JP7301332B2 - Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット - Google Patents
Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット Download PDFInfo
- Publication number
- JP7301332B2 JP7301332B2 JP2019015319A JP2019015319A JP7301332B2 JP 7301332 B2 JP7301332 B2 JP 7301332B2 JP 2019015319 A JP2019015319 A JP 2019015319A JP 2019015319 A JP2019015319 A JP 2019015319A JP 7301332 B2 JP7301332 B2 JP 7301332B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cas3
- crispr
- dna
- protein
- crrna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 62
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 title claims description 46
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 161
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 147
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 137
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 136
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 136
- 238000010440 CRISPR–Cas3 gene editing Methods 0.000 claims description 116
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 78
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 59
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 claims description 38
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 24
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 89
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 80
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 76
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 65
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 37
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 32
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 24
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 23
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 23
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 23
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 21
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 20
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 20
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 19
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 18
- 101001048956 Homo sapiens Homeobox protein EMX1 Proteins 0.000 description 17
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 14
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 14
- 101150017501 CCR5 gene Proteins 0.000 description 14
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 13
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 13
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 11
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 238000010442 DNA editing Methods 0.000 description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 9
- 102100023823 Homeobox protein EMX1 Human genes 0.000 description 8
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 101100438883 Homo sapiens CCR5 gene Proteins 0.000 description 5
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 4
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenoxy)-3,3-dimethyl-1-(1,2,4-triazol-1-yl)butan-2-one Chemical compound C1=NC=NN1C(C(=O)C(C)(C)C)OC1=CC=C(Cl)C=C1 WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 2
- 101000709520 Chlamydia trachomatis serovar L2 (strain 434/Bu / ATCC VR-902B) Atypical response regulator protein ChxR Proteins 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010025678 empty spiracles homeobox proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000000270 postfertilization Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102100036664 Adenosine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102100026846 Cytidine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010031325 Cytidine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 108010046331 Deoxyribodipyrimidine photo-lyase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101100005249 Escherichia coli (strain K12) ygcB gene Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 102000010437 HD domains Human genes 0.000 description 1
