するものである。
　ここで「ストリンジェントな条件」とは、２本のポリヌクレオチド鎖が、塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドを形成するが、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドは形成しない条件をいう。「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、換言すれば、配列同一性が高い核酸同士（例えば完全にマッチしたハイブリッド）の融解温度（Ｔｍ値）から１５℃低い温度、好ましくは１０℃低い温度、より好ましくは５℃低い温度までの温度範囲において、ハイブリダイズできる条件ともいえる。
　ストリンジェントな条件の一例を示すと、以下の通りである。まず、０．２５Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液（ｐＨ７．２）中、６０～６８℃（好ましくは６５℃、より好ましくは６８℃）にて、１６～２４時間、２種類のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる。その後、２０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１％　ＳＤＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡからなる緩衝液（ｐＨ７．２）中、６０～６８℃（好ましくは６５℃、より好ましくは６８℃）にて、１５分間の洗浄を２回行う。
　他の例としては、以下の方法が挙げられる。まず、２５％ホルムアミド（より厳しい条件では５０％ホルムアミド）、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃にて、一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することにより、２種類のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行う。
　次に、次の条件のいずれかで洗浄を行う。通常の条件；１×ＳＳＣおよび０．１％　ＳＤＳを洗浄液として、３７℃程度で洗浄。厳しい条件；．５×ＳＳＣおよび０．１％　ＳＤＳ洗浄液として、４２℃程度で洗浄。さらに厳しい条件；０．２×ＳＳＣおよび０．１％　ＳＤＳを洗浄液として、６５℃程度で洗浄。
　このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほど、特異性の高いハイブリダイズとなる。なお、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは、単なる例示に過ぎない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上述の要素、または他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することができる。このことは、例えば、［Ｊｏｓｅｐｈ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　＆　Ｄａｖｉｄ　Ｗ．　Ｒｕｓｓｅｌｌ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　３ｒｄ　Ｅｄ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　２００１］などに記載されている。
　－Ｃａｓタンパク質群をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター－
　本発明においては、Ｃａｓタンパク質群を発現させるための発現ベクターを利用することができる。発現ベクターは、基材ベクターとして、一般的に使用される種々のベクターを用いることができ、導入される細胞または導入方法に応じて適宜選択されうる。具体的には、プラスミド、ファージ、コスミドなどを用いることができる。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。
　上述した発現ベクターの例としては、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクターおよびウイルス由来ベクター（細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソームなど）、酵母染色体エレメントおよびウイルス（バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスなど）、および、それらの組み合わせに由来するベクター（コスミド、ファージミドなど）を挙げられる。
　発現ベクターは、さらに、転写開始および転写終結のための部位を含んでおり、かつ、転写領域中にリボソーム結合部位を含んでいることが好ましい。ベクター中の成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始コドンＡＵＧを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドンを含むことになる。
　本発明において、Ｃａｓタンパク質群を発現させるための発現ベクターは、プロモーター配列を含んでいてよい。上記プロモーター配列は、宿主となる真核細胞の種類に応じて適宜選択すればよい。また、発現ベクターは、ＤＮＡからの転写を亢進させるための配列、例えば、エンハンサー配列を含んでいてよい。エンハンサーとしては、例えば、ＳＶ４０エンハンサー（これは、複製起点の下流の１００～２７０ｂｐに配置される）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の下流に配置されるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、発現ベクターは、転写されたＲＮＡを安定化させるための配列、例えば、ポリＡ付加配列（ポリアデニル化配列、ｐｏｌｙＡ）を含んでいてよい。ポリＡ付加配列の例としては、成長ホルモン遺伝子由来のポリＡ付加配列、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリＡ付加配列、ヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリＡ付加配列、ＳＶ４０ウイルス由来ポリＡ付加配列、ヒトまたはウサギのβグロビン遺伝子由来のポリＡ付加配列が挙げられる。
　同一のベクター内に組み込まれるＣａｓタンパク質群をコードするポリヌクレオチドの数は、発現ベクターを導入した宿主細胞内でＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの機能を発揮しうる限りにおいて、特に限定されない。例えば、Ｃａｓタンパク質群をコードするポリヌクレオチドを１種類の（同一の）ベクターに搭載するという設計が可能であり、また、さらに、各Ｃａｓタンパク質群をコードするポリヌクレオチドの全てまたは一部を別々のベクターに搭載するという設計も可能である。例えば、カスケードタンパク質をコードするポリヌクレオチドを１種類の（同一の）ベクターに搭載し、Ｃａｓ３をコードするポリヌクレオチドを別のベクターに搭載するという設計が可能である。好ましくは、発現効率等の観点から、各Ｃａｓタンパク質群をコードするポリヌクレオチドを別々の６種類のベクターに搭載する方法が用いられる。
　その他、発現量を調節するなどの目的のために、同一のベクター中に、同じタンパク質をコードするポリヌクレオチドを複数搭載してもよい。例えば、Ｃａｓ３をコードするのポリヌクレオチドを１種類の（同一の）ベクター内の２箇所に配置するという設計が可能である。
　また、Ｃａｓタンパク質群をコードする複数の塩基配列を含んでおり、当該複数の塩基配列の間には、細胞内のプロテアーゼにより切断されるアミノ酸配列（２Ａペプチドなど）をコードする塩基配列が挿入されている発現ベクターを用いてもよい（例えば、図８のベクターの構造を参照）。このような塩基配列を有するポリヌクレオチドが転写・翻訳されると、細胞内で一つに連結されたポリペプチド鎖が発現する。その後、細胞内プロテアーゼの作用により、Ｃａｓタンパク質群が分離され、個別のタンパク質となった後に複合体を形成し、機能する。これにより、細胞内で発現するＣａｓタンパク質群の量比を調整することができる。例えば、「Ｃａｓ３をコードする塩基配列とＣｓｅ１（Ｃａｓ８）をコードする塩基配列とを１つずつ含む発現ベクター」からは、Ｃａｓ３とＣｓｅ１（Ｃａｓ８）とが、等量発現することが予測される。また、一種類の発現ベクターで複数のＣａｓタンパク質群を発現させることが可能であるため、ハンドリング性に優れる点で有利である。一方、ＤＮＡ切断活性の高さの観点からは、通常、Ｃａｓタンパク質群を各々異なる発現ベクターにより発現させる態様の方が優れている。
　本発明に用いられる発現ベクターは、公知の手法によって作製することができる。このような手法としては、ベクターを作製用のキットに付属する実施マニュアルに記載の手法に加え、種々の手引書に記載の手法が挙げられる。例えば、［Ｊｏｓｅｐｈ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　＆　Ｄａｖｉｄ　Ｗ．　Ｒｕｓｓｅｌｌ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　３ｒｄ　Ｅｄ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　２００１］は、包括的な手引書である。
　－ｃｒＲＮＡ、該ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター－
　本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムは、ゲノム編集を行うＤＮＡへの標的化のために、ｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。
　ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの一部を形成するＲＮＡであり、標的配列と相補的な塩基配列を有する。本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムは、ｃｒＲＮＡにより、標的配列を特異的に認識してその配列を切断することを可能とする。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを代表とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおいては、これまでｃＲＮＡとして、通常、成熟ｃｒＲＮＡが用いられてきた。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを真核細胞で機能させる場合においては、その理由は明らかではないが、成熟ｃｒＲＮＡの利用は適さないことが明らかとなった。そして、驚くべきことに、成熟ｃｒＲＮＡに代えて、プレｃｒＲＮＡを利用することにより、真核細胞において高効率でゲノム編集を行うことが可能であることが判明した。この事実は、成熟ｃｒＲＮＡとプレｃｒＲＮＡとの対比実験から明らかである（図１０）。従って、本発明のｃｒＲＮＡとしては、プレｃｒＲＮＡを用いることが特に好ましい。
　本発明に用いるプレｃｒＲＮＡは、典型的には、「リーダー配列－リピート配列－スペーサー配列－リピート配列（ＬＲＳＲ構造）」または「リピート配列－スペーサー配列－リピート配列（ＲＳＲ構造）」の構造を有する。リーダー配列は、ＡＴリッチな配列で、プレｃｒＲＮＡを発現させるプロモーターとして機能する。リピート配列は、スペーサー配列を介して反復している配列であり、スペーサー配列は、標的ＤＮＡに相補的な配列として本発明において設計する配列である（本来は、アダプテーションの過程において取り込まれた、外来ＤＮＡ由来の配列である）。プレｃｒＲＮＡは、カスケードを構成するタンパク質（例えば、タイプＩ－Ａ、Ｂ、Ｄ～ＥではＣａｓ６、タイプＩ－ＣではＣａｓ５）により切断されると成熟ｃｒＲＮＡとなる。
　典型的には、リーダー配列の鎖長は、８６塩基、リピート配列の鎖長は、２９塩基である。スペーサー配列の鎖長は、例えば、１０～６０塩基、好ましくは２０～５０塩基、より好ましくは２５～４０塩基、典型的には３２～３７塩基である。従って、本発明において用いられるプレｃｒＲＮＡの鎖長は、ＬＲＳＲ構造の場合、例えば、１５４～２０４塩基、好ましくは１６４～１９４塩基、より好ましくは１６９～１８４塩基、典型的には、１７６～１８１塩基である。また、ＲＳＲ構造の場合、例えば、６８～１１８塩基、好ましくは７８～１０８塩基、より好ましくは８３～９８塩基、典型的には、９０～９５塩基である。
　本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを真核細胞において機能させるためには、プレｃｒＲＮＡのリピート配列が、カスケードを構成するタンパク質により切断される過程が重要であると考えられる。従って、上記リピート配列は、このような切断が生じる限り、上記鎖長より短くても、長くてもよいことは、理解されたい。すなわち、プレｃｒＲＮＡは、後述の成熟ｃｒＲＮＡの両端に、カスケードを構成するタンパク質による切断に十分な配列が付加されたｃｒＲＮＡと言うことができる。本発明の方法の好ましい態様は、このように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを真核細胞に導入した後に、カスケードを構成するタンパク質によりｃｒＲＮＡが切断される工程を含む。
　一方、プレｃｒＲＮＡが切断されて生成する成熟ｃｒＲＮＡは、「５’ハンドル配列－スペーサー配列－３’ハンドル配列」の構造を有する。典型的には、５’ハンドル配列は、リピート配列の２２～２９番目の８塩基からなりＣａｓ５にホールドされる。また、典型的には、３’ハンドル配列は、リピート配列の１～２１番目の２１塩基からなり、６～２１番目の塩基でステムループ構造を形成して、Ｃａｓ６にホールドされる。従って、成熟ｃｒＲＮＡの鎖長は、通常、６１～６６塩基である。但し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムのタイプによっては、３’ハンドル配列をもたない成熟ｃｒＲＮＡもあることから、この場合には、鎖長は、２１塩基短くなる。
