CN107557378A - 一种基于I型CRISPR‑Cas系统中基因cas7‑3的真核基因编辑方法 - Google Patents

Abstract

本发明首次公开了1类I型CRISPR‑Cas系统中2个Cas蛋白（Cas7和Cas3）对真核生物基因组进行的基因敲除和基因插入；该方法的发明打破了依靠单基因cas9与cpf1的局限，为多基因进行真核生物的基因编辑提供了新视野。应用该系统对真核生物酿酒酵母基因组可方便、快速、有效地进行基因编辑。优化后的该工具可望广泛应用于其他真核生物的基因编辑中。

Description

一种基于I型CRISPR-Cas系统中基因cas7-3的真核基因编辑 方法

本发明涉及生物技术领域的基因工程技术，确切地说是一种基于I型CRISPR-Cas系统中基因cas7-3的真核基因编辑方法。

背景技术

基因工程(genetic engineering)或称DNA重组技术，是以限制性内切酶和连接酶为基础而产生的一项革命性技术。通常指将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外整合到载体(如：质粒或病毒)中，然后导入活细胞进而改变生物原有的遗传特性、获得新品种或提高产品产量的技术。其特点是该DNA的改造与功能的实现主要通过能自主复制的工程质粒与工程病毒而实现。基因组编辑技术(简称基因编辑技术)与常说的基因工程一样都是改变细胞的遗传特性，但不同点主要在于基因编辑技术直接针对细胞的染色体，从而使其功能远大于依靠载体的传统的基因工程技术。

CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中,是原核生物长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。对Ⅱ型CRISPR/Cas系统的改造使其成为继锌指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)以来的一种高效基因组编辑新技术。与ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas基因编辑系统具有更为简单高效之优势。CRISPR由一系列短的高度保守的正向重复序列(repeats)与长度相近的间隔序列(spacers)间隔排列组成。CRISPR位点的数量在不同物种间有所不同，CRISPR中重复序列的数量也随着不同物种而有所变化。CRISPR位点通常定位于原核细胞染色体上，个别定位于质粒中(Horvath P,Barrangou R(January 2010).CRISPR/CAS,the immune system of bacteria andarchaea.Science.327(5962):167-70.)

迄今为止，报道的能用于基因编辑的仅有含单个Cas效应物的2类II型CRISPR-Cas系统中的Cas9与2类V型的Cpf1(Mohanraju,P.,Makarova,K.S.,Zetsche,B.,Zhang,F.,Koonin,E.V.,and van der Oost,J.(2016).Diverse evolutionary roots andmechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.Science 353,aad5147)。关于含有多个Cas效应物的1类I型CRISPR-Cas系统用于原核生物基因编辑虽已被我们报道(童望宇，许鑫，张雁，孙焰，曹素丽，一种维吉尼亚链霉菌IBL14type I-B-sv14型CAS基因编辑系统，CN201611113137.3；童望宇，邱彩花，杨兴旺，王安静，一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因编辑方法，CN201611089333.1)，但应用于真核生物基因编辑未见报道。

本发明将首次公开一个以维吉尼亚链霉菌IBL14染色体中I型Cas系统中双基因cas7与cas3为基础设计的由Cas7-3蛋白表达载体(vector-cas7-3)和基因编辑载体(vector-t/g-gene abbreviation)组成的基因编辑系统。由于真核生物具有核膜及仅以单顺反子进行翻译的特征，故本发明中碱基优化后的2个cas基因分别带有转录启动子、终止子和核定位序列。本基因编辑工具的出现打破了cas9在进行基因编辑时所具有的局限性，同时为发现其他的基因编辑工具提供了新依据。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于1类I型CRISPR-Cas系统双基因cas7与cas3构建的真核生物基因编辑工具。

为达此目的，本发明所采用的技术方案是：

一种基于I型CRISPR-Cas系统中基因cas7-3的真核基因编辑方法，其特征在于：利用维吉尼亚链霉菌IBL14基因组中的cas7与cas3基因所构建的蛋白表达质粒和/或基因编辑质粒对真核生物基因组进行有效的基因编辑。

所述的一种基于I型CRISPR-Cas系统中基因cas7-3的真核基因编辑方法包括蛋白表达质粒的构建、基因编辑质粒的构建和重组子的获取与检验，具体步骤如下：

(1)蛋白表达载体的构建

根据维吉尼亚链霉菌IBL14中基因cas7与cas3序列及载体序列，合成其密码子优化的基因cas7与cas3及相关引物，并将优化后的基因cas7与cas3与载体连接得蛋白表达载体vector-cas7-3；

(2)基因编辑载体的构建

根据真核生物靶向基因DNA序列信息设计引物，以真核生物基因组为模版，通过PCR反应分别扩增得到末端同时带有限制性内切酶切位点及overlap PCR互补序列的靶向基因的上、下游同源臂片段，并通过overlap PCR将上、下游同源臂连接到基因编辑模版t-DNA上，同时根据真核生物靶向基因序列信息设计并直接合成首尾分别包含半乳糖启动子和RNA终止子的靶向基因片段g-DNA，依据限制性酶切位点上的粘性末端将基因编辑模版t-DNA与靶向基因片段g-DNA连接到载体上，得到基因编辑载体vector-t/g-geneabbreviation；

