JP6727680B2 - 細胞の有する二本鎖dnaの標的部位を改変する方法 - Google Patents
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Description
[1] 細胞の有する二本鎖DNAの標的部位を改変する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素又はDNAグリコシラーゼとが結合した複合体、及び挿入配列を含むドナーDNAを該二本鎖DNAと接触させ、該標的部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的部位を該挿入配列に置換する、又は該標的部位に該挿入配列を挿入する工程を含む、方法。
[2] 前記ドナーDNAが、標的部位の隣接領域に相同な配列を含む、[1]に記載の方法。
[3] 前記核酸配列認識モジュールが、Casエフェクタータンパク質の少なくとも1つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフからなる群より選択される、[1]又は[2]に記載の方法。
[4] 前記核酸配列認識モジュールが、Casエフェクタータンパク質の2つのDNA切断能のうちの一方のみのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5] 前記核酸配列認識モジュールが、Casエフェクタータンパク質の両方のDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[6] 前記核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7] 前記デアミナーゼがシチジンデアミナーゼである、[6]に記載の方法。
[8] 前記シチジンデアミナーゼがPmCDA1である、[7]に記載の方法。
[9] 二本鎖DNAと複合体との接触が、該細胞への、該複合体をコードする核酸の導入により行われる、[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10] 前記細胞が原核生物細胞又は真核生物細胞である、[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11] 前記細胞が微生物細胞である、[10]に記載の方法。
[12] 前記細胞が植物細胞、昆虫細胞又は動物細胞である、[10]に記載の方法。
[13] 前記動物細胞が脊椎動物細胞である、[12]に記載の方法。
[14] 前記脊椎動物細胞が哺乳類動物細胞である、[13]に記載の方法。
また、「ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低い」とは、細胞の生存に影響を与えない程度に細胞毒性が抑えられる頻度でしか、ひずみのない二重らせん構造のDNAを形成する領域内での脱塩基反応を起こさないことを意味する。ここで「ひずみのない二重らせん構造のDNA」とは、強固な二重らせん構造を形成した状態にあること(即ち、unrelaxed double-helical DNA(又は単にunrelaxed DNAともいう))を意味し、対形成する塩基同士が完全に解離した一本鎖DNAの状態のみならず、塩基対は形成しているものの二重らせん構造がほどけた緩んだ二本鎖(relaxed double-stranded DNA)の状態のものも含まれない。ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼとしては、生来的にひずみのない二重らせん構造のDNAに対する反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼや、野生型に比べてひずみのない二重らせん構造のDNAに対する反応性を低下させる変異が導入された変異DNAグリコシラーゼ等が挙げられる。さらに、2つの断片に分断されたDNAグリコシラーゼであって、それぞれの断片が2つに分断された核酸配列認識モジュールのいずれか一方と結合して2つの複合体を形成し、両複合体がリフォールディングすると該核酸配列認識モジュールは標的ヌクレオチド配列と特異的に結合することができ、該特異的な結合によって該DNAグリコシラーゼが脱塩基反応を触媒することが可能となるようにデザインされたスプリット酵素であるDNAグリコシラーゼも、本発明における「ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼ」に包含される。
従って、核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素等とは、それらの融合タンパク質をコードする核酸として、あるいは、結合ドメインやインテイン等を利用してタンパク質に翻訳後、宿主細胞内で複合体を形成し得るような形態で、それらをそれぞれコードする核酸として調製することが好ましい。ここで核酸は、DNAであってもRNAであってもよい。DNAの場合は、好ましくは二本鎖DNAであり、宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下に配置した発現ベクターの形態で提供される。RNAの場合は、好ましくは一本鎖RNAである。
核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素等とが結合した本発明の複合体は、DNA二重鎖切断(DSB)を伴わないため、毒性の低いゲノム編集が可能であり、本発明の方法は幅広い生物材料に適用することができる。従って、核酸配列認識モジュール及び/又は核酸塩基変換酵素等をコードする核酸が導入される細胞は、原核生物である大腸菌などの細菌や下等真核生物である酵母などの微生物の細胞から、ヒト等の哺乳動物を含む脊椎動物、昆虫、植物など高等真核生物の細胞にいたるまで、あらゆる生物種の細胞をも包含し得る。