　なお、ＲＮＡの配列は、ＤＮＡの編集を所望する標的配列に応じて適宜設計すればよい。また、ＲＮＡの合成は、当該分野で既知の任意の方法を用いて行うことができる。
　－真核細胞－
　本発明における「真核細胞」としては、例えば、動物細胞、植物細胞、藻細胞、真菌細胞が挙げられる。また動物細胞としては、例えば、哺乳動物細胞の他、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類の細胞が挙げられる。
　「動物細胞」には、例えば、動物の個体を構成している細胞、動物から摘出された器官・組織を構成する細胞、動物の組織に由来する培養細胞などが含まれる。具体的には、例えば、卵母細胞や精子などの生殖細胞；各段階の胚の胚細胞（例えば、１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、桑実期胚など）；誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞や胚性幹（ＥＳ）細胞などの幹細胞；線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、脳細胞、腎細胞などの体細胞などが挙げられる。ゲノム編集動物の作成に用いられる卵母細胞としては、受精前及び受精後の卵母細胞を利用することができるが、好ましくは受精後の卵母細胞、すなわち受精卵である。特に好ましくは、受精卵は前核期胚のものである。卵母細胞は、凍結保存されたものを解凍して用いることができる。
　本発明において「哺乳動物」とは、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を包含する概念である。非ヒト哺乳動物の例としては、ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、リスなどの齧歯類、ウサギなどのウサギ目、イヌ、ネコ、フェレットなどの食肉類などが挙げられる。上述の非ヒト哺乳動物は、家畜またはコンパニオンアニマル（愛玩動物）であってもよく、野生動物であってもよい。
　「植物細胞」としては、例えば、穀物類、油料作物、飼料作物、果物、野菜類の細胞が挙げられる。「植物細胞」には、例えば、植物の個体を構成している細胞、植物から分離した器官や組織を構成する細胞、植物の組織に由来する培養細胞などが含まれる。植物の器官や組織としては、例えば、葉、茎、茎頂（生長点）、根、塊茎、カルスなどが挙げられる。植物の例としては、イネ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、タバコ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーションなどが挙げられ、その繁殖材料（例えば、種子、塊根、塊茎など）も含まれる。
　－ＤＮＡの編集－
　本発明において、「真核細胞のＤＮＡを編集する」とは、真核細胞のＤＮＡの編集をインビボで行う工程であってもよく、インビトロで行う工程であってもよい。また、「ＤＮＡを編集する」とは、以下の類型に例示される操作（その組み合わせを含む）を意図する。
　なお、本明細書において、上記の文脈で用いられるＤＮＡは、細胞核内に存在するＤＮＡのみならず、ミトコンドリアＤＮＡなどの細胞核以外に存在するＤＮＡ、および外来性のＤＮＡをも包含する。
１．標的部位におけるＤＮＡ鎖を切断する。
２．標的部位におけるＤＮＡ鎖の塩基を欠失させる。
３．標的部位におけるＤＮＡ鎖に塩基を挿入する。
４．標的部位におけるＤＮＡ鎖の塩基を置換する。
５．標的部位におけるＤＮＡ鎖の塩基を修飾する。
６．標的部位におけるＤＮＡ（遺伝子）の転写を調節する。
　本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムの一つの態様においては、ＤＮＡ切断を導入する以外の方法で、標的ＤＮＡを修飾する酵素活性を有するタンパク質を利用する。この態様は、例えば、Ｃａｓ３あるいはカスケードを所望の酵素活性を有する異種タンパク質と融合し、キメラタンパク質とすることにより達成することができる。従って、本発明における「Ｃａｓ３」および「カスケード」には、このような融合タンパク質も含まれる。融合するタンパク質の酵素活性としては、例えば、デアミナーゼ活性（例えば、シチジンデアミナーゼ活性、アデノシンデアミナーゼ活性）、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、光回復酵素活性、およびグリコシラーゼ活性が含まれるが、これらに制限されない。この場合、必ずしも、Ｃａｓ３のヌクレアーゼ活性やヘリカーゼ活性は必要がないことから、Ｃａｓ３としては、これら活性の一部もしくは全部を欠失させた変異体（例えば、ＤドメインＨ７４Ａの変異体（ｄｎＣａｓ３）、ＳＦ２ドメインモチーフ１のＫ３２０Ｎの変異体（ｄｈＣａｓ３）、およびＳＦ２ドメインモチーフ３のＳ４８３Ａ／Ｔ４８５Ａのダブルの変異体（ｄｈ２Ｃａｓ３））を利用することができる。例えば、Ｃａｓ３のヌクレアーゼ活性の一部または全部を消失させた変異体とデアミナーゼとの融合タンパク質を本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムの構成要素とすることにより、標的部位における大きな欠失を生じさせることなく、塩基を置換することにより、精密なゲノム編集が可能となる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムへのデアミナーゼの適用の手法は公知であり（Ｎｉｓｈｉｄａ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ａｎｄ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ａｄａｐｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　ＤＯＩ：　１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ８７２９，（２０１６））、それを本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムに応用すればよい。
　本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムの他の態様においては、ＤＮＡ切断せずに、本システムの結合部位における遺伝子の転写を調節する。この態様は、例えば、Ｃａｓ３あるいはカスケードを所望の転写調節タンパク質と融合し、キメラタンパク質とすることにより達成することができる。従って、本発明における「Ｃａｓ３」および「カスケード」には、このような融合タンパク質も含まれる。転写調節タンパク質としては、例えば、光誘導性転写制御因子、小分子／薬剤反応性転写制御因子、転写因子、転写抑制因子などが挙げられるが、これらに制限されない。この場合、必ずしも、Ｃａｓ３のヌクレアーゼ活性やヘリカーゼ活性は必要がないことから、Ｃａｓ３としては、これら活性の一部もしくは全部を欠失させた変異体（例えば、ＤドメインＨ７４Ａの変異体（ｄｎＣａｓ３）、ＳＦ２ドメインモチーフ１のＫ３２０Ｎの変異体（ｄｈＣａｓ３）、およびＳＦ２ドメインモチーフ３のＳ４８３Ａ／Ｔ４８５Ａのダブルの変異体（ｄｈ２Ｃａｓ３））を利用することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムへの転写調節タンパク質の適用の手法は、当業者に公知である。
　また、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにおいて、例えば、Ｃａｓ３のヌクレアーゼ活性の一部もしくは全部を欠失させた変異体を利用する場合、他のヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をＣａｓ３またはカスケードと融合してもよい。このような態様も、本発明に含まれる。
　なお、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにおいて、Ｃａｓ３のヌクレアーゼ活性の一部もしくは全部を欠失させた変異体を利用し、ＤＮＡの編集において、他のタンパク質の活性を利用する場合には、本明細書における「ＤＮＡの切断活性」は、適宜、当該他のタンパク質が有する各種活性に読み替えるものとする。
　また、ＤＮＡの編集は、個体内の特定の細胞に含まれるＤＮＡに対して行われるものであってもよい。このようなＤＮＡの編集は、例えば、動植物の個体を構成する細胞のうち、特定の細胞を標的として行うことができる。
　本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを構成する分子をポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形態で真核細胞に導入する方法は、特に限定されない。例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、ウイルベクターを用いた感染などの方法が挙げられる。このような方法は、「Ｌｅｏｎａｒｄ　Ｇ．　Ｄａｖｉｓｅｔ　ａｌ．，　Ｂａｓｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，　１９８６」など、多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
　本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを分子をタンパク質の形態で真核細胞に導入する方法は、特に限定されない。例えば、エレクトロポレーション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、マイクロインジェクションなどが挙げられる。
　本発明によるＤＮＡの編集は、様々な分野に応用することができる。応用には、例えば、遺伝子治療、品種改良、トランスジェニック動物または細胞の作製、有用物質の生産、生命科学研究などが含まれる。
　細胞から非ヒト個体を作製する方法としては、公知の方法を利用することができる。動物において細胞から非ヒト個体を作製する場合、通常、生殖細胞又は多能性幹細胞が利用される。例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを構成する分子を卵母細胞に導入し、得られた卵母細胞を次いで、偽妊娠状態にした雌非ヒト哺乳動物の子宮に移植し、その後産仔を得る。移植は１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、又は桑実期胚の受精卵にて行うことができる。卵母細胞は必要に応じて、移植されるまで適当な条件下にて培養することができる。卵母細胞の移植及び培養は従来公知の手法に基づいて行うことができる（Ｎａｇｙ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　２００３）。得られた非ヒト個体からは、所望のＤＮＡが編集された子孫やクローンを得ることもできる。
　また、植物においては、古くから、その体細胞が分化全能性を有していることが知られており、様々な植物において、植物細胞から植物体を再生する方法が確立されている。従って、例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを構成する分子を植物細胞に導入し、得られた植物細胞から植物体を再生することにより、所望のＤＮＡがノックインされた植物体を得ることができる。得られた植物体からは、所望のＤＮＡが編集された子孫、クローン、または繁殖材料を得ることもできる。組織培養により植物の組織を再分化させて個体を得る方法としては、本技術分野において確立された方法を利用することができる（形質転換プロトコール［植物編］　田部井豊・編　化学同人　ｐｐ．３４０－３４７（２０１２））。
　［２］ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムに用いられるキット
　本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムに用いられるキットは、以下の（Ａ）および（Ｂ）を含む。
　（Ａ）Ｃａｓ３タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
　（Ｂ）カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
　さらに、ｃｒＲＮＡ、該ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチド含む発現ベクターを含んでもよい。
　本発明のキットの構成要素は、全てまたは一部が混合された態様であってもよく、各々が独立している態様であってもよい。
　本発明のキットは、例えば、医薬品、食品、畜産、水産、工業、バイオ工学、生命科学研究などの分野に利用できる。
　以下、本発明のキットについて、医薬品（薬剤）を想定して説明する。なお、上記キットを畜産、バイオ工学、生命科学研究などの分野で用いる場合には、以下の説明を、当該分野の技術常識に基づいて適宜置き換えることにより実施できる。
　本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを用いて、ヒトを含む動物細胞のＤＮＡを編集するための医薬品は、常法により調製されうる。より具体的には、上記本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを構成する分子を、例えば、医薬品添加物と調合することによって調製されうる。