(3)重组子的获取与检验

制备真核生物细胞感受态，将按步骤(1)得到的蛋白表达载体vector-cas7-3和步骤(2)得到的基因编辑载体vector-t/g-DNA分别转化或转染到目标感受态细胞中，得到候选的基因编辑重组子；对重组子染色体进行PCR和基因测序或功能分析，得到正确的基因编辑重组子。

所述的真核生物指酿酒酵母微生物或动、植物的真核细胞。

所述的基因编辑指对真核细胞的染色体基因进行插入、敲除、无痕点突变及任意组合。

本发明首次公开了1类I型CRISPR-Cas系统中2个Cas蛋白(Cas7和Cas3)对真核生物基因组进行的基因敲除和基因插入；该方法的发明打破了依靠单基因cas9与cpf1的局限，为多基因进行真核生物的基因编辑提供了新视野。应用该系统对真核生物酿酒酵母基因组可方便、快速、有效地进行基因编辑。优化后的该工具可望广泛应用于其他真核生物的基因编辑中。

附图说明

图1基因编辑工具构建示意图。(A)蛋白表达质粒pRS415-cas7-3：Ori/origin：DNA复制起始位点，f1ori：f1噬菌体起源的复制起始位，CEN/ARS：中心粒/自主复制，gal1promoter：半乳糖启动子，与RNA聚合酶结合起动DNA转录，LEU2promoter：亮氨酸启动子，AmpR/ampicillin resistance：氨苄青霉素抗性；(B)基因编辑质粒pYES2/NTA-t/g-ΔcrtI：Ori/origin:DNA复制起始点，f1ori：噬菌体复制起始位点，产生单链DNA，2μori：复制起始点，URA3promoter：尿嘧啶启动子，T₇promoter:T₇启动子，起始DNA转录，AmpR/ampicillin resistance:氨苄青霉素抗性。

图2SCBY4741基因组crtI基因的敲除结果。(A)红白斑筛选(黑色为原始菌株，白色为重组菌株)；(B)PCR电泳(泳道M：5000bp DNA ladder，泳道1：质粒pRS415-cas7-3和pYES2/NTA-t/g-ΔcrtI转化子，泳道2：pRS415-cas7-3和pYES2/NTA-t-ΔcrtI转化子，泳道3：pRS415-cas7-3-t/g-ΔcrtI转化子，泳道4：质粒pRS415-cas7-3-t-ΔcrtI转化子，泳道5：宿主SCBY4741)。

具体实施方式

为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明，旨在更好的解释本发明的内容，以下实施例不限制本发明的保护范围。此外，在所列实施例中如无特别说明均采用如下材料：

1)菌株、细胞与质粒

大肠杆菌Escherichia coli DH5α/EC DH5α,人胚肾细胞human embryonickidney 293cells/HEK293，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4741/SC BY4741；质粒pRS415，pYES2/NTA，pUC19,pSp-2A-Puro

2)溶液与培养基

1.0mol/L LiAc溶液：

称取6.6g的LiAc固体粉末，加90ml双蒸水溶解，定容至100ml。

100mmol/L LiAc溶液：

称取0.66g的LiAc固体粉末，加90ml双蒸水溶解，定容至100ml。

HEPES缓冲液：

称取0.0135g Na2HPO4﹒H2O，0.8g NaCl，0.037g KCl，0.5g葡萄糖，0.5g HEPES，加90ml双蒸水溶解，NaOH调pH至7.5，定容至100ml。

50mg/ml氨苄青霉素：

称取0.5g的氨苄青霉素粉末置于10ml离心管中，加入4ml双蒸水，混匀后，定容至10ml，用0.2μm的无菌水系滤膜过滤后，分装到1.5ml的EP管中，放于-20℃冰箱中保存。

50mg/ml G418：

称取0.5g G418置于10ml离心管中，加入4ml HEPES缓冲液，混匀后，定容至10ml，用0.2μm的无菌水系滤膜过滤后，分装到1.5ml的EP管中，放于-20℃冰箱中保存。

SD-LEU诱导培养基(100ml)：

0.17g YNB，0.5g硫酸铵，2g半乳糖，1g棉籽糖，加入适量双蒸水溶解后，定容至99.6ml，分装包扎后，115℃/30min灭菌。加入过滤除菌的400μl氨基酸(蛋氨酸0.5g/100ml，组氨酸0.5g/100ml，尿嘧啶0.5g/100ml)。

LB培养基：

酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，加入适量自来水溶解后，定容至1L，pH调至7.0～7.2，分装包扎后，121℃/20min灭菌，如制平板加入20g琼脂。

SD-LEU/URA选择培养基(100mL)

0.17g YNB，0.5g硫酸铵，2g葡萄糖，加入适量双蒸水溶解后，定容至99.6ml，分装包扎后，115℃/30min灭菌。加入过滤除菌的400μl氨基酸(蛋氨酸0.5g/100ml，组氨酸0.5g/100ml)，如制平板加入2g琼脂和18.2g山梨醇。

YNB培养基：

酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加入适量自来水溶解后，定容至1L，分装包扎后，115℃/30min灭菌，如制平板加入20g琼脂。

SD-LEU选择培养基(100mL)：

0.17gYNB，0.5g硫酸铵，2g葡萄糖，加入适量双蒸水溶解后，定容至99.6ml，分装包扎后，115℃/30min灭菌。加入过滤除菌的400μl氨基酸(蛋氨酸0.5g/100ml，组氨酸0.5g/100ml，尿嘧啶0.5g/100ml)，如制平板加入2g琼脂和18.2g山梨醇。