核酸塩基変換酵素等をコードするDNA(即ち、核酸塩基変換酵素をコードするDNA又はDNAグリコシラーゼをコードするDNA)も、同様に、使用する酵素のcDNA配列情報をもとにオリゴDNAプライマーを合成し、当該酵素を産生する細胞より調製した全RNAもしくはmRNA画分を鋳型として用い、RT-PCR法によって増幅することにより、クローニングすることができる。例えば、ヤツメウナギのPmCDA1をコードするDNAは、NCBIデータベースに登録されているcDNA配列(accession No. EF094822)をもとに、CDSの上流及び下流に対して適当なプライマーを設計し、ヤツメウナギ由来mRNAからRT-PCR法によりクローニングできる。また、ヒトAIDをコードするDNAは、NCBIデータベースに登録されているcDNA配列(accession No. AB040431)をもとに、CDSの上流及び下流に対して適当なプライマーを設計し、例えばヒトリンパ節由来mRNAからRT-PCR法によりクローニングできる。また、ドナーDNAも、標的部位の配列情報等に基づき、上記と同様にクローニングできる。
クローン化されたDNAは、そのまま、または所望により制限酵素で消化するか、適当なリンカー及び/又は核移行シグナル(目的の二本鎖DNAがミトコンドリアや葉緑体DNAの場合は、各オルガネラ移行シグナル)を付加した後に、核酸配列認識モジュールをコードするDNAとライゲーションして、融合タンパク質をコードするDNAを調製することができる。あるいは、核酸配列認識モジュールをコードするDNAと、核酸塩基変換酵素等をコードするDNAに、それぞれ結合ドメインもしくはその結合パートナーをコードするDNAを融合させるか、両DNAに分離インテインをコードするDNAを融合させることにより、核酸配列認識変換モジュールと核酸塩基変換酵素等とが宿主細胞内で翻訳された後に複合体を形成できるようにしてもよい。これらの場合も、所望により一方もしくは両方のDNAの適当な位置に、リンカー及び/又は核移行シグナルを連結することができる。また、ドナーDNAは、単一DNAとして作製してもよいし、核酸配列認識モジュール及び/又は核酸塩基変換酵素等をコードする核酸と単一なDNAとして提供されてもよい。
また、標的ヌクレオチド配列とPAM配列以外の部位を標的部位とする場合は、改変後もこれらの配列が残り、核酸改変酵素等により核酸塩基変換反応又は脱塩基反応が生じる可能性があるため、これらの配列が除かれるようにドナーDNAを設計するか、ホモロジーアーム上の標的ヌクレオチド配列又はPAM配列に、サイレント変異を導入することが好ましい。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC13);枯草菌由来のプラスミド(例、pUB110,pTP5,pC194);酵母由来プラスミド(例、pSH19,pSH15);昆虫細胞発現プラスミド(例:pFast-Bac);動物細胞発現プラスミド(例:pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo);λファージなどのバクテリオファージ;バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター(例:BmNPV、AcNPV);レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。DSBを伴う従来法では毒性のために宿主細胞の生存率が著しく低下する場合があるので、誘導プロモーターを使用して誘導開始までに細胞数を増やしておくことが望ましいが、本発明の核酸改変酵素複合体を発現させても十分な細胞増殖が得られるので、構成プロモーターも制限なく使用することができる。
例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーター、RSV(ラウス肉腫ウイルス)プロモーター、MoMuLV(モロニーマウス白血病ウイルス)LTR、HSV-TK(単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)プロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
宿主が大腸菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、Gal1/10プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
宿主が植物細胞である場合、CaMV35Sプロモーター、CaMV19Sプロモーター、NOSプロモーターなどが好ましい。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,60,160 (1968)〕,エシェリヒア・コリJM103〔Nucleic Acids Research,9,309 (1981)〕,エシェリヒア・コリJA221〔Journal of Molecular Biology,120,517 (1978)〕,エシェリヒア・コリHB101〔Journal of Molecular Biology,41,459 (1969)〕,エシェリヒア・コリC600〔Genetics,39,440 (1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis)MI114〔Gene,24,255 (1983)〕,バチルス・サブチルス207-21〔Journal of Biochemistry,95, 87 (1984)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)AH22,AH22R-,NA87-11A,DKD-5D,20B-12、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913,NCYC2036,ピキア・パストリス(Pichia pastoris)KM71などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫、ショウジョウバエ、コオロギなどが用いられる〔Nature,315,592 (1985)〕。