　ここで「医薬品添加物」とは、医薬品に含まれる有効成分以外の物質を意図する。医薬品添加物は、製剤化を容易にする、品質の安定化を図る、有用性を高めるなどの目的のために、医薬品に含まれる物質である。一例において、上記医薬品添加物は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動化剤（固形防止剤）、着色剤、カプセル被膜、コーティング剤、可塑剤、矯味剤、甘味剤、着香剤、溶剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤（粘着剤）、粘稠剤、ｐＨ調整剤（酸性化剤、アルカリ化剤、緩衝剤）、湿潤剤（可溶化剤）、抗菌性保存剤、キレート剤、坐剤基材、軟膏基剤、硬化剤、軟化剤、医療用水、噴射剤、安定剤、保存剤、でありうる。これらの医薬品添加物は、意図された剤型および投与経路、ならびに標準的な薬学的慣行に従って、当業者によって容易に選択されうる。
　また、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを利用して動物細胞のＤＮＡを編集するための医薬品は、さらなる有効成分を含んでいてよい。上記さらなる有効成分としては、特に限定されず、当業者により適宜設計することができる。
　以上に説明した有効成分および医薬品添加物の具体例は、例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）、日本国厚生労働省などが策定している基準により、知ることができる。
　医薬品を所望の細胞に送達する方法としては、例えば、該細胞を標的とするウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター等）、該細胞を特異的に認識する抗体などを用いた方法が挙げられる。医薬品は、目的に応じて任意の剤型を取りうる。また上記医薬品は、医師または医療従事者により、適宜処方される。
　本発明のキットは、さらに、使用説明書を備えていることが好ましい。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記実施例のみに限定されるものではない。
　Ａ．真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムの確立
　〔材料と方法〕
　［１］標的配列を含むレポーターベクターの作製
　標的配列は、ヒトＣＣＲ５遺伝子由来の配列（配列番号１９）、および大腸菌のＣＲＩＳＰＲのスペーサー配列（配列番号２２）とした。
　標的配列をベクターに挿入するために、ヒトＣＣＲ５遺伝子由来の標的配列（配列番号１９）を含む合成ポリヌクレオチド（配列番号２０）、および上記標的配列（配列番号１９）に相補的な配列を含む合成ポリヌクレオチド（配列番号２１）を用意した。同様に、大腸菌のＣＲＩＳＰＲのスペーサー配列由来の標的配列（配列番号２２）を含む合成ポリヌクレオチド（配列番号２３）、および上記標的配列（配列番号２２）に相補的な配列を含む合成ポリヌクレオチド（配列番号２４）を用意した。上記の合成ポリヌクレオチドは、全て北海道システム・サイエンス株式会社から入手した。
　上記のポリヌクレオチドを、［Ｓａｋｕｍａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．　（２０１３）　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ＴＡＬＥＮ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ａｎｉｍａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｇｅｎｅｓ　ｔｏ　Ｃｅｌｌｓ，　Ｖｏｌ．１８　（Ｉｓｓｕｅ　４），　ｐｐ．３１５－３２６］に記載の方法により、レポーターベクターに挿入した。概略を示すと以下の通りである。まず、互いに相補的な配列を有するポリヌクレオチド（配列番号２０のポリヌクレオチドおよび配列番号２１のポリヌクレオチド；配列番号２３のポリヌクレオチドおよび配列番号２４のポリヌクレオチド）を、９５℃にて５分間加熱し、その後室温まで冷却して、ハイブリダイズさせた。上記の工程には、ブロックインキュベーター（ＢＩ－５１５Ａ、アステック社）を用いた。次に、ハイブリダイズさせて二本鎖構造を形成したポリヌクレオチドを、基材ベクターに挿入し、レポーターベクターとした。
　作製したレポーターベクターの配列を、配列番号３１（ヒトＣＣＲ５遺伝子由来の標的配列を含むレポーターベクター）および配列番号３２（大腸菌のＣＲＩＳＰＲのスペーサー配列由来の標的配列を含むレポーターベクター）に示す。また、レポーターベクターの構造を、図４の（ｄ）に示す。
　［２］Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７およびｃｒＲＮＡ発現ベクターの作製
　［インサートの増幅および調製］
　Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６およびＣａｓ７をコードする、改変された塩基配列を有するポリヌクレオチド（それぞれ、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６）については、まず、配列番号２－配列番号３－配列番号６－配列番号４－配列番号５の順に連結されたポリヌクレオチド（Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）－Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）－Ｃａｓ７－Ｃａｓ５－Ｃａｓ６の順に、それぞれをコードする塩基配列が連結されたポリヌクレオチド）を、ジェンスクリプト社に製造委託し、入手した。Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）－Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）－Ｃａｓ７－Ｃａｓ５－Ｃａｓ６の各タンパク質をコードする塩基配列間は、２Ａペプチド（アミノ酸配列：ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５８））で連結した。
　なお、２Ａペプチドをコードする塩基配列は、それぞれのＣａｓタンパク質連結部によって若干異なり、以下の通りであった。Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）とＣｓｅ２（Ｃａｓ１１）との間における配列：ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＡＧＧＣＣＣＣ（配列番号５９）。Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）とＣａｓ７との間における配列：ＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＡＴＴＴＴＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴ（配列番号６０）。Ｃａｓ７とＣａｓ５との間における配列：ＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＴＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＡ（配列番号６１）。Ｃａｓ５とＣａｓ６との間における配列：ＧＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＴＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＴＣＣＡＧＧＡＣＣＧ（配列番号６２）。
　次いで、下表のＰＣＲ条件（プライマーおよびタイムコース）にて、各ポリヌクレオチドを増幅した。ＰＣＲには、２７２０　Ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ（ａｐｐｌｉｅｄ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ｃｒＲＮＡを発現させるための塩基配列を有するポリヌクレオチドとして、下記の相補的な配列を有するポリヌクレオチドを入手した。
１．ヒトＣＣＲ５遺伝子由来の配列に対応するｃｒＲＮＡを発現させるためのポリヌクレオチド（配列番号２５および２６、北海道システムサイエンス社より入手）
２．大腸菌のＣＲＩＳＰＲのスペーサー配列に対応するｃｒＲＮＡを発現させるためのポリヌクレオチド（配列番号２７および２８、北海道システムサイエンス社より入手）
３．ヒトＥＭＸ１遺伝子由来の配列に対応するｃｒＲＮＡを発現させるためのポリヌクレオチド（配列番号２９および３０、ファスマック社より入手）。
　［ライゲーションおよび形質転換］
　基材プラスミドとして、ｐＰＢ－ＣＡＧ－ＥＢＮＸＮ（Ｓａｎｇｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒより供与）を用いた。ＮＥＢバッファー中で、基材プラスミド１．６μｇと、制限酵素ＢｇｌＩＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）１μｌおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）０．５μｌとを混合し、３７℃にて２時間反応させた。切断された基材プラスミドは、Ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）にて精製した。
　このように調製した基材プラスミドおよび上記インサートを、Ｇｉｂｓｏｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙシステムにてライゲーションした。ライゲーションでは、基材プラスミドとインサートとの比率が１：１になるようにし、Ｇｉｂｓｏｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙシステムのプロトコールに従って行った（５０℃で２５分間、反応液の全容量：８μＬ）。
　次いで、上記で得られたプラスミドの溶液（ライゲーション反応液）６μＬと、コンピテントセル（竹田研究室作製）とを用いて、通常の方法により、形質転換を行った。
　その後、アルカリプレップ法にて、形質転換した大腸菌からプラスミドベクターを精製した。簡潔には、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてプラスミドベクターを回収し、回収したプラスミドベクターをエタノール沈殿法にて精製後、ＴＥ緩衝液中で１μｇ／μＬの濃度となるように調製した。
　各プラスミドベクターの構造を、図４の（ａ）～（ｃ）に示す。また、プレｃｒＲＮＡの発現ベクターの塩基配列を、配列番号３３（ヒトＣＣＲ５遺伝子由来の配列に対応するｃｒＲＮＡを発現させる発現ベクター）、配列番号３４（大腸菌のＣＲＩＳＰＲのスペーサー配列に対応するｃｒＲＮＡを発現させる発現ベクター）および配列番号３５（ヒトＥＭＸ１遺伝子由来の配列に対応するｃｒＲＮＡを発現させる発現ベクター）に示す。
　［３］Ｃａｓ３発現ベクターの作製
　Ｃａｓ３をコードする、改変された塩基配列を有するポリヌクレオチド（配列番号１）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社より入手した。具体的には、上記のポリヌクレオチドが組み込まれているｐＵＣ５７　ｖｅｃｔｏｒを、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社より入手した。
　上記のベクターを、制限酵素ＮｏｔＩで切断した。次に、Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ社）を２Ｕ、および２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ社）を１μＬを用いて、フラグメントの断端を平滑化させた。その後、Ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、上記フラグメントを精製した。精製されたフラグメントを、制限酵素ＸｈｏＩでさらに切断し、Ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。
　精製されたフラグメントを、基材プラスミド（ｐＴＬ２－ＣＡＧ－ＩＲＥＳ－ＮＥＯ　ｖｅｃｔｏｒ、竹田研究室作製）およびライゲーションキット（Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ、タカラバイオ社）を用いて、ライゲーションした。ライゲーションした。その後、［２］と同じ操作により、形質転換および精製を行った。回収したプラスミドベクターは、ＴＥ緩衝液中で１μｇ／μＬの濃度となるように調製した。
　［４］ＢＰＮＬＳを含むプラスミドベクターの作製
　ＢＰＮＬＳを５’末端および３’末端に連結させた、Ｃａｓ３、Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６およびＣａｓ７発現ベクターを作製した（図７を参照）。
　ＢＰＮＬＳを両末端に含む各Ｃａｓタンパク質群についてのインサートの作製は、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃに依頼した。上記インサートの具体的な配列は、（ＡＧＡＴＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣ：配列番号５６）－（配列番号７～１２のいずれか１つ）－（ＴＡＡＴＡＴＣＣＴＣＧＡＧ：配列番号５７）である。配列番号５６は、ＢｇＩＩＩによる切断箇所を設けた配列である。配列番号５７は、ＸｈｏＩによる切断箇所を設けた配列である。
　上記配列が組み込まれているｐＭＫ　ｖｅｃｔｏｒを、制限酵素ＢｇＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、Ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。精製したフラグメントを、基材プラスミド（ｐＰＢ－ＣＡＧ－ＥＢＮＸＮ、Ｓａｎｇｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒより供与）およびライゲーションキット（Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ、タカラバイオ社）を用いて、ライゲーションした。その後、［２］と同じ操作により、形質転換および精製を行った。回収したプラスミドベクターは、ＴＥ緩衝液中で１μｇ／μＬの濃度となるように調製した。