高糖DMEM培养基：

无水氯化钙.2H₂O265.00mg/L，硝酸铁.9H₂O 0.10mg/L、氯化钾400.0mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6400.0mg/L、无水磷酸二氢钠109.0mg/L、丁二酸75.0mg/L、丁二酸钠100.0mg/L、L-盐酸精氨酸84.0mg/L、L-盐酸胱氨酸63.0mg/L、甘氨酸30.0mg/L、L-盐酸组氨酸42.0mg/L、L-异亮氨酸105.0mg/L、L-亮氨酸105.0mg/L、L-盐酸赖氨酸146.0mg/L、L-甲硫氨酸30.0mg/L、L-苯丙氨酸66.0mg/L、L-丝氨酸42.0mg/L、L-苏氨酸95.0mg/L、L-色氨酸16.0mg/L、L-酪氨酸72.0mg/L、L-缬氨酸94.0mg/L、D-泛酸钙4.0mg/L、酒石酸胆碱7.20mg/L、叶酸4.0mg/L、肌醇7.2mg/L、烟酰胺4.0mg/L、核黄素0.40mg/L、盐酸硫胺4.0mg/L、盐酸吡哆辛4.0mg/L、葡萄糖4500.0mg/L、丙酮酸钠110.0mg/L、酚红9.3mg/L。

所用试剂均为市售品。

实施例1pRS415-cas7-3和pYES2/NTA-t/g-ΔcrtI分别转化敲除SC BY4741基因crtI

(1)蛋白表达质粒pRS415-cas7-3的构建

(A)蛋白表达质粒pRS415-cas3的构建

根据质粒pRS415的序列信息，设计特异性引物cas3-F/cas3-R和pRS415-cas3-F/pRS415-cas3-R，引物两端分别带有cas3基因和质粒pRS415-cas9的互补序列。使用全式金生物技术有限公司生产的TransStart FastPfu DNA Polymerase进行cas3基因PCR扩增，反应条件：95±1℃5±1min，95±1℃30s，62±3℃30s，72℃1±1min(50μl反应体系)，30个循环，72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化的cas3基因片段。再进行一次同样的PCR扩增，得到纯化的pRS415质粒骨架。通过全式金生物技术有限公司生产的一步克隆无缝克隆试剂盒进行快速克隆，将连接产物转化至EC DH5α感受态中。待单克隆长出后通过引物cas3-F/cas3-R进行菌落PCR，将PCR阳性菌落的剩余菌落接种至含有Amp的LB培养基中培养过夜，提取质粒鉴定得到蛋白表达质粒pRS415-cas3。

(B)带有启动子、终止子及核定位序列的cas7基因片段的制备

质粒pMD-18T-crtI序列信息，设计特异性引物cas7-F(1)/cas7-R(1)和pMD18T-cas7-F/pMD18T-cas7-R分别带有质粒pMD-18T-crtI和cas7基因的互补序列。使用全式金生物技术有限公司生产的TransStart FastPfu DNA Polymerase进行cas7基因PCR扩增，扩增条件同实施例1步骤(1A)。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化的cas7基因片段。再进行一次同样的PCR扩增，得到纯化的含有CDC19p和CDC19t的pMD-18T质粒骨架。再通过一步克隆无缝连接，反应体系与转化步骤同pRS415-cas3质粒的构建，得到构建成功的pMD-18T-cas7质粒；然后通过TransStart FastPfu DNA Polymerase与引物pRS415-cas7-F/pRS415-cas7-R进行PCR扩增，得到纯化的含有CDC19p、CDC19t和SV40NLS的cas7基因片段。

(C)蛋白表达质粒pRS415-cas7-3的构建

根据已经构建好的pRS415-cas3序列信息设计特异性引物pRS415-cas7-3-F/pRS415-cas7-3-R,引物两端带有cas7的互补序列。使用全式金生物技术有限公司生产的TransStart FastPfu DNA Polymerase进行PCR扩增，扩增条件同实施例1步骤(1A)，得到纯化的pRS415-cas3的质粒骨架。通过全式金生物技术有限公司生产的一步克隆无缝克隆试剂盒进行快速克隆，将上一步所获得的含有CDC19p、CDC19t和SV40NLS的cas7基因片段和pRS415-cas3的质粒骨架连接。将连接产物转化至EC DH5α感受态中，待单克隆长出后通过引物cas7-F/cas7-R进行菌落PCR，将PCR阳性菌落的剩余菌落接种至含有Amp的LB培养基中培养过夜，提取质粒鉴定得到蛋白表达质粒pRS415-cas7-3。

(2)基因编辑质粒pYES2/NTA-t/g-ΔcrtI的构建

(A)上、下游同源臂的制备

根据crtI基因全序列设计crtI基因上游同源臂引物crtI-UF和crtI-UR、下游同源臂引物crtI-DF和crtI-DR(黑体加粗为overlap PCR互补序列)，且上同源臂上游引物含HindIII限制性内切酶酶切位点，下同源臂下游引物含BamHI限制性内切酶酶切位点。以纯化的crtI基因DNA为模板，先分别扩增上、下游同源臂，扩增条件同实施例1步骤(1)。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化后的上、下游同源臂DNA 片段备用。

