BR112020019301A2

BR112020019301A2 - Método para modificar um sítio alvo de um dna de fita dupla de uma célula.

Info

Publication number: BR112020019301A2
Application number: BR112020019301-1A
Authority: BR
Inventors: Keiji Nishida
Original assignee: National University Corporation Kobe University
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2021-01-05
Also published as: CN111148833A; JP6727680B2; CA3095291C; JPWO2019189147A1; JP2020191879A; WO2019189147A1; US11041169B2; CN111148833B; EP3660152A1; CA3095291A1; KR20200123255A; EP3660152A4; KR102287880B1; JP7250349B2; JP2023063448A; US20200270631A1; SG11202009319YA

Abstract

a presente invenção provê um método para a modificação de um sítio alvo em um dna de fita dupla em uma célula, o método inclui a etapa de colocar um complexo no qual um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico capaz de se ligar especificamente a uma sequência de nucleotídeos alvo em dna de fita dupla selecionado é ligado a uma enzina conversora de base de ácido nucleico ou uma dna glicosilase e dna doador contendo uma sequência de inserção em contato com o dna de fita dupla, substituindo-se assim o sítio alvo pela sequência de inserção ou inserindo-se a sequência de inserção no sítio alvo sem a necessidade de clivar pelo menos uma fita do dna dupla-fita no sítio alvo.

Description

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MÉTODO PARA MODIFICAR UM SÍTIO ALVO DE UM DNA DE FITA

DUPLA DE UMA CÉLULA [Campo da técnica]

[001] A presente invenção se refere a um método para modificar um DNA de fita dupla, que permite a modificação de um sítio alvo em uma determinada região de um DNA de fita dupla que uma célula tem, usando recombinação homóloga, sem clivar o DNA de fita dupla (sem clivagem ou clivagem de fita simples). [Fundamentos da Invenção]

[002] A proteína CRISPR (repetições palindômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas) e a proteína associada a CRISPR (Cas) são conhecidas por funcionarem como um sistema imunológico adaptativo bacteriano, mediante a clivagem do DNA alvo de uma maneira dependente de um único RNA guia (sgRNA) e de motivo adjacente ao protoespaçador (PAM). A nuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes é amplamente usada como uma poderosa ferramenta de edição de genoma em eucariotos com uma via de reparo de quebra de DNA de fita dupla (DSB) (por exemplo, documentos não patentários 1 e 2). Durante o reparo do DSB pela via de junção de extremidade não homóloga (NHEJ), uma pequena inserção e/ou deleção (indels) é introduzida no DNA alvo, e ocorre mutação ou destruição genética sítio-específica. Embora a eficiência dependa da célula hospedeira, o reparo de recombinação homóloga (HDR) pode ser promovido provendo-se um DNA doador contendo um braço de homologia à região alvo para uma edição mais precisa. No entanto, uma vez que os métodos convencionais acima mencionados envolvem modificações inesperadas do genoma durante a clivagem do DNA de fita dupla, efeitos colaterais como forte citotoxicidade, rearranjo cromossômico e similares ocorrem, e têm problemas comuns de confiabilidade prejudicada na terapia genética, número extremamente pequeno de células sobreviventes por modificação de nucleotídeos, e similares. Embora a recombinação homóloga usando a nickase Cas9 (nCas9) também tenha sido

2 / 50 relatada (documentos não patentários 1 e 2), a eficiência da indução de recombinação é muitas vezes muito baixa em comparação com a da nuclease Cas9 (documento não patentário 3). De acordo com o conhecimento do presente inventor, não foi relatada recombinação homóloga usando Cas9, na qual ambas as atividades de nuclease são inativadas (dCas9).

[003] Recentemente, foi demonstrada a edição da base-alvo mediada por desaminase, na qual os nucleotídeos são diretamente editados no sítio do gene alvo sem o uso de DNA doador contendo um braço de homologia para a região alvo (por exemplo, documento patentário 1, documentos não patentários 4 a 6). Uma vez que esta técnica utiliza a desaminação de DNA em vez de clivagem de DNA mediada por nuclease, a toxicidade celular é baixa e mutações pontuais podem ser introduzidas. [Lista de citações] [Literatura Patentária]

[004] Literatura Patentária 1: WO 2015/133554 [Literatura não patentária]

[005] Literatura não patentária 1: Mali, P. et al., Science 339:823-827 (2013); Literatura não patentária 2: Cong, L. et al., Science 339:819-823 (2013); Literatura não patentária 3: Ran, F.A. et al., Nat Protoc, 8:2281- 2308 (2013); Literatura não patentária 4: Komor, A. C. et al., Nature 61:5985-91 (2016); Literatura não patentária 5: Nishida, K. et al., Science 102:553-563 (2016); Literatura não patentária 6: Ma, Y. et al., Nat. Methods 1-9 (2016) doi:10.1038/nmeth.4027. [SUMÁRIO DA INVENÇÃO]

3 / 50 [Problema Técnico]

[006] No entanto, como essa técnica usa desaminase, existem restrições ao tipo de mutação que pode ser introduzida ou o sítio da mutação, e não foi possível trocar a direção e a combinação dos genes ou segmentos genéticos de knock-in. Portanto, o problema da presente invenção é o fornecimento de uma nova técnica de modificação de DNA usando uma enzima conversora de bases de ácido nucleico, como a desaminase e similares, ou DNA glicosilase, em que a técnica não é limitada pelo tipo de mutação que pode ser introduzida ou pelo sítio da mutação, pode mudar a direção e a combinação de genes, e pode realizar knock-in de segmentos gênicos. [Solução para o problema]

[007] Para células em divisão, um modo particularmente sério de dano ao DNA é uma desordem na qual ambas as fitas do DNA de fita dupla são clivadas. Como um mecanismo de reparo desse distúrbio, são conhecidas as recombinações homólogas e a união de extremidades não homólogas. Por outro lado, no caso de danos a uma fita do DNA de fita dupla, ele é reparado principalmente pelo reparo de excisão base, que é um mecanismo para reparar danos devido à alquilação ou desaminação, ou reparo por excisão de nucleotídeos (NER), que é um mecanismo para reparar um dano relativamente grande em algumas dezenas de pares de base que distorce a fita dupla. Embora a razão e semelhantes não tenham sido verificados, também se sabe que o reparo da fita complementar é induzido mesmo quando uma das fitas duplas de DNA é danificada.

[008] No entanto, o grau de atividade do reparo da fita complementar para o reparo por excisão de base não foi suficientemente verificado, e a edição de DNA por recombinação homóloga usando reparo por excisão de base não foi realizado ativamente. De acordo com o conhecimento do presente inventor, não há relatos de tal edição de DNA. Sob tais circunstâncias, o presente inventor concebeu uma ideia de que o reparo da fita complementar pode ser induzido por causar desaminação ou excisão de base do DNA intracelular usando uma enzima

4 / 50 conversora de bases de ácido nucleico, durante a qual o DNA pode ser recombinado usando recombinação homóloga mediante o contato de um DNA doador com o DNA. Com base nessa ideia, o inventor realizou mais estudos. Como resultado, o inventor descobriu que a recombinação homóloga do DNA é possível enquanto se suprime a toxicidade celular mediante a colocação de um complexo no qual um módulo de reconhecimento de sequências de ácidos nucleicos e uma enzima conversora de base de ácido nucleico estão ligados, e um DNA doador contendo uma sequência de inserção em contato com um DNA alvo, e que, em uma modaliadde preferencial, surpreendentemente, aproximadamente 100% de atividade de recombinação homóloga ocorre em um sítio alvo. O presente inventor realizou mais estudos com base nesses achados e completou a presente invenção.

[009] Especificamente, a presente invenção provê o seguinte.

[0010] [1] Um método para modificar um sítio alvo de um DNA de fita dupla de uma célula, distinguido pelo fato de que compreende uma etapa de colocar um complexo no qual um módulo de reconhecimento de sequências de ácidos nucleicos que se liga especificamente a uma sequência de nucleotídeos alvo selecionada em um DNA de fita dupla e uma enzima conversora de bases de ácido nucleico ou glicosilase de DNA estão ligadas, e um DNA doador contendo uma sequência de inserção em contato com o dito DNA de fita dupla, para substituir o sítio alvo com a sequência de inserção, ou para inserir a sequência de inserção no dito sítio alvo, sem clivar pelo menos uma fita do dito DNA de fita dupla no sítio alvo.

[0011] [2] O método de [1], em que o DNA doador compreende uma sequência homóloga a uma região adjacente ao sítio alvo.

[0012] [3] O método de [1] ou [2], no qual o módulo de reconhecimento de sequências de ácidos nucleicos é selecionado a partir do grupo que consiste em um sistema CRISPR-Cas no qual pelo menos uma capacidade de clivagem de DNA da proteína efetora Cas é inativada, um motivo de dedo de zinco, um efetor TAL e um motivo PPR.

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[0013] [4] O método de qualquer um de [1] a [3], em que o módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico é um sistema CRISPR-Cas no qual apenas uma das duas capacidades de clivagem de DNA da proteína efetora Cas é inativada.

[0014] [5] O método de qualquer um de [1] a [3], em que o módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico é um sistema CRISPR-Cas no qual ambas as capacidades de clivagem de DNA da proteína efetora Cas são inativadas.

[0015] [6] O método de qualquer um de [1] a [5], em que a enzima conversora de base de ácido nucleico é uma desaminase.

[0016] [7] O método de [6], em que a desaminase é citidina desaminase.

[0017] [8] O método de [7], em que a citidina desaminase é PmCDA1.

[0018] [9] O método de qualquer um de [1] a [8], em que o DNA de fita dupla é colocado em contato com o complexo ao introduzir um ácido nucleico que codifica o complexo na célula.

[0019] [10] O método de qualquer um de [1] a [9], em que a célula é uma célula procariótica ou uma célula eucariótica.

[0020] [11] O método de [10], em que a célula é uma célula microbiana.

[0021] [12] O método de [10], em que a célula é uma célula vegetal, uma célula de inseto ou uma célula animal.

[0022] [13] O método de [12], em que a célula animal é uma célula de vertebrado.

[0023] [14] O método de [13], em que a célula de vertebrado é uma célula de mamífero. [Efeitos vantajosos da invenção]

[0024] De acordo com a presente invenção, é provida uma nova técnica de modificação de DNA usando uma enzima conversora de bases de ácido nucleico, como uma desaminase e similares, ou DNA glicosilase, em que a técnica não é limitada pelo tipo de mutação que pode ser introduzida ou pelo sítio da mutação, pode mudar a direção e a combinação de genes, e pode realizar knock-in de

6 / 50 segmentos gênicos. Uma vez que a técnica de modificação de DNA da presente invenção pode modificar o sítio alvo sem clivar o DNA de fita dupla, o rearranjo inesperado e a toxicidade que acompanham a clivagem são suprimidos, e o sítio alvo pode ser modificado muito mais eficientemente em comparação com os métodos convencionais. [Breve Descrição dos Desenhos]

[0025] A Fig. 1 mostra um desenho esquemático do mecanismo de modificação do genoma por modificação da fita complementar. A introdução de um complexo no qual um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e uma enzima conversora de bases de ácidos nucleicos ou DNA glicosilase estão ligadas, e um DNA doador para recombinação em uma célula permite um knock-in altamente eficiente de uma sequência de inserção.

[0026] A Fig. 2 mostra a introdução bem sucedida de uma mutação em um sítio alvo usando dCas9-CDA ou nCas9-CDA, e um DNA doador. vetor 1525:pRS415_dCas9-CDA+CAN(mut); vetor 1526: pRS415_nCas9- CDA+CAN(mut); vetor 1059:pRS426_SNR52-Can7R-sgRNA; vetor 1149: pRS426_SNR52-Can10R-sgRNA.

[0027] A Fig. 3 mostra um sistema de avaliação de recombinação que usa uma levedura brotante (cepa BY4741) na qual um interruptor de marcador foi introduzido anteriormente entre a Ade1 e a região promotora de Ade1. Quando o interruptor de marcador é invertido por recombinação na região homóloga, a função de Ade1 é restaurada e a cor da colônia muda de vermelho para branco.