　［５］カスケード（２Ａ）を含むプラスミドベクターの作製
　Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５およびＣａｓ６が、この順に連結された塩基配列の発現ベクターを作製した。より具体的には、（ＮＬＳ－Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）：配列番号２）－２Ａ－（ＮＬＳ－Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）：配列番号３）－２Ａ－（ＮＬＳ－Ｃａｓ７：配列番号６）－２Ａ－（ＮＬＳ－Ｃａｓ５：配列番号４）－２Ａ－（ＮＬＳ－Ｃａｓ６：配列番号５）の順に配置された発現ベクターを作製した（図８参照）。なお、ＮＬＳのアミノ酸配列はＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５２）、塩基配列はＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＴＧ（配列番号５３）である。また、２Ａペプチドのアミノ酸配列はＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５８）である（対応する塩基配列は、それぞれ配列番号５９～６２である）。
　上述の塩基配列を有するポリペプチドを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔより入手した。上記配列が組み込まれているｐＵＣ５７　ｖｅｃｔｏｒを、制限酵素ＥｃｏＲＩ－ＨＦで切断し、Ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。精製したフラグメントを、基材プラスミド（ｐＴＬ２－ＣＡＧ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ　ｖｅｃｔｏｒ、竹田研究室作製）およびライゲーションキット（Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ、タカラバイオ社）を用いて、ライゲーションした。その後、［２］と同じ操作により、形質転換および精製を行った。回収したプラスミドベクターは、ＴＥ緩衝液中で１μｇ／μＬの濃度となるように調製した。
　〔実施例Ａ－１〕
　塩基配列を改変し、核移行シグナルを付加したＣａｓ３、Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６およびＣａｓ７と、ｃｒＲＮＡとをＨＥＫ（ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｋｉｄｎｅｙ）２９３Ｔ細胞に発現させ、外因性ＤＮＡの標的配列の切断活性を評価した。
　トランスフェクションに先立ち、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍディッシュ中で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養は、ＥＦ培地（ＧＩＢＣＯ社）で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下にて行った。ＥＦ培地中におけるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の密度は、３×１０４／１００μＬに調製した。
　また、上記レポーターベクター１００ｎｇ；Ｃａｓ３プラスミド、Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）プラスミド、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）プラスミド、Ｃａｓ５プラスミド、Ｃａｓ６プラスミド、Ｃａｓ７プラスミドおよびｃｒＲＮＡプラスミド各２００ｎｇ；ｐＲＬ－ＴＫベクター（レニラルシフェラーゼを発現可能、Ｐｒｏｍｅｇａ社）６０ｎｇ；ならびに、ｐＢｌｕｅｃｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（＋）ベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）３００ｎｇを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）２５μＬに混合した。レポーターベクターとして、ＣＣＲ５由来の標的配列を有するレポーターベクターを用いた条件が図１の１に相当し、大腸菌のＣＲＩＳＰＲのスペーサー配列を有するレポーターベクターを用いた条件が図１の１０に相当する。
　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）１．５μＬとＯｐｔｉＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）２５μＬとを混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、上記のプラスミド＋ＯｐｔｉＭＥＭ　ｍｉｘｔｕｒｅとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００＋ＯｐｔｉＭＥＭ　ｍｉｘｔｕｒｅとを混合し、室温で２０分間インキュベートした。得られた混合物を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む上記ＥＦ培地１ｍＬと混合し、９６ウェルプレートに播種した（それぞれのベクターの組み合わせにつき１ウェルずつ、合計１２ウェルに播種した）。
　３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下にて２４時間培養後、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のプロトコールに従い、ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイを行った。ルシフェラーゼおよびレニラルシフェラーゼの測定には、Ｃｅｎｔｒｏ　ＸＳ３　ＬＢ　９６０（ＢＥＲＴＨＯＬＤ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を用いた。
　対照実験として、以下の条件で同様の実験を行った。
１．Ｃａｓ３プラスミド、Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）プラスミド、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）プラスミド、Ｃａｓ５プラスミド、Ｃａｓ６プラスミドまたはＣａｓ７プラスミドのいずれか１つの代わりに、同量のｐＢｌｕｅｃｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（＋）ベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を混合し、発現させた（図１の２～７）。
２．上記の操作手順で用いたｃｒＲＮＡプラスミドの代わりに、標的配列とは相補的でないｃｒＲＮＡを発現させるプラスミドを混合した。すなわち、ＣＣＲ５遺伝子由来の標的配列に対しては、大腸菌のＣＲＩＳＰＲのスペーサー配列に対応するｃｒＲＮＡを発現させるプラスミドを混合させ（図１の８）、大腸菌のＣＲＩＳＰＲのスペーサー配列を標的とする場合は、ＣＣＲ５遺伝子由来の配列に対応するｃｒＲＮＡを発現させるプラスミドを混合し、発現させた（図１の１１）。
３．ネガティブコントロールとして、ＣＣＲ５由来の標的配列を有するレポーターベクターのみ（図１の９）、大腸菌のＣＲＩＳＰＲのスペーサー配列を有するレポーターベクターのみ（図１の１２）を発現させた。
　（結果）
　ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイの結果を図１上のグラフに、実験条件を図１下の表に示した。図１の（ｂ）中、「ＣＣＲ５－ｔａｒｇｅｔ」および「ｓｐａｃｅｒ－ｔａｒｇｅｔ」は、それぞれ、ＣＣＲ５由来の標的配列および大腸菌のＣＲＩＳＰＲのスペーサー配列を表す。また、「ＣＣＲ５－ｃｒＲＮＡ」および「ｓｐａｃｅｒ－ｃｒＲＮＡ」は、それぞれ、上記ＣＣＲ５－ｔａｒｇｅｔと相補的な配列およびｓｐａｃｅｒ－ｔａｒｇｅｔと相補的な配列を表す。
　図１において、Ｃａｓ３プラスミド、Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）プラスミド、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）プラスミド、Ｃａｓ５プラスミド、Ｃａｓ６プラスミドおよびＣａｓ７プラスミドの全てと、標的配列に相補的なｃｒＲＮＡプラスミドとを導入したシステムは、その他のシステムと比較して、高い切断活性を示した（１と２～８、１０と１１とをそれぞれ比較）。したがって、本発明の一実施形態に係る発現ベクターを用いることにより、ヒト細胞中において、Ｃａｓ３、Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６およびＣａｓ７を発現させることが可能であることが分かった。
　また、上記発現ベクターをヒト細胞に導入することにより、ヒト細胞中でＣａｓ３、カスケードおよびｃｒＲＮＡの複合体が形成され、標的配列を切断することが示唆された。
　さらに、図１において、８と９、および１１と１２とを比較すると、標的配列と相補的でないｃｒＲＮＡを発現させたシステムにおいては、切断活性がネガティブコントロールと同等のレベルであった。すなわち、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムは、哺乳動物細胞内において、ｃｒＲＮＡと相補的な配列を特異的に切断できることが示唆された。
　〔実施例Ａ－２〕
　実施例Ａ－１と同様の方法を用いて、タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによりヒト細胞の内因性ＤＮＡを切断できるか否かを評価するための実験を行った。
　具体的には、ヒト細胞において塩基配列を改変し、核移行シグナルを付加したＣａｓ３、Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６およびＣａｓ７と、プレｃｒＲＮＡとを発現させ、上記細胞の内因性ＣＣＲ５遺伝子の配列が切断されるか否かを評価した。
　実施例Ａ－１と同じＨＥＫ２３９Ｔ細胞を、１×１０５個／ウェルの密度で、２４ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。
　Ｃａｓ３プラスミド１μｇ、Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）プラスミド１．３μｇ、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）プラスミド１．３μｇ、Ｃａｓ５プラスミド１．１μｇ、Ｃａｓ６プラスミド０．８μｇ、Ｃａｓ７プラスミド０．３μｇ、およびｃｒＲＮＡプラスミド１μｇを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）５０μＬに混合した。次いで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）５μＬ、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）５０μＬ、およびＥＦ培地１ｍＬの混合物を、上記のＤＮＡ混合物に加えた。その後、得られた混合物１ｍＬを、上記２４ウェルプレートに添加した。
　３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下にて２４時間培養後、ＥＦ培地１ｍＬで培地を交換した。トランスフェクションから４８時間後（培地交換から２４時間後）、細胞を回収し、ＰＢＳ中で１×１０４個／５μＬの濃度に調整した。
　上記細胞を、９５℃にて１０分間加熱した。次に、プロテイナーゼＫを１０ｍｇ加え、５５℃にて７０分間インキュベートした。さらに、９５℃にて１０分間加熱処理をしたものを、ＰＣＲの鋳型として用いた。
　上記鋳型１０μＬを、２ステップＰＣＲを３５サイクル施すことにより、増幅させた。このとき、ＰＣＲのプライマーには、配列番号４７および４８の配列を有するプライマーを使用した。また、ＤＮＡポリメラーゼにはKOD FX（東洋紡社）を用い、２ステップＰＣＲの手順はＫＯＤ　ＦＸに添付のプロトコールに従った。ＰＣＲにより増幅された産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。具体的な手順は、上記キットに添付のプロトコールに従った。
　ｒＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）を用いて、得られた精製ＤＮＡの３’末端にｄＡを付加した。上記精製ＤＮＡを２％アガロースゲル中で電気泳動させ、約５００～７００ｂｐのバンドを切り出した後、Ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、切り出したゲルからＤＮＡを抽出、精製した。次に、ｐＧＥＭ－Ｔ　ｅａｓｙ　ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＴＡクローニングを行い、上記ＤＮＡをクローニングした。最後に、アルカリプレップ法によってクローニングされたＤＮＡを抽出し、サンガーシーケンスで解析した。解析には、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３７３０　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。