(B)基因编辑模版载体pYES2/NTA-t-ΔcrtI的构建

取上同源臂纯化产物与下同源臂纯化产物各0.5μl混合作为模板，25μl反应体系进行overlap PCR，反应条件为：94℃5min，94℃l min，61℃30s，72℃1min，一个循环后加入引物crtI-UF和crtI-DR各1μl，继续PCR，反应条件为：94℃5min，94℃30s，61℃30s，72℃1min，进行30个循环，72℃10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物并纯化，得基因编辑模版t-ΔcrtI；将获得的t-ΔcrtI通过HindIII限制性内切酶酶、BamHI限制性内切酶切出粘性末端，然后通过全式金生物技术有限公司生产的T4连接酶将其连接到pYES2/NTA质粒上，得到基因编辑模版载体pYES2/NTA-t-ΔcrtI。

(C)基因编辑质粒pYES2/NTA-t/g-ΔcrtI的构建

含半乳糖启动子及g-crtI连接产物的靶向基因片段由滁州通用生物公司直接合成，首尾分别加上EcoRI及XhoI酶切位点，中间依次是启动子，重复序列(repeat)，间隔序列(spacer)，重复序列(repeat)及终止子；将合成的靶向基因片段通过EcoRI和XhoI限制性内切酶切出粘性末端，然后通过T4连接酶将其连接到得基因编辑模版载体pYES2/NTA-t-ΔcrtI上得基因编辑质粒pYES2/NTA-t/g-ΔcrtI(图1(B))。

合成的g-crtI基因序列(PAM：ttc)：

其中大写字母为酶切位点，波浪线为保护碱基，单下划线为启动子promoter，斜体为spacer，黑体加粗为repeat，双下划线为终止子terminator。

(3)重组子的获取与检验

(A)SCBY4741感受态制备和pRS415-cas7-3转化

在超净台内，从新鲜平板上挑取单菌落到5ml YPD培养基中，30℃下振荡培养过夜；接种1ml菌液到50ml YPD，30℃下振荡培养至OD600为1.0-1.3；用50ml无菌离心管以4000rpm的速度离心5min，沉淀细胞；弃培养液，把细胞重悬在25ml无菌水中，再以4000rpm的速度离心5min；弃水，把细胞悬浮在1ml的100mmol/L醋酸锂(LiAc)中，转悬浮物到1.5ml离心管；高速离心5s沉淀细胞，用微量移液器吸尽醋酸锂；加入400μl 100mmol/L醋酸锂；将1mlssDNA煮沸5min，快速在冰水中冷却；振荡细胞悬浮液，取50μl样品加到标记的离心管中，离心沉淀细胞，用微量移液器除去醋酸锂；小心按顺序加入基本转化混合液240μl PEG(50％m/V)、36μl 1.0mol/L醋酸锂、25μl ssDNA(2.0mg/ml)、50μl水或质粒DNA或PCR纯化产物；剧烈振荡每个反应管，直到细胞完全混匀，通常需要1min左右；放置30℃保温30min；放置42℃水浴中热激60min；高速离心15s，用微量移液器除去转化混合液；吸取1ml YPD培养基加入每个离心管中，置于30℃下振荡4h；离心，弃去上层培养基，加入1ml无菌水，悬浮菌体；取100μl涂在SD-LEU缺陷的选择平板上，30℃培养3天；挑取红色单克隆作为模板，再以cas7-3基因验证引物cas3-F/cas3-R进行PCR扩增反应，扩增条件同实施例1步骤(1)。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，观察重组子SC BY4741-pRS415-cas7-3中cas3外围扩增条带与预期结果一致，证明pRS415-cas7-3质粒已经成功转入酵母中。

(B)SC BY4741-pRS415-cas7-3感受态制备和pYES2/NTA-t/g-ΔcrtI转化

除挑取成功转入pRS415-cas7-3质粒的SC BY4741-pRS415-cas7-3的单克隆于50ml SC-LEU诱导培养基中进行转化，得到的重组子为白色单克隆外，其余同实施例1步骤(3A)。SCBY4741基因组crtI基因的敲除结果见图2。

各步骤所涉及的引物及其序列如表1所示，大写字母为酶切位点，黑体加粗为互补区。

表1引物及其序列

实施例2pRS415-cas7-3和pYES2/NTA-t-ΔcrtI分别转化敲除SC BY4741基因crtI

(1)蛋白表达质粒pRS415-cas7-3的构建

同实施例1步骤(1)

(2)基因编辑模版载体pYES2/NTA-t-ΔcrtI的构建

(A)上、下游同源臂的制备

同实施例1步骤(2A)

(B)基因编辑模版载体pYES2/NTA-t-ΔcrtI的构建

同实施例1步骤(2B)

(3)重组子的获取与检验

(A)SCBY4741感受态制备和pRS415-cas7-3转化

同实施例1步骤(3-A)

(B)SC BY4741-pRS415-cas7-3感受态制备和pYES2/NTA-t-ΔcrtI转化

除导入质粒pYES2/NTA-t-ΔcrtI外，其余同实施例1步骤(3B)(见图2)。

实施例3单质粒pRS415-cas7-3-t/g-ΔcrtI转化敲除SC BY4741基因crtI

(1)蛋白表达质粒pRS415-cas7-3的构建

同实施例1步骤(1)