[0028] A Fig. 4 mostra os resultados de um experimento de demonstração de uma reação de recombinação utilizando o sistema de avaliação de recombinação da Fig. 3. O vetor de plasmídeo (doravante algumas vezes abreviado como “vetor”) 1553: nCas9-CDA_UraAde target 2 (sequência de nucleotídeos alvo: cctttagcggcttaactgtg (SEQ ID NO: 9)); vetor 1557: nCas9-CDA_UraAde target 6 (sequência de nucleotídeos alvo: ggcccaggtattgttagcgg (SEQ ID NO: 10)), vetor 1559: nCas9-CDA_UraAde target 8 (sequência de nucleotídeos alvo:

7 / 50 ttggcggataatgcctttag (SEQ ID NO: 11)); vetor 1560: nCas9-CDA_UraAde target 9 (sequência de nucleotídeos alvo: tgcagttgggttaagaatac (SEQ ID NO: 12)), vetor 1562: nCas9-CDA_UraAde target 11 (sequência de nucleotídeos alvo: ggcccaggtattgttagcgg (SEQ ID NO: 13)); vetor 1565: dCas9-CDA_UraAde target 3 (sequência de nucleotídeos alvo: ttggcggataatgcctttag (SEQ ID NO: 14)). Os vetores acima mencionados (1553, 1557, 1559, 1560, 1562, 1565) correspondem aos vetores nos quais as sequências de nucleotídeos na 3890ª à 3909ª posições na sequência do vetor 1059 (SEQ ID NO: 5) foram substituídas pelas sequências de nucleotídeos alvo acima mencionadas. Os dois últimos dígitos do número do vetor correspondem aos números dos sítios-alvo na Fig. 4.

[0029] A Fig. 5 mostra um diagrama esquemático de um método de knock-in ou knock-out usando o método de modificação de DNA da presente invenção.

[0030] A Fig. 6 mostra os resultados de um experimento de demonstração de knock-in ou knock-out usando o método da Fig. 5.

[0031] A Fig. 7 mostra um diagrama esquemático e as condições experimentais do sistema de avaliação de recombinação realizado no Exemplo 5 utilizando células animais.

[0032] A Fig. 8 mostra os resultados de um experimento de demonstração de uma reação de recombinação utilizando o sistema de avaliação de recombinação da Fig. 7. O eixo horizontal do gráfico mostra taxa de recombinação homóloga (%).

[0033] A Fig. 9 mostra um diagrama esquemático e as condições experimentais do sistema de avaliação de recombinação realizado no Exemplo 6 utilizando células animais.

[0034] A Fig. 10 mostra os resultados de um experimento de demonstração de uma reação de recombinação utilizando o sistema de avaliação de recombinação da Fig. 9. O eixo vertical do gráfico mostra taxa de recombinação homóloga (%).

[0035] A Fig. 11 mostra um diagrama esquemático e as condições

8 / 50 experimentais do sistema de avaliação de recombinação realizado no Exemplo 7 utilizando células animais.

[0036] A Fig. 12 mostra os resultados de um experimento de demonstração de uma reação de recombinação utilizando o sistema de avaliação de recombinação da Fig. 11. O eixo horizontal do gráfico mostra taxa de recombinação homóloga (%). [Descrição das modalidades]

[0037] A presente invenção provê um método para modificar um sítio alvo de um DNA de fita dupla mediante a substituição do sítio alvo no DNA de fita dupla por uma sequência de inserção contida em um DNA doador exógeno, ou para inserir a sequência de inserção no sítio alvo, sem clivar pelo menos uma das fitas de um DNA de fita dupla (por exemplo, DNA cromossomial, DNA mitocondrial, DNA de cloroplasto; de agora em diante estes também devem ser amplamente ditos como “DNA genômico”) (doravante algumas vezes abreviado como “o método da presente invenção”). O método é distinguido por uma etapa de colocar um complexo de um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico que se liga especificamente à sequência de nucleotídeos alvo no DNA de fita dupla, e uma enzima conversora de base de ácido nucleico ou DNA glicosilase (doravante algumas vezes abreviada como “enzima conversora de base de ácido nucleico etc.”), e um DNA doador contendo uma sequência de inserção em contato com o DNA de fita dupla.

[0038] Na presente invenção, a “modificação” de um DNA de fita dupla significa que um nucleotídeo (por exemplo, dA, dC, dG ou dT) ou uma sequência de nucleotídeos em uma fita de DNA é substituído por outro nucleotídeo ou uma sequência de nucleotídeos, ou que outro nucleotídeo ou uma sequência de nucleotídeos é inserido entre certos nucleotídeos em uma fita de DNA. Embora o DNA de fita dupla a ser modificado não seja particularmente limitado, ele é, de preferência, um DNA genômico.

[0039] Na presente invenção, “DNA doador” significa um DNA contendo

9 / 50 uma sequência de inserção exógena, e o DNA doador geralmente contém dois tipos de sequências homólogas às sequências (doravante algumas vezes referida como “braço de homologia”) das duas regiões no lado a montante e no lado a jusante do sítio alvo adjacente ao sítio alvo (doravante também referido como “região adjacente”). Quando os respectivos braços de homologia são distinguidos, eles podem ser chamados de “braço de homologia 5’” e “braço de homologia 3’”. O “sítio alvo” do DNA de fita dupla significa que uma região será substituída por uma sequência de inserção contida no DNA doador, ou uma região entre os nucleotídeos nos quais a sequência de inserção é inserida, e o sítio alvo não inclui a sequência adjacente acima mencionada.

[0040] A sequência homóloga à região adjacente ao sítio alvo não é apenas uma sequência completamente idêntica, mas também uma sequência que tem preferencialmente não menos que 80% (por exemplo, não menos que 85%, não menos que 90%, não menos que 95%, não menos que 96%, não menos que 97%, não menos que 98%, não menos que 99%) de identidade com a sequência completamente idêntica, desde que a recombinação homóloga possa ocorrer em uma célula.

[0041] A sequência de inserção pode conter, quando necessário, um gene de resistência a fármacos (por exemplo, gene de resistência à canamicina, gene de resistência à ampicilina, gene de resistência à puromicina e similares), uma sequência de marcadores de seleção como um gene de timidina quinase, um gene de toxina diftérica e similates, uma sequência gênica repórter como proteína verde fluorescente (GFP), proteína vermelha fluorescente, β-glucuronidase (GUS), FLAG, e similares. Além disso, uma sequência LoxP, uma sequência FRT ou uma sequência de inserção de terminal específica de transposon (PiggyBac Terminal Repeat) podem ser providas antes e depois do gene para que esses genes possam ser cortados após a classificação celular ter sido concluída, ou similar. Exemplos de transposons preferidos incluem piggyBac, que é um transposon derivado do inseto Lepidoptera, e similares (Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009), Woltjen et al.,

10 / 50 Nature, 458: 766-770 (2009), WO 2010/012077). Alternativamente, como descrito em Oji A et al., Sci Rep, 6: 31666 (2016) e similares, um vetor de expressão contendo o gene de resistência a fármacos acima mencionado é co-transfectado e a seleção transitória por fármacos (cerca de vários dias) pode ser realizada. O fato de a sequência de inserção ter sido inserida no sítio alvo ou substituída pelo sítio alvo pode ser confirmado decodificand-se a sequência e realizando uma triagem para DNA cromossômico separado e extraído das células pelo método de hibridização Southern ou PCR ou similares. Quando o gene de resistência a fármacos acima mencionado ou semelhante está presente no DNA doador, a confirmação também pode ser realizada usando a sua expressão como um índice.

[0042] O DNA do doador pode ser linear (por exemplo, DNA sintético dupla-fita), circular (por exemplo, DNA plasmidial) ou DNA de fita simples (por exemplo, oligodesoxinucleotídeo fita simples) (ssODN)) ou um DNA de fita dupla. O DNA doador pode ser apropriadamente projetado dependendo do comprimento de bases da sequência de inserção, da atividade de recombinação homóloga da célula hospedeira, e afins. Por exemplo, quando a sequência de inserção tem 100 bases de comprimento ou é mais curta, o ssODN ou DNA sintético de dupla fita é geralmente usado, e quando ela é mais longa do que isso, geralmente, DNA sintético de dupla fita ou DNA plasmidial é geralmente usado. Além disso, o comprimento do DNA doador não é particularmente limitado, e pode ser adequadamente projetado dependendo do comprimento da sequência de inserção e afins. O comprimento da sequência de inserção não é particularmente limitado, e pode ser adequadamente projetado geralmente dentro da faixa de 1 a dezenas de milhares de bases (por exemplo, no caso de ssODN, não mais de 100 bases de comprimento (por exemplo, não mais do que 70 bases, não mais do que 50 bases)) de acordo com os propósitos. Além disso, o comprimento de cada braço de homologia não é particularmente limitado. Quando o DNA doador é ssODN, um comprimento de 10 bases a 150 bases é geralmente usado. Quando o DNA doador é DNA sintético de dupla fita, um comprimento de 10 bases a 5000 bases é

11 / 50 geralmente usado, e quando o DNA do doador é DNA plasmidial, um comprimento de 100 bases a 5000 bases, de preferência 500 bases a 1000 bases, é geralmente usado. Esses DNAs doadores podem ser projetados referindo-se à literatura conhecida (por exemplo, Ochiai H, Int J Mol Sci, 16:21128-21137 (2015), Hockemeyer D et al., Nat Biotetchnol, 27:851-857 (2009)).

[0043] Na presente invenção, o “módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico” significa uma molécula ou complexo de moléculas tendo a capacidade de reconhecer e se ligar especificamente a uma sequência de nucleotídeos específica (ou seja, uma sequência de nucleotídeos alvo) em uma fita de DNA. A ligação do módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico a uma sequência de nucleotídeos alvo permite que uma enzima conversora de base de ácido nucleico, etc. ligada ao módulo atue especificamente em um sítio alvo de uma enzima conversora de base de ácido nucleico e semelhante de um DNA de fita dupla (ou seja, sequência de nucleotídeos alvo e o nucleotídeo nas suas proximidades).

[0044] Como mostrado nos exemplos mencionados abaixo, foi demonstrado que um sítio alvo pode ser modificado introduzindo-se um complexo de uma enzima conversora de base de ácidos nucleicos e um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico, e um DNA doador em uma célula. Embora não deseje ser vinculado a nenhuma teoria, o mecanismo de modificação do sítio alvo pelo método é como segue. Uma base presente no sítio direcionado pela enzima conversora de base de ácido nucleico é convertida em outra base, a base convertida é removida pela DNA glicosilase, um sítio abásico (sítio apurínico/apirimidico (AP)) resultante da reação de excisão de base pela enzima é tratado por uma enzima a jusante da via de reparo de excisão de base (BER), como uma endonuclease AP, DNA polimerase, DNA ligase e similares. Por outro lado, a presença de estrutura de nucleotídeos anormal ou não pareada sem conclusão de BER também ativa a via de reparo da fita complementar, causando recombinação homóloga entre o sítio alvo e a região contida no DNA doador, de modo que

12 / 50 ocorreu a modificação do sítio alvo. Portanto, mesmo quando a DNA glicosilase é usada, presume-se que a mesma modificação ocorre causando excisão base em um sítio alvo da enzima. Assim, não só a enzima conversora de base de ácido nucleico, mas também a DNA glicosilase podem ser aplicadas ao método da presente invenção.

[0045] Na presente invenção, a expressão “enzima conversora de base de ácido nucleico” significa uma enzima capaz de converter um nucleotídeo alvo em outro nucleotídeo catalisando uma reação para converter um substituto em um anel de purina ou pirimidina em uma base de DNA em outro grupo ou átomo, sem clivar a fita de DNA.

[0046] Na presente invenção, a expressão “DNA glicosilase” significa uma enzima que hidrolisa a ligação n-glicosídica do DNA. A DNA glicosilase originalmente desempenha um papel de remover a base danificada do DNA em BER. Na presente invenção, uma que seja capaz de atuar sobre bases normais no DNA (ou seja, dC, dT, dA ou dG, ou aquelas que sofreram modificação epigenética) é preferencial. Uma DNA glicosilase mutante que não reage originalmente com a base normal ou tem baixa reatividade, mas que adquiriu reatividade com a base normal devido à mutação ou melhorou a reatividade também está incluída na DNA glicosilase da presente invenção, e pode ser preferencialmente usada. Um sítio sem uma base (sítio apurínico/apirimídico (AP) gerado como resultado da reação de excisão base pela enzima é tratado por uma enzima a jusante da via BER, como uma endonuclease AP, DNA polimerase, DNA ligase e similares. Além disso, “reatividade suficientemente baixa com o DNA tendo uma estrutura de dupla hélice sem distorção” significa que uma reação de excisão de base ocorre em regiões nas quais um DNA que tem uma estrutura de dupla hélice sem distorção é formado, apenas em uma frequência que suprime a citotoxicidade a um nível que não afeta a viabilidade celular. Como usado aqui, o “DNA que tem uma estrutura de dupla hélice sem distorção” significa que uma estrutura de dupla hélice forte é formada (ou seja, DNA dupla-hélice não relaxado

13 / 50 (ou também simplesmente dito como DNA não relaxado)), e não apenas o estado do DNA de fita simples no qual as bases que formam pares são completamente dissociadas, mas também o estado do DNA de fita dupla relaxado no qual os pares de base são formados, mas a estrutura de dupla hélice está desenrolada. Exemplos da DNA glicosilase com reatividade suficientemente baixa com DNA que tem uma estrutura de dupla hélice sem distorção incluem uma DNA glicosilase que tem inerentemente reatividade suficientemente baixa com o DNA que tem uma estrutura de dupla hélice sem distorção, uma DNA glicossilase mutada na qual uma mutação que reduz a reatividade com o DNA que tem uma estrutura de dupla hélice sem distorção em comparação com o tipo selvagem foi introduzida e similares. Além disso, uma DNA glicosilase dividida em dois segmentos, a qual é uma enzima dividida projetada de tal forma que cada segmento esteja ligado a qualquer um dos dois módulos de reconhecimento de sequência de ácido nucleico divididos para formar dois complexos, o módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico pode se ligar especificamente a uma sequência de nucleotídeos alvo quando ambos os complexos são redobrados, e a DNA glicosilase pode catalisar uma reação de excisão de base por ligação específica também é englobada no termo “DNA glicosilase com reatividade suficientemente baixa com DNA que tem uma estrutura de dupla hélice sem distorção” da presente invenção.

