CN115725650A

CN115725650A - 实现a到c和/或a到t碱基突变的碱基编辑系统及其应用

Info

Publication number: CN115725650A
Application number: CN202110988933.6A
Authority: CN
Inventors: 陈亮; 李大力; 洪梦佳; 栾昌明
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2021-08-26
Filing date: 2021-08-26
Publication date: 2023-03-03
Also published as: WO2023024089A1

Abstract

本发明公开了一种实现A到C和/或A到T碱基突变的碱基编辑系统及其应用，采用3‑甲基腺嘌呤糖苷酶，与腺苷脱氨酶、催化活性受损的Cas9核酸酶融合构建碱基编辑器，首次实现基于腺嘌呤的颠换。并且本发明通过实验对比发现，小鼠来源的3‑甲基腺嘌呤糖苷酶与来源于大肠杆菌的腺苷脱氨酶TadA‑8e以及来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)活性受损的Cas9n融合构建AXBE，其催化腺嘌呤颠换的效果最好。这是单碱基基因编辑技术领域重大的一个技术创新，也将极大地促进基因治疗、细胞治疗、人类疾病模型制作以及在作物遗传育种等方面的应用。

Description

实现A到C和/或A到T碱基突变的碱基编辑系统及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种实现A到C和/或A到T碱基突变的碱基编辑系统及其应用。

背景技术

人类遗传病发生的本质是由于基因突变，60％左右的遗传疾病由单个碱基突变引起，传统的利用基因组编辑技术介导的同源重组进行纠正这类遗传病非常低效(0.1％-5％)。基于CRISPR系统衍生出来的单碱基编辑器是近年来新兴的高效碱基编辑技术，因不产生DNA双链断裂、无须重组模板、高效编辑等优势使其在基础研究和临床疾病治疗展示了巨大的应用前景。

经典的碱基编辑器主要分为胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，前者由活性受损的来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)spCas9n、大鼠来源的胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1和尿嘧啶糖苷酶抑制剂组成，其中Cas9蛋白以NGG作为PAM识别并特异结合DNA，紧接着在脱氨酶以及DNA修复的作用下，最终在NGG(21-23位)上游靶向序列20bp范围实现C·G-T·A的替换,编辑窗口主要位于4-8位，有望纠正14％人类致病性点突变；后者则是将细菌来源的TadA与spCas9融合，在定向进化和蛋白质工程化改造技术的辅助下，经历7轮进化最终获得可作用于单链DNA的腺嘌呤碱基编辑器ABE7.10，活性编辑区域主要位于4-7位，该系统在人类细胞中引起A·T-G·C的平均编辑效率约为53％，远高于利用同源重组介导碱基突变的效率，其产物纯度高达99.9％以及极低的indels(插入和缺失)发生，更重要的是人类致病性点突变约47％是由C·G突变为T·A所形成，而腺嘌呤碱基编辑器有望纠正近一半的病原性点突变，展现出其在突变碱基修改以及遗传病治疗的巨大潜力，目前ABE已广泛应用于动物模型制备和基因治疗。

无论是CBE还是ABE均只能实现碱基的转换，科学家在开发CBE的早期过程中，发现敲除细胞内尿嘧啶糖苷酶(UNG)或者去除胞嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)会产生C·G-to-G·C和C·G-to-A·T编辑副产物，即发生基于C的颠换。近期，科学家根据之前CBE产生的编辑副产物现象，将去除UGI的CBE融合不同类型UNG，DNA损伤修复蛋白或者跨损伤聚合酶等，开发出CGBE系列，有望治疗11％G·C to C·G的致病性点突变。

然而没有已报道的酶可直接将基因组DNA中的腺嘌呤(A)催化为胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)，而需要A-to-C和A-to-T来逆转的人类致病点突变占人类疾病相关的点突变近四分之一，特别是对于占比16％的A·T到C·G的颠换可纠正第二大最常见的致病性SNV，这也超出了经典CBE可以覆盖的疾病范围。

发明内容

本发明的目的在于提供一种实现A到C和/或A到T碱基突变的碱基编辑系统及其应用，采用3-甲基腺嘌呤糖苷酶，与腺苷脱氨酶、催化活性受损的Cas9核酸酶融合构建碱基编辑器，首次实现基于腺嘌呤的颠换，包括A突变为C以及A突变为T。

为了实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：

一种实现A到C和/或A到T碱基突变的基因编辑系统，包括腺苷脱氨酶TadA、Cas9核酸酶以及3-甲基腺嘌呤糖苷酶。

优选的，所述3-甲基腺嘌呤糖苷酶的基因序列如SEQ ID No.1-4任一个所示，所述3-甲基腺嘌呤糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5-8任一个所示，更加优选的，所述3-甲基腺嘌呤糖苷酶来源于人、大鼠、小鼠或枯草芽孢杆菌。

以上内容中涉及的氨基酸序列或核苷酸序列中，与本申请中所涉及序列的同源性在80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上的序列，和/或在本申请所涉及序列的基础上进行氨基酸残基或核苷酸的替换、删除或插入后的序列，且具有本申请所涉及序列具有相同或相近功能的序列，均在本申请的保护范围之内。

其中，腺苷脱氨酶TadA的来源包括大肠杆菌，金黄色葡萄球菌,酱油海洋杆菌和不动杆菌等，优选的，所述腺苷脱氨酶TadA来源自大肠杆菌；更优选的，大肠杆菌来源的TadA为TadA-8e。