大腸菌は、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69,2110 (1972)やGene,17,107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、Molecular & General Genetics,168,111 (1979)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
酵母は、例えば、Methods in Enzymology,194,182-187 (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75,1929 (1978)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、Bio/Technology,6,47-55 (1988)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊8 新細胞工学実験プロトコール,263-267 (1995)(秀潤社発行)、Virology,52,456 (1973)に記載の方法に従ってベクター導入することができる。
例えば、大腸菌またはバチルス属菌を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが;窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が;無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。
大腸菌を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β-インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。大腸菌の培養は、通常約15〜約43℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
バチルス属菌の培養は、通常約30〜約40℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
酵母を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー(Burkholder)最小培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77,4505 (1980)〕や0.5%カザミノ酸を含有するSD培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81,5330 (1984)〕などが挙げられる。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。培養は、通常約20℃〜約35℃で行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
昆虫細胞または昆虫を培養する場合の培地としては、例えばGrace's Insect Medium〔Nature,195,788 (1962)〕に非働化した10%ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6.2〜約6.4である。培養は、通常約27℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
動物細胞を培養する場合の培地としては、例えば、約5〜約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地(MEM)〔Science,122,501 (1952)〕,ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)〔Virology,8,396 (1959)〕,RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association,199,519 (1967)〕,199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73,1 (1950)〕などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6〜約8である。培養は、通常約30℃〜約40℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
植物細胞を培養する培地としては、MS培地、LS培地、B5培地などが用いられる。培地のpHは好ましくは約5〜約8である。培養は、通常約20℃〜約30℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素等との複合体、即ち核酸改変酵素複合体を細胞内で発現させることができる。