[0047] Na presente invenção, o “complexo enzimático modificador de ácido nucleico” significa um complexo molecular composto por um complexo que compreende o módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico acima mencionado e a enzima conversora de base de ácido nucleico ou DNA glicosilase conectados, e tendo uma função catalisadora de uma reação de conversão de base de ácido nucleico ou uma reação de excisão de base e dotada de uma determinada capacidade de reconhecimento de sequência de nucleotídeos. O “complexo” aqui abrange não apenas aquele constituído de múltiplas moléculas, mas também um com um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e uma enzima conversora de base de ácido nucleico etc. em uma única molécula, como uma

14 / 50 proteína de fusão.

[0048] A enzima conversora de base de ácido nucleico a ser usada na presente invenção não é particularmente limitada, desde que ela possa catalisar a reação acima mencionada, e exemplos disso incluem a desaminase pertencente à superfamília de ácido nucleico/nucleotídeo desaminase, que catalisa uma reação de desaminação que converte um grupo amino em um grupo carbonila. Exemplos preferenciais incluem citidina desaminase capaz de converter citosina ou 5- metilcitosina em uracila ou timina, respectivamente, adenosina desaminase capaz de converter adenina em hipoxantina, guanosina desaminase capaz de converter guanina em xantina e afins. Como citidina desaminase, a mais preferida é a citidina desaminase induzida por ativação (doravante também referida como AID) que é uma enzima que introduz uma mutação em um gene de imunoglobulina na imunidade adquirida de vertebrados ou similares.

[0049] Embora a derivação da enzima conversora de base de ácido nucleico não seja particularmente limitada, por exemplo, PmCDA1 (Petromyzon marinus cytosine deaminase 1) derivada de Petromyzon marinus, ou AID (citidina desaminase induzida por ativação; AICDA) derivada de mamífero (por exemplo, humano, suíno, bovino, cavalo, macaco etc.) pode ser usada. Por exemplo, os Nᵒˢ de acesso do GenBank EF094822 e ABO15149 podem se referir à sequência de base e à sequência de aminoácidos do cDNA do PmCDA1, os Nᵒˢ de acesso GenBank No. NM_020661 e NP_065712 podem se referir à sequência de base e à sequência de aminoácidos do cDNA de AID humano. Do aspecto da atividade enzimática, o PmCDA1 é o preferido.

[0050] A DNA glicosilase a ser usada na presente invenção não é particularmente limitada, desde que ela possa catalisar uma reação para hidrolisar a ligação N-glicosídica do DNA e eliminar a base. Para aprimorar a utilidade ampla como técnica de edição de genomas, os preferidos são aqueles que podem atuar em bases normais (ou seja, dC, dT, dA ou dG, ou aqueles obtidos por modificação epigenética, por exemplo, 5-metilcitosina etc.). Exemplos desta enzima incluem

15 / 50 uma enzima com atividade de CDG que catalisa uma reação para remover a citosina, uma enzima que tem atividade de TDG que catalisa uma reação para removera timina, uma enzima que tem atividade para remover a 5-metilcitosine (atividade de 5-mCDG) e similares. Especificamente, a timina DNA glicosilase, oxoguanina glicosilase, alquiladenina DNA glicosilase (por exemplo, levedura 3- metiladenina-DNA glicosilase (MAG1) etc.) e similares podem ser mencionadas. O presente inventor relatou anteriormente que o uso de uma DNA glicosilase com reatividade suficientemente baixa com DNA tendo uma estrutura de dupla hélice sem distorção (DNA não relaxado) como a DNA glicosilase pode reduzir a citotoxicidade e modificar eficientemente uma sequência alvo (WO 2016/072399). Portanto, como DNA glicosilase, uma DNA glicosilase com reatividade suficientemente baixa com DNA tendo uma estrutura de dupla hélice sem distorção é de preferência usada. Exemplos de tal DNA glicosilase incluem um mutante de UNG tendo atividade de citosina-DNA glicosilase (CDG) e/ou atividade de timina- DNA glicosilase (TDG) (uracil-DNA glicosilase), e mutante UDG do vírus vaccinia, que são descritos em WO 2016/072399.

[0051] Exemplos específicos do mutante de UNG supracitado incluem o mutante duplo N222D/L304A de UNG1 de levedura, o mutante duplo N222D/R308E, o mutante duplo N222D/R308C, mutante duplo Y164A/ L304A, mutante duplo Y164A/R308E, mutante duplo Y164A/R308C, mutante duplo Y164G/L304A, mutante duplo Y164G/R308E, mutante duplo Y164G/R308C, mutante triplo N222D/Y164A/L304A, mutante triplo N222D/Y164A/R308E, mutante triplo N222D/Y164A/R30, mutante triplo N222D/Y164G/L304A, mutante triplo N222D/Y164G/R308E, mutante triplo N222D/Y164G/R308C e similares. Quando outro UNG é usado no lugar do UNG1 de levedura, um mutante no qual uma mutação semelhante foi introduzida no aminoácido correspondente a cada mutante descrito acima pode ser usado. Por exemplo, como uma mutação de UNG de E. coli correspondente à mutação Y164A ou Y164G de UNG1 de levedura, que é uma mutação que confere atividade de TDG, Y66A ou Y66G pode

16 / 50 ser mencionado e, como uma mutação de UNG humano, Y147A ou Y147G pode ser mencionado. Como uma mutação de UNG de Escherichia coli correspondente à mutação N222D de UNG1 de levedura, que é uma mutação que confere atividade de CDG, N123D pode ser mencionado e, como uma mutação de UNG humano, N204D pode ser mencionado. Como uma mutação de UNG de Escherichia coli correspondente à mutação L304A, R308E ou R308C de UNG1 de levedura, que diminui a reatividade com o DNA tendo uma estrutura de dupla hélice sem distorção, L191A, R195E ou R195C pode ser mencionado e, como uma mutação de UNG humano, L272A, R276E ou R276C pode ser mencionado. Como mutante de UDG do vírus vaccinia, um mutante N120D (ao qual a atividade de CDG é conferida), mutante Y70G (ao qual a atividade de TDG é conferida), mutante Y70A (ao qual a atividade de TDG é conferida), mutante duplo N120D/Y70G, duplo mutante N120D/Y70A e similares pode ser mencionado. Alternativamente, pode ser uma DNA glicosilase dividida em dois segmentos, a qual é uma enzima dividida projetada de tal forma que cada segmento esteja ligado a qualquer um dos dois módulos de reconhecimento de sequência de ácido nucleico divididos para formar dois complexos, o módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico pode se ligar especificamente a uma sequência de nucleotídeos alvo quando ambos os complexos são redobrados, e a DNA glicosilase pode catalisar uma reação de excisão de base pela ligação específica. A enzima dividida pode ser projetada e produzida referindo-se às descrições de, por exemplo, WO 2016/072399, Nat Biotechnol. 33(2): 139-142 (2015), PNAS 112(10): 2984-2989 (2015).

[0052] Embora a derivação de UNG não seja particularmente limitada, por exemplo, ung de Escherichia coli (Varshney, U. et al. (1988) J. Biol. Chem., 263, 7776-7784), UNG1 ou UNG2 derivado de levedura, mamífero (por exemplo, humano, rato, suíno, bovino, cavalo, macaco etc.) ou similares, ou UDG derivado de vírus (por exemplo, Poxviridae (vírus vaccinia etc.), Herpesviridae e similares) podem ser usados.

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[0053] Uma sequência de nucleotídeos-alvo em um DNA de fita dupla a ser reconhecida pelo módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico no complexo enzimático modificador de ácido nucleico da presente invenção não é particularmente limitada contanto que o módulo se ligue especificamente a, e possa ser qualquer sequência no DNA de fita dupla. O comprimento da sequência de nucleotídeos alvo só precisa ser suficiente para a ligação específica do módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico. Por exemplo, quando a mutação é introduzida em um determinado sítio no DNA genômico de um mamífero, ela não é inferior a 12 nucleotídeos, de preferência não tem menos que 15 nucleotídeos, com mais preferência não menos que 17 nucleotídeos, de acordo com o tamanho do genoma. Embora o limite superior do comprimento não seja particularmente limitado, ele é de preferência de no máximo 25 nucleotídeos, com mais preferência no máximo 22 nucleotídeos. Como mostrado nos Exemplos abaixo, a alta eficiência de modificação foi demonstrada em qualquer um dos sistemas experimentais nos quais a sequência de nucleotídeos alvo está presente no sítio local, uma sequência homóloga ao braço homologia, e uma região contendo uma sequência parcial homóloga ao braço de homologia. Portanto, a sequência de nucleotídeos alvo pode estar presente no sítio alvo, pode estar presente em pelo menos uma parte da região de uma sequência homóloga ao braço de homologia, ou pode estar presente em uma região próxima a uma sequência homóloga ao braço de homologia.

[0054] Como o módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico no complexo enzimático modificador de ácido nucleico da presente invenção, um sistema CRISPR-Cas no qual pelo menos uma capacidade de clivagem de DNA da proteína efetora Cas (doravante também referida como nuclease Cas) é inativada (doravante também referida como “Cas CRISPR-mutante”), motivo de dedo de zinco, efetor de TAL (semelhante a ativador de transcrição) e PPR (repetição de pentatricopeptídeo) e similares, bem como um fragmento que contém um domínio de ligação de DNA de uma proteína que se liga especificamente ao DNA, como

18 / 50 enzima de restrição, fator de transcrição, RNA polimerase e similares, e não tem uma capacidade de clivagem de fita dupla de DNA e similares pode ser usado, mas o módulo não se limita a isso. De preferência, o Cas CRISPR-mutante, o motivo de dedo de zinco, o efetor TAL, o motivo PPR e similares podem ser mencionados. No presente relatório descritivo, a proteína efetora Cas supracitada na qual pelo menos uma capacidade de clivagem de DNA é inativada também é chamada de mutante de proteína efetora Cas.

[0055] Um motivo de dedo de zinco é constituído por ligação de 3 a 6 diferentes unidades de dedo de zinco tipo Cys2His2 (1 dedo reconhece cerca de 3 bases), e pode reconhecer uma sequência de nucleotídeos alvo de 9 a 18 bases. Um motivo de dedo de zinco pode ser produzido por um método conhecido como método de montagem modular (Nat Biotechnol (2002) 20: 135-141), método OPEN (Mol Cell (2008) 31: 294-301), método CoDA (Nat Methods (2011) 8: 67- 69), método de híbrido de Escherichia coli (Nat Biotechnol (2008) 26:695-701) e similares. JP-B-4968498 pode ser mencionado para o detalhe da produção de motivos de dedo de zinco.

[0056] Um efetor TAL tem uma estrutura de repetição de módulos com cerca de 34 aminoácidos como uma unidade, e o 12º e 13º resíduos de aminoácidos (chamados RVD) de um módulo determinam a estabilidade de ligação e a especificidade de base. Uma vez que cada módulo é altamente independente, o efetor TAL específico para uma sequência de nucleotídeos alvo pode ser produzido simplesmente conectando-se o módulo. Para o efetor TAL, um método de produção que usa um recurso aberto (método REAL (Curr Protoc Mol Biol (2012) Capítulo 12: Unidade 12.15), método FLASH (Nat Biotechnol (2012) 30: 460-465) e método Golden Gate (Nucleic Acids Res (2011) 39: e82) etc.) foram estabelecidos, e um efetor TAL para uma sequência de nucleotídeos alvo pode ser projetado comparativamente convenientemente. A Publicação Nacional do Pedido de Patente internacional Nº 2013-513389 pode ser mencionada para fornecer detalhes da produção de um efetor TAL.