所述Cas9核酸酶包括来源于酿酒酵母的spCas9、Cas9n以及其变体VQR-spCas9、VRER-spCas9、spRY和spNG，以及来源于金黄色葡萄球菌来源SaCas9及其突变体SaCas9-KKH、SaCas9-NG，也包括来源于毛螺菌科细菌来源LbCas12a和酸胺球菌属来源enAsCas12a，所述Cas9核酸酶还可用其它能特异识别DNA具备切割功能的核酸酶替代，优选的，所述Cas9核酸酶为Cas9n核酸酶，优选的，所述Cas9n核酸酶来源于酿脓链球菌。

本发明还公开了一种实现A到C和/或A到T碱基突变的基因编辑方法，所述方法包括如下步骤：

在受体中表达前述的腺苷脱氨酶、Cas9核酸酶和3-甲基腺嘌呤糖苷酶，从而对所述受体基因组中的靶基因进行碱基编辑，优选的，所述受体为真核细胞，更优选的，所述受体为动物细胞，更优选的，所述受体为人、大鼠、小鼠或枯草芽孢杆菌的细胞。

其中，所述在“在受体中表达腺苷脱氨酶、Cas9核酸酶和3-甲基腺嘌呤糖苷酶”是通过将所述腺苷脱氨酶的编码基因、所述Cas9核酸酶的编码基因以及所述3-甲基腺嘌呤糖苷酶的编码基因导入受体生物细胞中，使腺苷脱氨酶的编码基因Cas9核酸酶的编码基因以及所述3-甲基腺嘌呤糖苷酶的编码基因均得到表达，实现A突变为C和/或A突变为T。

更为具体地，A到C和/或A到T碱基突变的具体实现过程为：在Cas9核酸酶和腺苷脱氨酶的共同作用下，基因组内目标序列的腺嘌呤脱去氨基变为次黄嘌呤，通过3-甲基腺嘌呤糖苷酶识别/切除次黄嘌呤，最终该位点形成无嘌呤/嘧啶位点，最后在内源的DNA损伤修复介导下发生A到C和/或A到T的颠换。

另外，关于靶点的选用，并不受本发明具体实施例中所列举的靶点限制，凡是能够验证本发明基因编辑系统功能的靶点均可选用，优选的，实现A到C和A到T的编辑范围主要位于靶点基因(20个碱基序列)5`末端的第2-10位的位置，表示为A2-A10，即位于5`末端的第2-10个碱基位置的A可实现A到C或A到T的颠换。

另外，凡是包括上述基因编辑系统的产品也落入本发明的保护范围之内，所述产品包括试剂盒、药物组合物，但不限于此，只要运用到本发明的基因编辑系统的产品均属于本发明的保护范围。

另外，本发明所采用的细胞为常用293T细胞，也包括来源于人类及其它哺乳类动物的细胞，如HELA、U2OS、NIH3T3和N2A等。也包括来人源人类及其它哺乳类动物的配子及受精卵等。

本发明所使用的细胞为真核细胞基因编辑，也括非真核细胞，如原核和古生物等。也包括动物体内的能实现的编辑、治疗和基因表达调控等。

本发明中所用的AXBE组成为CMV-Tad8e-Cas9n-HDG4-BGH polyA，也包括能行使相对于AXBE更高效或者精准的A到C或者A到T的排列组合，也包括Tad蛋白嵌入cas9中间等其他位置变换。

所用的启动子元件为CMV，也包括其它类型的光谱启动子及组织特异型启动子，如CAG、PGK、EF1α、肌肉特异启动子Ctsk和肝脏特异性启动子Lp1等；所用的polyA为牛生长激素多腺苷酸化信号BGH polyA，也包括其它物种包括真核原核多腺苷酸化信号。

本发明实施例中所用的Tad为大肠杆菌来源tad，但不限于此，也包括来源其它物种，以及其它原核生物来源的tad。

本发明的优点：

本发明首次公开了一种实现A到C和/或A到T碱基突变的碱基编辑系统，采用3-甲基腺嘌呤糖苷酶，与腺苷脱氨酶、催化活性受损的Cas9核酸酶融合构建碱基编辑器，首次实现基于腺嘌呤的颠换。通过3-甲基腺嘌呤糖基化酶体内具有次黄嘌呤识别/切除能力，其和腺苷脱氨酶Tad-8e和Cas9n蛋白形成基因编辑系统，在Cas9n和腺苷脱氨酶Tad-8e的共同作用下，基因组内目标序列的腺嘌呤脱去氨基变为次黄嘌呤，通过3-甲基腺嘌呤糖苷酶切除次黄嘌呤，最终该位点形成无嘌呤/嘧啶位点，最后在内源的DNA损失修复介导下发生A到C和A到T的颠换。

本发明通过不同来源的DNA糖苷酶(HDGs)进行对比，结果发现，小鼠来源的3-甲基腺嘌呤糖苷酶与来源于大肠杆菌的单体腺苷脱氨酶Tad-8e、催化来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)活性受损的Cas9n融合构建AXBE，其催化腺嘌呤颠换的效果最好。首次在哺乳动物细胞实现基于腺嘌呤的颠换，即A突变为C以及A突变为T，实验结果显示，A·T到C·G的最高编辑效率为23.4％，A·T到T·A的最高编辑效率为12％，AXBE有望治疗16％C·G到A·T或7％T·A到A·T疾病相关的SNP，这是单碱基基因编辑技术领域重大的一个技术创新，也将极大地促进基因治疗、细胞治疗、人类疾病模型制作以及在作物遗传育种等方面的应用。