これに対し、CRISPR-Casシステムは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的なガイドRNAにより目的の二本鎖DNAの配列を認識するので、標的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成し得るオリゴDNAを合成するだけで、任意の配列を標的化することができる。
従って、本発明のより好ましい実施態様においては、核酸配列認識モジュールとして、Casエフェクタータンパク質の1つのみ、又は両方のDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム(CRISPR-変異Cas)が用いられる。
あるいはCasエフェクタータンパク質をコードするDNAは、核酸配列認識モジュールをコードするDNAや核酸塩基変換酵素をコードするDNAについて上記したのと同様の方法により、化学合成又はPCR法もしくはGibson Assembly法との組み合わせで、用いる宿主細胞での発現に適したコドン使用を有するDNAとして構築することもできる。
ここで「標的鎖」とは、標的ヌクレオチド配列のcrRNAとハイブリッド形成する方の鎖を意味し、その反対鎖で標的鎖とcrRNAとのハイブリッド形成により一本鎖状になる鎖を「非標的鎖(non-targeted strand)」と呼ぶこととする。標的ヌクレオチド配列を片方の鎖で表現する場合(例えばPAM配列を表記する場合や、標的ヌクレオチド配列とPAMとの位置関係を表す場合等)、非標的鎖の配列で代表させるものとする。
温度感受性変異を利用する場合、例えば、ベクターの自律複製に必要なタンパク質の温度感受性変異体を、本発明の核酸改変酵素複合体をコードするDNAを含むベクターに搭載することにより、該核酸改変酵素複合体の発現後、速やかに自律複製が出来なくなり、細胞分裂に伴って該ベクターは自然に脱落する。このような温度感受性変異タンパク質としては、pSC101 oriの複製に必要なRep101 oriの温度感受性変異体が挙げられるが、これに限定されない。Rep101 ori (ts)は30℃以下(例、28℃)では、pSC101 oriに作用してプラスミドの自律複製を可能にするが、37℃以上(例、42℃)になると機能を失い、プラスミドは自律複製できなくなる。従って、上記λファージのcIリプレッサー(ts)と併用することで、本発明の核酸改変酵素複合体の一過的発現と、プラスミド除去とを、同時に行うことができる。
出芽酵母Saccharomyces cerevisiae BY4741株(ロイシン及びウラシル要求性)を用い、標準的なYPDA培地ないしSD培地の栄養要求性に合わせたDropout組成で培養した。培養は25℃から30℃の間で、寒天プレートでの静置培養または液体培地での振とう培養を行った。形質転換は酢酸リチウム法を用い、適切な栄養要求性に合わせたSD培地で選抜を行った。ガラクトースによる発現誘導には、適切なSD培地で一晩予備培養した後、炭素源を2%グルコースから2%ラフィノースに代えたSR培地に植え継いで一晩培養、さらに炭素源を0.2%ガラクトースに代えたSGal培地に植え継いで3時間から二晩程度培養して発現誘導を行った。
生存細胞数及びCan1変異率の測定には、細胞懸濁液をSDプレート培地及びSD-Arg+60mg/l Canavanineプレート培地あるいはSD+300mg/l Canavanineプレート培地に適宜希釈して塗布し、3日後に出現するコロニー数を生存細胞数としてカウントした。SDプレートでの生存コロニー数を全細胞数とし、Canavanineプレートでの生存コロニー数を耐性変異株数として、変異率を算出・評価した。変異導入箇所はコロニーPCR法によって各株のターゲット遺伝子領域を含むDNA断片を増幅した後DNAシーケンスを行い、Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/)の配列をベースにアラインメント解析を行って同定した。
ヒト胎児腎臓由来細胞(HEK293T細胞)を、10μg/mL ピューロマイシン(Life Technologies)及び10%胎仔ウシ血清(FBS)(Biosera, Nuaille, France)を添加したDME-glutamax培地(Thermo Fisher Scientific)を用いて、37℃、5% CO2条件で培養を行った。細胞の回収には5%トリプシンを用いた。ディープフリーザーで保存したHEK293T細胞を37℃のウォーターバスにて溶解し、5x106 cellsになるように75 T-flaskに播種した。1-3日間培養後に細胞を回収し、0.5x105cells/wellになるように24ウェルプレートの各ウェルに播種した。1-3日培養後に60-80%コンフルエント状態の各ウェルの細胞に対して、各500 ng/wellの下記プラスミド(エフェクタープラスミド及びレポータープラスミド)(計1 μg/well)、200 nMのドナーDNA、1.5 μlのFugeneHD(プロメガ)を用いてトランスフェクションした。各実施例で用いたドナーDNAを表1に示す。トランスフェクション72時間後に細胞を回収し、FACSを用いてiRFP及びEGFPの蛍光を検出した。検出された細胞数から、以下の式により組み換え効率(%)を算出した。
DNAは、PCR法、制限酵素処理、ライゲーション、Gibson Assembly法、人工化学合成のいずれかによって、加工・構築した。プラスミドは酵母・大腸菌シャトルベクターとしてロイシン選抜用のpRS415、及びウラシル選抜用のpRS426をバックボーンとして用いた。プラスミドは大腸菌株XL-10 gold又はDH5αで増幅し、酢酸リチウム法で酵母に導入した。