　本実施例におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの標的となる内因性ＣＣＲ５遺伝子配列の概要を、図２に基づいて説明する。なお図２では、エキソンは大文字で、イントロンは小文字で表した。
　本実施例では、第３染色体短腕（Ｐ）２１領域に位置する、ＣＣＲ５遺伝子内の配列を標的とした（図２；配列番号４６にＣＣＲ５の塩基配列の全長を示す）。具体的には、ＣＣＲ５遺伝子のエキソン３内の配列を標的配列とした。コントロールとして、Ｃａｓ９の標的配列も、ほぼ同じ位置に配置した。すなわち、下線部の配列全体がタイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの標的配列（ＡＡＧおよびそれに続く３２塩基）であり、二重下線部の配列がＣａｓ９の標的配列（ＣＧＧおよびそれに先立つ２０塩基）である。タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの標的配列（ＡＡＧおよびそれに続く３２塩基）へのガイドを可能とするように、ｃｒＲＮＡの配列を設計した。
　（結果）
　上記実験の結果、元々の塩基配列と比較して、４０１ｂｐが欠失しているクローン１、３４１ｂｐが欠失しているクローン２、２６８ｂｐが欠失しているクローン３、および３４４ｂｐが欠失しているクローン４が得られた（図３Ａ～Ｄ）。このことより、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムによって、ヒト細胞の内因性ＤＮＡを欠失できることが示された。すなわち、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによって、ヒト細胞のＤＮＡの編集が可能であることが示唆された。
　本実施例では、塩基対を欠失しているクローンが観察された。この事実は、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムによれば、複数の箇所でＤＮＡ切断が生じることを支持している。
　本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにより、数百塩基対（２６８～４０１ｂｐ）のＤＮＡが欠失した。これは、Ｃａｓ９を用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにより得られる欠失（通常ＤＮＡ上の一箇所のみで切断）よりも、広範囲に渡るものであった。
　〔実施例Ａ－３〕
　実施例Ａ－１と同様の方法を用いて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムによりヒト細胞の内因性ＤＮＡを切断できるか否かを評価するための、実験を行った。
　具体的には、ヒト細胞において塩基配列を改変し、核移行シグナルを付加したＣａｓ３、Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６およびＣａｓ７と、プレｃｒＲＮＡとを発現させ、上記細胞の内因性ＥＭＸ１遺伝子の配列が切断されるか否かを評価した。
　実施例Ａ－１と同じＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１×１０５個／ウェルの密度で、２４ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。
　Ｃａｓ３プラスミド５００ｎｇ、Ｃｓｅ１（Ｃａｓ８）プラスミド５００ｎｇ、Ｃｓｅ２（Ｃａｓ１１）プラスミド１μｇ、Ｃａｓ５プラスミド１μｇ、Ｃａｓ６プラスミド１μｇ、Ｃａｓ７プラスミド３μｇ、およびｃｒＲＮＡプラスミド５００μｇを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）５０μＬに混合した。上記の混合物に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）４μＬ、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）５０μＬを、さらに加えて、混合した。得られた混合物を、室温にて２０分間インキュベートした後、上記ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に添加した。
　ここで、実施例Ａ－３において用いた、Ｃａｓタンパク質群の発現ベクターの構造を、図７に示す。図７に示されているように、上記発現ベクターは、Ｃａｓタンパク質群をコードする配列の前後をＢＰＮＬＳ（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ　ＮＬＳ）で挟んだものである（［Ｓｕｚｕｋｉ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．（２０１６）　Ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｖｉａ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，　Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．５４０　（Ｉｓｓｕｅ　７６３１），　ｐｐ．１４４－１４９］を参照）。ＢＰＮＬＳのアミノ酸配列はＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＥ（配列番号５４）、塩基配列はＡＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＧＡＡＴＴＴＧＡＧＴＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＡ（配列番号５５）である。
　上記ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下にて２４時間培養した後、ＥＦ培地１ｍＬ（１ウェルあたり１ｍＬ）と培地を交換した。トランスフェクションから４８時間後（培地交換から２４時間後）、細胞を回収し、ＰＢＳ中で１×１０４個／５μＬの濃度に調整した。
　上記細胞を、９５℃にて１０分間加熱した。次に、プロテイナーゼＫを１０ｍｇ加え、５５℃にて７０分間インキュベートした。さらに、９５℃にて１０分間加熱処理をしたものを、ＰＣＲの鋳型として用いた。
　上記鋳型１０μＬを、３ステップＰＣＲを４０サイクル施すことにより、増幅させた。このとき、ＰＣＲのプライマーには、配列番号５０および５１の配列を有するプライマーを使用した。また、ＤＮＡポリメラーゼにはＨｏｔｓｔａｒｔａｑ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、３ステップＰＣＲの手順はＨｏｔｓｔａｒｔａｑに添付のプロトコールに従った。ＰＣＲにより増幅された産物は、２％アガロースゲル中で電気泳動させ、約９００～１１００ｂｐのバンドを切り出した後、Ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、切り出したゲルからＤＮＡを抽出、精製した。具体的な手順は、上記キットに添付のプロトコールに従った。
　次に、ｐＧＥＭ－Ｔ　ｅａｓｙ　ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＴＡクローニングを行い、上記ＤＮＡをクローニングした。最後に、アルカリプレップ法によってクローニングされたＤＮＡを抽出し、サンガーシーケンスで解析した。解析には、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３７３０　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。
　実施例Ａ－３においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムの標的となる、内因性ＥＭＸ１遺伝子配列の概要を、図５に基づいて説明する。なお図５では、エキソンは大文字で、イントロンは小文字で表した。
　実施例Ａ－３では、第２染色体短腕（Ｐ）１３領域に位置する、ＥＭＸ１遺伝子内の配列を標的とした（図５；配列番号４９にＥＭＸ１の塩基配列の全長を示す）。具体的には、ＥＭＸ１遺伝子のエキソン３内の配列を標的配列とした。コントロールとして、Ｃａｓ９の標的配列も、ほぼ同じ位置に配置した。すなわち、より上流にある下線部の配列がタイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの標的配列（ＡＡＧおよびそれに続く３２塩基）であり、より下流にある下線部の配列がＣａｓ９の標的配列（ＴＧＧおよびそれに先立つ２０塩基）である。実施例Ａ－３で用いたｃｒＲＮＡの配列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムの標的配列（ＡＡＧおよびそれに続く３２塩基）へのガイドを可能とするように設計されていた。
　（結果）
　上記実験の結果、元々の塩基配列と比較して、５１３ｂｐおよび３６３ｂｐの２箇所が欠失しているクローン１、ならびに６９４ｂｐが欠失しているクローン２が得られた（図６Ａ、Ｂ）。この実験結果からも、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムによって、ヒト細胞の内因性ＤＮＡを欠失できることが示された。すなわち、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムによって、ヒト細胞のＤＮＡの編集が可能であることが示唆された。
　また、二本鎖ＤＮＡの２箇所以上において切断が生じていること、および数百塩基対のＤＮＡが欠失することも実施例Ａ－２と同様であった。したがって、実施例Ａ－３の結果は、実施例Ａ－２から得られた示唆を、より強固に支持するものである。
　〔実施例Ａ－４〕
　塩基配列を改変し、さらにカスケードタンパク質をコードする塩基配列を連結したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に発現させ、外因性ＤＮＡの標的配列の切断活性を評価した。
　実施例Ａ－４においては、レポーターベクター１００ｎｇ；Ｃａｓ３プラスミド、カスケード（２Ａ）プラスミドおよびｃｒＲＮＡプラスミド各２００ｎｇ；ｐＲＬ－ＴＫベクター（レニラルシフェラーゼを発現可能、Ｐｒｏｍｅｇａ社）６０ｎｇ；ならびに、ｐＢｌｕｅｃｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（＋）ベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）３００ｎｇを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）２５μＬに混合した。レポーターベクターとして、ＣＣＲ５由来の標的配列を有するレポーターベクターを用いた条件が図９の（ｂ）の１に相当し、大腸菌のＣＲＩＳＰＲのスペーサー配列を有するレポーターベクターを用いた条件が図９の（ｂ）の６に相当する。
　ここで、上記レポーターベクターは、〔製造例〕の［１］で製作した２種類のレポーターベクター（すなわち、図４の（ｄ）に示されている構造のベクター）を用いた。また、上記カスケード（２Ａ）プラスミドは、〔製造例〕の［４］で製作した発現ベクター（すなわち、図８に示されている構造のベクター）を用いた。
　上記の発現ベクターを用いた以外は、実施例Ａ－１と同様の手法により、ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイを行った。
　また、対照実験として、以下の条件で同様の実験を行った。
１．Ｃａｓ３プラスミドおよびカスケード（２Ａ）プラスミドのいずれか一方の代わりに、同量のｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（＋）ベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を混合し、発現させた（図９の２および３）。
２．上記の操作手順で用いたｃｒＲＮＡプラスミドの代わりに、標的配列とは相補的でないｃｒＲＮＡを発現させるプラスミドを混合した。すなわち、ＣＣＲ５遺伝子由来の標的配列に対しては、大腸菌のＣＲＩＳＰＲのスペーサー配列に対応するｃｒＲＮＡを発現させるプラスミドを混合させ（図９の４）、大腸菌のＣＲＩＳＰＲのスペーサー配列を標的とする場合は、ＣＣＲ５遺伝子由来の配列に対応するｇＲＮＡを発現させるプラスミドを混合し、発現させた（図９の７）。
３．ネガティブコントロールとして、ＣＣＲ５由来の標的配列を有するレポーターベクターのみ（図９の５）、大腸菌のＣＲＩＳＰＲのスペーサー配列を有するレポーターベクターのみ（図９の８）を発現させた。
　（結果）
　ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイの結果を図９上のグラフに、実験条件を図９下の表に示した。図９において、「ＣＣＲ５－ｔａｒｇｅｔ」および「ｓｐａｃｅｒ－ｔａｒｇｅｔ」は、それぞれ、ＣＣＲ５由来の標的配列および大腸菌のＣＲＩＳＰＲのスペーサー配列を表す。また、「ＣＣＲ５－ｃｒＲＮＡ」および「ｓｐａｃｅｒ－ｃｒＲＮＡ」は、それぞれ、上記ＣＣＲ５－ｔａｒｇｅｔと相補的な配列およびｓｐａｃｅｒ－ｔａｒｇｅｔと相補的な配列を表す。
　図９に示されているように、Ｃａｓ３プラスミドおよびカスケード（２Ａ）プラスミドの両方と、標的配列に相補的なｃｒＲＮＡプラスミドとを導入したシステムは、その他のシステムと比較して、有意に高い切断活性を示した（１と２～５、６と７～８とをそれぞれ比較）。これより、カスケードタンパク質をコードする塩基配列を連結して発現させたシステムにおいても、本発明の一実施形態に係るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによれば、哺乳動物細胞内において、ｃｒＲＮＡと相補的な配列を特異的に切断できることが示唆された。
　Ｂ．真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムによるゲノム編集に影響を与える要素などの検証