- 108050001906 HD domains Proteins 0.000 description 1
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000615488 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 241000283953 Lagomorpha Species 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100021299 Methyl-CpG-binding domain protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 240000008790 Musa x paradisiaca Species 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 230000010718 Oxidation Activity Effects 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093078 Pyrimidine dimer Proteins 0.000 description 1
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000863432 Shewanella putrefaciens Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241001493546 Suina Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 1
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000002535 acidifier Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000008970 bacterial immunity Effects 0.000 description 1
- 235000021015 bananas Nutrition 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 101150055191 cas3 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 101150037603 cst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000027832 depurination Effects 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 102000040620 helicase family Human genes 0.000 description 1
- 108091070619 helicase family Proteins 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000012223 nuclear import Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000003883 ointment base Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000004848 polyfunctional curative Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000013635 pyrimidine dimer Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 210000003813 thumb Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/14—Plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(B)カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
(C)crRNA、該crRNAをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
[2]DNAが編集された動物(ただしヒトを除く)または植物を製造する方法であって、動物(ただしヒトを除く)または植物にCRISPR-Cas3システムを導入することを含み、CRISPR-Cas3システムが以下の(A)~(C)を含む方法。
(B)カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
(C)crRNA、該crRNAをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
[3]真核細胞にCRISPR-Cas3システムを導入した後に、カスケードタンパク質を構成するタンパク質によりcrRNAが切断される工程を含む、[1]または[2]に記載の方法。
(B)カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
[8]crRNA、該crRNAをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチド含む発現ベクターをさらに含む、[7]に記載のキット。
本発明の方法は、真核細胞にCRISPR-Cas3システムを導入することを含み、CRISPR-Cas3システムが以下の(A)~(C)を含む方法である。
(B)カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
(C)crRNA、該crRNAをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
クラス1のCRISPR-Casシステムは、タイプIおよびタイプIIIに分類され、さらに、タイプIは、カスケードを構成するタンパク質(以下、単に「カスケード」または「カスケードタンパク質」と称する。)の種類によって、タイプI-A、タイプI-B、タイプI-C、タイプI-D、タイプI-E、およびタイプI-Fの6種類、並びにタイプI-BのサブタイプであるタイプI-Gに分類される(例えば、[van der Oost J et al. (2014) Unravelling the structural and mechanistic basis of CRISPR-Cas systems, Nature Reviews Microbiologym, Vol.12 (No.7), pp.479-492]、[Jackson RN et al. (2014) Fitting CRISPR-associated Cas3 into the Helicase Family Tree, Current Opinion in Structural Biology, Vol.24, pp.106-114]を参照)。
本発明のCRISPR-Cas3システムにおいて、Casタンパク質群は、タンパク質の形態で、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの形態で、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形態で、真核細胞に導入することができる。Casタンパク質群をタンパク質の形態で真核細胞に導入する場合には、各タンパク質の量等を適宜調製することが可能であり、ハンドリングの観点で優れている。また、細胞内での切断効率等を考慮して、Casタンパク質群の複合体を先に形成させた後に、真核細胞へ導入することもできる。
Cas3;配列番号1または配列番号7で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質
Cse1(Cas8);配列番号2または配列番号8で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質
Cse2(Cas11);配列番号3または配列番号9で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質
Cas5;配列番号4または配列番号10で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質
Cas6;配列番号5または配列番号11で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質