附图说明

图1是基于腺嘌呤实现颠换，即A突变为C和A突变为T的原理；

图2是9种不同HDGs与Tad-8e、cas9n融合设计以及HDG4不同位置融合设计；

图3是9个HDGs构建和对照ABE8e在293T上PD-1-sg4和PD-1-sg3靶点实现A的编辑对比；

图4是ABE8e、AH4、AH4-M和AH4-N在293T上5个靶点实现A的编辑对比；

图5是AXBE的质粒图谱；

图6是ABE8e和AXBE在293T上5个靶点实现A的编辑对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、系统发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑动物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。

此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。

“基因编辑”，Gene editing，是一种新兴的精确对生物体基因组特定靶序列进行修饰的基因功能技术。

“细胞转染”是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。

一.催化腺嘌呤颠换的3-甲基腺嘌呤糖苷酶的选择

1.1质粒设计及构建

1.1.1根据DNA碱基切除修复机制，我们推测切除腺嘌呤的脱氨产物次黄嘌呤(I)可以实现基于A的颠换(图1)，在Cas9核酸酶和腺苷脱氨酶的共同作用下，基因组内目标序列的腺嘌呤脱去氨基变为次黄嘌呤，通过3-甲基腺嘌呤糖苷酶识别/切除次黄嘌呤，最终该位点形成无嘌呤/嘧啶位点，最后在内源的DNA损伤修复介导下发生A到C和A到T的颠换。

我们将不同物种来源(人、大鼠、小鼠、枯草芽孢杆菌、酵母)的3-甲基腺嘌呤糖苷酶(Aag)和其他具备次黄嘌呤识别/切除能力的DNA糖苷酶(HDGs)(大肠杆菌来源的核酸内切酶V，巴克红曲菌来源的DNA糖苷酶)与大肠杆菌来源的Tad-8e、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)来源活性受损的spcas9n融合设计得到9种构建，分别命名为AH1、AH2、AH3、AH4、AH5、AH6、AH7、AH8、AH9(图2)。同时设计2个人源基因(PD-1)的内源性测试靶点PD-1-sg4和PD-1-sg3及其序列(表2)用于筛选评价。

1.1.2 9个HDGs序列按表1中的基因序列和氨基酸序列进行合成，以ABE8e为载体，之后进行无缝克隆组装。靶点即按表2进行合成两条oligo，正链加CACC，反链加上AAAC，连接至已经用BbsI酶切好的U6-sgRNA-EF1α-GFP上。

1.1.3将1.1.1与1.1.2中构建的质粒经sanger测序，确保完全正确。

表1所用的HDGs基因序列和氨基酸序列

表2所用靶点及序列

靶点名称	序列(5`-3`)
		PD-1-sg4	CTTCCACATGAGCGTGGTCAGGG
PD-1-sg3	GGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGG
		HBB 03	CACGTTCACCTTGCCCCACAGGG
EMX1-sg7	GGCCCCAGTGGCTGCTCTGGGGG
		FANCF-M-b	AAGTTCGCTAATCCCGGAACTGG
CCR5-sg1	TAATAATTGATGTCATAGATTGG
		EMX1-sg1	GCTCCCATCACATCAACCGGTGG
FANCF site 2	GCTGCAGAAGGGATTCCATGAGG
		CCR5-sg2	GTGAGTAGAGCGGAGGCAGGAGG
ABE site 27	CGGGCATCAGAATTCCCTGGAGG
		HEK site 6	CAAAGCAGGATGACAGGCAGGGG
CCR5-sg5	TTCAATGTAGACATCTATGTAGG
		hFGF6-sg2	GCAGGTTAATGTTACAGCCCTGG

表3所用靶点的鉴定引物

1.2细胞转染

第1天用293T细胞铺种24孔板；

(1)消化HEK293T细胞，按照2×105cell/孔接种96孔板。

注：细胞复苏后，一般需传代2次后方可用于转染实验。

第2天转染

(2)观察各孔细胞状态。

注：要求转染前细胞密度应为70％-90％，且状态正常。

(3)质粒转染量如下，以ABE8e作为对照；

1.1新构建质粒:U6-sgRNA-EF1α-GFP＝750ng:250ng

设置n＝3孔/组。

1.3基因组提取及扩增子文库的准备

转染后72h，用天根细胞基因组提取试剂盒(DP304)提取细胞基因组DNA。之后用Hitom试剂盒的操作流程，按照表3对所用的靶点设计相对应的鉴定引物，即在正向鉴定引物5`端加上搭桥序列5`-ggagtgagtacggtgtgc-3`，反向鉴定引物5`端加上搭桥序列5`-gagttggatgctggatgg-3`，即得到一轮PCR产物，之后利用一轮PCR产物作为模板，进行二轮PCR产物，后混在一起进行切胶回收纯化后进行送公司进行测序。