(2)蛋白表达与基因编辑单质粒pRS415-cas7-3-t/g-ΔcrtI的构建

(A)上、下游同源臂的制备

除了crtI基因上游同源臂引物crtI-UF2、下游同源臂引物crtI-DR2同时含有XhoI限制性酶切位点，其他同实施例1步骤(2A)，所用的上游同源臂引物crtI-UF2的序列为ccgCTCGAGatcgtttgcgtcgggtgttctcct，下游同源臂引物crtI-DR2的序列为ccgCTCGAGaccaactgaacgagcaataacgg。

(B)蛋白表达与基因编辑单质粒pRS415-cas7-3-t/g-ΔcrtI的构建

除将g-crtI-DNA和t-ΔcrtI-DNA片段分别连到pRS415-cas7-3质粒上，其余步骤同实施例1步骤(2B)。

合成的g-crtI序列(PAM：ttc)：

其中大写字母为酶切位点，单下划线为启动子promoter，斜体为spacer，黑体加粗为repeat，双下划线为终止子terminator。

(3)重组子的获取与检验

(A)SCBY4741感受态制备和质粒pRS415-cas7-3-t/g-ΔcrtI的一步转化

同实施例1步骤(3B)，检测结果见图2。

实施例4单质粒pRS415-cas7-3-t-ΔcrtI转化敲除SC BY4741基因crtI

(1)蛋白表达质粒pRS415-cas7-3的构建

同实施例1步骤(1)

(2)蛋白表达与基因编辑模版单质粒pRS415-cas7-3-t-ΔcrtI的构建

(A)上、下游同源臂的制备

同实施例3步骤(2A)

(B)基因编辑导向载体单质粒pRS415-cas7-3-t-ΔcrtI的构建

除将t-ΔcrtI-DNA片段直接连到pRS415-cas7-3质粒上，其余步骤同实施例

1步骤(2B)。

(3)重组子的获取与检验

除用质粒pRS415-cas7-3-t-ΔcrtI进行转化外，其余同实施例1步骤(3B)，检测结果见图2。

实施例5pRS415-cas7-3和pYES2/NTA-t/g-ΔcrtYB::G418一步转化敲除SCBY4741基因crtYB

(1)蛋白表达质粒pRS415-cas7-3的构建

同实施例1步骤(1)

(2)基因编辑质粒pYES2/NTA-t/g-ΔcrtYB::G418的构建

(A)LoxP-G418-LoxP片段与crtYB上、下游同源臂的制备

根据SC BY4741全基因组测序信息，设计与LoxP-G418-LoxP片段特异性引物crtYB-G418-F/crtYB-G418-R及crtYB-UF/crtYB-UR和crtYB-DF/crtYB-DR分别扩增并检测纯化LoxP-G418-LoxP片段与crtYB上、下游同源臂，扩增条件同实施例1(2-A)。

(B)基因编辑模版载体pYES2/NTA-t-ΔcrtYB::G418的构建

取上同源臂纯化产物与LoxP-G418-LoxP纯化产物各0.5μl混合作为模板，25μl反应体系进行overlap PCR，反应条件为：94℃5min，94℃30s，65℃30s，72℃3min，一个循环后加入引物crtYB-UF和crtYB-G418-R各1μl，继续PCR，反应条件为：94℃5min，94℃30s，65℃30s，72℃3min，进行30个循环，72℃10min，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物并纯化；取得到的纯化产物crtYB-UHA-LoxP-G418-LoxP与下同源臂纯化产物各0.5μl混合作为模板，25μl反应体系进行overlap PCR，反应条件为：94℃5min，94℃30s，62℃30s，72℃4min，一个循环后加入引物crtYB-UF和crtYB-DR各1μl，继续PCR，反应条件为：94℃5min，94℃30s，59℃30s，72℃4min，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物并纯化得基因编辑模版t-ΔcrtYB::G418；将获得的t-ΔcrtYB::G418通过HindIII限制性内切酶、BamHI限制性内切酶切出粘性末端，然后通过全式金生物技术有限公司生产的T4连接酶将其连接到pYES2/NTA质粒上，得到基因编辑模版载体pYES2/NTA-t-ΔcrtYB::G418。

(C)基因编辑质粒pYES2/NTA-t/g-ΔcrtYB::G418的构建

除g-crtYB连接产物的靶向基因片段不同外，其余与实施例1步骤(2C)相同，得基因编辑质粒pYES2/NTA-t/g-ΔcrtYB::G418。

合成的g-crtYB基因序列(PAM:ttc)：

其中大写字母为酶切位点，波浪线为保护碱基，单下划线为启动子promoter，斜体为spacer，黑体加粗为repeat，双下划线为终止子terminator。

(3)重组子的获取与检验

除将质粒pRS415-cas7-3与质粒pYES2/NTA-t/g-ΔcrtYB::G418的同时转化SCBY4741感受态外，其余与实施例4步骤(3)相同。

各步骤中涉及的引物及其序列见表2，表中大写字母为酶切位点，黑体加粗为互补区。

表2引物及其序列

实施例6pSp-cas3-7和pUC19-t/g-Δdrosha敲除HEK293基因drosha

(1)蛋白表达质粒pSp-cas3-cas7的构建

(A)蛋白表达质粒pSp-cas3的构建

根据已经构建好的pRS415-cas7-3质粒的序列信息，设计特异性引物cas3R(1)/cas3F(1)，使用全式金生物技术有限公司生产的TransStart FastPfu DNAPolymerase进行PCR扩增，反应条件同实施例1步骤(1A)。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化的cas3片段。根据质粒pSp-cas9的序列信息设计特异性的引物VectorR(2)/VectorF(2)，使用全式金生物技术有限公司生产的TransStart FastPfu DNA Polymerase进行PC其余步骤同实例1步骤(2B)R扩增，反应条件同实施例1步骤(1A)。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化的pSp质粒骨架。使用全式金生物技术有限公司生产的一步克隆酶连接cas3片段和pSp质粒骨架，得到pSp-cas3质粒。