Cas7;配列番号6または配列番号12で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質
上記Casタンパク質群は、(1)野生型大腸菌のCas3、Cse1(Cas8)、Cse2(Cas11)、Cas5、Cas6、Cas7のN末端に、核移行シグナルとしてPKKKRKV(配列番号52)を付加したタンパク質、または(2)野生型大腸菌のCas3、Cse1(Cas8)、Cse2(Cas11)、Cas5、Cas6、Cas7のN末端およびC末端に、核移行シグナルとしてKRTADGSEFESPKKKRKVE(配列番号54)を付加したタンパク質である。このようなアミノ酸配列のタンパク質とすることにより、上記Casタンパク質群を真核細胞の核内へ移行させることができる。このようにして核内に移行した上記Casタンパク質群は、標的のDNAを切断する。また、CRISPAR-Cas9システムでは困難であると考えられている、強固な構造を有するDNA領域(ヘテロクロマチンなど)においても、標的のDNAの編集が可能となる。
タイプI-EのCRISPR-Casシステムを構成する野生型のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、真核細胞内で効率的に発現するように改変を施したポリヌクレオチドを含む。すなわち、Casタンパク質群をコードし、改変が施されたポリヌクレオチドを用いることができる。ポリヌクレオチドの改変の一つの好ましい態様は、真核細胞内での発現に適した塩基配列への改変であり、例えば、真核細胞内で発現するようにコドンを最適化することである。
Cas3;配列番号1または配列番号7で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
Cse1(Cas8);配列番号2または配列番号8で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
Cse2(Cas11);配列番号3または配列番号9で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
Cas5;配列番号4または配列番号10で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
Cas6;配列番号5または配列番号11で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
Cas7;配列番号6または配列番号12で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
これらは、大腸菌の野生型Casタンパク質群をコードする塩基配列(Cas3;配列番号13、Cse1(Cas8);配列番号14、Cse2(Cas11);配列番号15、Cas5;配列番号16、Cas6;配列番号17、Cas7;配列番号18)を、人工的に改変することにより、哺乳動物細胞において発現および機能できるようにしたポリヌクレオチドである。
本発明においては、Casタンパク質群を発現させるための発現ベクターを利用することができる。発現ベクターは、基材ベクターとして、一般的に使用される種々のベクターを用いることができ、導入される細胞または導入方法に応じて適宜選択されうる。具体的には、プラスミド、ファージ、コスミドなどを用いることができる。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。
本発明のCRISPR-Cas3システムは、ゲノム編集を行うDNAへの標的化のために、crRNA、crRNAをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。
本発明における「真核細胞」としては、例えば、動物細胞、植物細胞、藻細胞、真菌細胞が挙げられる。また動物細胞としては、例えば、哺乳動物細胞の他、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類の細胞が挙げられる。
本発明において、「真核細胞のDNAを編集する」とは、真核細胞のDNAの編集をインビボで行う工程であってもよく、インビトロで行う工程であってもよい。また、「DNAを編集する」とは、以下の類型に例示される操作(その組み合わせを含む)を意図する。
1.標的部位におけるDNA鎖を切断する。
2.標的部位におけるDNA鎖の塩基を欠失させる。
3.標的部位におけるDNA鎖に塩基を挿入する。
4.標的部位におけるDNA鎖の塩基を置換する。
5.標的部位におけるDNA鎖の塩基を修飾する。
6.標的部位におけるDNA(遺伝子)の転写を調節する。
本発明のCRISPR-Cas3システムに用いられるキットは、以下の(A)および(B)を含む。
(B)カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
さらに、crRNA、該crRNAをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチド含む発現ベクターを含んでもよい。
〔材料と方法〕
[1]標的配列を含むレポーターベクターの作製
標的配列は、ヒトCCR5遺伝子由来の配列(配列番号19)、および大腸菌のCRISPRのスペーサー配列(配列番号22)とした。
[インサートの増幅および調製]
Cse1(Cas8)、Cse2(Cas11)、Cas5、Cas6およびCas7をコードする、改変された塩基配列を有するポリヌクレオチド(それぞれ、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5および配列番号6)については、まず、配列番号2-配列番号3-配列番号6-配列番号4-配列番号5の順に連結されたポリヌクレオチド(Cse1(Cas8)-Cse2(Cas11)-Cas7-Cas5-Cas6の順に、それぞれをコードする塩基配列が連結されたポリヌクレオチド)を、ジェンスクリプト社に製造委託し、入手した。Cse1(Cas8)-Cse2(Cas11)-Cas7-Cas5-Cas6の各タンパク質をコードする塩基配列間は、2Aペプチド(アミノ酸配列:GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(配列番号58))で連結した。
1.ヒトCCR5遺伝子由来の配列に対応するcrRNAを発現させるためのポリヌクレオチド(配列番号25および26、北海道システムサイエンス社より入手)
2.大腸菌のCRISPRのスペーサー配列に対応するcrRNAを発現させるためのポリヌクレオチド(配列番号27および28、北海道システムサイエンス社より入手)
3.ヒトEMX1遺伝子由来の配列に対応するcrRNAを発現させるためのポリヌクレオチド(配列番号29および30、ファスマック社より入手)。
基材プラスミドとして、pPB-CAG-EBNXN(Sanger Centerより供与)を用いた。NEBバッファー中で、基材プラスミド1.6μgと、制限酵素BglII(New England Biolabs社)1μlおよびXhoI(New England Biolabs社)0.5μlとを混合し、37℃にて2時間反応させた。切断された基材プラスミドは、Gel extraction kit(Qiagen社)にて精製した。
Cas3をコードする、改変された塩基配列を有するポリヌクレオチド(配列番号1)は、Genscript社より入手した。具体的には、上記のポリヌクレオチドが組み込まれているpUC57 vectorを、Genscript社より入手した。
BPNLSを5’末端および3’末端に連結させた、Cas3、Cse1(Cas8)、Cse2(Cas11)、Cas5、Cas6およびCas7発現ベクターを作製した(図7を参照)。
Cse1(Cas8)、Cse2(Cas11)、Cas7、Cas5およびCas6が、この順に連結された塩基配列の発現ベクターを作製した。より具体的には、(NLS-Cse1(Cas8):配列番号2)-2A-(NLS-Cse2(Cas11):配列番号3)-2A-(NLS-Cas7:配列番号6)-2A-(NLS-Cas5:配列番号4)-2A-(NLS-Cas6:配列番号5)の順に配置された発現ベクターを作製した(図8参照)。なお、NLSのアミノ酸配列はPKKKRKV(配列番号52)、塩基配列はCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTG(配列番号53)である。また、2Aペプチドのアミノ酸配列はGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(配列番号58)である(対応する塩基配列は、それぞれ配列番号59~62である)。