ホモロジーアーム、ガイドRNA、挿入配列等の配列は、酵母ゲノムのデータベース(https://www.yeastgenome.org/)を参照して設計した。ベクター構築は、Nishida K. et al., Science 16:353(6305) (2016) doi: 10.1126/science.aaf8729に記載する方法に準じて行った。1 x gRNAベクターは、配列番号15の配列の5871番〜5890番の塩基配列を、L86又はM4の標的ヌクレオチド配列の相補配列に置換したベクターに相当する。2 x gRNAベクターは、配列番号16の配列の2638番〜2657番の塩基配列を、L86、L87、L88、L93及びR90のいずれかの標的ヌクレオチド配列の相補配列に置換し、かつ配列番号16の6293番〜6312番の塩基配列を、L87、R89、R90、R91及びR92のいずれかの標的ヌクレオチド配列の相補配列に置換したものに相当する。上記標的ヌクレオチドは、次の通り。
L86:CGAACAGAGTAAACCGAATC(配列番号17)
L87:AGCACTATCAAGGCTAATAA(配列番号18)
L88:GCGAACTTGAAGAATAACCA(配列番号19)
R89:TCACCTAACTCAGACATTAT(配列番号20)
R90:TTGCTGATTCTATTTACAAA(配列番号21)
R91:GCAAACTCTATTCTTGGTGC(配列番号22)
R92:ACCAGAGTATCATCCATGTC(配列番号23)
L93:AATTCGGACACTTTAGGGTT(配列番号24)
M4 :AGATATTATACCTGGACCCC(配列番号25)
pcDNA3.1ベクターバックボーンおよびCMV, PmCDA1, Cas9, H1, sgRNAの各配列はNishida et al 2016の論文より由来する。各変異はPCR法によって導入した。EF1,iRFPおよびmEGFP断片は人工遺伝子合成によって作製した。ギブソンアッセンブリーないしライゲーション反応によって断片を挿入・置換した。
iRFP陽性細胞をFACSにより分取し、次いでGenomic DNA及び導入したプラスミドDNAを抽出した後、以下のサンプルを調製し、以下の条件でPCRを行い目的の箇所を増幅した。
サンプル調製:
gDNA 1μL
プライマー 各1μL
rTaq 10x Buffer 5μL
25mM MgCl2 3μL
2mM dNTP 5μL
rTaq(TOYOBO) 0.5μL
ddH 2 O 33.5μL
計50μL
PCRの条件:94℃に2分間維持した後、94℃で45秒、55℃で45秒、72℃で1分30秒のサイクルを33サイクル行い、最後に72℃に5分間維持した。
増幅用のプライマーとして、以下のSY157及びSY182を使用した。増幅産物のサイズは、1554 bpである。
SY157: TTCTGCTTGTCGGCCATGAT(配列番号47)
SY182: AGGCAAGGCTTGACCGACAATT(配列番号48)
増幅産物を切り出し、Fastgeneを用いて精製した後、各精製産物とpGEM-t easy vecterとをTAクローニングし、該ベクターで大腸菌(JM109)をトランスフォーメーションした。次いで、各サンプルにつき24個のコロニーをピックアップし(青白選抜あり)、プラスミドDNAをMini prep (Fastgene使用)により精製した。
各サンプル 2.5μL
プライマー SY157 (10 pmol/μL) 2.5μL
ddH 2 O 10μL
計15μL
最後に、入手した配列情報をSnapgeneを用いてアライメントした。
出芽酵母BY4741株を、プラスミドベクター1525(配列番号4の6036番目の塩基がg、6037番目の塩基がcである)又は1526(配列番号4の6036番目の塩基がc、6037番目の塩基がaである)と、1059(配列番号5)又は1149(配列番号5の配列の3890番〜3909番の塩基配列をTCCAATAACGGAATCCAACT(配列番号6)に置換したベクターに相当する)とで二重形質転換し、栄養要求性培地(SD-Leu-Ura)により選抜した。S-Leu-Ura 2% ラフィノース培地で一晩培養した。S-Leu-Ura 2% ラフィノース + 0.02% ガラクトース培地に1/32希釈し、30℃で一晩培養した。SD-Ura-Leu及びSD-Ura-Leu+Canavanineプレートに10倍希釈でスポッティングした。二日後にCanavanine耐性コロニーをシーケンス解析した。その結果、標的部位への変異の挿入が確認された(図2)。
プラスミドベクター1548(配列番号7)を、SmaI/HpaIで処理したDNA断片をBY4741株に形質転換し、SD-Ura培地で選抜した。シーケンス解析により、Ade1領域への組み込みが確認された。
上記のプラスミドベクターのいずれかを実証実験株に形質転換し、SD-Leu-Ura培地で選抜した。S-Leu-Ura 2% ラフィノース培地で一晩培養した。S-Leu 2% ラフィノース + 0.02% (又は0.2%) ガラクトース培地に1/32希釈し、30℃で一晩培養したものを5 generationsとした。20 generationsには、1/32希釈を計4回繰り返した。SD-Leuプレートに10倍希釈でスポッティングし、2日後にコロニー数と色を評価した。その結果、Ade1機能が回復して白くなったコロニーが高頻度で現れたことから、本発明の方法により、標的部位での相同組換えの誘導が示された(図4)。
出芽酵母BY4741株を、プラスミドベクター1251(配列番号8)及び2x gRNA ベクターで二重形質転換し、栄養要求性培地(SD-Leu-Ura)により選抜した。S-Leu-Ura 2% ラフィノース培地で一晩培養した。S-Leu-Ura 2% ラフィノース + 0.2% ガラクトース培地に1/32希釈し、30℃で一晩培養した。SD-Ura-LeuおよびSD-Ura-Leu (+Canavanine)プレートに10倍希釈でスポッティングし、二日後にCanavanine耐性コロニーをシーケンス解析した。その結果、本発明の方法により高い効率でノックインが実現できた(図6)。