1.4深度测序结果分析与统计

利用BE-analyzer网站进分析深度测序结果，即统计A到C,A到T,A到G的编辑效率，并用graphpad prism 9.1.0进行统计作图。

根据深度测序结果发现，仅有来源于小鼠、大鼠和人的3-甲基腺嘌呤糖苷酶以及枯草芽孢杆菌来源的Aag具备突变A为C和T的能力，对照组ABE8e无法产生基于A的颠换，而融合小鼠来源Aag的构建体AH4展现出最优颠换能力，PD-1-sg4靶点引起A突变为C和A突变为T的效率分别为4.5％和4.3％，PD-1-sg3靶点产生A突变为C和A突变为T的效率分别为7.4％和5.5％(图3)。

二.AH4、AH4-M和AH4-N产生的腺嘌呤编辑情况对比

2.1质粒设计及构建

2.1.1以上的实验均是Aag融合在C端进行的，为一步研究小鼠来源Aag不同位置的摆放对产生A到C和A到T的影响，将Aag融合在中间端和N端，经无缝克隆组装获得AH4-M,AH4-N构建(表2)。同时设计5个来自于人的内源性靶点HBB 03、EMX1-sg7、FANCF-M-b、CCR5-sg1和EMX1-sg1进行测试(表2)，构建方法同1.1.2。

2.1.2将2.1.1中构建的质粒经sanger测序，确保完全正确。

2.2细胞转染

第1天用293T细胞铺种24孔板；

(1)消化HEK293T细胞，按照2×105cell/孔接种96孔板。

注：细胞复苏后，一般需传代2次后方可用于转染实验。

第2天转染

(2)观察各孔细胞状态。

注：要求转染前细胞密度应为70％-90％，且状态正常。

(3)质粒转染量如下,以ABE8e作为对照；

2.1中新构建的质粒:U6-sgRNA-EF1α-GFP＝750ng:250ng

设置n＝3孔/组。

2.3基因组提取及扩增子文库的准备

转染后72h，用天根细胞基因组提取试剂盒(DP304)提取细胞基因组DNA。之后用Hitom试剂盒的操作流程，设计相对应的鉴定引物见表3，即在正向鉴定引物5`端加上搭桥序列5`-ggagtgagtacggtgtgc-3`，反向鉴定引物5`端加上搭桥序列5`-gagttggatgctggatgg-3`，即得到一轮PCR产物，之后利用一轮PCR产物作为模板，进行二轮PCR产物，后混在一起进行切胶回收纯化后进行送公司进行测序。

2.4深度测序结果分析与统计

利用BE-analyzer网站进分析深度测序结果，即统计A到C,A到T,A到G的编辑效率,并用graphpad prism 9.1.0进行统计作图。

该实验同样以PD-1-sg4靶点和PD-1-sg3靶点进行评价，AH4-M,AH4-N产生A突变为C效率分别为4.3％和4.6％，产生A突变为T效率分别为3.6％和3.9％，AH4-M,AH4-N在这两靶点产生的A的颠换均低于AH4(图3)。为更客观公正评价Aag在不同位置对腺嘌呤执行颠换编辑的能力，再次设计另外5个内源性靶点再次验证，结果表明(图4)：对照组ABE8e在5个靶点均无法产生A到C和A到T的突变，对于AH4来说，在HBB 03,FANCF-M-b,CCR5-sg1三个内源性靶点展现最优的颠换效果，三个靶点A到C的最高编辑效率分别为7.8％、11.7％、8.8％，三个靶点A到T的最高编辑为7.5％、2.9％、4.6％，但在个别靶点上，AH4-M或者AH4-N表现最佳，如在EMX1-sg7靶点，AH4-M引起A到C的编辑效率达24.4％，催化A到T的编辑效率达12.8％，对于EMX1-sg1靶点，对于HBG-sg1靶点，AH4-N引起A到C的编辑效率可达10.4％，催化A到T的编辑效率达7.3％，总的来说，无论是Aag融合在C端还是中间端或者N端，均具有一定的编辑效率，在实际融合过程中，可以针对不同的靶点选择不同的融合端，结合上述7个靶点的编辑情况，我们选择更稳定的AH4作为最终的碱基编辑器，并命名为AXBE(组成为CMV-Tad8e-Cas9n-HDG4-BGH polyA，构建的质粒图谱如图5所示)，可在哺乳动物细胞中实现A·T到C·G以及A·T到T·A。

三.AXBE编辑特性的验证

3.1质粒设计及构建

3.1.1为进一步评价AXBE编辑特性，再次设计6个的内源性测试靶点FANCF site2、CCR5-sg2、ABE site 27、HEK site 6、CCR5-sg5和hFGF6-sg2(表2)，以ABE8e作为对照。

3.1.2将3.1.1中构建的质粒经sanger测序，确保完全正确。

3.2细胞转染

第1天用293T细胞铺种24孔板

(1)消化HEK293T细胞，按照2×105cell/孔接种96孔板。

注：细胞复苏后，一般需传代2次后方可用于转染实验。

第2天转染

(2)观察各孔细胞状态。

注：要求转染前细胞密度应为70％-90％，且状态正常。

(3)质粒转染量如下,以BE4max作为对照

3.1中新构建的质粒:U6-sgRNA-EF1α-GFP＝750ng:250ng

设置n＝3孔/组。

3.3基因组提取及扩增子文库的准备

Wu转染后72h，用天根细胞基因组提取试剂盒(DP304)提取细胞基因组DNA。之后用Hitom试剂盒的操作流程，设计相对应的鉴定引物见表3，即在正向鉴定引物5`端加上搭桥序列5`-ggagtgagtacggtgtgc-3`，反向鉴定引物5`端加上搭桥序列5`-gagttggatgctggatgg-3`，即得到一轮PCR产物，之后利用一轮PCR产物作为模板，进行二轮PCR产物，后混在一起进行切胶回收纯化后进行送公司进行测序。