　〔材料と方法〕
　［１］Ｃａｓ遺伝子とｃｒＲＮＡの構成
　ｂｐＮＬＳをそれぞれの５’側および３’側に付加した、大腸菌Ｋ－１２株由来のＣａｓ３とカスケードの構成遺伝子（Ｃｓｅ１，　Ｃｓｅ２，　Ｃａｓ５，　Ｃａｓ６，　Ｃａｓ７）を設計し、哺乳動物細胞にコドンオプティマイズ後に遺伝子合成によりクローニングした。これらの遺伝子は、サンガー研究所より寄贈されたｐＰＢ－ＣＡＧ．ＥＢＮＸＮプラスミドのＣＡＧプロモーターの下流にサブクローニングした。Ｈ７４Ａ（ｄｅａｄ　ｎｉｃｋａｓｅ；　ｄｎ）、Ｋ３２０Ｎ（ｄｅａｄ　ｈｅｌｉｃａｓｅ；　ｄｈ）、Ｓ４８３ＡとＴ４８５Ａの二重変異体（ｄｅａｄ　ｈｅｌｉｃａｓｅ　ｖｅｒ．２；　ｄｈ２）といったＣａｓ３の変異体は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＭＡＸのＰＣＲ産物をセルフライゲーションすることで作製した。ｃｒＲＮＡの発現プラスミドに関して、Ｕ６プロモーター下のスペーサーの位置に２カ所のＢｂｓＩ制限酵素部位を持っているｃｒＲＮＡの配列を合成した。全てのｃｒＲＮＡ発現プラスミドは、ＢｂｓＩ制限酵素サイトに、標的配列の３２塩基対の二重鎖オリゴを挿入することで作製した。
　Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ発現プラスミドであるｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ－ＣＢｈ－ｈＳｐＣａｓ９は、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した。ｇＲＮＡを設計するために、ヒトゲノムでのユニークな標的部位を予測するＣＲＩＳＰＲ　ｗｅｂ　ｔｏｏｌ、ＣＲＩＳＰＲ　ｄｅｓｉｇｎ　ｔｏｏｌ、および／またはＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔを用いた。標的配列は、Ｆｅｎｇ　Ｚｈａｎｇ研究所のプロトコルに従って、ｐＸ３３０のｓｇＲＮＡスキャフォールドにクローニングした。
　２カ所のＢｓａＩ制限酵素部位を含むＳＳＡレポータープラスミドは、広島大学の山本卓教授より寄贈された。ゲノム領域の標的配列は、ＢｓａＩサイトに挿入した。レニラルシフェラーゼベクターとして、ｐＲＬ－ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を入手した。全てのプラスミドは、ＰｕｒｅＬｉｎｋ　ＨｉＰｕｒｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて、ミディプレップもしくはマキシプレップ法により準備した。
　［２］ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのＤＮＡ切断活性の評価
　哺乳動物細胞でＤＮＡ切断活性を検出するために、実施例Ａと同様に、ＳＳＡアッセイを実施した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％胎児ウシ血清を加えたｈｉｇｈ－Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ社）で、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。０．５×１０４個の細胞を９６穴プレートのウェルに播種し、２４時間後に、Ｃａｓ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、ｃｒＲＮＡ発現プラスミド（それぞれ１００ｎｇ）、ＳＳＡレポーターベクター（１００ｎｇ）、レニラルシフェラーゼベクター（６０ｎｇ）を、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００およびＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、わずかに修正したプロトコルに従い、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、プロトコルに従って、デュアルルシフェラーゼアッセイを行った。
　［３］ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのインデルの検出
　２．５ｘ１０４個の細胞を２４穴プレートのウェルに播種した２４時間後に、Ｃａｓ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、ｃｒＲＮＡ発現プラスミド（それぞれ２５０ｎｇ）を、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００とＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用い、わずかに修正したプロトコルに従って、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後、Ｔｉｓｓｕｅ　ＸＳ　ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ－ｂｉｏ社）を用いて、プロトコルに従い、回収した細胞から全ＤＮＡを抽出した。標的遺伝子座をＧｆｌｅｘ　（Ｔａｋａｒａ　ｂｉｏ社）またはＱｕｉｃｋ　Ｔａｑ　ＨＳ　ＤｙｅＭｉｘ　（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて増幅し、アガロースゲルで電気泳動した。ＰＣＲ産物における小さな挿入／欠失変異を検出するために、ＳＵＲＶＥＹＯＲ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をプロトコルに従い用いた。ＴＡクローニングでは、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ－ＴＯＰＯ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をプロトコルに従い用いた。シークエンス解析には、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＫｉｔおよびＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１３０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた。
　珍しい様々な変異を検出するために、ＴｒｕＳｅｑ　Ｎａｎｏ　ＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてＰＣＲ増幅産物のＤＮＡライブラリを調製し、Ｍａｃｒｏｇｅｎの標準手順に従ってＭｉＳｅｑ（２　ｘ　１５０ｂｐ）でアンプリコンシークエンスを行った。それぞれのサンプルのローリード（ｒａｗ　ｒｅａｄｓ）を、ＢＷＡ－ＭＥＭによってヒトゲノムのｈｇ３８にマップした。カバレッジデータは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）で視覚化し、標的領域でのヒストグラムを抽出した。
　哺乳動物細胞でのＳＮＰ－ＫＩ（スニップノックイン）を検出するための、ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ　ｃ３２１Ｃ＞Ｇを持ったレポーターＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、中田慎一郎教授から寄贈頂いた。レポーター細胞は、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンで培養した。５００ｎｇのドナープラスミドまたは１本鎖ＤＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３とともに、上記の方法で共導入した。トランスフェクション５日後に全細胞を回収し、ＡｒｉａＩＩＩｕ（ＢＤ）を用いてＦＡＣＳ解析を行った。ＧＦＰ陽性細胞をソートし、上記の方法で全ＤＮＡを抽出した。ゲノムにおけるＳＮＰ交換は、ＨｉＤｉ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｍｙＰＯＬＳ　Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いたＰＣＲ増幅により検出した。
　［４］オフターゲット部位の候補の検出
　タイプＩ－Ｅ　ＣＲＩＳＰＲのオフターゲット候補は、ヒトゲノムのｈｇ３８において、２つの異なった手順によりＧＧＧｅｎｏｍｅを用いて検出した。ＰＡＭ候補の配列としては、既報（Ｌｅｅｎａｙ，　Ｒ．Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　６２，　１３７－１４７（２０１６）、Ｊｕｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　２０１７Ｊｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　１７０，　３５－４７（２０１７））に従い、ＡＡＧ、ＡＴＧ、ＡＧＧ、ＧＡＧ、ＴＡＧ、ＡＡＣを選択した。６の倍数のポジションは標的部位として認識されないことが報告されていたことから（Ｋｕｎｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ　６３，　１－１３（２０１６)）、最初のアプローチでは、これらを除いた標的配列の３２塩基対に対して、よりミスマッチが少ないものを選択した。次のアプローチでは、標的配列のＰＡＭ側５’端に完全にマッチしている領域を検出し、高い順にリストした。
　［５］オフターゲット解析のディープシークエンス
　全ゲノムシークエンスでは、トランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、Ｃｏｖａｒｉｓ　ｓｏｎｉｃａｔｏｒを使用して切断した。ＴｒｕＳｅｑ　ＤＮＡ　ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ　ＬＴ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてＤＮＡライブラリを準備し、タカラバイオの標準手順に従い、ＨｉＳｅｑ　Ｘ（２×１５０ｂｐ）を用いてゲノムシークエンスを行った。それぞれのサンプルのローリード（ｒａｗ　ｒｅａｄｓ）を、ＢＷＡ－ＭＥＭによりヒトゲノムのｈｇ３８にマップし、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ　ｐｒｏｇｒａｍによってクリーニングした。ディスコーダントリードペア（Ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ　ｒｅａｄ　ｐａｉｒｓ）とスプリットリード（ｓｐｌｉｔ　ｒｅａｄｓ）は、それぞれｓａｍｔｏｏｌｓとＬｕｍｐｙ－ｓｖによって除外した。同じ染色体での大きい欠失だけを検出するために、Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｏｏｌｋｉｔ　ｐｒｏｇｒａｍのＢａｄＭａｔｅＦｉｌｔｅｒを用いて、異なる染色体にマップされたリードペアを除去した。それぞれ１００ｋｂ領域でのディスコーダントリードペアまたはスプリットリードの総数をＢｅｄｔｏｏｌｓでカウントし、ネガティブコントロールとのエラー率を算出した。シークエンス前のオフターゲット候補を豊富にするために、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ　ｃｕｓｔｏｍ　ＤＮＡ　ｐｒｏｂｅｓをＳｕｒｅＤｅｓｉｇｎによって適度にストリンジェントな条件で設計し、Ａｇｉｌｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが作製した。標的領域は、以下の通り、選択した。標的領域付近のプローブは、ＰＡＭの上流８００ｋｂと下流２００ｋｂをカバーした。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３のオフターゲット領域付近では、ＰＡＭ候補の９ｋｂ上流と１ｋｂ下流をカバーした。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９のオフターゲット領域付近では、ＰＡＭの上流、下流それぞれ１ｋｂをカバーした。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｋｉｔとｃｕｓｔｏｍ　ｐｒｏｂｅ　ｋｉｔによるＤＮＡライブラリの準備の後、タカラバイオの標準手順に従い、Ｈｉｓｅｑ　２５００（２×１５０ｂｐ）により、ゲノムシークエンスを行った。同一の染色体でのディスコーダントリードペアとスプリットリードは、上記の方法で除外した。それぞれ１０ｋｂ領域でのディスコーダントリードペアまたはスプリットリードの総数をＢｅｄｔｏｏｌｓでカウントし、ネガティブコントロールとのエラー率を算出した。
　〔実施例Ｂ－１〕ＤＮＡ切断活性におけるｃｒＲＮＡと核移行シグナルの種類の影響
　実施例Ａでは、偶然にも、ｃｒＲＮＡとしてプレｃｒＲＮＡ（ＬＲＳＲ；リーダー配列－リピート配列－スペーサー配列－リピート配列）を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを利用して真核細胞におけるゲノム編集に成功した。ここで、本発明者は、これまで長年に渡ってＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを利用した真核細胞でのゲノム編集に成功しなかった理由が、ｃｒＲＮＡとして成熟ｃｒＲＮＡが用いられてきたことにあるのではないかと考えた。そこで、ｃｒＲＮＡとして、プレｃｒＲＮＡ（ＬＲＳＲ）の他に、プレｃｒＲＮＡ（ＲＳＲ；リピート配列－スペーサー配列－リピート配列）と成熟ｃｒＲＮＡ（５’ハンドル配列－スペーサー配列－３’ハンドル配列）を調製し、実施例Ａのレポーターシステムによりゲノム編集効率を検証した（図１０Ａ、Ｂ）。なお、プレｃｒＲＮＡ（ＬＲＳＲ）、プレｃｒＲＮＡ（ＲＳＲ）、成熟ｃｒＲＮＡの塩基配列を、それぞれ配列番号：６３、６４、６５に示す。