塩基配列を改変し、核移行シグナルを付加したCas3、Cse1(Cas8)、Cse2(Cas11)、Cas5、Cas6およびCas7と、crRNAとをHEK(human embryonic kidney)293T細胞に発現させ、外因性DNAの標的配列の切断活性を評価した。
1.Cas3プラスミド、Cse1(Cas8)プラスミド、Cse2(Cas11)プラスミド、Cas5プラスミド、Cas6プラスミドまたはCas7プラスミドのいずれか1つの代わりに、同量のpBluecscriptII KS(+)ベクター(Agilent Technologies社)を混合し、発現させた(図1の2~7)。
2.上記の操作手順で用いたcrRNAプラスミドの代わりに、標的配列とは相補的でないcrRNAを発現させるプラスミドを混合した。すなわち、CCR5遺伝子由来の標的配列に対しては、大腸菌のCRISPRのスペーサー配列に対応するcrRNAを発現させるプラスミドを混合させ(図1の8)、大腸菌のCRISPRのスペーサー配列を標的とする場合は、CCR5遺伝子由来の配列に対応するcrRNAを発現させるプラスミドを混合し、発現させた(図1の11)。
3.ネガティブコントロールとして、CCR5由来の標的配列を有するレポーターベクターのみ(図1の9)、大腸菌のCRISPRのスペーサー配列を有するレポーターベクターのみ(図1の12)を発現させた。
dual-Luciferaseアッセイの結果を図1上のグラフに、実験条件を図1下の表に示した。図1の(b)中、「CCR5-target」および「spacer-target」は、それぞれ、CCR5由来の標的配列および大腸菌のCRISPRのスペーサー配列を表す。また、「CCR5-crRNA」および「spacer-crRNA」は、それぞれ、上記CCR5-targetと相補的な配列およびspacer-targetと相補的な配列を表す。
実施例A-1と同様の方法を用いて、タイプIのCRISPR-Casシステムによりヒト細胞の内因性DNAを切断できるか否かを評価するための実験を行った。
上記実験の結果、元々の塩基配列と比較して、401bpが欠失しているクローン1、341bpが欠失しているクローン2、268bpが欠失しているクローン3、および344bpが欠失しているクローン4が得られた(図3A~D)。このことより、本発明のCRISPR-Cas3システムによって、ヒト細胞の内因性DNAを欠失できることが示された。すなわち、上記CRISPR-Casシステムによって、ヒト細胞のDNAの編集が可能であることが示唆された。
実施例A-1と同様の方法を用いて、CRISPR-Cas3システムによりヒト細胞の内因性DNAを切断できるか否かを評価するための、実験を行った。
上記実験の結果、元々の塩基配列と比較して、513bpおよび363bpの2箇所が欠失しているクローン1、ならびに694bpが欠失しているクローン2が得られた(図6A、B)。この実験結果からも、本発明のCRISPR-Cas3システムによって、ヒト細胞の内因性DNAを欠失できることが示された。すなわち、上記CRISPR-Cas3システムによって、ヒト細胞のDNAの編集が可能であることが示唆された。
塩基配列を改変し、さらにカスケードタンパク質をコードする塩基配列を連結したCRISPR-Cas3システムを、HEK293T細胞に発現させ、外因性DNAの標的配列の切断活性を評価した。
1.Cas3プラスミドおよびカスケード(2A)プラスミドのいずれか一方の代わりに、同量のpBluscriptII KS(+)ベクター(Agilent Technologies社)を混合し、発現させた(図9の2および3)。
2.上記の操作手順で用いたcrRNAプラスミドの代わりに、標的配列とは相補的でないcrRNAを発現させるプラスミドを混合した。すなわち、CCR5遺伝子由来の標的配列に対しては、大腸菌のCRISPRのスペーサー配列に対応するcrRNAを発現させるプラスミドを混合させ(図9の4)、大腸菌のCRISPRのスペーサー配列を標的とする場合は、CCR5遺伝子由来の配列に対応するgRNAを発現させるプラスミドを混合し、発現させた(図9の7)。
3.ネガティブコントロールとして、CCR5由来の標的配列を有するレポーターベクターのみ(図9の5)、大腸菌のCRISPRのスペーサー配列を有するレポーターベクターのみ(図9の8)を発現させた。
dual-Luciferaseアッセイの結果を図9上のグラフに、実験条件を図9下の表に示した。図9において、「CCR5-target」および「spacer-target」は、それぞれ、CCR5由来の標的配列および大腸菌のCRISPRのスペーサー配列を表す。また、「CCR5-crRNA」および「spacer-crRNA」は、それぞれ、上記CCR5-targetと相補的な配列およびspacer-targetと相補的な配列を表す。
〔材料と方法〕
[1]Cas遺伝子とcrRNAの構成
bpNLSをそれぞれの5’側および3’側に付加した、大腸菌K-12株由来のCas3とカスケードの構成遺伝子(Cse1, Cse2, Cas5, Cas6, Cas7)を設計し、哺乳動物細胞にコドンオプティマイズ後に遺伝子合成によりクローニングした。これらの遺伝子は、サンガー研究所より寄贈されたpPB-CAG.EBNXNプラスミドのCAGプロモーターの下流にサブクローニングした。H74A(dead nickase; dn)、K320N(dead helicase; dh)、S483AとT485Aの二重変異体(dead helicase ver.2; dh2)といったCas3の変異体は、PrimeSTAR MAXのPCR産物をセルフライゲーションすることで作製した。crRNAの発現プラスミドに関して、U6プロモーター下のスペーサーの位置に2カ所のBbsI制限酵素部位を持っているcrRNAの配列を合成した。全てのcrRNA発現プラスミドは、BbsI制限酵素サイトに、標的配列の32塩基対の二重鎖オリゴを挿入することで作製した。
哺乳動物細胞でDNA切断活性を検出するために、実施例Aと同様に、SSAアッセイを実施した。HEK293T細胞は、10%胎児ウシ血清を加えたhigh-Glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium(Thermo fisher社)で、37℃、5%CO2下で培養した。0.5×104個の細胞を96穴プレートのウェルに播種し、24時間後に、Cas3、Cse1、Cse2、Cas7、Cas5、Cas6、crRNA発現プラスミド(それぞれ100ng)、SSAレポーターベクター(100ng)、レニラルシフェラーゼベクター(60ng)を、lipofectamine2000およびOptiMEM(Life Technologies社)を用いて、わずかに修正したプロトコルに従い、HEK293T細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後に、Dual-Glo luciferase assay system(Promega社)を用い、プロトコルに従って、デュアルルシフェラーゼアッセイを行った。
2.5x104個の細胞を24穴プレートのウェルに播種した24時間後に、Cas3、Cse1、Cse2、Cas7、Cas5、Cas6、crRNA発現プラスミド(それぞれ250ng)を、lipofectamine2000とOptiMEM(Life Technologies社)を用い、わずかに修正したプロトコルに従って、HEK293T細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの2日後、Tissue XS kit(Takara-bio社)を用いて、プロトコルに従い、回収した細胞から全DNAを抽出した。標的遺伝子座をGflex (Takara bio社)またはQuick Taq HS DyeMix (TOYOBO社)を用いて増幅し、アガロースゲルで電気泳動した。PCR産物における小さな挿入/欠失変異を検出するために、SURVEYOR Mutation Detection Kit(Integrated DNA Technologies社)をプロトコルに従い用いた。TAクローニングでは、pCR4Blunt-TOPO plasmid vector(Life Technologies社)をプロトコルに従い用いた。シークエンス解析には、BigDye Terminator Cycle Sequencing KitおよびABI PRISM 3130 Genetic Analyzer(Life Technologies社)を用いた。
タイプI-E CRISPRのオフターゲット候補は、ヒトゲノムのhg38において、2つの異なった手順によりGGGenomeを用いて検出した。PAM候補の配列としては、既報(Leenay, R.T, et al. Mol. Cell 62, 137-147(2016)、Jung, et al. Mol. Cell. 2017Jung et al., Cell 170, 35-47(2017))に従い、AAG、ATG、AGG、GAG、TAG、AACを選択した。6の倍数のポジションは標的部位として認識されないことが報告されていたことから(Kunne et al., Molecular Cell 63, 1-13(2016))、最初のアプローチでは、これらを除いた標的配列の32塩基対に対して、よりミスマッチが少ないものを選択した。次のアプローチでは、標的配列のPAM側5’端に完全にマッチしている領域を検出し、高い順にリストした。