ドナーDNAとして一本鎖オリゴDNA(70塩基長)(表1)を用いて、動物細胞(HEK293T細胞)において組み換え反応が生じるか否かを検証した。実験の概略図を図7に示す。レポータープラスミドとして、ベクターSY4(H1_sgRNA、CMV_mEGFP)を用い、エフェクタープラスミドとして、ベクターSY45(CMV_Cas9-PmCDA1、EF1_iRFP)、ベクターSY45(CMV_nCas9(D10A)-PmCDA1、EF1_iRFP)、ベクターSY45(CMV_nCas9(H840A)-PmCDA1、EF1_iRFP)、ベクターSY45(CMV_dCas9-PmCDA1、EF1_iRFP)、ベクターSY45(CMV_Cas9、EF1_iRFP)、ベクターSY45(CMV_nCas9(D10A)、EF1_iRFP)、ベクターSY45(CMV_nCas9(H840A)、EF1_iRFP)又はベクターSY45(CMV_dCas9、EF1_iRFP)を用いた。ドナーDNAとしてFw2、Fw3を用いた場合、首尾よく相同組換えが生じた場合には、EGFPをコードする配列に開始コドンが生じる結果、EGFPの発現が認められる。Fw1は、相同組換えが生じてもEGFPをコードする配列に開始コドンが生じないように設計されたドナーDNAであり、ネガティブコントロールとして用いた。Fw3は、Fw2のホモロジーアームの1塩基が置換(c→g)されたものであり、ホモロジーアームが標的部位の隣接領域と完全に相同でない場合でも、相同組換え反応が生じるか否かを検証するため、及び複数の異なる箇所の変異も導入可能であるか否かを検証するために用いた。
ドナーDNAとして一本鎖オリゴDNA(50塩基長)(表1)を用いて、動物細胞(HEK293T細胞)において組み換え反応が生じるか否かを検証した。実験の概略図を図9に示す。レポータープラスミドとして、ベクターSY4(H1_sgRNA、CMV_mEGFP)を用い、エフェクタープラスミドとして、ベクターSY45(CMV_nCas9(D10A))-PmCDA1、EF1_iRFP)又はベクターSY45(CMV_nCas9(H840A))-PmCDA1を用いた。
異なる相同領域に対するホモロジーアームを有するドナーDNA(表1)を用いて、相同領域により相同組換え反応の効率の変化を検証した。実験の概略図を図11示す。レポータープラスミドとして、ベクターSY4(H1_sgRNA、CMV_mEGFP)を用い、エフェクタープラスミドとして、ベクターSY45(CMV_nCas9(D10A))-PmCDA1、EF1_iRFP)又はベクターSY45(CMV_nCas9(H840A))-PmCDA1を用いた。
実施例5のFw2を用いた実験と同じgRNA及びドナーDNAを用いて、DNAにおける改変を検証した。結果を以下の表2に示す。nCas9(D10A)-PmCDA1及びnCas9(H840A)-PmCDA1を用いた場合には、Cas9を用いた場合に比べて、副産物であるIndelの発生が顕著に抑制されること、即ち細胞毒性が低減されることが実証された。なお、本実施例で用いるDNAとの用語には、ゲノムDNAとプラスミドDNAの両方が含まれる。
Claims (13)
- 真核生物細胞の有する二本鎖DNAの標的部位を改変する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素又はDNAグリコシラーゼとが結合した複合体、及び挿入配列を含むドナーDNAを該二本鎖DNAと接触させ、該標的部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的部位を該挿入配列に置換する、又は該標的部位に該挿入配列を挿入する工程を含む、方法(但し、ヒト体内で行われる方法を除く)。
- 前記ドナーDNAが、標的部位の隣接領域に相同な配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸配列認識モジュールが、Casエフェクタータンパク質の少なくとも1つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフからなる群より選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記核酸配列認識モジュールが、Casエフェクタータンパク質の2つのDNA切断能のうちの一方のみのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸配列認識モジュールが、Casエフェクタータンパク質の両方のDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記デアミナーゼがシチジンデアミナーゼである、請求項6に記載の方法。
- 前記シチジンデアミナーゼがPmCDA1である、請求項7に記載の方法。
- 二本鎖DNAと複合体との接触が、該細胞への、該複合体をコードする核酸の導入により行われる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が微生物細胞である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が植物細胞、昆虫細胞又は動物細胞である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記動物細胞が脊椎動物細胞である、請求項11に記載の方法。
- 前記脊椎動物細胞が哺乳類動物細胞である、請求項12に記載の方法。
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