(B)蛋白表达质粒pSp-cas3-7的构建

根据已经构建好的pRS415-cas7-3质粒的序列信息，设计特异性的引物cas7R/cas7F，使用全式金生物技术有限公司生产的TransStart FastPfu DNAPolymerase进行PCR扩增，反应条件同实施例1步骤(1A)。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化的cas7片段。根据质粒pSp-cas3的序列信息设计特异性的引物VectorR(1)/VectorF(1)，使用全式金生物技术有限公司生产的TransStart FastPfu DNA Polymerase进行PCR扩增，反应条件同实施例1步骤(1A)。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化的pSp-cas3质粒骨架。使用全式金生物技术有限公司生产的一步克隆酶连接cas7片段和pSp-cas3质粒骨架，得到pSp-cas3-7蛋白表达质粒。

(2)基因编辑质粒pUC19-t/g-Δdrosha的构建

(A)上、下游同源臂的制备

除所用引物drosha-UF/drosha-UR和drosha-DR/drosha-DF且上同源臂上游引物含HindIII限制性内切酶酶切位点，下同源臂下游引物含SphI限制性内切酶酶切位点不同外，其余步骤同实施例1步骤(2A)

(B)基因编辑模版载体pUC19-t-Δdrosha的构建

除所用的限制性内切酶酶切位点HindIII、SphI不同之外，

(C)基因编辑质粒pUC19-t/g-Δdrosha的构建

除合成的g-drosha首尾所加的限制性内切酶酶切位点XbaI和BamHI外，其余步骤同实例1步骤(2C)。

合成的g-drosha序列(PAM:ttc)：

其中大写字母为酶切位点，波浪线为保护碱基，单下划线为启动子promoter，斜体为spacer，黑体加粗为repeat，双下划线为终止子terminator。

(3)重组子的获取与检验

取加入含DMEM培养基的6孔培养板，将HEK293细胞接种于含6孔板中，37℃5％CO₂培养箱中培养至70％-90％汇合，将构建好的载pSp-cas3-7(4μl)和pUC19-t/g-Δdrosha(6μl)共转染90μl HEK293细胞(Lipofectamine 2000转染试剂)，6小时后更换新鲜细胞培养液，5-7天后将转染的HEK293细胞接种到大的细胞培养皿中(1×10⁶个/皿)，约10-15天后，将细胞培养皿中出现的肉眼可见的单克隆接种传代到另一6孔板中，待细胞培养长满板时，提取基因组进行PCR，经1％琼脂糖电泳检测，观察重组子染色体DNA扩增条带大小的改变，并经基因测序证明HEK293细胞drosha基因敲除。

各步骤中涉及的引物及其序列见表3，表中大写字母为酶切位点，黑体加粗为互补区。

表3引物及其序列

以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

序列表

<110> 安徽大学

<120> 一种基于I型CRISPR-Cas系统中基因cas7-3的真核基因编辑方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1020

<212> DNA

<213> S. virginiae IBL14

<400> 1

atggttgccg gtgcaccaaa caatggtgaa ggtgaagata atacaggtag agttaaaaaa 60

ttaagggttg gtagggaaga atttccctac gtttccgcac aagcctttag acgttggttg 120

agggattcct tacctgccca agaacctagg tccgttgtta ctagatccgg ttcaggtgct 180

aaacaacaag ctcatacagc aggtagacct gatttgcatt tggatgatga cctctttggt 240

tatatggttg ctgttaaagg taaaggtggt tcatatcaaa gagatacagt tttagcaact 300

ggtacattag tttccgttgt tcctcaaagg ccaactttgg attttggtac tatgtctagg 360

gattttccag ccggtgaaca tcctgttatt catagtcatg aattgtatag tgccactttg 420

gccggcgatg ttttattgga cctccctagg gccggtgttt ttgaaactga tggtaatggt 480

ttaagagttg caatttcacc agccgttgct gaagaagccg ctaaaaatgg tgccgaagtt 540

actactttga ggggttctgc tgctattaga ttaccattga cagaaagaca tcggcggatt 600

ggtacattat tgaggacttt agcatccgtt aggggtggtg ccaaacaagc cttgcattat 660

ggcgaccgag caccatcctt agttttatta gctccattaa aaggtggtgt taatccgttt 720

actagagttt tgggtgccag agatggtaaa cctgttttct tgtccgatgt tttgagggaa 780

gaattggaag cctgggccga tgaattggat ggtccagttt tattgggttg ggcaccaggg 840

ttcttggggg accaaaggga acaagttaga agggaattaa aagaccttat tgatgaaggt 900

agagttgttt tgtcacatcc tagagtttta ttgactcaat tagcagatag gattgaacaa 960

ggtgaccatg atgcctggtt tgaagatagc gctgctccca agaagaagag gaaggtgtga 1020

<210> 2

<211> 2337

<212> DNA

<213> S. virginiae IBL14

<400> 2

atgggtagat tggatgccgt tgaagatgtt tttggtggta gattttggcc agttgttgaa 60

ttggccggtt tgacacatga tgccggaaag attccagaag gttttcaaag aatgttagcc 120

ggttatagta gagcatgggg tgaaagacat gaagttgctt ccttggggtt cttacctgcc 180

ttaattgggg accctgatgt tttattgtgg gttgctacag ctgttgcaac acatcataga 240

ccattaactg gtcaaaatgg tagggacctc caaactttgt atagtggtgt tactattaca 300

gaattggctc ataggtttgg tccatttgat ccaagggccg ttcctgcctt ggaagcctgg 360

ttaagggctt cagcaattag agttggttta cctgccgccg ccgttcctga tgatggtact 420

ttaactgata caggtgttgt tgctggtgct catcaattat tggaagaaat tttggatagg 480

tgggccgata gagttagacc agaagttggt ttagcagcag ttttattaca aggtgccgtt 540

actttggccg atcatttgtc ttccgcccat caagccttac caacagttca accattgggt 600

gcaggttttc gtagtaggtt agaaaaagaa tttgcagaaa ggggtaggac attaagggca 660

catcaattgg aagccgccac tgttacaggt catttgttat tgagaggtcc tacaggttca 720

ggaaagacag aagcagcctt gttgtgggct gcttcacaag ttgaagcctt aaaagccgaa 780

ggtagaggtg ttcctagagt tttctttaca ttaccatacc ttgcttctat taatgctatg 840

gccactagat tgggagacac tttgggggat ggtgaagctg ttggtgttgc ccattcgcgc 900

gctgcttctt atcatttggc tcaagctatt gccccacaag atggcgacga agaagatgaa 960

catggtgcac catgtagagt tgatgcagct gctaaagcct tgtcacgggc agctgctact 1020

aaactcttta gggaatccgt tagagttgcc actccatatc aattattaag ggccgcctta 1080

gccggtccag cacattccgg tattttaatt gatgcagcta attccgtttt tattttggat 1140

gaattacatg cttacgatgc acggaggttg ggttatattt tagcttccgc cagattgtgg 1200

gaaagattgg gtggtaggat tactgttttg tccgcaactt taccaagggc cttagccgat 1260

ttgtttgaat ctactttaac agcacctatt acgtttttgg atactcctga tttgggttta 1320

ccagccaggc atttgttaca tactaggggt catcatttga ctgatcctgc aactttggaa 1380

gaaattaggt tgagattgtc cagggatgaa tccgttttag ttattgctaa caacgtttct 1440

caagctattg ccttgtatga acaattagca cctgatgttt gtgaaaggtt tggtcaagat 1500

gcagccttgt tattacattc tcgctttaga cggatggatc gcagcaggat tgaacaaaaa 1560

attgccgata gatttgccac agttgctcct gatgctcaaa atagtaggaa accaggttta 1620

gttgttgcta cacaagttgt tgaagtttcc ttggatgttg attttgatgt tttgtttaca 1680

ggtgctgccc cattggaagc cttattgcaa agatttggta ggactaatag agttggtgcc 1740

agacctccag ccgatgttat tgttcatcat ccagcatgga ctacacgtcg tagacaacct 1800

ggtgaatatg ccgatggtat ctatccaagg gaacctgttg aatccgcttg gcatatttta 1860

actagaaatc atggtagagt tattgatgaa gccgatgcca ctgcatggtt ggatgaagtt 1920

tatgcaactg attggggtag gcaatggcat agggaagttt tggaaagacg tgaaagattt 1980

gatagagcct ttttgcagtt tagataccca tttgaagata ggactgatct cgcagatact 2040

tttgatgaat tatttgatgg ttccgaagca attttagcag aagatcaaga tgcctatagt 2100

gccgccttag ctgccccaga tggagaccat ccaggtgccg gtaggttatt agccgaagaa 2160

tatttgattc cagttcctca ttgggcttca ccattatcta ggtatgaaaa acaattaaaa 2220

gttagagtta ttaatggcga ctatcatcca gatcatggtt taatggccgt taggggttta 2280

cctcaacctg catatagggc cggtgaagtt ttacccaaga agaagaggaa ggtgtga 2337

<210> 3

<211> 908

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atcgtttgcg tcgggtgttc tcctttgccg ttatgtatat gggtcaatca ccatatagtg 60

cccctggtac atattcctta ttacaatata cagaattaac agaaggtatt tggtatcctc 120

gtggtggttt ttggcaagtt cctaatacat tgttgcaaat tgttaaacgt aacaatccat 180

ccgccaagtt taattttaat gcaccagttt cacaagtttt attatcacct gccaaagatc 240

gtgccacagg tgttcgttta gaatccggtg aagaacatca tgccgatgtt gttattgtta 300

atgccgattt ggtttatgcc tccgaacatc tcattccagc agctccagaa ggtaaagatg 360

ctattgttat tttagttcca tgtggtcata ttgatacttc taatccacaa gattataaca 420

agttagttgc tcgtgctcgt aaatttgtta ttcaaacatt aagtgctaaa ttaggtttac 480

ctgattttga aaaaatgatt gttgccgaaa aagttcatga tgcaccatca tgggaaaaag 540

agtttaattt gaaagatggt agtattttgg gtttagcaca taattttatg caagttttgg 600

gttttcgtcc tagtactcgt catcctaaat atgataaatt gtttttcgtt ggtgcttcta 660

ctcatccagg tacaggtgtt ccaattgttt tggccggtgc caaattaact gccaatcaag 720

ttttggaatc ctttaatcgt tctccagcac ctgatcctaa tatgtccttg tccgttccat 780

acggtaaacc attgaaatct aatggtacag gtattgattc tcaagttcaa ttgaagttta 840

tggatttgga aaaatgggtt tatcttttag ttttgttaat tggtgccgtt attgctcgtt 900

cagttggt 908

<210> 4

<211> 889

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gccttaccta aaactcggtc ttctgcacgt tcattagcct taaaagcatt aattccatta 60

ccaattatct acctgtttac agttcatcca tcaccatcac cagatccatt agttactgat 120

cattattttt atatgcgtgc cttgtcattg ttaattacac cacctacaat gttattagcc 180

gccttaagtg gtgaatatgc ctttgattgg aaatcaggtc gtgccaaatc tactattgca 240

gctattatga ttccaacagt ttatctgatt tgggttgatt atgttgccgt tggtcaagat 300

tcatggagta ttaatgatga aaaaattgtt ggttggcgtt tgggtggtgt tttaccaatt 360

gaagaagcaa tgttcttctt gttgactaat ttgatgattg ttttgggttt gagtgcctgt 420

gatcatacac aagccttgta tcttttgcat ggtccaagtc gtccaactgg tatgtatcca 480

ttgccaccac ctccatcttt atcaccagcg gaattagttc gttttttgac agaacgtgtt 540

ccagttcaat atcattttgc ctttcgttta ttagctaaat tgcaaggttt aattcctcgt 600

tatccattag atgaattgtt acgtggttat acaacagacc tgacatttcc attaagtaca 660

gaagccgttc aagcccgtaa aactcctatt gaaacaactg ccgatttgtt agattatggt 720

ttatgtgttg ctggttcagt tgccgaatta ttagtttatg tttcatgggc ctcagcccca 780

tcacaagttc cagctactat tgaagaacgt gaagccgttt tagttgctag tcgtgaaatg 840

ggtacagcct tacaattagt taatattgct cgtgatatta aaggcgatg 889

<210> 5

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ggttatgttt gaatttgaat gctggtctca ctgtgatttt tgtgtttggt ctatgcctac 60

atggtttgtt tttttttttg tttttttttt tttgtttgtt tttttgagac tgtcgcccag 120

gctggaatgc agtggcgcca tctcggctca ctgcaagctc tgcctcccag gttcatgtca 180

ttctcctgcc tcagcctccc gagtagctgg gactacaggc gcccaccacc acgcccggct 240

aagtttttgt atttttagta gagacaggat ttcactgtgt tagccaggat ggtctccacc 300

tcctgccctc gtgatccacc tgcctcgacc tcctggaaac tttaacacag ttcaacatgc 360

ttttaatttt gtttgtaggc taagtgtatt ggaaactaca aaattagtgt tatggtaatt 420

gcagaaatat tttgtagcat tggcagtttg ggaaacatgt ttatgtctgt tttattcttt 480

ctgtttttta gagcttatat tctctgtgga agatgtgaca tatccaggcg gaacatcatg 540

atgcagggaa ac 552

Claims (4)

1.一种基于I型CRISPR-Cas系统中基因cas7-3的真核基因编辑方法，其特征在于：利用维吉尼亚链霉菌IBL14基因组中的cas7和cas3基因所构建的蛋白表达质粒和/或基因编辑质粒对真核细胞进行基因编辑。

2.根据权利要求1所述的一种基于I型CRISPR-Cas系统中基因cas7-3的真核基因编辑方法，其特征在于：包括蛋白表达质粒的构建、基因编辑质粒的构建和重组子的获取与检验，具体步骤如下：

（1）蛋白表达质粒的构建

根据维吉尼亚链霉菌IBL14中基因cas7与cas3序列及载体序列，合成其密码子优化的基因cas7与cas3及相关引物，并将优化后的基因cas7与cas3与载体连接得蛋白表达载体vector-cas7-3；

（2）基因编辑载体的构建

根据真核生物靶向基因DNA序列信息设计引物，以真核生物基因组为模版，通过PCR反应分别扩增得到末端同时带有限制性内切酶切位点及overlap PCR互补序列的靶向基因的上、下游同源臂片段，并通过overlap PCR将上、下游同源臂连接到基因编辑模版t-DNA上，同时根据真核生物靶向基因序列信息设计并直接合成首尾分别包含半乳糖启动子和RNA终止子的靶向基因片段g-DNA，依据限制性酶切位点上的粘性末端将基因编辑模版t-DNA与靶向基因片段g-DNA连接到载体上，得到基因编辑载体vector-t/g-gene abbreviation；

（3）重组子的获取与检验

制备真核生物细胞感受态，将按步骤（1）得到的蛋白表达载体vector-cas7-3和步骤（2）得到的基因编辑载体vector-t/g-DNA分别转化或转染到目标感受态细胞中，得到候选的基因编辑重组子；对重组子染色体进行PCR和基因测序或功能分析，得到正确的基因编辑重组子。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于I型CRISPR-Cas系统中基因cas7-3的真核基因编辑方法，其特征在于：所述的真核生物指酿酒酵母微生物或动、植物的真核细胞。

4.根据权利要求1所述的一种基于I型CRISPR-Cas系统中基因cas7-3的真核基因编辑方法，其特征在于：所述的基因编辑指对真核细胞的染色体基因进行插入、敲除、无痕点突变及任意组合。