全ゲノムシークエンスでは、トランスフェクションされたHEK293T細胞からゲノムDNAを抽出し、Covaris sonicatorを使用して切断した。TruSeq DNA PCR-Free LT Library Prep Kit(Illumina社)を用いてDNAライブラリを準備し、タカラバイオの標準手順に従い、HiSeq X(2×150bp)を用いてゲノムシークエンスを行った。それぞれのサンプルのローリード(raw reads)を、BWA-MEMによりヒトゲノムのhg38にマップし、Trimmomatic programによってクリーニングした。ディスコーダントリードペア(Discordant read pairs)とスプリットリード(split reads)は、それぞれsamtoolsとLumpy-svによって除外した。同じ染色体での大きい欠失だけを検出するために、Genome Analysis Toolkit programのBadMateFilterを用いて、異なる染色体にマップされたリードペアを除去した。それぞれ100kb領域でのディスコーダントリードペアまたはスプリットリードの総数をBedtoolsでカウントし、ネガティブコントロールとのエラー率を算出した。シークエンス前のオフターゲット候補を豊富にするために、SureSelectXT custom DNA probesをSureDesignによって適度にストリンジェントな条件で設計し、Agilent technologiesが作製した。標的領域は、以下の通り、選択した。標的領域付近のプローブは、PAMの上流800kbと下流200kbをカバーした。CRISPR-Cas3のオフターゲット領域付近では、PAM候補の9kb上流と1kb下流をカバーした。CRISPR-Cas9のオフターゲット領域付近では、PAMの上流、下流それぞれ1kbをカバーした。SureSelectXT reagent kitとcustom probe kitによるDNAライブラリの準備の後、タカラバイオの標準手順に従い、Hiseq 2500(2×150bp)により、ゲノムシークエンスを行った。同一の染色体でのディスコーダントリードペアとスプリットリードは、上記の方法で除外した。それぞれ10kb領域でのディスコーダントリードペアまたはスプリットリードの総数をBedtoolsでカウントし、ネガティブコントロールとのエラー率を算出した。
実施例Aでは、偶然にも、crRNAとしてプレcrRNA(LRSR;リーダー配列-リピート配列-スペーサー配列-リピート配列)を含むCRISPR-Cas3システムを利用して真核細胞におけるゲノム編集に成功した。ここで、本発明者は、これまで長年に渡ってCRISPR-Cas3システムを利用した真核細胞でのゲノム編集に成功しなかった理由が、crRNAとして成熟crRNAが用いられてきたことにあるのではないかと考えた。そこで、crRNAとして、プレcrRNA(LRSR)の他に、プレcrRNA(RSR;リピート配列-スペーサー配列-リピート配列)と成熟crRNA(5’ハンドル配列-スペーサー配列-3’ハンドル配列)を調製し、実施例Aのレポーターシステムによりゲノム編集効率を検証した(図10A、B)。なお、プレcrRNA(LRSR)、プレcrRNA(RSR)、成熟crRNAの塩基配列を、それぞれ配列番号:63、64、65に示す。
CRISPR-Cas3システムの標的特異性を確認するために、DNA切断活性における様々なPAM配列の効果を調べた(図12)。SSAアッセイでは、異なったPAM配列によってDNA切断活性は様々な結果となった。5’-AAG PAMが最も高い活性を示し、AGG、GAG、TAC、ATG、TAGも注目すべき活性をみせた。
大腸菌のカスケードの結晶構造の過去の研究では、crRNAとスペーサーDNAとの間で5塩基区画のヘテロ2本鎖を形成することが示されており、これはCas7エフェクターのサムエレメントにより、6番目のポジション毎に塩基対合が破綻することによる(図13)。DNA切断活性でのcrRNAとスペーサー配列のミスマッチの影響を評価した(図1g)。標的として認識されない塩基(ポジション6)を除いて、シード領域(ポジション1-8)でのどの単一ミスマッチでも切断活性は劇的に落ちた。
Cas3タンパクの触媒的特徴のインビトロでの性質決定では、N末端のHDヌクレアーゼドメインがDNA基質の1本鎖領域を切断し、続いて、C末端のSF2ヘリケースドメインが、ATP依存的に、標的DNA上を3’から5‘方向へ進行してほどいていくことが明らかになった。3つのCas3の変異体、すなわち、HDドメインH74Aの変異体(dnCas3)、SF2ドメインモチーフ1のK320Nの変異体(dhCas3)、およびSF2ドメインモチーフ3のS483A/T485Aのダブルの変異体(dh2Cas3)を作製して、Cas3ドメインがDNA切断に必要か否かを検証した(図14)。その結果、3つ全てのCas3タンパクの変異体でDNA切断活性が完全に消失しており、Cas3はHDヌクレアーゼドメインとSF2ヘリケースドメインを通して標的DNAを切断できることが判明した。
タイプ1のCRISPR-Cas3システムは高度に多様化している(タイプ1のA~Gの7種類)。上記実施例では、タイプI-EのCRISPR-Cas3システムにおける真核細胞でのDNA切断活性を検証したが、本実施例では、それ以外のタイプ1のCRISPR-Cas3システム(タイプI-FとタイプI-G)におけるDNA切断活性の検証を行った。具体的には、タイプI-Fのシュワネラ・プトレファシエンスのCas3、Cas5-7、およびタイプI-Gのピュロコックス・フリオススのCas5-8をコドンオプティマイズしクローニングした(図15)。その結果、DNA切断活性の強さに差異はあるものの、293T細胞を用いたSSAアッセイにおいて、これらのタイプ1のCRISPR-Cas3システムにもDNA切断活性が認められた。
CRISPR-Cas3システムにより内因性遺伝子に導入された変異を、タイプI-Eシステムを利用して検証した。EMX1遺伝子とCCR5遺伝子を標的遺伝子として選択し、プレcrRNA(LRSR)プラスミドを調製した。293T細胞にプレcrRNAと6つのCas(3,5-8,11)エフェクターをコードするプラスミドをリポフェクションした結果、CRISPR-Cas3により数百から数千塩基対の欠失が主に標的領域のスペーサー配列の5’PAMの上流方向で起きたことが明らかとなった(図16)。修復されたジャンクションでの5-10塩基対のマイクロホモロジーが確認でき、アニーリング依存性の修復経路による相補鎖のアニーリングによって起こったのかもしれない。なお、成熟crRNAプラスミドでは、EMX1とCCR5領域でのゲノム編集は見られなかった。
Claims (9)
- DNAが編集された真核細胞(ただし、ヒト体内に存在する状態の細胞、ヒト生殖細胞、およびヒト胚細胞を除く)または動物(ただし、ヒトを除く)を製造する方法であって、真核細胞(ただし、ヒト体内に存在する状態の細胞、ヒト生殖細胞、およびヒト胚細胞を除く)または動物(ただし、ヒトを除く)に、真核細胞内または動物内でDNAを編集できるCRISPR-Cas3システムを導入することを含み、CRISPR-Cas3システムが以下の(A)~(C)を含む方法(ただし、CRISPR-Cas3システムがタイプI-Dの場合には、真核細胞は哺乳動物細胞であり、動物は哺乳動物である)。
(A)Cas3タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
(B)カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
(C)プレcrRNA、該crRNAをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター - DNAが編集された植物を製造する方法であって、植物に、植物内でDNAを編集できるCRISPR-Cas3システムを導入することを含み、CRISPR-Cas3システムが以下の(A)~(C)を含む方法(ただし、CRISPR-Cas3システムがタイプI-Dの場合を除く)。
(A)Cas3タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
(B)カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