3.4深度测序结果分析与统计

结果表明(图6)：AXBE在6个靶点的A到C的编辑效率(每个靶点取最高值)为5.5％-23.4％，6个靶点的A到C的平均编辑效率为15.3％，6个靶点的A到T的编辑效率(每个靶点取最高值)为3.5％-12％，6个靶点的A到T的平均编辑效率为7.6％，结合之前测试的7个内源性靶点，根据全部13个靶点编辑特性发现A到C和A到T编辑范围主要位于A2-A10(NGG记为21-23)。综上，AXBE可以哺乳动物细胞有效介导基于腺嘌呤的颠换，有望治疗16％C·G到A·T或7％T·A到A·T疾病相关的SNP，也将极大地促进人类疾病模型制作，作物遗传育种等方面的应用。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东师范大学

<120> 实现A到C和/或A到T碱基突变的碱基编辑系统及其应用

<130> 2021

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 891

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gtgacccccg ccctgcagat gaagaagccc aagcagttct gcagaagaat gggccagaag 60

aagcaaaggc ccgccagagc cggccaaccc catagcagct ctgacgccgc tcaggctcct 120

gccgagcaac cccacagctc gtcggacgcc gcccaggcac cgtgtcccag agaaagatgc 180

ctgggccccc ccaccacccc cggcccctac agaagcatct acttcagcag ccccaagggc 240

cacctgacca gactgggcct ggagttcttc gaccagcccg ccgtgcccct ggccagagcc 300

ttcctgggcc aggtgctggt gagaagactg cccaacggca ccgagctgag aggcagaatc 360

gtggagaccg aggcctacct gggccccgaa gatgaggccg cccacagcag aggcggcaga 420

cagaccccca gaaacagagg catgttcatg aagcccggca ccctgtacgt gtacatcatc 480

tacggcatgt acttctgcat gaacatcagc agccagggcg acggcgcctg cgtgctgctg 540

agagccctgg agcccctgga gggcctggag accatgagac agctgagaag caccctgaga 600

aagggcaccg ccagcagagt gctgaaggac agagagctgt gcagcggccc cagcaagctg 660

tgccaggccc tggccatcaa caagagcttc gaccagagag atctcgcgca agatgaagcg 720

gtatggttag agagaggccc cttagagcca agcgaacccg ccgtggtggc agccgccaga 780

gtgggtgttg gccacgccgg cgagtgggcc agaaagcccc tgagattcta cgtgagaggc 840

agcccctggg tgagcgtggt ggacagagtg gccgagcagg acacccaggc c 891

<210> 2

<211> 984

<212> DNA

<213> Rattus norvegicus

<400> 2

agaggccgtg gcggcacggc aagactgggc agaggaagcc tgaagcccgt aagcgtagtc 60

ctgcccgaca ccgagcaccc cgccttcccc ggcagaacac gaagacccgg aaatgccaga 120

gccggcagcc aagtgaccgg ctctagagag gtgggccaga tgcccgcccc cctgagcaga 180

aagatcggcc agaagaagca gcagctggcc cagagcgagc agcagcagac ccccaaggag 240

agactgagca gcacccccgg cctgctgaga agcatctact tcagcagccc cgaggacaga 300

cccgccagac tggggcccga gtatttcgac cagcccgccg tgaccctggc cagagccttc 360

ctgggccagg tgctggtgag aagactggcc gacggcaccg agctgagagg cagaatcgtg 420

gagaccgagg catatctggg ccccgaagat gaggcggctc acagcagagg gggcaggcaa 480

acccccagaa acagaggcat gttcatgaag cccggcaccc tgtacgtgta cctgatctac 540

ggcatgtact tctgcctgaa cgtatcctcc cagggcgcag gtgcgtgtgt gctgctgaga 600

gccctggagc ccctggaggg cctggagacc atgagacagc tgagaaacag cctgagaaag 660

agcaccgtgg gcagaagcct gaaggacaga gagctgtgca acggccccag caagctgtgc 720

caggccctgg ccatcgacaa gagcttcgac cagagagact tagcccagga cgaggctgtg 780

tggctggaac acgggcccct ggaaagcagc agcccggcgg tggtggccgc tgccagaatc 840

ggcatcggcc acgccggcga gtggacccag aagcccctga gattctacgt gcagggcagc 900

ccctgggtga gcgtcgtaga cagagtggcc gagcagatgt accagcccca gcagaccgcc 960

tgcagcgact gcagcaaggt gaag 984

<210> 3

<211> 996

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 3

ccggcgcggg gcggctcagc ccgtccaggg agaggcgcac tgaagcccgt gagcgtgacc 60

ctgctgcccg acaccgagca gccccccttc ttaggcagag cgcgtagacc tggcaatgct 120

agagcgggga gcctggtgac aggataccac gaggtgggcc agatgcccgc ccccctgagc 180

agaaagatcg gccagaagaa gcagagactg gccgatagcg agcagcagca gacccccaag 240

gagagactgc tgagcacccc cggcctgaga agaagcatct acttcagcag ccccgaggac 300

cacagcggca gactgggccc agagtttttc gaccagcccg ccgtgaccct ggccagagcc 360