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[0057] O motivo PPR é constituído de tal forma que uma sequência de nucleotídeos particular é reconhecida por uma continuação de motivos PPR, cada um composto por 35 aminoácidos e reconhecendo uma base de ácido nucleico, e reconhece uma base alvo apenas por 1, 4 e ii (-2) aminoácidos de cada motivo. A constituição dos motivos não tem dependência, e está livre de interferências de motivos de ambos os lados. Portanto, como o efetor TAL, uma proteína PPR específica para a sequência de nucleotídeos alvo pode ser produzida simplesmente conectando-se os motivos PPR. O documento JP-A-2013-128413 pode ser mencionado para fornecer detalhes da produção de um motivo PPR.

[0058] Quando um fragmento de enzima de restrição, fator de transcrição, RNA polimerase e semelhantes é usado, uma vez que os domínios de ligação de DNA dessas proteínas são bem conhecidos, um fragmento que contém o domínio e não tem uma capacidade de clivagem de fita dupla de DNA pode ser facilmente projetado e construído.

[0059] Qualquer um dos módulos de reconhecimento de sequência de ácido nucleico acima mencionados pode ser provido como uma proteína de fusão com a enzima conversora de base de ácido nucleico nucleico acima mencionada etc., ou um domínio de ligação de proteína como um domínio SH3, domínio PDZ, domínio GK, domínio GB e similares e um parceiro de ligação do mesmo pode ser fundido com um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e uma enzima conversora de base de ácido nucleico etc., respectivamente, e provido como um complexo de proteínas através de uma interação do domínio com um parceiro de ligação do mesmo. Alternativamente, um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e uma enzima conversora de base de ácido nucleico, etc. podem ser cada um, fundidos com inteína, e eles podem ser ligados por ligação após síntese proteica.

[0060] O complexo enzimático modificador de ácido nucleico da presente invenção contendo um complexo (incluindo uma proteína de fusão) no qual um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e uma enzima

20 / 50 conversora de base de ácido nucleico estão ligados é desejavelmente contatado com um DNA de fita dupla ao introduzir um ácido nucleico que codifica o complexo em uma célula com o DNA de fita dupla de interesse (por exemplo, DNA genômico). No presente relatório descritivo, um complexo enzimático modificador de ácido nucleico inclui uma sequência de bases que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico, e uma sequência de bases que codifica uma enzima conversora de base de ácido nucleico ou DNA glicosilase. Quando o módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico é o sistema CRISPR-Cas, ele ainda contém um RNA guia de codificação de sequência.

[0061] Portanto, o módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e a enzima conversora de base de ácido nucleico etc. são preferencialmente preparados como um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão, ou sob uma forma capaz de formar um complexo em uma célula hospedeira após a tradução em uma proteína utilizando um domínio de ligação, inteína e semelhantes, ou como um ácido nucleico que codifica cada um deles. O ácido nucleico aqui pode ser um DNA ou um RNA. Quando é um DNA, ele é preferencialmente um DNA de fita dupla, e é provido sob a forma de um vetor de expressão descartado sob a regulação de um promotor funcional em uma célula hospedeira. Quando ele é um RNA, ele é preferencialmente um RNA de fita simples.

[0062] Uma vez que o complexo da presente invenção no qual um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e uma enzima conversora de base de ácido nucleico etc. estão ligados não acompanha quebras de DNA de fita dupla (DSB), a edição de genomas com baixa toxicidade é possível, e o método da presente invenção pode ser aplicado a uma ampla gama de materiais biológicos. Portanto, as células a serem introduzidas com um ácido nucleico que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e/ou enzima conversora de base de ácido nucleico etc. podem abranger células de qualquer espécie, desde bactérias de Escherichia coli e semelhantes que são procariotos, células de

21 / 50 microrganismos como leveduras e semelhantes que são eucariotos inferiores, até células de eucariotos superiores, como vertebrados, incluindo mamíferos como humanos e semelhantes, insetos, plantas e afins.

[0063] Um DNA que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico, como um motivo de dedo de zinco, efetor TAL, motivo PPR e similares pode ser obtido por qualquer método mencionado acima para cada módulo. Um DNA que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de enzimas de restrição, fator de transcrição, RNA polimerase e similares pode ser clonado por, por exemplo, síntese de um iniciador de oligoDNA abrangendo uma região que codifica uma parte desejada da proteína (parte contendo o domínio de ligação ao DNA) com base nas informações de sequência de cDNA e amplificação pelo método de RT-PCR usando, como modelo, a fração total de RNA ou mRNA preparada a partir das células produtoras de proteínas.

[0064] Um DNA que codifica uma enzima conversora de base de ácido nucleico etc. (ou seja, DNA que codifica uma enzima conversora de base de ácido nucleico ou DNA que codifica DNA glicosilase) também pode ser clonada de forma semelhante, mediante a síntese de um iniciador de oligoDNA com base nas informações da sequência de cDNA e amplificação pelo método de RT-PCR usando, como modelo, a fração total de RNA ou mRNA preparada a partir das células produtoras de enzimas. Por exemplo, um DNA que codifica PmCDA1 de Petromyzon marinus pode ser clonada projetando-se iniciadores adequados para o montante e jusante de CDS com base na sequência de cDNA (Nº de acesso EF094822) registrada na base de dados do NCBI, e clonagem de mRNA da Petromyzon marinus pelo método de RT-PCR. Um DNA que codifica AID humano pode ser clonado projetando-se iniciadores adequados para o montante e jusante de CDS com base na sequência de cDNA (Nº de acesso AB040431) registrada no banco de dados do NCBI e clonagem a partir de, por exemplo, mRNA de linfonodo humano pelo método de RT-PCR. Além disso, o DNA doador pode ser clonado da mesma forma descrita acima com base nas informações de

22 / 50 sequência do sítio alvo e similares.

[0065] O DNA clonado pode ser diretamente, ou após a digestão com uma enzima de restrição, quando desejado, ou após a adição de um ligante adequado e/ou um sinal de localização nuclear (cada sinal de transferência de organela quando o DNA de fita dupla de interesse é DNA mitocondrial ou de cloroplasto), ligado com um DNA que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico para preparar um DNA que codifica uma proteína de fusão. Alternativamente, um DNA que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico, e um DNA que codifica uma enzima conversora de base de ácido nucleico etc. pode ser, cada um, fundido com um DNA que codifica um domínio de ligação ou um parceiro de ligação do mesmo, ou ambos os DNAs podem ser fundidos com um DNA que codifica uma inteína de separação, de modo que o módulo de conversão de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e a enzima conversora de base de ácido nucleico etc. são traduzidos em uma célula hospedeira para formar um complexo. Nestes casos, um ligante e/ou um sinal de localização nuclear pode ser ligado a uma posição adequada de um ou ambos os DNAs, quando desejado. O DNA doador pode ser preparado como um único DNA, ou pode ser provido como um único DNA com um ácido nucleico que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e/ou uma enzima conversora de base de ácido nucleico e similares.

[0066] Um DNA que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico, um DNA que codifica uma enzima conversora de base de ácido nucleico, etc., e um DNA doador podem ser obtidos sintetizando-se quimicamente a fita de DNA ou conectando-se fitas curtas de oligoDNA parcialmente sobrepostas sintetizadas utilizando o método de PCR e o método de montagem de Gibson para construir um DNA que codifica o comprimento total do mesmo. Quando o DNA doador é um ácido nucleico de fita simples, como um método diferente de sintetizar quimicamente uma fita de DNA, por exemplo, um DNA de plasmídeo contendo o DNA é digerido com uma enzima de restrição em

23 / 50 uma fita simples, o RNA é sintetizado pela RNA polimerase, após o que o cDNA é sintetizado com transcriptase reversa e a fita de RNA é diferenciada com RNaseH. Alternativamente, ele pode ser preparado por digestão de um plasmídeo contendo um DNA doador com uma enzima de restrição do tipo nickase, e separação e purificação do mesmo por eletroforese. A vantagem de construir um DNA de comprimento completo por síntese química ou uma combinação do método de PCR ou método de montagem de Gibson é que o códon a ser usado pode ser desenhado em CDS de comprimento total de acordo com o hospedeiro no qual o DNA é introduzido. Na expressão de um DNA heterólogo, espera-se que o nível de expressão da proteína aumente pela conversão da sua sequência de DNA em um códon usado com alta frequência no organismo hospedeiro. Como os dados de frequência de uso de códon no hospedeiro a ser usado, por exemplo, o banco de dados de frequência de uso de código genético divulgado na página inicial do Kazusa DNA Research Institute (http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html) pode ser usado, ou documentos que mostram a frequência de uso de códon em cada hospedeiro podem ser consultados. Com referência aos dados obtidos e à sequência de DNA a ser introduzida, códons que mostram baixa frequência de uso no hospedeiro dentre aqueles usados para a sequência de DNA podem ser convertidos em um códon que codifica o mesmo aminoácido e que mostra alta frequência de uso.

[0067] Quando um sítio diferente da sequência de nucleotídeos alvo e da sequência PAM é usado como sítio alvo, essas sequências podem permanecer mesmo após a modificação, e uma reação de conversão de base de ácido nucleico ou uma reação de excisão de base pode ocorrer devido a uma enzima modificadora de ácido nucleico e similares. Portanto, é preferível projetar o DNA doador de modo que essas sequências sejam removidas ou introduzir uma mutação silenciosa na sequência de nucleotídeos alvo ou na sequência PAM no braço de homologia.

[0068] Um vetor de expressão contendo um DNA que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e/ou uma enzima

24 / 50 conversora de base de ácido nucleico, etc. pode ser produzido, por exemplo, ligando-se o DNA a jusante de um promotor em um vetor de expressão adequado.

[0069] Como o vetor de expressão, plasmídeos de Escherichia coli (por exemplo, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13); plasmídeos de Bacillus subtilis (por exemplo, pUB110, pTP5, pC194); plasmídeos de levedura (por exemplo, pSH19, pSH15); plasmídeos de expressão em células de inseto (por exemplo, pFast-Bac); plasmídeos de expressão em células animais (por exemplo, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo); bacteriófagos, como fago λ e semelhantes; vetores de vírus de inseto, como baculovírus e semelhantes (por exemplo, BmNPV, AcNPV); vetores de vírus animais, tais como retrovírus, vírus vaccinia, adenovírus e semelhantes, são usados.

[0070] Como promotor, qualquer promotor apropriado para um hospedeiro usado para a expressão do gene pode ser usado. Em um método convencional envolvendo DSB, uma vez que a taxa de sobrevivência da célula hospedeira às vezes diminui acentuadamente devido à toxicidade, é desejável aumentar o número de células pelo início da indução usando um promotor indutivo. No entanto, uma vez que uma proliferação celular suficiente também pode ser alcançada pela expressão do complexo de enzima modificadora de ácido nucleico da presente invenção, um promotor constitutivo também pode ser usado, sem limitação.

[0071] Por exemplo, quando o hospedeiro é uma célula animal, promotor de SRα, promotor de SV40, promotor de LTR, promotor de CMV (citomegalovírus), promotor de RSV (vírus do sarcoma de Rous), LTR de MoMuLV (vírus da leucemia de camundongo Moloney), promotor de HSV-TK (promotor de timidina quinase do vírus herpes simples) e semelhantes, são usados. Destes, o promotor de CMV, o promotor de SRα e semelhantes são preferidos.

[0072] Quando o hospedeiro é Escherichia coli, são preferidos o promotor trp, o promotor lac, o promotor recA, o promotor λPL , o promotor lpp, o promotor de T7 e semelhantes.

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[0073] Quando o hospedeiro é do gênero Bacillus, o promotor de SPO1, o promotor de SPO2, o promotor de penP e semelhantes são preferidos.

[0074] Quando o hospedeiro é uma levedura, o promotor Gal1/10, o promotor de PHO5, o promotor de PGK, o promotor de GAP, o promotor de ADH e semelhantes são preferidos.

[0075] Quando o hospedeiro é uma célula de inseto, um promotor de poli- hedrina, um promotor P10 e semelhantes são preferidos.

[0076] Quando o hospedeiro é uma célula vegetal, o promotor de CaMV35S, o promotor de CaMV19S, o promotor de NOS e semelhantes são preferidos.

[0077] Como o vetor de expressão, além dos mencionados acima, um contendo um intensificador, um sinal de splicing, um terminador, um sinal de adição de poliA, um marcador de seleção, como um gene de resistência a fármacos, um gene complementar auxotrófico e semelhantes, uma origem de replicação e semelhantes sob demanda pode ser usada.