(C)プレcrRNA、該crRNAをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター - 真核細胞、動物、または植物にCRISPR-Cas3システムを導入した後に、カスケードタンパク質を構成するタンパク質によりcrRNAが切断される工程を含む、請求項1または2に記載の方法。
- Cas3タンパク質および/またはカスケードタンパク質に核移行シグナルが付加されている、請求項1~3のいずれかに記載の方法。
- 核移行シグナルがバイパルタイト核移行シグナルである、請求項4に記載の方法。
- DNAが編集された真核細胞または動物の製造に用いるためのキットであって、真核細胞内または動物内でDNAを編集できるCRISPR-Cas3システムを構成する以下の(A)から(C)を含むキット(ただし、CRISPR-Cas3システムがタイプI-Dの場合には、真核細胞は哺乳動物細胞であり、動物は哺乳動物である)。
(A)Cas3タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
(B)カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
(C)プレcrRNA、該crRNAをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチド含む発現ベクター - DNAが編集された植物の製造に用いるためのキットであって、植物内でDNAを編集できるCRISPR-Cas3システムを構成する以下の(A)から(C)を含むキット(ただし、CRISPR-Cas3システムがタイプI-Dの場合を除く)。
(A)Cas3タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
(B)カスケードタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
(C)プレcrRNA、該crRNAをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチド含む発現ベクター - Cas3タンパク質および/またはカスケードタンパク質に核移行シグナルが付加されている、請求項6または7に記載のキット。
- 核移行シグナルがバイパルタイト核移行シグナルである、請求項8に記載のキット。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2023025086A JP7430358B2 (ja) | 2017-06-08 | 2023-02-21 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
JP2024010099A JP2024028649A (ja) | 2017-06-08 | 2024-01-26 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017113747 | 2017-06-08 | ||
JP2017113747 | 2017-06-08 | ||
JP2018554598A JP6480647B1 (ja) | 2017-06-08 | 2018-06-08 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018554598A Division JP6480647B1 (ja) | 2017-06-08 | 2018-06-08 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023025086A Division JP7430358B2 (ja) | 2017-06-08 | 2023-02-21 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019062923A JP2019062923A (ja) | 2019-04-25 |
JP7301332B2 true JP7301332B2 (ja) | 2023-07-03 |
Family
ID=64566087
Family Applications (6)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018554598A Active JP6480647B1 (ja) | 2017-06-08 | 2018-06-08 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
JP2019015315A Pending JP2019062921A (ja) | 2017-06-08 | 2019-01-31 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
JP2019015319A Active JP7301332B2 (ja) | 2017-06-08 | 2019-01-31 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
JP2019015318A Pending JP2019062922A (ja) | 2017-06-08 | 2019-01-31 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
JP2023025086A Active JP7430358B2 (ja) | 2017-06-08 | 2023-02-21 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
JP2024010099A Pending JP2024028649A (ja) | 2017-06-08 | 2024-01-26 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018554598A Active JP6480647B1 (ja) | 2017-06-08 | 2018-06-08 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
JP2019015315A Pending JP2019062921A (ja) | 2017-06-08 | 2019-01-31 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
Family Applications After (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019015318A Pending JP2019062922A (ja) | 2017-06-08 | 2019-01-31 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
JP2023025086A Active JP7430358B2 (ja) | 2017-06-08 | 2023-02-21 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
JP2024010099A Pending JP2024028649A (ja) | 2017-06-08 | 2024-01-26 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US11807869B2 (ja) |
EP (2) | EP3636753B1 (ja) |
JP (6) | JP6480647B1 (ja) |
KR (1) | KR102541398B1 (ja) |
CN (2) | CN117778466A (ja) |
AU (1) | AU2018279457B2 (ja) |
BR (1) | BR112019025717A2 (ja) |
CA (1) | CA3066599A1 (ja) |
DK (1) | DK3636753T5 (ja) |
EA (1) | EA201992795A1 (ja) |
FI (1) | FI3636753T3 (ja) |
MX (1) | MX2019014497A (ja) |
PT (1) | PT3636753T (ja) |
WO (1) | WO2018225858A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7430358B2 (ja) | 2017-06-08 | 2024-02-13 | 国立大学法人大阪大学 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SG11202001471SA (en) * | 2017-08-21 | 2020-03-30 | Univ Tokushima | Target sequence specific alteration technology using nucleotide target recognition |