ttcctgggcc aggtgctggt gagaagactg gccgacggca ccgagctgag aggcagaatc 420

gtggagaccg aggcctactt gggacccgag gacgaggccg cccacagcag aggaggcaga 480

cagaccccca gaaacagagg catgttcatg aagcccggca ccctgtacgt gtacctgatc 540

tacggcatgt acttctgctt gaacgtgagc tctcagggcg ccggcgcctg cgtactcctc 600

agagccctgg agcccctgga gggcctggag accatgagac agctgagaaa cagcctgaga 660

aagagcaccg tgggcagaag cctgaaggac agagagctgt gcagcggccc cagcaagctg 720

tgccaggccc tggccatcga caagagcttc gaccagagag acttggcgca agatgacgcc 780

gtgtggctgg aacacgggcc cttggagagc agcagcccag ccgtagtggt ggcggccgcc 840

agaatcggca tcggccacgc cggcgagtgg acccagaagc ccctgagatt ctacgtgcag 900

ggcagcccct gggtgagcgt ggtggacaga gtggccgagc agatggacca gccccagcag 960

accgcctgca gcgagggcct gctgatcgtg cagaag 996

<210> 4

<211> 585

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 4

accagagaga agaaccccct gcccatcacc ttctaccaga agaccgccct ggagctggcc 60

cccagcctgc tgggctgcct gctggtgaag gagaccgacg agggcaccgc cagcggctac 120

atcgtggaga ccgaggccta catgggcgcc ggcgacagag ccgcccacag cttcaacaac 180

agaagaacca agagaaccga gatcatgttc gccgaggccg gcagagtgta cacctacgtg 240

atgcacaccc acaccctgct gaacgtggtg gccgccgagg aggacgtgcc ccaggccgtg 300

ctgatcagag ccatcgagcc ccacgagggc cagctgctga tggaggagag aagacccggc 360

agaagcccca gagagtggac caacggcccc ggcaagctga ccaaggccct gggcgtgacc 420

atgaacgact acggcagatg gatcaccgag cagcccctgt acatcgagag cggctacacc 480

cccgaggcca tcagcaccgg ccccagaatc ggcatcgaca acagcggcga ggccagagac 540

tacccctgga gattctgggt gaccggcaac agatacgtga gcaga 585

<210> 5

<211> 297

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Val Thr Pro Ala Leu Gln Met Lys Lys Pro Lys Gln Phe Cys Arg Arg

1 5 10 15

Met Gly Gln Lys Lys Gln Arg Pro Ala Arg Ala Gly Gln Pro His Ser

20 25 30

Ser Ser Asp Ala Ala Gln Ala Pro Ala Glu Gln Pro His Ser Ser Ser

35 40 45

Asp Ala Ala Gln Ala Pro Cys Pro Arg Glu Arg Cys Leu Gly Pro Pro

50 55 60

Thr Thr Pro Gly Pro Tyr Arg Ser Ile Tyr Phe Ser Ser Pro Lys Gly

65 70 75 80

His Leu Thr Arg Leu Gly Leu Glu Phe Phe Asp Gln Pro Ala Val Pro

85 90 95

Leu Ala Arg Ala Phe Leu Gly Gln Val Leu Val Arg Arg Leu Pro Asn

100 105 110

Gly Thr Glu Leu Arg Gly Arg Ile Val Glu Thr Glu Ala Tyr Leu Gly

115 120 125

Pro Glu Asp Glu Ala Ala His Ser Arg Gly Gly Arg Gln Thr Pro Arg

130 135 140

Asn Arg Gly Met Phe Met Lys Pro Gly Thr Leu Tyr Val Tyr Ile Ile

145 150 155 160

Tyr Gly Met Tyr Phe Cys Met Asn Ile Ser Ser Gln Gly Asp Gly Ala

165 170 175

Cys Val Leu Leu Arg Ala Leu Glu Pro Leu Glu Gly Leu Glu Thr Met

180 185 190

Arg Gln Leu Arg Ser Thr Leu Arg Lys Gly Thr Ala Ser Arg Val Leu

195 200 205

Lys Asp Arg Glu Leu Cys Ser Gly Pro Ser Lys Leu Cys Gln Ala Leu

210 215 220

Ala Ile Asn Lys Ser Phe Asp Gln Arg Asp Leu Ala Gln Asp Glu Ala

225 230 235 240

Val Trp Leu Glu Arg Gly Pro Leu Glu Pro Ser Glu Pro Ala Val Val

245 250 255

Ala Ala Ala Arg Val Gly Val Gly His Ala Gly Glu Trp Ala Arg Lys

260 265 270

Pro Leu Arg Phe Tyr Val Arg Gly Ser Pro Trp Val Ser Val Val Asp

275 280 285

Arg Val Ala Glu Gln Asp Thr Gln Ala

290 295

<210> 6

<211> 328

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 6

Arg Gly Arg Gly Gly Thr Ala Arg Leu Gly Arg Gly Ser Leu Lys Pro

1 5 10 15

Val Ser Val Val Leu Pro Asp Thr Glu His Pro Ala Phe Pro Gly Arg

20 25 30

Thr Arg Arg Pro Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ser Gln Val Thr Gly Ser