[0078] Um RNA que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e/ou uma enzima conversora de base de ácido nucleico, etc. pode ser preparado, por exemplo, por transcrição em mRNA em um sistema de transcrição in vitro conhecido per se usando um vetor que codifica DNA que codifica o módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico mencionado acima e/ou uma enzima conversora de base de ácido nucleico, etc. como um modelo.

[0079] Um complexo de um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e uma enzima conversora de base de ácido nucleico etc. pode ser expresso intracelularmente pela introdução de um vetor de expressão contendo um DNA que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e/ou uma enzima conversora de base de ácido nucleico, etc. em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira.

[0080] Como o hospedeiro, são usados o gênero Escherichia, gênero

26 / 50 Bacillus, levedura, célula de inseto, inseto, célula animal e semelhantes.

[0081] Como o gênero Escherichia, são usados Escherichia coli K12･ DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], Escherichia coli JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], Escherichia coli JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], Escherichia coli HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] e semelhantes.

[0082] Como o gênero Bacillus, BacillusBacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], BacillusBacillus subtilis 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] e semelhantes são usados.

[0083] Como a levedura, são usados Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris KM71 e semelhantes.

[0084] Como a célula de inseto, quando o vírus é AcNPV, células de linhagem estabelecida de larvas de lagarta do cartucho (célula de Spodoptera frugiperda; célula Sf), células MG1 do intestino médio de Trichoplusia ni, células High FiveTM de um ovo de Trichoplusia ni, células de Mamestra brassicae, células de Estigmena acrea e semelhantes são usadas. Quando o vírus é BmNPV, células de linhagenm estabelecida de Bombyx mori (célula Bombyx mori N; célula BmN) e semelhantes são usadas como as células de inseto. Como a célula Sf, por exemplo, são utilizadas a célula Sf9 (ATCC CRL1711), a célula Sf21 [todas acima, In Vivo, 13, 213-217 (1977)] e semelhantes.

[0085] Como o inseto, por exemplo, são utilizadas larvas de Bombyx mori, Drosophila, grilos e semelhantes [Nature, 315, 592 (1985)].

[0086] Como a célula animal, linhagens celulares como célula de macaco COS-7, célula Vero de macaco, célula de ovário de hamster chinês (CHO), célula CHO deficiente no gene dhfr, célula L de camundongo, célula AtT-20 de camundongo, célula de mieloma de camundongo, célula GH3 de rato, célula de rim fetal humano (por exemplo, célula HEK293), célula de câncer de fígado humano

27 / 50 (por exemplo, HepG2), célula FL humana e semelhantes, células-tronco pluripotentes, como célula iPS, célula ES e semelhantes de humanos e outros mamíferos, e células de cultura primária preparadas a partir de vários tecidos são utilizadas. Além disso, embrião de peixe-zebra, oócito de Xenopus e semelhantes também podem ser usados.

[0087] Como a célula vegetal, células cultivadas em suspensão, calo, protoplasto, segmento de folha, segmento de raiz e semelhantes preparados a partir de várias plantas (por exemplo, grãos, como arroz, trigo, milho e semelhantes, safras de produtos, como tomate, pepino, berinjela e semelhantes, plantas de jardim, tais como cravo, Eustoma russellianum e semelhantes, plantas experimentais, tais como tabaco, Arabidopsis thaliana e semelhantes) são usadas.

[0088] Um vetor de expressão pode ser introduzido por um método conhecido (por exemplo, método de lisozima, método competente, método PEG, método de coprecipitação de CaCl2 , método de eletroporação, método de microinjeção, o método de pistola de partículas, método de lipofecção, método de Agrobacterium e semelhantes) de acordo com o tipo de hospedeiro. O DNA doador também pode ser introduzido nas células por um método semelhante. Ao introduzir o vetor de expressão e o DNA doador como moléculas diferentes, a introdução do vetor de expressão e do DNA doador pode ser realizada simultaneamente ou em tempos diferentes.

[0089] Escherichia coli pode ser transformada de acordo com os métodos descritos em, por exemplo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982) e similares.

[0090] O gênero Bacillus pode ser introduzido em um vetor de acordo com os métodos descritos, por exemplo, em Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) e semelhantes.

[0091] Uma levedura pode ser introduzida em um vetor de acordo com os métodos descritos, por exemplo, em Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) e similares.

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[0092] Uma célula de inseto e um inseto podem ser introduzidos em um vetor de acordo com os métodos descritos em, por exemplo, Bio/Technology, 6, 47-55 (1988) e semelhantes.

[0093] Uma célula animal pode ser introduzida em um vetor de acordo com os métodos descritos, por exemplo, em Cell Engineering volume adicional 8, New Cell Engineering Experiment Protocol, 263-267 (1995) (publicado por Shujunsha), e Virology, 52, 456 (1973).

[0094] Uma célula introduzida com um vetor e um DNA doador pode ser cultivada de acordo com um método conhecido de acordo com o tipo de hospedeiro.

[0095] Por exemplo, quando Escherichia coli ou gênero Bacillus é cultivado, um meio líquido é um meio preferido para ser usado para a cultura. O meio contém de preferência uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma substância inorgânica e semelhantes, que são necessários para o crescimento de um transformante. Exemplos da fonte de carbono incluem glicose, dextrina, amido solúvel, sacarose e semelhantes; exemplos da fonte de nitrogênio incluem substâncias inorgânicas ou orgânicas, como sais de amônio, sais de nitrato, líquido de maceração de milho, peptona, caseína, extrato de carne, bolo de soja, extrato de batata e semelhantes; e exemplos da substância inorgânica incluem cloreto de cálcio, di-hidrogenofosfato de sódio, cloreto de magnésio e semelhantes. O meio pode conter extrato de levedura, vitaminas, fator de promoção de crescimento e semelhantes. O pH do meio é, preferencialmente, de 5 a cerca de 8.

[0096] Como um meio para a cultura de Escherichia coli, por exemplo, o meio M9 contendo glicose, casaminoácido [Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] é preferido. Quando necessário, por exemplo, agentes tais como ácido 3β-indolilacrílico podem ser adicionados ao meio para assegurar uma função eficiente de um promotor. A Escherichia coli é cultivada geralmente a cerca de 15 a cerca de 43°C. Quando necessário, aeração e agitação podem ser realizadas.

[0097] O gênero Bacillus é cultivado geralmente a cerca de 30 a cerca de

29 / 50 40°C. Quando necessário, aeração e agitação podem ser realizadas.

[0098] Exemplos do meio para cultivar a levedura incluem meio mínimo de Burkholder [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)], meio SD contendo 0,5% casamino ácido [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)] e similares. O pH do meio é, preferencialmente, de 5 a cerca de 8. A cultura é realizada geralmente a cerca de 20°C a cerca de 35°C. Quando necessário, aeração e agitação podem ser realizadas.

[0099] Como um meio para a cultura de células de insetos ou insetos, por exemplo, é utilizado o meio para insetos de Grace [Nature, 195, 788 (1962)] contendo um aditivo tal como soro bovino a 10% inativado e semelhantes conforme apropriado e semelhantes. O pH do meio é, preferencialmente, de cerca de 6,2 a cerca de 6,4. A cultura é realizada geralmente a cerca de 27°C. Quando necessário, aeração e agitação podem ser realizadas.

[00100] Como um meio para a cultura de células animais, por exemplo, meio essencial mínimo (MEM) contendo cerca de 5 a cerca de 20% de soro fetal bovino [Science, 122, 501 (1952)], meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) [Virology, 8 , 396 (1959)], meio RPMI 1640 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], meio 199 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] e semelhantes são usados. O pH do meio é, preferencialmente, de cerca de 6 a cerca de 8. A cultura é realizada geralmente a cerca de 30°C a cerca de 40°C. Quando necessário, aeração e agitação podem ser realizadas.

[00101] Como um meio para a cultura de células vegetais, por exemplo, são usados meio MS, meio LS, meio B5 e semelhantes. O pH do meio é, preferencialmente, de 5 a cerca de 8. A cultura é realizada geralmente a cerca de 20°C a cerca de 30°C. Quando necessário, aeração e agitação podem ser realizadas.

[00102] Como mencionado acima, um complexo de um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e uma enzima conversora de base de ácido nucleico, etc., isto é, complexo de enzima modificadora de ácido nucleico,

30 / 50 pode ser expresso intracelularmente.

[00103] Um RNA que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e/ou uma enzima conversora de base de ácido nucleico, etc. pode ser introduzido em uma célula hospedeira pelo método de microinjeção, pelo método de lipofecção e semelhantes. A introdução de RNA pode ser realizada uma vez ou repetida várias vezes (por exemplo, 2 a 5 vezes) em intervalos adequados.

[00104] Quanto aos motivos de dedo de zinco, a produção de muitos motivos de dedo de zinco realmente funcionais não é fácil, uma vez que a eficiência da produção de um dedo de zinco que se liga especificamente a uma sequência de nucleotídeos alvo não é alta e a seleção de um dedo de zinco com alta especificidade de ligação é complicada. Embora os efetores TAL e motivos PPR tenham um alto grau de liberdade de reconhecimento de sequência de ácido nucleico alvo em comparação aos motivos de dedo de zinco, ainda permanece um problema na eficiência, uma vez que uma proteína grande precisa ser projetada e construída todas as vezes de acordo com a sequência de nucleotídeos alvo.

[00105] Em contrapartida, uma vez que o sistema CRISPR-Cas reconhece a sequência de DNA de fita dupla de interesse com um RNA guia complementar à sequência de nucleotídeos alvo, qualquer sequência pode ser direcionada simplesmente sintetizando-se um oligoDNA capaz de hibridizar especificamente com a sequência de nucleotídeos alvo.

[00106] Portanto, em uma modalidade mais preferencial da presente invenção, um sistema CRISPR-Cas em que a capacidade de clivagem de DNA de apenas uma ou ambas as proteínas efetoras Cas está inativada (Cas CRISPR- mutante) é usado como um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico.

[00107] O módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico da presente invenção usando CAS CRISPR-mutante é provido como um complexo de um RNA de CRISPR (crRNA) contendo uma sequência complementar à sequência

31 / 50 de nucleotídeos alvo e, quando necessário, um RNA transativador (tracrRNA) necessária para o recrutamento da proteína efetora Cas mutante (quando o tracrRNA é necessário, possivelmente provido como RNA quimérico com crRNA) e proteína efetora Cas mutante. Uma molécula de RNA que consiste em crRNA sozinho ou um RNA quimérico de crRNA e tracrRNA que constitui um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico em combinação com uma proteína efetora Cas mutante é coletivamente referida como um “RNA guia”. O mesmo também se aplica quando um sistema CRISPR/Cas sem introdução de mutação é usado.

[00108] Embora a proteína efetora Cas a ser usada na presente invenção não seja particularmente limitada, contanto que ela possa formar um complexo com o RNA guia e reconhecer e se ligar à sequência de nucleotídeos alvo no gene de interesse e um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) adjacente a ela, ela é preferencialmente Cas9 (também referida como nuclease Cas9) ou Cpf1 (também referida como nuclease Cpf1). Exemplos de Cas9 incluem, mas não estão limitados a, Cas9 derivado de Streptococcus pyogenes (SpCas9; sequência PAM NGG (N é A, G, T ou C, daqui em diante iguais)), Cas9 derivado de Streptococcus thermophilus (StCas9; sequência PAM NNAGAAW), Cas9 derivado de Neisseria meningitidis (MmCas9; sequência PAM NNNNGATT) e semelhantes. O preferido é o SpCas9 com menos restrição por PAM (substancialmente 2 bases e pode ter como alvo teoricamente qualquer sítio no genoma). Exemplos de Cpf1 incluem, mas não estão limitados a, Cpf1 derivado de Francisella novicida (FnCpf1; sequência PAM NTT), Cpf1 derivado de Acidaminococcus sp. (AsCpf1; sequência PAM NTTT), Cpf1 derivado da bactéria Lachnospiraceae (LbCpf1; sequência PAM NTTT) e semelhantes. Como uma proteína efetora Cas mutante (às vezes a ser abreviada como Cas mutante) a ser usada na presente invenção, qualquer uma das proteínas efetoras Cas nas quais a capacidade de clivagem de ambas as fitas do DNA de fita dupla está inativada e tendo atividade de nickase em que pelo menos uma capacidade de clivagem de uma fita isolada está inativada pode ser usada. Por

32 / 50 exemplo, no caso de SpCas9, um mutante D10A no qual o 10º resíduo de Asp é convertido em um resíduo de Ala e sem capacidade de clivagem de uma fita oposta à fita que forma uma fita complementar com um RNA guia (tendo, assim, atividade de nickase para uma fita que forma a fita complementar com o RNA guia), ou mutante H840A no qual o 840º resíduo de His é convertido em um resíduo de Ala e sem capacidade de clivagem de uma fita que forma uma fita complementar ao RNA guia (tendo assim atividade de nickase para uma fita que forma a fita complementar com o RNA guia, ou um mutante duplo deste (dCas9) pode ser usado. No caso de FnCpf1, um mutante no qual o 917º resíduo de Asp é convertido em um resíduo de Ala (D917A) ou o 1006º resíduo de Glu é convertido em um resíduo de Ala (E1006A), e sem capacidade de clivagem de ambas as fitas pode ser usado. Contanto que pelo menos uma das fitas de DNA de fita dupla não tenha capacidade de clivagem, outro mutante Cas também pode ser usado de forma semelhante.