　その結果、成熟ｃｒＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムでは、標的ＤＮＡの切断活性が認められなかった。その一方、驚くべきことに、プレｃｒＲＮＡ（ＬＲＳＲ、ＲＳＲ）を用いた場合には、非常に高い標的ＤＮＡの切断活性が認められた。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにおけるこの結果は、成熟ｃｒＲＮＡを用いることにより高いＤＮＡ切断活性が認められるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと対照的である。また、この事実は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムによって、これまで真核細胞におけるゲノム編集に成功しなかった主たる理由の一つとして、成熟ｃｒＲＮＡが用いられてきたことが挙げられることを示唆する。
　また、Ｃａｓ３に付加する核移行シグナルとして、ＳＶ４０核移行シグナルとバイパルタイト核移行シグナルを用いた検証も行った（図１１）。その結果、バイパルタイト核移行シグナルを用いた場合に、より高い標的ＤＮＡの切断活性が認められた。
　よって、以降の実験では、ｃｒＲＮＡとして、プレｃｒＲＮＡ（ＬＲＳＲ）を、核移行シグナルとして、バイパルタイト核移行シグナルを使用した。
　〔実施例Ｂ－２〕ＤＮＡ切断活性におけるＰＡＭ配列の影響
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムの標的特異性を確認するために、ＤＮＡ切断活性における様々なＰＡＭ配列の効果を調べた（図１２）。ＳＳＡアッセイでは、異なったＰＡＭ配列によってＤＮＡ切断活性は様々な結果となった。５’－ＡＡＧ　ＰＡＭが最も高い活性を示し、ＡＧＧ、ＧＡＧ、ＴＡＣ、ＡＴＧ、ＴＡＧも注目すべき活性をみせた。
　〔実施例Ｂ－３〕ＤＮＡ切断活性におけるｃｒＲＮＡとスペーサー配列のミスマッチの影響
　大腸菌のカスケードの結晶構造の過去の研究では、ｃｒＲＮＡとスペーサーＤＮＡとの間で５塩基区画のヘテロ２本鎖を形成することが示されており、これはＣａｓ７エフェクターのサムエレメントにより、６番目のポジション毎に塩基対合が破綻することによる（図１３）。ＤＮＡ切断活性でのｃｒＲＮＡとスペーサー配列のミスマッチの影響を評価した（図１ｇ）。標的として認識されない塩基（ポジション６）を除いて、シード領域（ポジション１－８）でのどの単一ミスマッチでも切断活性は劇的に落ちた。
　〔実施例Ｂ－４〕ＤＮＡ切断活性におけるＣａｓ３の各ドメインの必要性の検証
　Ｃａｓ３タンパクの触媒的特徴のインビトロでの性質決定では、Ｎ末端のＨＤヌクレアーゼドメインがＤＮＡ基質の１本鎖領域を切断し、続いて、Ｃ末端のＳＦ２ヘリケースドメインが、ＡＴＰ依存的に、標的ＤＮＡ上を３’から５‘方向へ進行してほどいていくことが明らかになった。３つのＣａｓ３の変異体、すなわち、ＨＤドメインＨ７４Ａの変異体（ｄｎＣａｓ３）、ＳＦ２ドメインモチーフ１のＫ３２０Ｎの変異体（ｄｈＣａｓ３）、およびＳＦ２ドメインモチーフ３のＳ４８３Ａ／Ｔ４８５Ａのダブルの変異体（ｄｈ２Ｃａｓ３）を作製して、Ｃａｓ３ドメインがＤＮＡ切断に必要か否かを検証した（図１４）。その結果、３つ全てのＣａｓ３タンパクの変異体でＤＮＡ切断活性が完全に消失しており、Ｃａｓ３はＨＤヌクレアーゼドメインとＳＦ２ヘリケースドメインを通して標的ＤＮＡを切断できることが判明した。
　〔実施例Ｂ－５〕様々なタイプのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにおけるＤＮＡ切断活性の検証
　タイプ１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムは高度に多様化している（タイプ１のＡ～Ｇの７種類）。上記実施例では、タイプＩ－ＥのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにおける真核細胞でのＤＮＡ切断活性を検証したが、本実施例では、それ以外のタイプ１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システム（タイプＩ－ＦとタイプＩ－Ｇ）におけるＤＮＡ切断活性の検証を行った。具体的には、タイプＩ－Ｆのシュワネラ・プトレファシエンスのＣａｓ３、Ｃａｓ５－７、およびタイプＩ－Ｇのピュロコックス・フリオススのＣａｓ５－８をコドンオプティマイズしクローニングした（図１５）。その結果、ＤＮＡ切断活性の強さに差異はあるものの、２９３Ｔ細胞を用いたＳＳＡアッセイにおいて、これらのタイプ１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにもＤＮＡ切断活性が認められた。
　〔実施例Ｂ－６〕ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにより内因性遺伝子に導入された変異の検証
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムにより内因性遺伝子に導入された変異を、タイプＩ－Ｅシステムを利用して検証した。ＥＭＸ１遺伝子とＣＣＲ５遺伝子を標的遺伝子として選択し、プレｃｒＲＮＡ（ＬＲＳＲ）プラスミドを調製した。２９３Ｔ細胞にプレｃｒＲＮＡと６つのＣａｓ（３，５－８，１１）エフェクターをコードするプラスミドをリポフェクションした結果、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３により数百から数千塩基対の欠失が主に標的領域のスペーサー配列の５’ＰＡＭの上流方向で起きたことが明らかとなった（図１６）。修復されたジャンクションでの５－１０塩基対のマイクロホモロジーが確認でき、アニーリング依存性の修復経路による相補鎖のアニーリングによって起こったのかもしれない。なお、成熟ｃｒＲＮＡプラスミドでは、ＥＭＸ１とＣＣＲ５領域でのゲノム編集は見られなかった。
　ＰＣＲ産物のＴＡクローニングとサンガーシークエンスにより、よりＣａｓ３によるゲノム編集を特徴付けるために、９６個のＴＡクローンをピックアップし、シークエンスで野生型のＥＭＸ１の配列と比較した（図１７）。配列の挿入を確認できた４９クローンのうち２４クローンで最小５９６塩基対、最大１４４７塩基対、平均９８５塩基対の欠失を認めた（４６．３％の効率）。半分のクローン（ｎ＝１２）でＰＡＭとスペーサーの配列を含んで大きな欠失を作っており、残り半分ではＰＡＭの上流で欠失していた。
　ＥＭＸ１遺伝子の３．８ｋｂ、ＣＣＲ５の９．７ｋｂといったより広域の領域におけるプライマーセットでのＰＣＲ増幅産物での次世代シークエンスによりさらなるＣａｓ３の特徴付けを行った。また、タイプＩ－Ｅ　ＣＲＩＳＰＲでの標的化のための複数のＰＡＭサイト（ＡＡＧ、ＡＴＧ、ＴＴＴ）を検証した。アンプリコンシークエンスでは、ＡＡＧは３８．２％、ＡＴＧは５６．４％であり、ＴＴＴの８６．４％、ＥＭＸ１を標的にしたＣａｓ９の８６．４％と比較してＰＡＭサイトの上流の広範なゲノム領域でのカバレッジ率が大きく減少していた。カバレッジの減少はＣＣＲ５領域をターゲットにした場合も同様であった。対照的に、Ｃａｓ９は標的部位での小挿入、小欠失（インデル）を誘発し、一方でＣａｓ３はＰＡＭや標的部位での小インデル変異は全くなかった。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムが、ヒト細胞において、標的部位の上流の幅広い領域で欠失を引き起こすことを示唆した。
　１０ｋｂ未満の増幅やより短いＰＣＲ断片に有利である強いバイアスといったＰＣＲ解析の限界を考え、標的にしたＥＭＸ１とＣＣＲ５遺伝子座の周囲１０００ｋｂ以上のマイクロアレイベースのキャプチャーシークエンスを利用した（図１８Ａ、Ｂ）。ＥＭＸ１遺伝子座では最大で２４ｋｂ、ＣＣＲ５遺伝子座では最大４３ｋｂの欠失を認めたが、ＥＭＸ１での９０％、ＣＣＲ５での９５％の変異は１０ｋｂ未満であった。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムが、真核細胞ゲノムでも強力なヌクレアーゼとヘリケースの活性を持ちうることを示唆した。
　なお、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムで示されるように、非標的ゲノム領域で望ましくないオフターゲット変異を誘発しうるかどうかは、特に臨床適用に関して大きな懸念事項であるが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムでは、顕著なオフターゲット効果はみられなかった。
　本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムは、真核細胞のＤＮＡを編集することができるため、ゲノム編集が求められている分野、例えば、医薬、農林水産、工業、生命科学、生命工学、遺伝子治療などの分野に広く利用することができる。

Claims (11)

  1. 　ＤＮＡが編集された真核細胞を製造する方法であって、真核細胞にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを導入することを含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムが以下の（Ａ）～（Ｃ）を含む方法。
    　（Ａ）Ｃａｓ３タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
    　（Ｂ）カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
    　（Ｃ）ｃｒＲＮＡ、該ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
  2. 　ＤＮＡが編集された動物（ただしヒトを除く）または植物を製造する方法であって、動物（ただしヒトを除く）または植物にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを導入することを含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムが以下の（Ａ）～（Ｃ）を含む方法。
    　（Ａ）Ｃａｓ３タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
    　（Ｂ）カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
    　（Ｃ）ｃｒＲＮＡ、該ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
  3. 　真核細胞にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを導入した後に、カスケードタンパク質を構成するタンパク質によりｃｒＲＮＡが切断される工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　ｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡである、請求項１または２に記載の方法。
  5. 　Ｃａｓ３タンパク質および／またはカスケードタンパク質に核移行シグナルが付加されている、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　核移行シグナルがバイパルタイト核移行シグナルである、請求項５に記載の方法。
  7. 　以下の（Ａ）および（Ｂ）を含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
    　（Ａ）Ｃａｓ３タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
    　（Ｂ）カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
  8. 　ｃｒＲＮＡ、該ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチド含む発現ベクターをさらに含む、請求項７に記載のキット。
  9. 　ｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡである、請求項８に記載のキット。
  10. 　Ｃａｓ３タンパク質および／またはカスケードタンパク質に核移行シグナルが付加されている、請求項７～９のいずれかに記載のキット。
  11. 　核移行シグナルがバイパルタイト核移行シグナルである、請求項１０に記載のキット。
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KR1020207000115A KR102541398B1 (ko) 2017-06-08 2018-06-08 Dna가 편집된 진핵 세포를 제조하는 방법 및 당해 방법에 사용되는 키트
CN201880037636.XA CN110770342B (zh) 2017-06-08 2018-06-08 Dna被编辑了的真核细胞的制造方法、和在该方法中使用的试剂盒
FIEP18812837.5T FI3636753T3 (fi) 2017-06-08 2018-06-08 Menetelmä DNA-muokatun eukaryoottisen solun valmistamiseksi
BR112019025717-9A BR112019025717A2 (pt) 2017-06-08 2018-06-08 método para produzir célula eucariótica de dna editado e kit usado no mesmo
MX2019014497A MX2019014497A (es) 2017-06-08 2018-06-08 Metodo para producir celula eucariota de adn editado, y kit usado en el mismo.