35 40 45

Arg Glu Val Gly Gln Met Pro Ala Pro Leu Ser Arg Lys Ile Gly Gln

50 55 60

Lys Lys Gln Gln Leu Ala Gln Ser Glu Gln Gln Gln Thr Pro Lys Glu

65 70 75 80

Arg Leu Ser Ser Thr Pro Gly Leu Leu Arg Ser Ile Tyr Phe Ser Ser

85 90 95

Pro Glu Asp Arg Pro Ala Arg Leu Gly Pro Glu Tyr Phe Asp Gln Pro

100 105 110

Ala Val Thr Leu Ala Arg Ala Phe Leu Gly Gln Val Leu Val Arg Arg

115 120 125

Leu Ala Asp Gly Thr Glu Leu Arg Gly Arg Ile Val Glu Thr Glu Ala

130 135 140

Tyr Leu Gly Pro Glu Asp Glu Ala Ala His Ser Arg Gly Gly Arg Gln

145 150 155 160

Thr Pro Arg Asn Arg Gly Met Phe Met Lys Pro Gly Thr Leu Tyr Val

165 170 175

Tyr Leu Ile Tyr Gly Met Tyr Phe Cys Leu Asn Val Ser Ser Gln Gly

180 185 190

Ala Gly Ala Cys Val Leu Leu Arg Ala Leu Glu Pro Leu Glu Gly Leu

195 200 205

Glu Thr Met Arg Gln Leu Arg Asn Ser Leu Arg Lys Ser Thr Val Gly

210 215 220

Arg Ser Leu Lys Asp Arg Glu Leu Cys Asn Gly Pro Ser Lys Leu Cys

225 230 235 240

Gln Ala Leu Ala Ile Asp Lys Ser Phe Asp Gln Arg Asp Leu Ala Gln

245 250 255

Asp Glu Ala Val Trp Leu Glu His Gly Pro Leu Glu Ser Ser Ser Pro

260 265 270

Ala Val Val Ala Ala Ala Arg Ile Gly Ile Gly His Ala Gly Glu Trp

275 280 285

Thr Gln Lys Pro Leu Arg Phe Tyr Val Gln Gly Ser Pro Trp Val Ser

290 295 300

Val Val Asp Arg Val Ala Glu Gln Met Tyr Gln Pro Gln Gln Thr Ala

305 310 315 320

Cys Ser Asp Cys Ser Lys Val Lys

325

<210> 7

<211> 332

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Pro Ala Arg Gly Gly Ser Ala Arg Pro Gly Arg Gly Ala Leu Lys Pro

1 5 10 15

Val Ser Val Thr Leu Leu Pro Asp Thr Glu Gln Pro Pro Phe Leu Gly

20 25 30

Arg Ala Arg Arg Pro Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ser Leu Val Thr Gly

35 40 45

Tyr His Glu Val Gly Gln Met Pro Ala Pro Leu Ser Arg Lys Ile Gly

50 55 60

Gln Lys Lys Gln Arg Leu Ala Asp Ser Glu Gln Gln Gln Thr Pro Lys

65 70 75 80

Glu Arg Leu Leu Ser Thr Pro Gly Leu Arg Arg Ser Ile Tyr Phe Ser

85 90 95

Ser Pro Glu Asp His Ser Gly Arg Leu Gly Pro Glu Phe Phe Asp Gln

100 105 110

Pro Ala Val Thr Leu Ala Arg Ala Phe Leu Gly Gln Val Leu Val Arg

115 120 125

Arg Leu Ala Asp Gly Thr Glu Leu Arg Gly Arg Ile Val Glu Thr Glu

130 135 140

Ala Tyr Leu Gly Pro Glu Asp Glu Ala Ala His Ser Arg Gly Gly Arg

145 150 155 160

Gln Thr Pro Arg Asn Arg Gly Met Phe Met Lys Pro Gly Thr Leu Tyr

165 170 175

Val Tyr Leu Ile Tyr Gly Met Tyr Phe Cys Leu Asn Val Ser Ser Gln

180 185 190

Gly Ala Gly Ala Cys Val Leu Leu Arg Ala Leu Glu Pro Leu Glu Gly

195 200 205

Leu Glu Thr Met Arg Gln Leu Arg Asn Ser Leu Arg Lys Ser Thr Val

210 215 220

Gly Arg Ser Leu Lys Asp Arg Glu Leu Cys Ser Gly Pro Ser Lys Leu

225 230 235 240

Cys Gln Ala Leu Ala Ile Asp Lys Ser Phe Asp Gln Arg Asp Leu Ala

245 250 255

Gln Asp Asp Ala Val Trp Leu Glu His Gly Pro Leu Glu Ser Ser Ser

260 265 270

Pro Ala Val Val Val Ala Ala Ala Arg Ile Gly Ile Gly His Ala Gly

275 280 285

Glu Trp Thr Gln Lys Pro Leu Arg Phe Tyr Val Gln Gly Ser Pro Trp

290 295 300

Val Ser Val Val Asp Arg Val Ala Glu Gln Met Asp Gln Pro Gln Gln

305 310 315 320

Thr Ala Cys Ser Glu Gly Leu Leu Ile Val Gln Lys

325 330

<210> 8

<211> 195

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 8

Thr Arg Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ile Thr Phe Tyr Gln Lys Thr Ala