[00109] Um DNA que codifica a proteína efetora Cas (incluindo Cas mutante, daqui em diante, igual) pode ser clonado por um método semelhante ao método acima mencionado para um DNA que codifica um inibidor de reparo por excisão de base, a partir de uma célula que produz a enzima. Um Cas mutante pode ser obtido pela introdução de uma mutação para converter um resíduo de aminoácido do sítio importante para a atividade de clivagem de DNA (por exemplo, 10º resíduo de Asp e 840º resíduo de His para SpCas9, 917º resíduo de Asp e 1006º resíduo de Glu para FnCpf1 e semelhantes, embora não se limitando a isso) a outros aminoácidos, em um DNA que codifica Cas clonado, por um método de indução de mutação sítio-específica conhecido per se.

[00110] Alternativamente, um DNA que codifica a proteína efetora Cas também pode ser construído como um DNA com uso de códon adequado para expressão em uma célula hospedeira a ser usada, por um método semelhante aos mencionados acima para um DNA que codifica um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e um DNA que codifica uma enzima conversora de

33 / 50 base de ácido nucleico e em uma combinação de síntese química ou método de PCR ou método de montagem de Gibson.

[00111] O DNA obtido que codifica uma proteína efetora Cas e/ou enzima de modificação de ácido nucleico e/ou inibidor de reparo por excisão de base pode ser inserido a jusante de um promotor de um vetor de expressão semelhante ao mencionado acima, de acordo com a célula alvo.

[00112] Por outro lado, um DNA que codifica um RNA guia pode ser obtido projetando-se uma sequência de oligoDNA que se liga a uma sequência de codificação de sequência de crRNA contendo uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos alvo (a ser também referida como “sequência de direcionamento” no presente relatório descritivo) (por exemplo, quando FnCpf1 é recrutado como a proteína efetora Cas, crRNA contendo a SEQ ID NO: 1; AAUUUCUACUGUUGUAGAU no lado 5’ da sequência de direcionamento pode ser usado, e as sequências sublinhadas formam pares de bases para formar uma estrutura de haste-alça) ou uma sequência de codificação de crRNA e, quando necessário, uma sequência de codificação de tracrRNA conhecida (por exemplo, como sequência de codificação de tracrRNA quando Cas é recrutado como a proteína efetora Cas9, gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt ; SEQ ID NO: 2, ou gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtggtgctt tt; SEQ ID NO: 3) e sintetizando-se quimicamente usando um sintetizador de DNA/RNA.

[00113] A “fita alvo” aqui significa uma fita que forma um híbrido com crRNA da sequência de nucleotídeos alvo, e a fita oposta, que se torna fita simples após a hibridização da fita alvo e crRNA, é referida como uma “fita não alvo”. Quando a sequência de nucleotídeos alvo deve ser expressa por uma das fitas (por exemplo, quando a sequência PAM é indicada, quando a relação posicional da sequência de nucleotídeos alvo e PAM é mostrada, etc.), ela é representada por uma

34 / 50 sequência da fita não alvo.

[00114] Embora o comprimento da sequência de direcionamento não seja particularmente limitado, desde que ele possa se ligar especificamente a uma sequência de nucleotídeos alvo, por exemplo, é de 15 a 30 nucleotídeos, preferencialmente de 18 a 25 nucleotídeos.

[00115] Quando Cas9 é usada como uma proteína efetora Cas, uma sequência de direcionamento pode ser projetada, por exemplo, usando uma página da internet para o design de RNA guia aberta ao público (CRISPR Design Tool, CRISPRdirect etc.) listando-se sequências de até 20 mer que tem PAM (por exemplo, NGG no caso de SpCas9) adjacente ao lado 3’ das sequências de CDS do gene de interesse, e selecionando-se uma sequência que causa uma mudança de aminoácido na proteína codificada pelo gene alvo quando C dentro de 7 nucleotídeos da extremidade 5’ na direção 3’ é convertida em T. Uma sequência apropriada pode ser selecionada mesmo quando uma sequência de direcionamento com um comprimento diferente de 20 mer é usada. Uma sequência candidata com um pequeno número de sítios fora do alvo no genoma hospedeiro de interesse pode ser usada como uma sequência de direcionamento. Quando o software de design de RNA guia a ser usado não tem uma função para pesquisar sítios fora do alvo no genoma do hospedeiro, por exemplo, os sítios fora do alvo podem ser pesquisados aplicando-se uma busca Blast contra o genoma do hospedeiro, por exemplo, 8 a 12 nucleotídeos no lado 3’ da sequência candidata (sequência de sementes com alta capacidade de discriminação da sequência de nucleotídeos alvo).

[00116] Um DNA que codifica um RNA guia também possa ser inserido em um vetor de expressão semelhante ao mencionado acima. Como o promotor, o promotor (por exemplo, promotor SNR6, SNR52, SCR1, RPR1, U3, U6, H1 etc.) e o terminador (por exemplo, a sequência poliT (sequência T6 , etc.)) do sistema pol III são preferencialmente usados.

[00117] Um DNA que codifica um RNA guia (crRNA ou quimera de crRNA-tracrRNA) pode ser obtido projetando-se uma sequência de oligoRNA por

35 / 50 ligar uma sequência complementar à fita alvo da sequência de nucleotídeos alvo e uma sequência conhecida de tracrRNA (quando Cas9 é recrutado) ou uma sequência de repetição direta de crRNA (quando Cpf1 é recrutado) e sintetizar quimicamente usando um sintetizador de DNA/RNA.

[00118] Um DNA ou RNA que codifica Cas mutante e/ou uma enzima conversora de base de ácido nucleico, etc., RNA guia-tracrRNA ou um DNA que codifica o mesmo pode ser introduzido em uma célula hospedeira por um método semelhante ao acima, de acordo com o hospedeiro.

[00119] Uma vez que a nuclease artificial convencional acompanha quebras de DNA de fita dupla (DSB), a inibição do crescimento e morte celular supostamente causadas pela clivagem desordenada do cromossomo (clivagem fora do alvo) ocorreu por direcionamento a uma sequência no genoma. Na presente invenção, o sítio alvo é modificado não por clivagem de DNA, mas pela utilização de uma reação de conversão do substituinte na base de DNA (particularmente, reação de desaminação), ou uma reação de excisão de base e um mecanismo de reparo posterior. Portanto, a redução drástica da toxicidade pode ser realizada.

[00120] No método da presente invenção, também é possível modificar o sítio alvo usando múltiplas sequências de nucleotídeos alvo em diferentes posições. Portanto, em uma modalidade preferencial da presente invenção, dois ou mais tipos de módulos de reconhecimento de sequência de ácido nucleico que se ligam especificamente a diferentes sequências de nucleotídeos alvo podem ser usados. Neste caso, cada um destes módulos de reconhecimento de sequência de ácido nucleico e enzima conversora de base de ácido nucleico, etc., formam um complexo enzimático de modificação de ácido nucleico. Aqui, pode ser usada uma enzima conversora de base de ácido nucleico comum, etc. Por exemplo, quando o sistema CRISPR-Cas é usado como um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico, um complexo comum (incluindo uma proteína de fusão) de uma proteína efetora Cas e uma enzima conversora de base de ácido nucleico etc. é usado, e dois ou mais tipos de RNAs quiméricos de dois ou mais tracrRNA ou cada

36 / 50 um dentre dois ou mais crRNAs que formam, respectivamente, uma fita complementar com uma sequência de nucleotídeos alvo diferente são produzidos e usados como RNA guia (crRNA ou quimera de crRNA-tracrRNA). Por outro lado, quando o motivo de dedo de zinco, o efetor TAL e semelhantes são usados como módulos de reconhecimento de sequência de ácido nucleico, por exemplo, uma enzima conversora de base de ácido nucleico etc. pode ser fundida com um módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico que se liga especificamente a um nucleotídeo alvo diferente.

[00121] Para expressar o complexo enzimático modificador de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira, como mencionado acima, um vetor de expressão contendo um DNA que codifica o complexo enzimático modificador de ácido nucleico é introduzido em uma célula hospedeira. Para a introdução eficiente da mutação, é desejável manter uma expressão do complexo enzimático modificador de ácido nucleico de um determinado nível ou superior por não menos do que um determinado período. Desse ponto de vista, é certo que o vetor de expressão é incorporado ao genoma do hospedeiro. Uma vez que a expressão contínua do complexo enzimático modificador de ácido nucleico aumenta o risco de clivagem fora do alvo, ele é preferencialmente removido imediatamente após alcançar a modificação do sítio alvo. Exemplos dos meios para remover DNA incorporado no genoma do hospedeiro incluem um método que usa um sistema Cre-loxP ou sistema FLP-FRT, um método que usa transposon e semelhantes.

[00122] Alternativamente, a edição do genoma do hospedeiro pode ser realizada de forma eficiente, evitando o risco de clivagem fora do alvo por causar uma reação de ácido nucleico em um estágio desejado e expressar transitoriamente o complexo enzimático modificador de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira por um período necessário para estabilizar a modificação do sítio alvo. Aqueles versados na técnica podem determinar apropriadamente um período de indução de expressão preferencial com base nas condições de cultura e

37 / 50 semelhantes a serem utilizadas. O período de indução de expressão de um ácido nucleico que codifica o complexo enzimático modificador de ácido nucleico da presente invenção pode ser estendido além do “período necessário para estabilizar a modificação do sítio alvo” acima mencionado, desde que a célula hospedeira esteja livre de efeitos colaterais.

[00123] Como um meio para expressar transitoriamente o complexo enzimático modificador de ácido nucleico da presente invenção em um estágio desejado por um período desejado pode-se mencionar um método que inclui a produção de um construto (vetor de expressão) contendo um ácido nucleico (um DNA que codifica um RNA guia e um DNA que codifica uma proteína efetora Cas e uma enzima modificadora de ácido nucleico, etc. no sistema CRISPR-Cas mutante) que codifica o complexo enzimático modificador de ácido nucleico em uma forma capaz de controlar o período de expressão e a introdução do construto em um hospedeiro. A “forma capaz de controlar o período de expressão” é especificamente, por exemplo, um ácido nucleico que codifica o complexo enzimático modificador de ácido nucleico da presente invenção colocado sob a regulação de uma região reguladora induzível. Embora a “região reguladora induzível” não seja particularmente limitada, ela é, por exemplo, um operon de um repressor de mutação sensível à temperatura (ts) e um operador regulado desse modo. Exemplos do repressor de mutação ts incluem, mas não estão limitados a, mutação ts do repressor cI de fago λ. No caso do repressor cI do fago λ (ts), ele está ligado a um operador para suprimir a expressão do gene a jusante em não mais de 30°C (por exemplo, 28°C). A uma temperatura elevada não inferior a 37°C (por exemplo, 42°C), ele é dissociado do operador para permitir a indução da expressão gênica. Portanto, o período no qual a expressão do gene alvo é suprimida pode ser minimizado por cultivar uma célula hospedeira introduzida com um ácido nucleico que codifica um complexo enzimático modificador de ácido nucleico geralmente em no máximo 30°C, aumentando-se a temperatura para no mínimo 37°C em um estágio apropriado, realizar cultura por um determinado período para realizar

38 / 50 recombinação homóloga e, após introdução da mutação no gene alvo, baixar rapidamente a temperatura para no máximo 30°C. Assim, mesmo quando um gene essencial para a célula hospedeira é direcionado, ele pode ser editado de forma eficiente enquanto os efeitos colaterais são suprimidos.