CA3066599A CA3066599A1 (en) 2017-06-08 2018-06-08 Method for producing dna-edited eukaryotic cell, and kit used in the same
EA201992795A EA201992795A1 (ru) 2017-06-08 2018-06-08 Способ получения эукариотических клеток с отредактированной днк и набор, используемый в этом способе
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020122104A1 (ja) * 2018-12-11 2020-06-18 国立大学法人京都大学 ゲノムｄｎａに欠失を誘導する方法
WO2020184723A1 (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 国立大学法人徳島大学 Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的配列改変技術
WO2020204159A1 (ja) 2019-04-05 2020-10-08 国立大学法人大阪大学 ノックイン細胞の作製方法
WO2021149829A1 (ja) 2020-01-24 2021-07-29 Ｃ４Ｕ株式会社 試料中の特定のｄｎａを検出する方法
WO2021251493A1 (ja) * 2020-06-12 2021-12-16 国立研究開発法人産業技術総合研究所 卵白タンパク質遺伝子における目的タンパク質をコードする遺伝子がノックインされた家禽細胞またはその製造方法
WO2022097663A1 (ja) 2020-11-06 2022-05-12 エディットフォース株式会社 ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの変異体
WO2022186063A1 (ja) 2021-03-01 2022-09-09 Ｃ４Ｕ株式会社 Ｃａｓ３タンパク質を製造する方法
CN115595330A (zh) * 2021-07-12 2023-01-13 中国科学院微生物研究所（Cn） 一种CRISPR-Cas3系统及其在抗植物病毒方面的应用
US12012596B2 (en) 2017-08-21 2024-06-18 Tokushima University Target sequence specific alteration technology using nucleotide target recognition
WO2024204287A1 (ja) * 2023-03-27 2024-10-03 国立大学法人京都大学 修飾ヌクレオチドを有するｃｒＲＮＡ

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11807869B2 (en) 2017-06-08 2023-11-07 Osaka University Method for producing DNA-edited eukaryotic cell, and kit used in the same
SG11202009319YA (en) 2018-03-26 2020-10-29 Univ Kobe Nat Univ Corp Method for modifying target site in double-stranded dna in cell
SG11202109550TA (en) 2019-03-07 2021-09-29 Univ Columbia Rna-guided dna integration using tn7-like transposons
US11008557B1 (en) * 2019-12-18 2021-05-18 Inscripta, Inc. Cascade/dCas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
US20240229081A1 (en) * 2021-05-26 2024-07-11 The Regents Of The University Of Michigan Crispr-cas3 systems for targeted genome engineering
CN113549650B (zh) * 2021-07-05 2023-05-09 天津协和生物科技开发有限公司 一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015503535A (ja) * 2011-12-30 2015-02-02 ヴァーヘニンヘン ウニフェルジテイト 改変されたｃａｓｃａｄｅリボ核タンパク質およびそれらの用途
WO2017043573A1 (ja) * 2015-09-09 2017-03-16 国立大学法人神戸大学 標的化したｄｎａ配列の核酸塩基を特異的に変換するゲノム配列の改変方法及びそれに用いる分子複合体
WO2017066497A2 (en) * 2015-10-13 2017-04-20 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
JP2017512481A (ja) * 2014-04-08 2017-05-25 ノースカロライナ ステート ユニバーシティーＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｒｉｓｐｒ関連遺伝子を用いた、ｒｎａ依存性の転写抑制のための方法および組成物
WO2017219033A1 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 Montana State University Bidirectional targeting for genome editing
CN107557373A (zh) * 2017-09-19 2018-01-09 安徽大学 一种基于I‑B型CRISPR‑Cas系统基因cas3的基因编辑方法
CN107557378A (zh) * 2017-09-19 2018-01-09 安徽大学 一种基于I型CRISPR‑Cas系统中基因cas7‑3的真核基因编辑方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4286402A3 (en) * 2012-12-12 2024-02-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
CN109536474A (zh) * 2015-06-18 2019-03-29 布罗德研究所有限公司 降低脱靶效应的crispr酶突变
US11807869B2 (en) 2017-06-08 2023-11-07 Osaka University Method for producing DNA-edited eukaryotic cell, and kit used in the same
MX2020001998A (es) * 2017-08-21 2020-10-05 Univ Tokushima Tecnología de alteración específica de secuencia objetivo utilizando reconocimiento de objetivos del nucleotído.
CN113528408B (zh) * 2021-06-08 2022-03-01 湖北大学 一种基于CRISPR-nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015503535A (ja) * 2011-12-30 2015-02-02 ヴァーヘニンヘン ウニフェルジテイト 改変されたｃａｓｃａｄｅリボ核タンパク質およびそれらの用途
JP2017512481A (ja) * 2014-04-08 2017-05-25 ノースカロライナ ステート ユニバーシティーＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｒｉｓｐｒ関連遺伝子を用いた、ｒｎａ依存性の転写抑制のための方法および組成物
WO2017043573A1 (ja) * 2015-09-09 2017-03-16 国立大学法人神戸大学 標的化したｄｎａ配列の核酸塩基を特異的に変換するゲノム配列の改変方法及びそれに用いる分子複合体
WO2017066497A2 (en) * 2015-10-13 2017-04-20 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
WO2017219033A1 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 Montana State University Bidirectional targeting for genome editing
CN107557373A (zh) * 2017-09-19 2018-01-09 安徽大学 一种基于I‑B型CRISPR‑Cas系统基因cas3的基因编辑方法
CN107557378A (zh) * 2017-09-19 2018-01-09 安徽大学 一种基于I型CRISPR‑Cas系统中基因cas7‑3的真核基因编辑方法

Non-Patent Citations (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AHMED A. GOMAA ET AL.: "Programmable Reomoval of Bacterial Strains by Use of Genome Targeting CRISPR-Cas Systems", MBIO.ASM.ORG, vol. 5, no. 1, 2014, pages e00928 - 13
ALTSCHUL SF: "Basic local alignment search tool", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 215, no. 3, 1990, pages 403 - 410, XP002949123, DOI: 10.1006/jmbi.1990.9999
JACKSON RN ET AL.: "Fitting CRISPR-associated Cas3 into the Helicase Family Tree", CURRENT OPINION IN STRUCTURAL BIOLOGY, vol. 24, 2014, pages 106 - 114
JINEK M ET AL.: "A Programmable Dual-RNA Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity", SCIENCE, vol. 337, no. 6096, 2012, pages 816 - 821, XP055549487, DOI: 10.1126/science.1225829
JOSEPH SAMBROOKDAVID W. RUSSELL: "Molecular cloning: a laboratory manual 3rd Ed.", 2001, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
JUNG ET AL., CELL, vol. 170, 2017, pages 35 - 47
JUNG ET AL., MOL. CELL., 2017
LEENAY, R. T ET AL., MOL. CELL, vol. 62, 2016, pages 137 - 147
LEONARD G. DAVIS ET AL.: "Basic methods in molecular biology", 1986, ELSEVIER
MING LI ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 45, no. 8, 5 May 2017 (2017-05-05), pages 4642 - 4654
MORISAKA, H. ET AL.: "Abstrac 490: Genome editing in mammalian cells by cascade and Cas3", J. INVEST, DERMATOL., vol. 137, no. 5, May 2017 (2017-05-01), pages S84, XP055561205 *
MORISAKA, HIROYUKI ET AL.: "P07-20: Genome editing in mammalian cells by Cascade and Cas3", PROGRAMS AND ABSTRACTS OF 42TH ANNUAL ACADEMIC CONFERENCE AND GENERAL CONFERENCE OF THE JAPANESE SOCIETY FOR INVESTIGATE DERMATOLOGY, 2 November 2017 (2017-11-02), pages 232, XP009517845 *
MULEPATI SBAILEY S: "In Vitro Reconstitution of an Escherichia coli RNA-guided Immune System Reveals Unidirectional, ATP-dependent Degradation of DNA Target", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 288, no. 31, 2013, pages 22184 - 22192
NAGY A. ET AL.: "Manipulating the Mouse Embryo", 2003, COLD SPRING HARBOUR LABORATORY PRESS
NISHIDA K. ET AL.: "Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems", SCIENCE, 2016
SAKUMA T ET AL.: "Efficient TALEN construction and evaluation methods for human cell and animal applications", GENES TO CELLS, vol. 18, no. 4, 2013, pages 315 - 326
SUZUKI K ET AL.: "In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration", NATURE, vol. 540, no. 7631, 2016, pages 144 - 149, XP055414804, DOI: 10.1038/nature20565
SUZUKI, KELLCHLRO ET AL.: "In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration", NATURE, vol. 540, 16 November 2016 (2016-11-16), pages 144 - 149, XP055414804 *
TABEI YUTAKA, KAGAKU-DOJIN, 2012, pages 340 - 347
VAN DER OOST J ET AL.: "Unravelling the structural and mechanistic basis of CRISPR-Cas systems", NATURE REVIEWS MICROBIOLOGYM, vol. 12, no. 7, 2014, pages 479 - 492, XP055619310, DOI: 10.1038/nrmicro3279
WU J ET AL.: "The Intracellular Mobility of Nuclear Import Receptors and NLS Cargoes", BIOPHYSICAL JOURNAL, vol. 96, no. 9, 2009, pages 3840 - 3849

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12012596B2 (en) 2017-08-21 2024-06-18 Tokushima University Target sequence specific alteration technology using nucleotide target recognition
JP7395159B2 (ja) 2018-12-11 2023-12-11 国立大学法人京都大学 ゲノムｄｎａに欠失を誘導する方法
WO2020122104A1 (ja) * 2018-12-11 2020-06-18 国立大学法人京都大学 ゲノムｄｎａに欠失を誘導する方法
JPWO2020122104A1 (ja) * 2018-12-11 2021-10-21 国立大学法人京都大学 ゲノムｄｎａに欠失を誘導する方法
WO2020184723A1 (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 国立大学法人徳島大学 Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的配列改変技術
JP7489112B2 (ja) 2019-03-14 2024-05-23 国立大学法人徳島大学 Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的配列改変技術
WO2020204159A1 (ja) 2019-04-05 2020-10-08 国立大学法人大阪大学 ノックイン細胞の作製方法
JP6940086B1 (ja) * 2020-01-24 2021-09-22 Ｃ４Ｕ株式会社 試料中の特定のｄｎａを検出する方法
KR20220130727A (ko) 2020-01-24 2022-09-27 씨포유 가부시키가이샤 시료 중의 특정한 dna를 검출하는 방법
WO2021149829A1 (ja) 2020-01-24 2021-07-29 Ｃ４Ｕ株式会社 試料中の特定のｄｎａを検出する方法
EP4095245A4 (en) * 2020-01-24 2024-10-09 C4U Corp METHOD FOR DETECTING SPECIFIC DNA IN A SAMPLE
WO2021251493A1 (ja) * 2020-06-12 2021-12-16 国立研究開発法人産業技術総合研究所 卵白タンパク質遺伝子における目的タンパク質をコードする遺伝子がノックインされた家禽細胞またはその製造方法
WO2022097663A1 (ja) 2020-11-06 2022-05-12 エディットフォース株式会社 ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの変異体
WO2022186063A1 (ja) 2021-03-01 2022-09-09 Ｃ４Ｕ株式会社 Ｃａｓ３タンパク質を製造する方法
CN115595330A (zh) * 2021-07-12 2023-01-13 中国科学院微生物研究所（Cn） 一种CRISPR-Cas3系统及其在抗植物病毒方面的应用
WO2024204287A1 (ja) * 2023-03-27 2024-10-03 国立大学法人京都大学 修飾ヌクレオチドを有するｃｒＲＮＡ

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