1 5 10 15

Leu Glu Leu Ala Pro Ser Leu Leu Gly Cys Leu Leu Val Lys Glu Thr

20 25 30

Asp Glu Gly Thr Ala Ser Gly Tyr Ile Val Glu Thr Glu Ala Tyr Met

35 40 45

Gly Ala Gly Asp Arg Ala Ala His Ser Phe Asn Asn Arg Arg Thr Lys

50 55 60

Arg Thr Glu Ile Met Phe Ala Glu Ala Gly Arg Val Tyr Thr Tyr Val

65 70 75 80

Met His Thr His Thr Leu Leu Asn Val Val Ala Ala Glu Glu Asp Val

85 90 95

Pro Gln Ala Val Leu Ile Arg Ala Ile Glu Pro His Glu Gly Gln Leu

100 105 110

Leu Met Glu Glu Arg Arg Pro Gly Arg Ser Pro Arg Glu Trp Thr Asn

115 120 125

Gly Pro Gly Lys Leu Thr Lys Ala Leu Gly Val Thr Met Asn Asp Tyr

130 135 140

Gly Arg Trp Ile Thr Glu Gln Pro Leu Tyr Ile Glu Ser Gly Tyr Thr

145 150 155 160

Pro Glu Ala Ile Ser Thr Gly Pro Arg Ile Gly Ile Asp Asn Ser Gly

165 170 175

Glu Ala Arg Asp Tyr Pro Trp Arg Phe Trp Val Thr Gly Asn Arg Tyr

180 185 190

Val Ser Arg

195

Claims

1.一种实现A到C和/或A到T碱基突变的基因编辑系统，其特征在于，包括腺苷脱氨酶TadA、Cas9核酸酶以及3-甲基腺嘌呤糖苷酶。

2.根据权利要求1所述的实现A到C和/或A到T碱基突变的基因编辑系统，其特征在于，所述3-甲基腺嘌呤糖苷酶的基因序列如SEQ ID No.1-4任一个所示。

3.根据权利要求1所述的实现A到C和/或A到T碱基突变的基因编辑系统，其特征在于，所述3-甲基腺嘌呤糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5-8任一个所示。

4.根据权利要求1所述的实现A到C和/或A到T碱基突变的基因编辑系统，其特征在于，所述3-甲基腺嘌呤糖苷酶来源于人、大鼠、小鼠或枯草芽孢杆菌。

5.根据权利要求1所述的实现A到C和/或A到T碱基突变的基因编辑系统，其特征在于，所述腺苷脱氨酶TadA的来源包括大肠杆菌，金黄色葡萄球菌,酱油海洋杆菌和不动杆菌，优选的，所述腺苷脱氨酶TadA来源自大肠杆菌；更优选的，大肠杆菌来源的TadA为TadA-8e。

所述Cas9核酸酶包括来源于酿酒酵母的spCas9、Cas9n以及其变体VQR-spCas9、VRER-spCas9、spRY和spNG，以及来源于金黄色葡萄球菌的SaCas9及其突变体SaCas9-KKH、SaCas9-NG，也包括来源于毛螺菌科细菌的LbCas12a和来源于酸胺球菌属的enAsCas12a，所述Cas9核酸酶还可用其它能特异识别DNA具备切割功能的核酸酶替代，优选的，所述Cas9核酸酶为Cas9n核酸酶，优选的，所述Cas9n核酸酶来源于酿脓链球菌。

6.一种实现A到C和/或A到T碱基突变的基因编辑方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

在受体中表达权利要求1-5任一项所述的腺苷脱氨酶、Cas9核酸酶和3-甲基腺嘌呤糖苷酶，从而对所述受体基因组中的靶基因进行碱基编辑，优选的，所述受体为真核细胞，更优选的，所述受体为动物细胞，更优选的，所述受体为人、大鼠、小鼠或枯草芽孢杆菌的细胞。

7.根据权利要求6所述的基因编辑方法，其特征在于，所述在“在受体中表达腺苷脱氨酶、Cas9核酸酶和3-甲基腺嘌呤糖苷酶”是通过将所述腺苷脱氨酶的编码基因、所述Cas9核酸酶的编码基因以及所述3-甲基腺嘌呤糖苷酶的编码基因导入受体生物细胞中，使腺苷脱氨酶的编码基因，Cas9核酸酶的编码基因以及所述3-甲基腺嘌呤糖苷酶的编码基因均得到表达，实现A突变为C和/或A突变为T。

8.根据权利要求6所述的基因编辑方法，其特征在于，A到C和/或A到T碱基突变的具体实现过程为：在Cas9核酸酶和腺苷脱氨酶的共同作用下，基因组内目标序列的腺嘌呤脱去氨基变为次黄嘌呤，通过3-甲基腺嘌呤糖苷酶识别/切除次黄嘌呤，最终该位点形成无嘌呤/嘧啶位点，最后在内源的DNA损伤修复介导下发生A到C和/或A到T的颠换，优选的，对靶基因的编辑范围为A2-A10。

9.包含权利要求1-5任一项所述的基因编辑系统的产品，所述产品包括试剂盒和药物组合物。

10.权利要求9所述的产品在实现A到C和/或A到T碱基突变中的应用。