[00124] Quando uma mutação sensível à temperatura é utilizada, por exemplo, um mutante sensível à temperatura de uma proteína necessária para a replicação autônoma de um vetor é incluído em um vetor contendo um DNA que codifica o complexo enzimático modificador de ácido nucleico da presente invenção. Como resultado, a replicação autônoma se torna impossível rapidamente após a expressão do complexo enzimático modificador de ácido nucleico e o vetor cai naturalmente durante a divisão celular. Exemplos da proteína mutante sensível à temperatura incluem, mas não estão limitados a um mutante sensível à temperatura de Rep101 ori necessário para a replicação de pSC101 ori. Rep101 ori (ts) atua em pSC101 ori para permitir a replicação autônoma do plasmídeo em no máximo 30°C (por exemplo, 28°C), mas perde a função em no mínimo 37°C (por exemplo, 42°C), e o plasmídeo não pode se replicar de forma autônoma. Portanto, um uso combinado com repressor cI (ts) do fago λ acima mencionado permite simultaneamente a expressão transitória do complexo enzimático modificador de ácido nucleico da presente invenção e a remoção do plasmídeo.

[00125] Além disso, um DNA que codifica o complexo enzimático modificador de ácido nucleico da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira sob a regulação do promotor induzível (por exemplo, promotor lac (induzido por IPTG), promotor cspA (induzido por choque frio), promotor araBAD (induzida por arabinose) etc.), a substância indutora é adicionada ao meio (ou removida do meio) em um estágio apropriado para induzir a expressão do complexo enzimático modificador de ácido nucleico, a cultura é realizada por um determinado período para realizar uma reação de modificação de ácido nucleico e a introdução de mutação no gene alvo, e a expressão transitória do complexo enzimático modificador de ácido nucleico pode ser realizada.

39 / 50

[00126] A presente invenção é explicada a seguir com referência a Exemplos, que não devem ser interpretados como limitativos. [Exemplo] <Linhagem celular, cultura, transformação e indução de expressão de levedura em brotamento>

[00127] A cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae BY4741 em brotamento (que exige leucina e uracila) foi cultivada em um meio YPDA padrão ou meio SD com uma composição de Dropout que satisfaz a auxotroficidade. A cultura foi realizada em cultura estática em uma placa de ágar ou em cultura agitada em meio líquido entre 25°C e 30°C. A transformação foi realizada pelo método do acetato de lítio, e a seleção foi feita em meio SD apresentando auxotroficidade adequada. Para indução de expressão por galactose, após a pré-cultura durante a noite em um meio SD apropriado, foi realizada cultura em meio SR durante a noite com fonte de carbono trocada de glicose a 2% para rafinose a 2%, e cultura adicional em meio SGal por 3 horas a cerca de duas noites com fonte de carbono trocada para galactose a 0,2% para indução de expressão.

[00128] Para a medição do número de células sobreviventes e a taxa de mutação Can1, uma suspensão de células foi adequadamente diluída e aplicada ao meio da placa SD e SD-Arg+60 mg/L de meio de placa Canavanina ou SD + 300mg/L de meio de placa Canavanina, e o número de colônias que surgem 3 dias depois foi contado como o número de células sobreviventes. Usando o número de colônias sobreviventes na placa SD como o número total de células, e o número de colônias sobreviventes na placa Canavanina como o número de cepas mutantes resistentes, a taxa de mutação foi calculada e avaliada. O sítio da mutação foi identificado pela amplificação de fragmentos de DNA contendo a região do gene alvo de cada cepa por um método de PCR de colônia, seguido por sequenciamento de DNA e uma análise de alinhamento com base na sequência do banco de dados do genoma de Saccharomyces (http://www.yeastgenome.org/). <Linhagem celular, cultura, indução de expressão de célula animal>

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[00129] Células de rim fetal humano (células HEK293T) foram cultivadas em meio DME-glutamax (Thermo Fisher Scientific) adicionado com 10 μg/mL de puromicina (Life Technologies) e soro fetal bovino (FBS) a 10% (Biosera, Nuaille, França) sob condições de 37°C e 5% de CO2. As células foram recuperadas usando 5% de tripsina. As células HEK293T preservadas em um freezer foram dissolvidas em banho-maria a 37°C e semeadas em um frasco T 75 a 5x106 células. Após cultura durante 1 a 3 dias, as células foram recuperadas e semeadas em cada poço de uma placa de 24 poços a 0,5x105 células/poço. Após cultura por 1 a 3 dias, 60 a 80% das células confluentes em cada poço foram transfectadas com cada 500 ng/poço do seguinte plasmídeo (plasmídeo efetor e plasmídeo repórter) (total de 1 μg/poço), 200 nM de DNA doador, 1,5 μl de FugeneHD (Promega). O DNA doador usado em cada Exemplo é mostrado na Tabela 1. Após a transfecção por 72 horas, as células foram recuperadas e a fluorescência de iRFP e EGFP foi detectada usando FACS. A eficiência recombinante (%) foi calculada a partir do número de células detectadas pela seguinte fórmula.

[Tabela 1] SEQ ID nome no nome no nome no sequência de oligos (5’-3’) NO: exemplo 5 exemplo 6 exemplo 7 gcgCTACCGGACTCAGATCTACCggcccagttggaatgtaggTGGTGAGCAAGGGCGAGGaGCTGTTC Fw1 (70 b) 32 Fw1

AC gcgCTACCGGACTCAGATCTACCggcccagttggaatgtagaTGGTGAGCAAGGGCGAGGaGCTGTTC Fw2 (70 b) 33 Fw2

AC gcgCTACCGGACTCAGATCTACgggcccagttggaatgtagaTGGTGAGCAAGGGCGAGGaGCTGTTC Fw3 (70 b) 34 Fw3 Fw1

AC GTGAACAGCtCCTCGCCCTTGCTCACCAcctacattccaactgggccGGTAGATCTGAGTCCGGTAGc Rv1 (70 b) 35 gc GTGAACAGCtCCTCGCCCTTGCTCACCAtctacattccaactgggccGGTAGATCTGAGTCCGGTAGcg 41 / 50 Rv2 (70 b) 36 c Rv3 (70 b) GTGAACAGCtCCTCGCCCTTGCTCACCAtctacattccaactgggcccGTAGATCTGAGTCCGGTAGcgc 37 Fw70b deslocado 15b para a CCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTACCggcccagttggaatgtagaTGGTGAGCA 38 Fw2 esquerda AGGG Fw70b deslocado 15b para a GATCTACCggcccagttggaatgtagaTGGTGAGCAAGGGCGAGGaGCTGTTCACCGGGGTGGTGCC 39 Fw3 direita CAT Fw50b centro ACTCAGATCTACCggcccagttggaatgtagaTGGTGAGCAAGGGCGAGG 40 Fw Fw4 Rv50b centro CCTCGCCCTTGCTCACCAtctacattccaactgggccGGTAGATCTGAGT 41 Rv

42 / 50 número de células duplo-positivas para Taxa de recombinação iRFP e GFP X100 homóloga = Número de células positivas para iRFP <Manipulação de ácidos nucleicos>

[00130] O DNA foi processado ou construído por qualquer método de PCR, o tratamento de enzimas de restrição, ligação, método de montagem Gibson e síntese química artificial. Para o plasmídeo, como um vetor de transporte de levedura-Escherichia coli, pRS415 para seleção de leucina e pRS426 para seleção de uracila foram usados como a estrutura principal. O plasmídio foi amplificado pela linhagem de Escherichia coli XL-10 ouro ou DH5α, e introduzido na levedura pelo método de acetato de lítio. <Construção do construto de levedura em brotamento>

[00131] As sequências do braço de homologia, RNA guia, sequência de inserção e semelhantes foram projetadas por referência ao banco de dados do genoma de levedura (https://www.yeastgenome.org/). O vetor foi construído de acordo com o método descrito em Nishida K. et al., Science 16:353(6305) (2016) doi: 10.1126/science.aaf8729. O vetor 1 x gRNA corresponde a um vetor no qual a sequência da 5871ª a 5890ª bases da sequência mostrada na SEQ ID NO: 15 é substituída por uma sequência complementar da sequência de nucleotídeos alvo L86 ou M4. O vetor 2 x gRNA corresponde a um vetor no qual a sequência da 2638ª a 2657ª bases da sequência mostrada na SEQ ID NO: 16 é substituída por uma sequência complementar de uma sequência de nucleotídeos alvo de qualquer um dentre L86, L87, L88, L93 e R90, e a sequência da 6293ª a 6312ª bases da SEQ ID NO: 16 é substituída por uma sequência complementar de uma sequência de nucleotídeos alvo de qualquer um dentre L87, R89, R90, R91 e R92. Os nucleotídeos alvo mencionados acima são os seguintes: L86: CGAACAGAGTAAACCGAATC (SEQ ID NO: 17) L87: AGCACTATCAAGGCTAATAA (SEQ ID NO: 18) L88: GCGAACTTGAAGAATAACCA (SEQ ID NO: 19)

43 / 50 R89: TCACCTAACTCAGACATTAT (SEQ ID NO: 20) R90: TTGCTGATTCTATTTACAAA (SEQ ID NO: 21) R91: GCAAACTCTATTCTTGGTGC (SEQ ID NO: 22) R92: ACCAGAGTATCATCCATGTC (SEQ ID NO: 23) L93: AATTCGGACACTTTAGGGTT (SEQ ID NO: 24) M4 : AGATATTATACCTGGACCCC (SEQ ID NO: 25) <Construção do construto de células animais>

[00132] A estrutura do vetor pcDNA3.1 e as respectivas sequências de CMV, PmCDA1, Cas9, H1, sgRNA são derivadas de um artigo de Nishida et al.

2016. Cada mutação foi introduzida pelo método de PCR. Os segmentos EF1, iRFP e mEGFP foram gerados por síntese artificial de genes. Os segmentos foram inseridos e substituídos por montagem de Gibson ou reação de ligação.

[00133] As sequências do vetor SY4 produzido (H1_sgRNA, CMV_mEGFP) (plasmídeo repórter), vetor SY45 (CMV_Cas9-PmCDA1, EF1_iRFP) e vetor SY45 (CMV_Cas9, EF1_iRFP) são mostradas, respectivamente, nas SEQ ID NOs: 42 a 44. O vetor SY45 (CMV_nCas9 (D10A)-PmCDA1, EF1_iRFP) corresponde a um vetor no qual a 770ª a 772ª bases da sequência número 43 são substituídas por gct. O vetor SY45 (CMV_nCas9(H840A)- PmCDA1, EF1_iRFP) corresponde a um vetor no qual a 3260ª a 3262ª bases da sequência número 43 são substituídas por gct. O vetor SY45 (CMV_dCas9- PmCDA1, EF1_iRFP) corresponde a um vetor no qual a 770ª a 772ª bases da sequência número 43 são substituídas por gct e a 3260ª a 3262ª bases são substituídas por gct. O vetor SY45 (CMV_nCas9(D10A), EF1_iRFP) corresponde a um vetor no qual a 3724ª a 3726ª bases da sequência número 44 são substituídas por gct. O vetor SY45 (CMV_nCas9(H840A), EF1_iRFP) corresponde a um vetor no qual a 6214ª a 6216ª bases da sequência número 44 são substituídas por gct. O vetor SY45 (CMV_dCas9, EF1_iRFP) corresponde a um vetor no qual a 3724ª a 3726ª bases da sequência número 44 são substituídas por gct e a 6214ª a 6216ª bases são substituídas por gct.

44 / 50 <Sequenciamento do DNA na célula>

[00134] As células positivas para iRFP foram separadas por FACS, o DNA genômico e o DNA de plasmídeo introduzido foram extraídos e as seguintes amostras foram preparadas e submetidas a PCR sob as seguintes condições para amplificar o sítio alvo.

[00135] Preparação da amostra: 1 μL de gDNA 1 μL de cada iniciador 5 μL de tampão rTaq 10x 3 μL de MgCl2 a 25 mM 5 μL de dNTP a 2 mM 0,5 μL de rTaq (TOYOBO) 33,5 μL de ddH2O total de 50 μL

[00136] Condições de PCR: manter a 94°C por 2 min, um ciclo de 94°C por 45 s, 55°C por 45 seg e 72°C por 1 minuto e 30 segundos foi realizado 33 vezes e, finalmente, manutenção a 72°C por 5 min.

[00137] Como iniciadores de amplificação, foram usados os seguintes SY157 e SY182. O tamanho do produto de amplificação foi de 1554 bp.

[00138] SY157: TTCTGCTTGTCGGCCATGAT (SEQ ID NO: 47) SY182: AGGCAAGGCTTGACCGACAATT (SEQ ID NO: 48)

[00139] O produto amplificado foi cortado e purificado usando Fastgene. Em seguida, a clonagem de TA foi realizada com cada produto purificado usando o vetor pGEM-t easy, e Escherichia coli (JM109) foi transformada com o vetor. Em seguida, 24 colônias foram selecionadas de cada amostra (com seleção azul- branca), e o DNA plasmidial foi purificado por Mini prep (usando Fastgene).

[00140] Em seguida, a seguinte mistura de sequenciamento foi preparada e terceirizada para a Genewiz para obter informações sobre a sequência.