BR112020019301A2 (pt) | 2018-03-26 | 2021-01-05 | National University Corporation Kobe University | Método para modificar um sítio alvo de um dna de fita dupla de uma célula. |
EP3896158A4 (en) * | 2018-12-11 | 2022-11-02 | Kyoto University | METHODS OF INDUCING A DELETION IN GENOMIC DNA |
SG11202109550TA (en) * | 2019-03-07 | 2021-09-29 | Univ Columbia | Rna-guided dna integration using tn7-like transposons |
JP7489112B2 (ja) | 2019-03-14 | 2024-05-23 | 国立大学法人徳島大学 | Crisprタイプi-dシステムを利用した標的配列改変技術 |
AU2020254078A1 (en) | 2019-04-05 | 2021-12-02 | Osaka University | Method for producing knock-in cell |
AU2020407048A1 (en) * | 2019-12-18 | 2022-06-09 | Inscripta, Inc. | Cascade/dCas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells |
CA3165508A1 (en) * | 2020-01-24 | 2021-07-29 | Tomoji Mashimo | Method for detecting specific dna in sample |
JPWO2021251493A1 (ja) * | 2020-06-12 | 2021-12-16 | ||
US20230416709A1 (en) | 2020-11-06 | 2023-12-28 | Editforce, Inc. | Foki nuclease domain mutant |
US20240141310A1 (en) | 2021-03-01 | 2024-05-02 | C4U Corporation | Methods for producing cas3 proteins |
US20240229081A1 (en) * | 2021-05-26 | 2024-07-11 | The Regents Of The University Of Michigan | Crispr-cas3 systems for targeted genome engineering |
CN113549650B (zh) * | 2021-07-05 | 2023-05-09 | 天津协和生物科技开发有限公司 | 一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统及其应用 |
CN115595330B (zh) * | 2021-07-12 | 2024-08-02 | 中国科学院微生物研究所 | 一种CRISPR-Cas3系统及其在抗植物病毒方面的应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017066497A2 (en) | 2015-10-13 | 2017-04-20 | Duke University | Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells |
WO2019039417A1 (ja) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | 国立大学法人徳島大学 | ヌクレオチド標的認識を利用した標的配列特異的改変技術 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201122458D0 (en) * | 2011-12-30 | 2012-02-08 | Univ Wageningen | Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof |
CN110982844B (zh) | 2012-12-12 | 2024-08-13 | 布罗德研究所有限公司 | 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物 |
US11439712B2 (en) | 2014-04-08 | 2022-09-13 | North Carolina State University | Methods and compositions for RNA-directed repression of transcription using CRISPR-associated genes |
TWI813532B (zh) | 2015-06-18 | 2023-09-01 | 美商博得學院股份有限公司 | 降低脱靶效應的crispr酶突變 |
DK3348636T3 (da) * | 2015-09-09 | 2022-02-28 | Univ Kobe Nat Univ Corp | Fremgangsmåde til modificering af en genomsekvens, der specifikt omdanner nukleobasen af en targetteret DNA-sekvens, og molekylær sekvens anvendt i fremgangsmåden |
US20190323038A1 (en) * | 2016-06-17 | 2019-10-24 | Montana State Univesity | Bidirectional targeting for genome editing |
MX2019014497A (es) | 2017-06-08 | 2020-10-12 | Univ Osaka | Metodo para producir celula eucariota de adn editado, y kit usado en el mismo. |
CN107557373A (zh) | 2017-09-19 | 2018-01-09 | 安徽大学 | 一种基于I‑B型CRISPR‑Cas系统基因cas3的基因编辑方法 |
CN107557378A (zh) * | 2017-09-19 | 2018-01-09 | 安徽大学 | 一种基于I型CRISPR‑Cas系统中基因cas7‑3的真核基因编辑方法 |
CN113528408B (zh) * | 2021-06-08 | 2022-03-01 | 湖北大学 | 一种基于CRISPR-nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用 |
-
2018
- 2018-06-08 MX MX2019014497A patent/MX2019014497A/es unknown
- 2018-06-08 JP JP2018554598A patent/JP6480647B1/ja active Active
- 2018-06-08 AU AU2018279457A patent/AU2018279457B2/en active Active
- 2018-06-08 FI FIEP18812837.5T patent/FI3636753T3/fi active
- 2018-06-08 KR KR1020207000115A patent/KR102541398B1/ko active IP Right Grant
- 2018-06-08 CN CN202311603183.1A patent/CN117778466A/zh active Pending
- 2018-06-08 DK DK18812837.5T patent/DK3636753T5/da active
- 2018-06-08 EP EP18812837.5A patent/EP3636753B1/en active Active
- 2018-06-08 BR BR112019025717-9A patent/BR112019025717A2/pt unknown
- 2018-06-08 CN CN201880037636.XA patent/CN110770342B/zh active Active
- 2018-06-08 WO PCT/JP2018/022066 patent/WO2018225858A1/ja unknown
- 2018-06-08 EA EA201992795A patent/EA201992795A1/ru unknown