[00141] 2,5 μL de cada amostra

45 / 50 2,5 μL de iniciador SY157 (10 pmol/μL) 10 μL de ddH2O total de 15 μL

[00142] Por fim, as informações de sequência obtidas foram alinhadas usando Snapgene. Exemplo 1: Inserção da sequência de inserção no sítio alvo usando dCas9-CDA ou nCas9-CDA e DNA doador

[00143] A cepa de levedura em brotamento BY4741 foi submetida a dupla transformação com o vetor plasmidial 1525 (em SEQ ID NO: 4, a 6036ª base é g, a 6037ª base é c) ou 1526 (em SEQ ID NO: 4, a 6036ª base é c, a 6037ª base é a) e 1059 (SEQ ID NO: 5) ou 1149 (corresponde ao vetor no qual a sequência da 3890ª a 3909ª bases da sequência de SEQ ID NO: 5 é substituída por TCCAATAACGGAATCCAACT (SEQ ID NO: 6)), e a cepa foi selecionada em meio auxotrófico (SD-Leu-Ura). As células foram cultivadas durante a noite em meio de rafinose S-Leu-Ura a 2%. Elas foram diluídos 1/32 em meio de rafinose S- Leu-Ura a 2% + 0,02% de galactose e cultivadas durante a noite a 30°C. Elas foram identificados com diluição de 10 vezes em placa SD-Ura-Leu e SD-Ura-Leu + Canavanina. Dois dias depois, as colônias resistentes a Canavanina foram submetidas à análise de sequência. Como resultado, a inserção da mutação no sítio alvo foi confirmada (Fig. 2). Exemplo 2: Construção do sistema de avaliação recombinante

[00144] O vetor plasmidial 1548 (SEQ ID NO: 7) foi tratado com SmaI/HpaI para produzir um fragmento de DNA, a cepa BY4741 foi transformada com o fragmento e selecionada em meio SD-Ura. A análise de sequência confirmou a integração na região Ade1. Exemplo 3: Experimento de demonstração da reação de recombinação usando o sistema de avaliação recombinante

[00145] Qualquer um dos vetores de plasmídeo acima mencionados foi transformado em uma cepa experimental de demonstração e selecionado usando

46 / 50 meio SD-Leu-Ura. As células foram cultivadas durante a noite em meio de rafinose S-Leu-Ura a 2%. Elas foram diluídas 1/32 com S-Leu 2% de rafinose + 0,02% (ou 0,2%) de meio galactose, cultivados durante a noite a 30°C resultando em 5 gerações. Para gerar 20 gerações, a diluição 1/32 foi repetida 4 vezes no total. Elas foram identificadas na placa SD-Leu com diluição de 10 vezes e, dois dias depois, o número e a cor das colônias foram avaliados. Como resultado, colônias com função Ade1 restaurada e aparência branca apareceram frequentemente, indicando que a recombinação homóloga foi induzida no sítio alvo pelo método da presente invenção (Figura 4). Exemplo 4: Experimento de demonstração de knock-in ou knock-out pela presente invenção

[00146] A cepa de levedura em brotamento BY4741 foi duplamente transformada com o vetor de plasmídeo 1251 (SEQ ID NO: 8) e o vetor de gRNA 2x, e selecionada usando um meio auxotrófico (SD-Leu-Ura). As células foram cultivadas durante a noite em meio de rafinose S-Leu-Ura a 2%. As células foram diluídas 1/32 com meio de rafinose S-Leu-Ura a 2% + 0,2% de galactose e cultivadas durante a noite a 30°C. Elas foram identificados na diluição de 10 vezes em placas SD-Ura-Leu e SD-Ura-Leu (+ Canavanina). Dois dias depois, as colônias resistentes à Canavanina foram submetidas à análise de sequência. Como resultado, o knock-in foi realizado com alta eficiência pelo método da presente invenção (Fig. 6). Exemplo 5: Experimento de demonstração da reação recombinante em célula animal

[00147] Usando um oligo DNA de fita simples (70 bases de comprimento) (Tabela 1) como DNA doador, foi verificado se uma reação de recombinação ocorre ou não em células animais (células HEK293T). Um desenho esquemático do experimento é mostrado na Fig. 7. O vetor SY4 (H1_sgRNA, CMV_mEGFP) foi usado como plasmídeo repórter e o vetor SY45 (CMV_Cas9-PmCDA1, EF1_iRFP), o vetor SY45 (CMV_nCas9(D10A)-PmCDA1, EF1_iRFP), o vetor

47 / 50 SY45 (CMV_nCas9(H840A)-PmCDA1, EF1_iRFP), o vetor SY45 (CMV_dCas9- PmCDA1, EF1_iRFP), o vetor SY45 (CMV_Cas9, EF1_iRFP), o vetor SY45 (CMV_nCas9(D10A), EF1_iRFP), o vetor SY45 (CMV_nCas9(H840A), EF1_iRFP) ou o vetor SY45 (CMV_dCas9, EF1_iRFP) foi usado como o plasmídeo efetor EF1_iRFP9. Quando Fw2 ou Fw3 é usado como um DNA doador e quando a recombinação homóloga é realizada com sucesso, o códon de iniciação é gerado na sequência que codifica EGFP, resultando na expressão de EGFP. O Fw1 é um DNA doador projetado para evitar a ocorrência de um códon de iniciação em uma sequência que codifica EGFP, mesmo quando ocorre recombinação homóloga, e foi usado como um controle negativo. Fw3 é um braço homólogo de Fw2 no qual uma base é substituída (c → g), e foi usada para verificar se a recombinação homóloga ocorre mesmo quando o braço de homologia não é completamente homólogo à região adjacente do sítio alvo e se mutações em uma pluralidade de sítios diferentes podem ser introduzidas.

[00148] Os resultados são mostrados na Figura 8. Foi demonstrado que quando nCas9-pmCDA1 foi usado, a eficiência de recombinação homóloga foi maior do que quando nCas9 foi usado, e a eficiência da recombinação homóloga foi igual ou maior do que quando Cas9 foi usado. Além disso, foi observada recombinação homóloga significativa mesmo quando dCas9-pmCDA1 foi usado. Não houve diferença significativa na taxa de recombinação homóloga entre quando Fw2 foi usado como DNA doador e quando Fw3 foi usado como DNA doador. Exemplo 6: Verificação da influência do número de bases do DNA doador e do tipo de fita complementar (Sentido direto (Forward, Fw) ou Reverso (Reverse, Rv)) sobre a reação de recombinação homóloga

[00149] Usando um oligo DNA de fita simples (50 bases de comprimento) (Tabela 1) como DNA doador, foi verificado se uma reação de recombinação ocorre ou não em células animais (células HEK293T). Um desenho esquemático do experimento é mostrado na Fig. 9. O vetor SY4 (H1_sgRNA, CMV_mEGFP) foi usado como um plasmídeo repórter e o vetor SY45 (CMV_nCas9(D10A))-

48 / 50 PmCDA1, EF1_iRFP) ou o vetor SY45 (CMV_nCas9(H840A))-PmCDA1) foi usado como um plasmídeo efetor.

[00150] Os resultados são mostrados na Figura 10. Foi demonstrado que a recombinação homóloga é possível mesmo com um oligo DNA de fita simples com 50 bases de comprimento, a recombinação homóloga é possível com ambas as fitas complementares Fw e Rv, e que a recombinação homóloga é possível com ambas as versões de nCas9 de nCas9 (D10A) e nCas9 (H840A). Exemplo 7: Verificação do braço de homologia do DNA doador

[00151] Usando um DNA doador com um braço de homologia para uma região homóloga diferente (Tabela 1), foi verificada variação na eficiência da reação de recombinação homóloga devido à região homóloga. Um desenho esquemático do experimento é mostrado na Fig. 11. O vetor SY4 (H1_sgRNA, CMV_mEGFP) foi usado como um plasmídeo repórter e o vetor SY45 (CMV_nCas9(D10A))-PmCDA1, EF1_iRFP) ou o vetor SY45 (CMV_nCas9(H840A))-PmCDA1) foi usado como um plasmídeo efetor.

[00152] Os resultados são mostrados na Figura 12. Foi demonstrado que a eficiência da recombinação homóloga é melhorada projetando-se um DNA doador de modo que quando o sítio no qual uma “quebra” (nick) é gerada ou o sítio de desaminase de PmCDA1 na região homóloga é considerado como o centro, o braço de homologia no lado 3’ da região seria mais longo do que o braço de homologia no lado 5’. Exemplo 8: Verificação da modificação de DNA de célula de mamífero

[00153] Usando o mesmo gRNA e DNA doador que no experimento que usa Fw2 no Exemplo 5, a modificação do DNA foi verificada. Os resultados são mostrados na Tabela 2 a seguir. Foi demonstrado que quando nCas9 (D10A)- PmCDA1 e nCas9(H840A)-PmCDA1 foram usados, a ocorrência de Indel, um subproduto, é notavelmente suprimida em comparação com o uso de Cas9, ou seja, a citotoxicidade é reduzida. O termo “DNA” usado neste exemplo inclui tanto DNA genômico quanto DNA plasmidial.

49 / 50 [Tabela 2] vetor Substituição Sucesso/falha A substituição neste estudo mostra a substituição de base vista na sequência alvo de gRNA. Não foi encontrada mutação, como substituição de base C → T que, presumidamente, teria envolvimento na ação de CDA1.

[00154] Do exposto acima, quando nCas9-CDA é usado, a eficiência da recombinação homóloga é pelo menos tão alta quanto aquela usando Cas9 e evita a geração de Indel como um subproduto e alta citotoxicidade que ocorre ao usar Cas9. Portanto, um método que usa nCas9-CDA pode ser mais benéfico e útil do que o método convencional. Além disso, o nCas9-CDA pode atingir uma eficiência mais alta do que o nCas9 com a finalidade de evitar o problema mencionado acima que ocorre ao usar o Cas9.

[00155] Este pedido é baseado no Pedido de Patente Japonês No. 2018- 059073 depositado no Japão (data de depósito: 26 de março de 2018), cujo conteúdo é totalmente incorporado neste documento. [Aplicabilidade Industrial]

[00156] A presente invenção provê uma nova técnica de modificação de DNA usando uma enzima conversora de bases de ácido nucleico, como uma desaminase e similares, ou DNA glicosilase, em que a técnica não é limitada pelo tipo de mutação que pode ser introduzida ou pelo sítio da mutação, pode mudar a direção e a combinação de genes, e pode realizar knock-in de segmentos gênicos. A técnica de modificação de DNA da presente invenção é extremamente útil uma vez que ela pode modificar o sítio alvo sem clivar o DNA de fita dupla, o rearranjo

50 / 50 inesperado e a toxicidade que acompanham a clivagem são suprimidos, e o sítio alvo pode ser modificado muito mais eficientemente em comparação com os métodos convencionais.

Claims

1 /2 REIVINDICAÇÕES

1. Método para modificar um sítio alvo de um DNA de fita dupla de uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de colocar um complexo no qual um módulo de reconhecimento de sequências de ácidos nucleicos que se liga especificamente a uma sequência de nucleotídeos alvo selecionada em um DNA de fita dupla e uma enzima conversora de bases de ácido nucleico ou glicosilase de DNA estão ligadas, e um DNA doador contendo uma sequência de inserção em contato com o dito DNA de fita dupla, para substituir o sítio alvo com a sequência de inserção, ou para inserir a sequência de inserção no dito sítio alvo, sem clivar pelo menos uma fita do dito DNA de fita dupla no sítio alvo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o DNA doador compreende uma sequência homóloga a uma região adjacente ao sítio alvo.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o módulo de reconhecimento de sequências de ácidos nucleicos é selecionado a partir do grupo que consiste em um sistema CRISPR-Cas no qual pelo menos uma capacidade de clivagem de DNA da proteína efetora Cas é inativada, um motivo de dedo de zinco, um efetor TAL e um motivo PPR.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico é um sistema CRISPR-Cas no qual apenas uma das duas capacidades de clivagem de DNA da proteína efetora Cas é inativada.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o módulo de reconhecimento de sequência de ácido nucleico é um sistema CRISPR-Cas no qual ambas as capacidades de clivagem de DNA da proteína efetora Cas são inativadas.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a enzima conversora de base de ácido nucleico é uma

2 /2 desaminase.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a desaminase é citidina desaminase.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a citidina desaminase é PmCDA1.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o DNA de fita dupla é colocado em contato com o complexo ao introduzir um ácido nucleico que codifica o complexo na célula.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula procariótica ou uma célula eucariótica.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula microbiana.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula vegetal, uma célula de inseto ou uma célula animal.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a célula animal é uma célula de vertebrado.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a célula de vertebrado é uma célula de mamífero.