- 2018-06-08 PT PT188128375T patent/PT3636753T/pt unknown
- 2018-06-08 US US16/611,308 patent/US11807869B2/en active Active
- 2018-06-08 EP EP24158618.9A patent/EP4349973A3/en active Pending
- 2018-06-08 CA CA3066599A patent/CA3066599A1/en active Pending
-
2019
- 2019-01-31 JP JP2019015315A patent/JP2019062921A/ja active Pending
- 2019-01-31 JP JP2019015319A patent/JP7301332B2/ja active Active
- 2019-01-31 JP JP2019015318A patent/JP2019062922A/ja active Pending
-
2023
- 2023-02-21 JP JP2023025086A patent/JP7430358B2/ja active Active
- 2023-09-14 US US18/467,356 patent/US20240117381A1/en active Pending
- 2023-09-14 US US18/467,297 patent/US20240124898A1/en active Pending
-
2024
- 2024-01-26 JP JP2024010099A patent/JP2024028649A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017066497A2 (en) | 2015-10-13 | 2017-04-20 | Duke University | Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells |
WO2019039417A1 (ja) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | 国立大学法人徳島大学 | ヌクレオチド標的認識を利用した標的配列特異的改変技術 |
JP7017259B2 (ja) | 2017-08-21 | 2022-02-08 | 国立大学法人徳島大学 | ヌクレオチド標的認識を利用した標的配列特異的改変技術 |
JP7054283B2 (ja) | 2017-08-21 | 2022-04-13 | 国立大学法人徳島大学 | ヌクレオチド標的認識を利用した標的配列特異的改変技術 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
MORISAKA, H. et al.,Genome editing in mammalian cells by cascade and Cas3,J. Invest. dermatol.,2017年05月,Vol. 137,p. S84 |
MORISAKA, Hiroyuki et al.,Genome editing in mammalian cells by Cascade and Cas3,日本研究皮膚科学会第42回年次学術大会・総会 プログラム・抄録集,2017年11月02日,p. 232 |
RAN, F. Ann et al.,"In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9",Nature,2015年,Vol. 520,pp. 186-191, Supplementary Information,Published online: 2015 Apr 1 |
SUZUKI, Keiichiro et al.,In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration,Nature,2016年,Vol. 540,pp. 144-149, Extended Data |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7430358B2 (ja) | 2017-06-08 | 2024-02-13 | 国立大学法人大阪大学 | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7301332B2 (ja) | Dnaが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット | |
JP6958917B2 (ja) | 遺伝子ノックイン細胞の作製方法 | |
CN111471719A (zh) | 有效的非减数分裂等位基因渐渗 | |
US20190223417A1 (en) | Genetically modified animals having increased heat tolerance | |
JP2018531003A6 (ja) | 向上した耐暑性を有する遺伝子改変動物 | |
WO2020198541A1 (en) | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) resistant swine | |
WO2022097663A1 (ja) | FokIヌクレアーゼドメインの変異体 | |
Long et al. | Targeted mutagenesis in human iPSCs using CRISPR genome-editing tools | |
WO2021171688A1 (ja) | 遺伝子ノックイン方法、遺伝子ノックイン細胞作製方法、遺伝子ノックイン細胞、がん化リスク評価方法、がん細胞製造方法、及びこれらに用いるためのキット | |
WO2022050377A1 (ja) | 標的dnaの編集方法、標的dnaが編集された細胞の製造方法、及びそれらに用いるdna編集システム | |
EA040859B1 (ru) | Способ получения эукариотических клеток с отредактированной днк и набор, используемый в этом способе | |
Lucas Toca | Edición genómica en ratón basada en la electroporación de CRISPR/Cas9 en cigotos. Aplicación al estudio del síndrome de mano hendida | |
Kouskoff et al. | OPEN ACCESS EDITED AND REVIEWED BY | |
JP2023131616A (ja) | Dna編集システム、並びに、それを用いた標的dnaの編集方法及び標的dnaが編集された細胞の製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190327 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210608 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220617 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20221208 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230221 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20230221 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20230221 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20230313 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20230314 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230424 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230518 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230606 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230614 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7301332 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |