WO2022050377A1 - 標的ｄｎａの編集方法、標的ｄｎａが編集された細胞の製造方法、及びそれらに用いるｄｎａ編集システム - Google Patents

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卓 山本
奈穂子 西堀
忠彦 吉間
一彦 堀込
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国立大学法人広島大学
住友化学株式会社
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    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Definitions

  • the present invention relates to a method for editing a target DNA, a method for producing a cell in which the target DNA has been edited, and a DNA editing system used for them. It relates to a method for producing cells and a combination used for them.
  • Non-Patent Document 1 A base editing method combining CRISPR-dCas9 / nCas9 with a nucleobase converting enzyme such as deaminase was first reported in 2016 ( Komor, A. et al., Nature 533,420-424 (2016), DOI: 10). Since 1038 / nature17946 (Non-Patent Document 1)), its use has spread rapidly due to its high editing efficiency and simplicity that does not require donor DNA, and examples in various organisms and cells have been reported. At the same time, many improved systems have been developed (Rees, HA and Liu, DR, Nat Rev Genet 19,770-788 (2016), DOI: 10.1038 / s41576-018-0059- 1 (Non-Patent Document 2), etc.).
  • Non-Patent Document 4 et al., Science 353, aaf8729 (2016), DOI: 10.1126 / science.aaf8729 (Non-Patent Document 4) is often used.
  • APOBEC3A, APOBEC3B, etc. can be used (Gehrke, J. et al., Nat Biotechnol 36, 977-982 (2016), DOI: 10.1038 / nbt.4199 (Non-patent document). 5); Martin, AS et al., Sci Rep 9,497 (2019), DOI: 10.1038 / s41598-018-36739-9 (Non-Patent Document 6)).
  • ABE Adenine Base Editor
  • Non-Patent Document 8 DNA-binding proteins such as ZF and TALE do not have the property of dissociating double-stranded DNA into single strands. The efficiency of base editing by the substrate deaminase is extremely low.
  • Patent Document 1 the efficiency of base editing by the system described in Patent Document 1 is about 1/3 of that of BE3 (Non-Patent Document 1), which is a conventional base editing system, even if the efficiency is the highest. It was considered that the decrease in activity was caused by.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and is a method capable of specifically and efficiently editing a target DNA by a nucleobase converting enzyme, and genome editing is performed using the method. It is an object of the present invention to provide a method for producing cells and a DNA editing system used for them.
  • the present inventors have fused the nucleobase converting enzyme into TALE without converting it into a split, and the TALE-nucleobase converting enzyme fusion protein (preferably TALE-deaminase).
  • TALE-nucleobase converting enzyme fusion protein preferably TALE-deaminase
  • -UGI fusion protein dCas9 / guide RNA complex or nCas9 / guide RNA complex were both bound in the vicinity of the target site of the target DNA.
  • the structure that does not split the nucleobase converting enzyme is based on the previously reported highly active system AncBE4max, for example, in the case of deaminase, but this is not directly linked to dCas9 or nCas9, but is linked to TALE.
  • the present inventors have a spacer 1 between the TALE recognition sequence (or its complementary sequence) and the target site on the target DNA. And by examining the position of the RNA target sequence on the target DNA, it was demonstrated that the base editing efficiency equivalent to that of the conventional AncBE4max system could be achieved (maximum activity by the reporter assay), and the present invention was completed.
  • the aspects of the present invention obtained from such findings are as follows.
  • the TALE recognition sequence or its complementary sequence recognized by TALE in the fusion protein is present on the 5'side of the target site via a spacer 1 having a chain length of 7 to 31 bp, and
  • the guide RNA target sequence recognized by the guide RNA in the CRISPR-Cas9 system is present to contain the complementary base of the target site.
  • [2] A method of producing cells in which the target DNA has been edited.
  • Fusion proteins containing TALE and nucleobase converting enzymes and (2)
  • a CRISPR-Cas9 system containing a Cas9 protein having lost part or all of its nuclease activity and its guide RNA is introduced into a cell or expressed intracellularly and brought into contact with a target DNA to convert the nucleobase of the fusion protein. It comprises the step of editing the base of the target site of the target DNA by enzymatic activity.
  • the TALE recognition sequence or its complementary sequence recognized by TALE in the fusion protein is present on the 5'side of the target site via a spacer 1 having a chain length of 7 to 31 bp, and
  • the guide RNA target sequence recognized by the guide RNA in the CRISPR-Cas9 system is present to contain the complementary base of the target site.
  • nucleobase converting enzyme in the fusion protein is deaminase.
  • a DNA editing system for use in the method according to any one of [1] to [6].
  • Fusion proteins containing TALE and nucleobase converting enzymes and (2) A DNA editing system comprising a CRISPR-Cas9 system comprising a Cas9 protein having lost some or all of its nuclease activity and a guide RNA thereof.
  • nucleobase converting enzyme in the fusion protein is deaminase.
  • a method capable of specifically and efficiently editing a target DNA by a nucleobase converting enzyme, a method for producing a genome-edited cell using the method, and DNA editing used for them It becomes possible to provide a system.
  • TALE-deaminase activity value (ratio to the AncBE4max activity value) obtained in Test 4 and the length of linker 1.
  • It is a schematic diagram of the structure of NanoLuc expression reporter and one aspect of base editing by TALE-deaminase. It is a conceptual diagram which shows one aspect (A, B) of the structure of TALE-deaminase respectively.
  • It is a graph which shows the TALE-deaminase activity value (ratio to the AncBE4max activity value) obtained in test 5 ((A) BE4-TALE-WT: BE4-32-WT, BE4-135-WT, BE4-234-WT.
  • BE4-TALE-63 BE4-32-63, BE4-135-63, BE4-234-63). It is a graph which shows the TALE-deaminase activity value (the ratio to the AncBE4max activity value or the ABE8e activity value) obtained in the test 5 ((C) BE4-TALE-47: BE4-32-47, BE4-135-47, BE4 -234-47, (D) ABE8e-TALE-47: ABE8e-32-47, ABE8e-135-47, ABE8e-234-47).
  • Target region (AS5 (d), AS14 (e), AS6 (f), AS7 (g)) on endogenous DNA (CCR5, HBB), position of TALE recognition sequence and its complementary sequence, target sequence of guide RNA
  • A 1st base
  • B 10th base
  • sgRNA-AS3 11 of the complementary sequence of the target sequence of the guide RNA
  • the target DNA editing method of the present invention is It is a method of editing the target DNA, (1) Fusion proteins containing TALE and nucleobase converting enzymes, and (2) A CRISPR-Cas9 system containing a Cas9 protein having lost part or all of its nuclease activity and its guide RNA is brought into contact with the target DNA, and the nucleobase converting enzyme activity of the fusion protein causes the target site of the target DNA to be contacted.
  • the TALE recognition sequence or its complementary sequence recognized by TALE in the fusion protein is present on the 5'side of the target site via a spacer 1 having a chain length of 7 to 31 bp, and
  • the guide RNA target sequence recognized by the guide RNA in the CRISPR-Cas9 system is present to contain the complementary base of the target site.
  • the fusion protein according to the present invention is a fusion protein containing TALE and a nucleobase converting enzyme.
  • the fusion protein according to the present invention is, in some cases, referred to as "TALE-nucleobase converting enzyme fusion protein" or "TALE-nucleobase converting enzyme”.
  • the fusion protein may be bound in the order of TALE and nucleobase converting enzyme from the N-terminal, or may be bound in the order of nucleobase converting enzyme and TALE.
  • the fusion protein according to the present invention may contain two or more (preferably two) nucleobase converting enzymes, and in this case, the nucleobase converting enzyme may contain only one type or two types.
  • the fusion protein according to the present invention contains two nucleobase converting enzymes (first nucleobase converting enzyme, second nucleobase converting enzyme), these are the first nucleobase converting enzyme, TALE, the first. It may be bound in the order of 2 nucleobase converting enzymes. Among these, the fusion protein according to the present invention is preferably bound in the order of TALE and nucleobase converting enzyme from the N-terminal, or in the order of nucleic acid-based converting enzyme and TALE from the N-terminal.
  • TALE Transcription Activator-Like Effector
  • the "TALE” according to the present invention includes at least an N-terminal domain and a TALE repeat domain, and may further include a C-terminal domain.
  • the TALE repeat domain is composed of a plurality of TALE sequences forming a right-handed supercoil, for example, 10 to 30, preferably 13 to 25, and more preferably 15 to 20 tandem repeats (TALE repeats).
  • a typical TALE repeat unit (one TALE sequence) consists of 33 to 35 amino acids, and the DNA is identified by a variable residue (repeat variable awareness: RVD) consisting of the 12th and 13th amino acid residues. Recognize the base of. Examples of RVDs that specifically recognize bases include HD that recognizes C, NG that recognizes T, NI that recognizes A, G, or NN that recognizes A, and recognizes A, C, G, or T. NS and the like can be mentioned.
  • RVD receat variable awareness
  • the TALE sequence of TALE according to the present invention may be appropriately modified with respect to the natural amino acid sequence as long as the TALE repeat domain can recognize and bind to the TALE recognition sequence. ..
  • one or more amino acid residues other than RVD for example, 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7) 4 or less, 6 or less, preferably 5 or less or 4 or less, more preferably 3 or less or 2 or less
  • Substitution, insertion, and / or deletion may be performed, and the 12th RVD.
  • the 13th 2 amino acid residue may be replaced with another amino acid residue in order to enhance the specificity for A, T, C and G.
  • the TALE repeat domain of TALE recognizes a base sequence or a complementary sequence thereof existing on the 5'side of the target site of the target DNA via a spacer 1 having a chain length of 7 to 31 bp.
  • the TALE recognition sequence recognized by TALE or its complementary sequence is designed to be a base sequence existing on the 5'side of the target site via a spacer 1 having a chain length of 7 to 31 bp.
  • Techniques for designing and producing such desired TALE are known (eg, Miller et al., Nat. Biotechnol., 29, 143-148 (2011); Sakuma et al., Scientific Rep., 3: 3379 (2013)), for example, Sakuma et al.
  • TALE having high binding activity to the base sequence can be produced.
  • a natural amino acid sequence for example, the amino acid sequence of the N-terminal domain contained in pTALETF_v2 (ID: 32185 to 32188) of Addgene
  • the present invention can be used.
  • the natural amino acid sequence may be appropriately modified. ..
  • one or more for example, 50 or less, 30 or less, 20 or less, 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, preferably 5 or less or 4).
  • 3 or less or 2 or less amino acid residues may be substituted, inserted, and / or deleted. It may also contain a flag tag for purification or detection, a nuclear localization signal (NLS) for translocating a TALE-nucleobase converting enzyme to the cell nucleus, and the like.
  • NLS nuclear localization signal
  • the chain length of the N-terminal domain is preferably 49 to 287 amino acid residues, more preferably 80 to 200 amino acid residues, and 120 to 180 amino acid residues. Is even more preferable. If the chain length of the N-terminal domain is less than the lower limit, it tends to be unable to bind to the target DNA, while if it exceeds the upper limit, the expression efficiency of the fusion protein tends to decrease.
  • N-terminal domain of TALE include, for example, the amino acid sequence of the N-terminal domain contained in Addgene's ptCMV-136 / 63-VR-HD (ID: 50699) and Addgene's ptCMV-153 /. Examples thereof include, but are not limited to, the amino acid sequence of the N-terminal domain contained in 47-VR-HD (ID: 50703).
  • the amino acid sequence of the C-terminal domain contained in the natural amino acid sequence is also used as the C-terminal domain of the TALE.
  • the amino acid sequence of the C-terminal domain contained in the natural amino acid sequence is also used as the C-terminal domain of the TALE.
  • the above-mentioned natural amino acid sequence can be used. , May be appropriately modified.
  • one or more for example, 50 or less, 30 or less, 20 or less, 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, preferably 5 or less or 4).
  • more preferably, 3 or less or 2 or less amino acid residues may be substituted, inserted, and / or deleted.
  • the C-terminal domain of the TALE may be a natural amino acid sequence in which a part of the amino acid sequence on the C-terminal side is removed.
  • the chain length of the C-terminal domain is preferably 1 to 180 amino acid residues, more preferably 20 to 100 amino acid residues, and 40 to 70 amino acid residues. Is even more preferable.
  • the chain length of the C-terminal domain exceeds the upper limit, the expression efficiency of the fusion protein tends to decrease when the fusion protein is expressed.
  • pTALETF_v2 32185 to 32188
  • pTALEN_v2 ID: 32189 to 32192
  • the nucleic acid base converting enzyme is a target without breaking the DNA strand by catalyzing a reaction of converting or dropping a substituent on the purine or pyrimidine ring of a DNA base to another group or atom.
  • the nucleobase converting enzyme is not particularly limited as long as it can catalyze the above reaction, and examples thereof include deaminase and glycosylase, and even if only one of these is used, two or more of them may be used. It may be a combination. Among these, deaminase is preferable as the nucleobase converting enzyme according to the present invention.
  • the deaminase is an enzyme that catalyzes a deamination reaction that converts an amino group of a base into a carbonyl group, and belongs to the nucleic acid / nucleotide deaminase superfamily.
  • Examples of such deaminase include cytosine deaminase capable of converting cytosine or 5-methylcytosine to uracil or thymine, adenosine deaminase capable of converting adenine to hypoxanthine, and guanosine deaminase capable of converting guanine to xanthine. It can be used properly according to the base substitution of.
  • the origin of the deaminase is not particularly limited, and examples thereof include lamprey; mammals such as humans, monkeys, pigs, cows, horses, rats, and mice.
  • cytidine deaminase for example, APOBEC (rAPOBEC1 derived from rat, hAPOBEC1, hAPOBEC2, hAPOBEC3 (hAPOBEC3A, 3B, 3C, 3D (3E), 3F, 3G, 3H), hAPOBEC4, etc. derived from human).
  • Anc689 which is an ancestral amino acid sequence of APOBEC; AID (Activation-induced cytidine deaminase (AICDA)) derived from mammals (eg, humans, pigs, cows, horses, monkeys, etc.); PmCDA1 derived from AID and lamprey.
  • AICDA Activity-induced cytidine deaminase
  • adenosine deaminase 1 (Petromyzon marinus cytosine deaminase 1) can be mentioned.
  • TadA derived from Escherichia coli
  • Each of the above deaminase contains a variant thereof (for example, TadA-8e, TadA7.10, and variants thereof, etc.).
  • the deaminase is preferably at least one selected from the group consisting of APOBEC, PmCDA1, Anc689, and TadA (each containing a variant thereof).
  • the fusion protein according to the present invention contains two or more deaminase
  • these combinations can be appropriately selected depending on the desired base substitution, for example, the same or different combination of cytidine deaminase, the same or different adenosine deaminase.
  • the combination of TadA and PmCDA1 is preferable as the combination of deaminase.
  • the base sequence and amino acid sequence of these deaminase are known and can be obtained from a public database (Genbank or the like).
  • deaminase activity As long as the deaminase has deamination activity (deaminase activity), it is modified (for example, substitution, insertion, and / or lack of amino acid residues) based on the base sequence and amino acid sequence of these known deaminase. It may be the one that has been introduced).
  • the presence or absence of deaminase activity can be confirmed by appropriately using a known method.
  • cytidine deaminase can be confirmed by performing an enzymatic reaction using cytidine as a substrate and detecting and quantifying uridine, which is a metabolite of cytidine.
  • the fusion protein according to the present invention preferably further contains linker 1.
  • linker 1 in the fusion protein according to the present invention, TALE and the nucleobase converting enzyme are linked by linker 1.
  • the number of linkers 1 is plural.
  • the fusion protein according to the present invention contains a plurality of linkers 1, these may be only one kind or a combination of two or more kinds.
  • the chain length of the linker 1 is not particularly limited, but is preferably 1 to 450 amino acid residues, and more preferably 5 to 250 amino acid residues. It is preferably 5 to 200 amino acid residues, more preferably 12 to 150 amino acid residues, and even more preferably 12 to 104 amino acid residues.
  • the chain length of the linker 1 exceeds the upper limit, the expression efficiency of the fusion protein tends to decrease when the fusion protein is expressed.
  • linker 1 for example, Yang L et al. , Nat Commun 7 13330 (2016), and Nishida, K. et al. et al. , Science 353, aaf8729 (2016), 104 amino acids, Kobran, L. et al. et al. , Nat Biotechnology 36, p. 843-846 (2016), 32 amino acids, Sun, N. et al. And Zhao, H. , Mol BioSystem 10, p. 446-453 (2014), Doi: 10.1039 / c3mb70412b), and examples thereof include, but are not limited to, the HTS95 amino acid sequence (95 amino acids) and its repetition.
  • the fusion protein of the present invention when the nucleobase converting enzyme is located on the C-terminal side of TALE, the TALE repeat domain and the nucleobase converting enzyme are separated from each other by 1 to 630 amino acid residues. Is preferable. Therefore, the fusion protein of the present invention preferably contains at least one of the C-terminal domain of TALE and linker 1.
  • the chain length between the TALE repeat domain and the nucleic acid-based converting enzyme (the amino acid residue adjacent to the C-terminal side of the C-terminal of the TALE repeat domain is set as the first residue, and the N-terminal of the nucleic acid-based converting enzyme is used as the first residue.
  • the number of amino acid residues up to the residue adjacent to the N-terminal side is more preferably 25 to 300 amino acid residues, and even more preferably 52 to 174 amino acid residues. If the chain length is less than the lower limit, the efficiency of base editing tends to decrease, while if the chain length exceeds the upper limit, the expression efficiency tends to decrease when the fusion protein is expressed.
  • the C-terminal residue of the TALE repeat domain is a TALE sequence (preferably N-terminal) located immediately before (N-terminal) the truncated last half-repeat (LHR) located on the C-terminal side of the TALE repeat domain.
  • LHR truncated last half-repeat
  • the N-terminal residue of the nucleobase converting enzyme is a typical amino acid sequence of a nucleobase converting enzyme that can be obtained from a known database (for example, NCBI) and a known method (for example, BLAST (NCBI)). It can be the starting residue (usually methionine) of an amino acid sequence having an identity of 85% or more (preferably 90% or more) in the homology search used.
  • the fusion protein according to the present invention further includes the C-terminal side, that is, the C-terminal of the nucleobase-converting enzyme (when the nucleobase-converting enzyme is located on the C-terminal side of TALE) or the C-terminal of TALE (the nucleobase).
  • the converting enzyme is located only on the N-terminal side of TALE
  • the number of the base excision repair inhibitor may be one per the fusion protein, or may be two or more (preferably two) via the linker 2. Further, in the case of a plurality of types, only one type or a combination of two or more types may be used, but one type is preferable.
  • the base excision repair inhibitor according to the present invention is not particularly limited as long as it inhibits base excision repair, but a DNA glycosylase inhibitor is preferable.
  • the DNA glycosylase inhibitor include a thymine DNA glycosylase inhibitor, a uracil DNA glycosylase inhibitor, an oxoguanine DNA glycosylase inhibitor, and an alkylguanine DNA glycosylase inhibitor.
  • a uracil DNA glycosylase inhibitor UGI
  • the presence of deaminase and UGI on one polypeptide further improves the efficiency of base editing.
  • uracil DNA glycosylase inhibitor examples include a uracil DNA glycosylase inhibitor (UGI) derived from PBS1 which is a Bacillus subtilis bacteriophage or a uracil DNA glycosylase inhibitor derived from PBS2 which is a Bacillus subtilis bacteriophage (Bacillus subtilis). UGI), but is not limited to these.
  • UGI uracil DNA glycosylase inhibitor
  • base sequences and amino acid sequences are known and can be obtained from public databases (Genbank, etc.).
  • the base excision repair inhibitor according to the present invention is modified (for example, substitution of amino acid residues) based on the base sequence and amino acid sequence of a known base excision repair inhibitor as long as it has the repair inhibitory activity of the above DNA mismatch. , Insertion, and / or introduction of deletion).
  • the fusion protein according to the present invention further contains the base excision repair inhibitor and there are a plurality of the base excision repair inhibitors
  • the fusion protein-linker 2-first base excision repair inhibitor-linker 2- can be linked via the linker 2 as in the second base excision repair inhibitor.
  • the plurality of linkers 2 at this time may be only one type or a combination of two or more types, but one type is preferable.
  • the linker 2 is not particularly limited, but the chain length is preferably 1 to 50 amino acid residues, more preferably 5 to 30 amino acid residues, and 8 to 15 amino acid residues. Is even more preferable. If the chain length of the linker 2 is less than the lower limit, the functionality of the base excision repair inhibitor tends to decrease, while if it exceeds the upper limit, the expression efficiency of the fusion protein decreases. There is a tendency.
  • linker 2 examples include, but are not limited to, the 10 amino acids described in pCMV_AncBE4max_P2A_GFP (ID: 112100) of Addgene.
  • the fusion protein according to the present invention includes a flag tag for purification and detection at the N-terminal and / or C-terminal, a nuclear localization signal (NLS) for transferring TALE-nucleobase converting enzyme to the cell nucleus, and the like. These may be contained in the N-terminal domain of TALE as described above, or may be added to the N-terminal and / or C-terminal of the fusion protein.
  • NLS nuclear localization signal
  • the fusion protein according to the present invention is, for example, transcribed and expressed as a whole with the above-mentioned TALE and nucleobase converting enzyme, and, if necessary, the linker 1, the base excision repair inhibitor, the linker 2, and other amino acid-encoding genes. It can be obtained by letting it. Further, the fusion protein according to the present invention can be produced by appropriately adopting and improving a conventionally known method, for example, a method of chemically synthesizing based on the amino acid sequence by a commercially available synthesizer, or the following.
  • the method for producing a cell in which the target DNA of the above is edited it can be obtained by a method of introducing a polynucleotide encoding a fusion protein or a vector expressing the fusion protein into the cell and expressing it.
  • the CRISPR-Cas9 system contains a Cas9 protein in which some or all of the nuclease activity is lost and a guide RNA thereof.
  • the Cas9 protein is a Cas9 protein that has lost a part of nuclease activity (referred to as “nCas9” in the present specification) or a Cas9 protein that has lost all of the nuclease activity. (In this specification, it is referred to as "dCas9”). That is, the Cas9 protein typically contains a domain involved in the cleavage of the target chain (RuvC domain) and a domain involved in the cleavage of the non-target chain (HNH domain), but the Cas9 protein according to the present invention includes. It is necessary that the nuclease activity of at least one domain is lost due to the introduction of a mutation or the like.
  • SpCas9 protein (Cas9 protein derived from S. pyogenes)
  • a mutation of the 10th amino acid (aspartic acid) from the N-terminal to alanin (D10A: mutation in the RuvC domain) for example, a mutation of the 10th amino acid (aspartic acid) from the N-terminal to alanin (D10A: mutation in the RuvC domain).
  • the amino acid sequence and base sequence of the Cas9 protein are registered in a public database, for example, Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (for example, accession number: KX151730.1). Etc.), these can be used in the present invention.
  • the Cas9 protein may be introduced with further mutations, for example, mutations for modifying the recognition of PAM sequences (Benjamin, P. et al., Nature 523, 481-485 (2015); Hirano). , S. et al., Molecular Cell 61, 886-894 (2016)), and a nuclear localization signal (NLS) for translocating to the cell nucleus may be added.
  • such a Cas9 protein may be one encoded by a sequence contained in a commercially available plasmid.
  • the following guide RNA is designed so that the guide RNA target sequence contains a complementary base at the target site of the target DNA.
  • the complementary base of the target site of the target DNA refers to the complementary base of the target site 1 base on the complementary strand of the strand in which the target site is present.
  • the guide RNA is a crRNA containing a base sequence (hereinafter, sometimes referred to as "targeted base sequence") complementary to a sequence on the target DNA (guide RNA target sequence). It is a combination of CRISPR RNA) and tracrRNA (trans-activating crRNA).
  • the crRNA further contains a base sequence capable of interacting (hybridizing) with tracrRNA on the 3'side.
  • tracrRNA contains a base sequence capable of interacting (hybridizing) with a part of the base sequence of crRNA on the 5'side, the guide RNA interacts with Cas9 protein by the interaction of these base sequences.
  • the guide RNA recognizes and binds to the guide RNA target sequence of the target DNA, induces the Cas9 protein forming a complex with the guide RNA to the target DNA, and the induced Cas9 protein is the induced Cas9 protein.
  • the helicase activity exposes the single-stranded DNA at the target site of the target DNA.
  • the guide RNA of the CRISPR-Cas9 system may be a single-molecule guide RNA (sgRNA) containing crRNA and tracrRNA, or a double-molecule guide RNA composed of a crRNA fragment and a tracrRNA fragment.
  • sgRNA single-molecule guide RNA
  • the target DNA editing of the base at the target site is performed on the complementarity of base pairing between the target base sequence of the guide RNA and the guide RNA target sequence and on the 3'side of the complementary strand of the guide RNA target sequence. It occurs at a position determined by both the existing PAM sequence and.
  • the guide RNA of the CRISPR-Cas9 system the guide RNA target sequence becomes a sequence containing a complementary base of the target site, and the Cas9 protein can recognize the PAM sequence on the 3'side of the target site. Designed to.
  • the target site is specifically exposed by the helicase activity that exposes the single-stranded DNA, and the editing efficiency by the nucleobase converting enzyme is improved.
  • E-CRISPR http://www.e-crisp.org/E-CRISPR.
  • Zifit Targeter http://zifit.partners.org/ZiFiT/) (Zing Finger Consortium)
  • CRISPRdirect http://crispr.dbcls.jp/) (Tokyo University)
  • CRISPR-P /Cbi.hzau.edu.cn/crispr/) China Agricultural University
  • Guide RNA Target Design Tool It can be determined by using (https://wwws.blueheronbio.com/external/tools/gRNASrc.jsp) (BlueHeronBiotech) and the like.
  • the CRISPR-Cas9 system according to the present invention is, for example, by simultaneously transcribing and expressing the above-mentioned Cas9 protein and the gene encoding the guide RNA, respectively, as described in the following method for producing a cell in which the target DNA is edited.
  • the Cas9 protein and guide RNA according to the present invention can be produced by appropriately adopting and improving conventionally known methods. For example, a polynucleotide encoding them or an expression vector containing the polynucleotide is applied to the cell. It can be obtained by the method of introduction and expression.
  • target DNA the DNA containing the target site to be the target of DNA editing
  • target DNA the DNA containing the target site to be the target of DNA editing
  • the target DNA according to the present invention is a double-stranded DNA, and for convenience, at least one of the strands has a TALE recognition sequence in order from the 5'side in order to show the correspondence with the above fusion protein and the CRISPR-Cas9 system. Or, it is assumed that the structure includes the complementary sequence thereof, the spacer 1, the target site, and the PAM sequence.
  • the inclusion of the complementary sequence of the TALE recognition sequence on the 5'side indicates that the complementary strand of the strand contains the TALE recognition sequence. That is, the TALE recognition sequence may be set on the same strand as the target site or on the complementary strand thereof.
  • the complementary strand of the strand contains a guide RNA target sequence so as to contain the complementary base of the target site.
  • An example of the configuration of the target DNA according to the present invention is shown in FIG. 2 below, but the present invention is not limited thereto.
  • the target site according to the present invention refers to one base targeted for editing by the nucleobase converting enzyme (preferably deamination with deaminase).
  • bases near both sides of the 1 base are further edited (deamination in the case of deaminase).
  • the TALE recognition sequence is a sequence recognized by the TALE.
  • the number of bases in the TALE recognition sequence is 10 to 30 bases, preferably 13 to 25 bases, and more preferably 15 to 20 bases.
  • the TALE recognition sequence is selected to be present on the 5'side of the target site via a spacer 1 having a chain length of 7 to 31 bp. When the chain length of the spacer 1 is within such a range, one base of the target site can be deaminated specifically and with high efficiency.
  • the chain length of the spacer 1 is the length from the base adjacent to the 5'side of the base of the target site to the base adjacent to the 3'side of the TALE recognition sequence as the first base.
  • the chain length of such a spacer 1 is more preferably 10 to 31 bp, further preferably 10 to 28 bp, and even more preferably 13 to 25 bp.
  • the PAM sequence is a sequence recognized by the Cas9 protein.
  • the PAM sequence depends on the type of Cas9 protein used. Typical PAM sequences include, for example, S. cerevisiae.
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (type II) derived from pyogenes is 5'-NGG, and S. streptococcus pyogenes.
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (IA1 type) derived from solfatalicus is 5'-CCN, and S.I.
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (type I-A2) derived from solfatalicus is 5'-TCN, and H.I.
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (type IB) derived from walsbyl is 5'-TTC, and E.I.
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (type IE) derived from colli is 5'-AWG, and E.I.
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (type IF) derived from coli is 5'-CC, and P.I.
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (type IF) derived from aeruginosa is 5'-CC, and S. a.
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (II-A type) derived from Thermophilus is 5'-NNAGAA.
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (type II-A) derived from agalactiae is 5'-NGG, and S. a.
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from aureus is 5'-NGRRT or 5'-NGRRN, N.I.
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from meningitidis is 5'-NNNGATT, T.I.
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from denticola is 5'-NAAAAC.
  • the PAM sequence exists on the 3'side of the target site, and the guide RNA target sequence recognized by the guide RNA is determined according to the position of the PAM sequence.
  • the position of the complementary base of the target site in the guide RNA target sequence is not particularly limited, but is preferably, for example, between the 1st and 50th positions, and the 1st to 30th positions. It is more preferably between 1st and 25th positions.
  • the position of the base in the guide RNA target sequence is the position from the base at the 3'end of the guide RNA target sequence to the complementary base of the base adjacent to the 5'side of the PAM sequence. ..
  • the upper and lower limits of the base position depend on the length of the guide RNA target sequence and can be adjusted by adjusting the length of the guide RNA.
  • the guide RNA target sequence recognized by the guide RNA is selected so as to be a sequence containing a complementary base of the target site. By selecting the position of the guide RNA target sequence in this way, one base of the target site can be edited specifically and with high efficiency.
  • the number of bases in the guide RNA target sequence according to the present invention is preferably 12 to 50 bases, more preferably 17 to 30 bases, and even more preferably 17 to 25 bases.
  • the base sequence of such a target DNA is not particularly limited, and the TALE recognition sequence or its complementary sequence, spacer 1, the complementary sequence of the guide RNA target sequence, the target site contained in the complementary sequence, and the PAM sequence are described above.
  • the targeting base sequences of TALE and guide RNA so as to satisfy the conditions, and modifying the recognition specificity of PAM as necessary, it can be targeted by the DNA editing method of the present invention.
  • the target DNA according to the present invention may be intracellular DNA (endogenous DNA) or extracellular DNA, depending on the purpose.
  • the DNA existing in the cell may be endogenous DNA or extrinsic DNA. Examples of the endogenous DNA include genomic DNA, and examples of the exogenous DNA include DNA introduced into cells.
  • the DNA existing outside the cell may be a DNA derived from a cell or a DNA amplified and synthesized extracellularly.
  • Target DNA editing method In the target DNA editing method of the present invention, the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system are brought into contact with the target DNA, and the base of the target site of the target DNA is edited by the nucleobase converting enzyme activity of the fusion protein.
  • the TALE of the fusion protein recognizes and binds to the TALE recognition sequence on the target DNA, and the nucleobase converting enzyme linked to the TALE is attached to the target DNA.
  • the guide RNA of the CRISPR-Cas9 system recognizes and binds to the guide RNA target sequence on the target DNA, and induces the Cas9 protein that forms a complex with the guide RNA to the target DNA.
  • the Cas9 protein exposes the single-stranded DNA at the target site by helicase activity, so that the nucleobase converting enzyme can efficiently cause the substitution of the target base (for example, deamination of the base).
  • This causes a single base substitution at the target site (eg, C ⁇ U), and in cells, for example, due to a double-stranded DNA mismatch, the base on the opposite strand of the substituted strand is paired with the substituted base. It may be repaired to form (eg, G ⁇ A), replaced with another nucleotide during repair (eg, U ⁇ A, G), or result in a deletion or insertion of one or a dozen bases. Thereby, various mutations can be introduced.
  • deletion of one or more nucleotides, substitution with another one or more nucleotides, or 1 in the target site converted by the nucleobase converting enzyme and the vicinity containing the same. Includes the insertion of the above nucleotides or a combination of these mutations.
  • the target DNA editing method of the present invention may be performed intracellularly or in a cell-free system.
  • the "intracellular" field of the target DNA editing method of the present invention may be in eukaryotic cells or prokaryotic cells, preferably in eukaryotic cells.
  • the eukaryotic cell include animal cells (mammalian, fish, birds, reptiles, amphibians, insect cells, etc.), plant cells, algae cells, yeast, and examples of the prokaryotic cells include Escherichia coli. Examples include salmonella, bacillus, lactic acid, and highly thermophilic bacteria.
  • Animal cells include, for example, cells constituting an individual animal, cells constituting an organ / tissue excised from an animal, cultured cells derived from an animal tissue, and the like. Specifically, for example, germ cells such as egg mother cells and sperm; embryo cells of embryos at each stage (for example, 1-cell stage embryo, 2-cell stage embryo, 4-cell stage embryo, 8-cell stage embryo, 16-cell stage). Embryos, mulberry stage embryos, etc.); Stem cells such as induced pluripotent stem (iPS) cells and embryonic stem (ES) cells; fibroblasts, hematopoietic cells, neurons, muscle cells, bone cells, hepatocytes, pancreatic cells , Brain cells, somatic cells such as kidney cells and the like.
  • germ cells such as egg mother cells and sperm
  • embryo cells of embryos at each stage for example, 1-cell stage embryo, 2-cell stage embryo, 4-cell stage embryo, 8-cell stage embryo, 16-cell stage.
  • pre-fertilized and post-fertilized oocytes can be used, but a post-fertilized oocyte, that is, a fertilized egg is preferable.
  • the fertilized egg is from a pronuclear stage embryo. Oocytes can be thawed and used after being cryopreserved.
  • the "plant cell” includes, for example, cells constituting an individual plant, cells constituting an organ or tissue separated from a plant, cultured cells derived from a plant tissue, and the like.
  • plant organs and tissues include leaves, stems, shoot apex (growth point), roots, tubers, callus and the like.
  • the "cell-free system" which is the place of the target DNA editing method of the present invention refers to a system without living cells (the eukaryotic cells and prokaryotic cells).
  • the cell-free system according to the present invention is not particularly limited as long as it is a system in which the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system can contact the target DNA, for example, in a buffer; the eukaryotic cell or prokaryote. Examples thereof include the inside of a cell crushed solution and the inside of a cell extract.
  • the method of contacting the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system with the target DNA is not particularly limited.
  • the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system are introduced into the cell containing the target DNA or a vector encoding the same, as in the method for producing a cell in which the target DNA is edited below. Examples thereof include a method of introducing the above into cells and expressing them.
  • a solution of the target DNA may be mixed with the fusion protein and the solution of the CRISPR-Cas9 system.
  • the solvent of these solutions is not particularly limited, but for example, a buffer solution such as a phosphate buffer solution, a Tris buffer solution, a Good's buffer solution, or a borate buffer solution is preferable.
  • the method for producing a cell in which the target DNA of the present invention has been edited is A method of producing cells in which the target DNA has been edited.
  • Fusion proteins containing TALE and nucleobase converting enzymes and (2) A CRISPR-Cas9 system containing a Cas9 protein having lost part or all of its nuclease activity and its guide RNA is introduced into a cell or expressed intracellularly and brought into contact with a target DNA to convert the nucleobase of the fusion protein. It comprises the step of editing the base of the target site of the target DNA by enzymatic activity.
  • the TALE recognition sequence or its complementary sequence recognized by TALE in the fusion protein is present on the 5'side of the target site via a spacer 1 having a chain length of 7 to 31 bp, and
  • the guide RNA target sequence recognized by the guide RNA in the CRISPR-Cas9 system is present to contain the complementary base of the target site. The method.
  • the fusion protein, the CRISPR-Cas9 system, and the target DNA are the above-mentioned target DNA editing methods of the present invention.
  • the target DNA in the production method of the present invention is genomic DNA, and the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system can be designed according to the editing purpose of the genomic DNA.
  • the contact between the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system and the target DNA in the cell is the introduction of the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system into the cell in the form of a protein, into the cell. It is carried out by introduction in the form of a polynucleotide and / or introduction into a cell in the form of a polynucleotide or introduction in an expression vector to express the protein intracellularly.
  • the form of RNA or DNA (polynucleotide) encoding the protein is obtained. It may be introduced into cells and expressed intracellularly, or it may be introduced into cells in the form of a vector (expression vector) expressing the protein and expressed intracellularly.
  • the guide RNA may be introduced into cells in the form of RNA, or introduced into cells in the form of DNA (polynucleotide) encoding the RNA and expressed intracellularly. It may be introduced into a cell in the form of a vector (expression vector) expressing the RNA and expressed intracellularly.
  • fusion protein and the CRISPR-Cas9 system are introduced into cells in the form of an expression vector and expressed intracellularly, for example, a vector expressing the fusion protein, a vector expressing the Cas9 protein, and the guide RNA.
  • a vector expressing the above may be introduced into the cell, or a vector expressing a combination of two or more of these may be introduced into the cell.
  • the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system are introduced into cells in the form of an expression vector and expressed intracellularly, the fusion protein and the polynucleotide encoding the Cas9 protein are independently introduced. It may be appropriately codon-optimized according to the cell.
  • the expression vector preferably contains a promoter and / or other control sequence operably linked to the polynucleotide to be expressed. Further, it is preferable that the expression vector is one that can stably express the encoding protein without being integrated into the host genome.
  • Such an expression vector can be appropriately prepared according to a conventionally known method.
  • a method for introducing a protein of the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system, a polynucleotide encoding the protein, and a vector expressing the protein into cells a known method for introducing a protein, DNA, or RNA fragment into cells.
  • the method can be appropriately adopted depending on the type of cell, and examples of such a method include an electroporation method, a microinfection method, a particle gun method, a calcium phosphate method, and polyethyleneimine (PEI).
  • the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system When the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system are introduced into a cell or expressed intracellularly, the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system come into contact with the target DNA in the cell, and the target DNA editing method of the present invention described above.
  • target DNA editing substitution of a target one-base base occurs at the target site, and as a result, it becomes possible to obtain a cell in which the target DNA has been edited.
  • the present invention also provides a method for producing a non-human individual containing a cell in which the target DNA has been edited.
  • This method comprises the step of producing a non-human individual from the cells obtained by the above-mentioned production method.
  • the non-human individual include non-human animals and plants.
  • the non-human animal include mammals (mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit, monkey, pig, cow, goat, sheep, etc.), fish, birds, reptiles, amphibians, and insects.
  • the mammal is preferably a rodent such as a mouse, rat, guinea pig, hamster, and particularly preferably a mouse.
  • the plant include cereals, oil crops, feed crops, fruits and vegetables. Specific crops include, for example, rice, corn, banana, peanut, sunflower, tomato, oilseed rape, tobacco, wheat, barley, potato, soybean, cotton, and carnation.
  • a known method can be used.
  • germ cells or pluripotent stem cells are usually utilized.
  • the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system can be microinjected into oocytes and the resulting oocytes can be transplanted into the uterus of a pseudopregnant female non-human mammal to obtain offspring. can.
  • the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system were microinjected into plant cells to obtain the same. By regenerating a plant from a plant cell, a plant with the desired DNA edited can be obtained.
  • progeny or clones in which the desired DNA is edited from the obtained non-human individuals.
  • Confirmation of the presence or absence of target DNA editing and determination of genotype can be performed based on conventionally known methods, and for example, PCR method, sequencing method, Southern blotting method and the like can be used.
  • the present invention is used in the above-mentioned method for editing a target DNA of the present invention, the method for producing a cell in which the target DNA of the present invention has been edited, or the above-mentioned method for producing a non-human individual of the present invention.
  • Fusion proteins containing TALE and nucleobase converting enzymes and (2) Provided is a DNA editing system including a CRISPR-Cas9 system containing a Cas9 protein having lost part or all of nuclease activity and a guide RNA thereof.
  • the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system are as described in the above-mentioned target DNA editing method and production method of the present invention. These are independently in the form of a protein or RNA, in the form of a polynucleotide encoding the protein or RNA, or in the form of a vector (expression vector) expressing the protein or RNA. May be good.
  • the invention allows the user to design the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system depending on the target site of the target DNA.
  • a vector containing a polynucleotide encoding a polynucleotide encoding TALE and a polynucleotide encoding a polynucleotide other than TALE of the fusion protein and
  • B A polynucleotide encoding a Cas9 protein that has lost part or all of its nuclease activity, or a vector containing the polynucleotide.
  • Each of the vectors (a) to (c) contains an expression unit that enables expression of each polynucleotide.
  • the DNA editing system of the present invention may be a combination including the fusion protein and the CRISPR-Cas9 system, respectively, or may be a kit containing the combination.
  • the kit may further include one or more additional reagents.
  • additional reagents include, but are limited to, for example, dilution buffers, reconstruction buffers, wash buffers, nucleic acid transfer reagents, protein transfer reagents, control reagents (eg, control deaminase). It's not a thing.
  • the kit may further include an instruction manual for carrying out the method of the present invention.
  • Each element included in the kit may be contained in a separate container or may be contained in the same container. Each element may be contained in a container for each single use, or a plurality of doses may be contained in one container. Each element may be contained in a container in a dry form, or may be contained in a container in a form dissolved in a suitable solvent (solvent containing a buffer solution, a stabilizer, a preservative, a preservative, etc.). ..
  • the BEtag sequence is a TALE recognition sequence (underlined in Table 1 (* 1): 5'-tACAGAAGCGGGCAAAGG-3'; lower letters indicate thymine recognized by the N-terminal domain of TALE), a target codon (underlined in Table 1 (underlined in Table 1). * 2): 5'-ACG-3') and the spacer 1 sequence between them are included, and the length of the spacer 1 sequence is 7 bp, 13 bp including the base (A) at 5'of the target codon. , 19bp, 25bp, or 31bp.
  • Each BEtag sequence (Betag-7 to 31bp: SEQ ID NOs: 1 to 5) was annealed with an oligonucleotide designed to allow the addition of NheI recognition sites and SbfI recognition sites at both ends, and treated with NheI and SbfI-. It was inserted into the M / A and used as pNLF-BEtag (pNLF-BEtag-7bp to 31bp).
  • the TALE recognition sequence is a Right TALE sequence of TALEN for the human adenomatous polyposis colli gene whose intracellular activity has been confirmed (Sakuma et al., "Repeating pattern of non-RVD binding DNA binding”. ", Sci. Rep., 3: 3379 (2013)).
  • the oligonucleotide of the sequence (PAM: SEQ ID NO: 6) containing the PAM portion shown in Table 1 below and its antisense sequence.
  • the oligonucleotide with 5'-TCGA-3'added to the 5'end of the above was annealed and inserted into each pNLF-BEtag treated with EcoRV and XhoI, and the reporter plasmids (pNLF-BEtag-7bp-PAM, pNLF-) were inserted.
  • Betag-13bp-PAM, pNLF-BEtag-19bp-PAM, pNLF-BEtag-25bp-PAM, pNLF-BEtag-31bp-PAM were prepared.
  • the complementary sequence of the guide RNA target sequence located on the 5'side of the PAM part is 3 bases at a time.
  • the position of the PAM sequence can be shifted downstream by one base, thereby setting eight PAM sequences (PAMs 1 to 8 in Table 7 below). be able to.
  • Table 1 below shows each sequence inserted into the pNLF-M / A plasmid.
  • FIG. 1 shows a conceptual diagram showing the structure of the completed reporter plasmid.
  • the sequence from the NheI recognition site to the XhoI recognition site containing the TALE recognition sequence, spacer 1, target site, PAM part, and guide RNA target sequence is shown in FIG.
  • the target codon is located at the site corresponding to the start codon of NanoLuc luciferase, and according to such reporter plasmid, ACG, which is the target codon, becomes ATG by TALE-deaminase bound to the TALE recognition sequence.
  • ACG which is the target codon
  • TALE vector set and TALE expression plasmid The sequence and composition of the TALE vector set are as described in 1. above for the TALE repeat unit. To correspond to the TALE recognition sequence of the reporter plasmid prepared in Sakuma et al. It was constructed according to (2013). First, a module sequence (non-repeat-variable di-reside (non) other than the sequence encoding four types of variable residues (RVD: HD, NG, NI, NN) composed of the 12th and 13th amino acids.
  • RVD non-repeat-variable di-reside
  • the number of amino acids in the C-terminal domain is 63 (63)
  • the number of amino acids in the C-terminal domain is 47 (47).
  • the sequence encoding "WT” is the sequence of the C-terminal domain contained in addgene's pTALETF_v2 (ID: 32185 to 32188), and the sequence encoding "63” is the sequence of Addgene's pTALEN_v2 (ID: 32189).
  • N-terminal domain of TALE the sequence of the N-terminal domain included in pTALETF_v2 (ID: 32185 to 32188) of WT: Addgene corresponding to these C-terminal domains; 63: ptCMV-136 / 63- of Addgene. Sequence of N-terminal domain contained in VR-HD (ID: 50699); 47: Sequence of N-terminal domain contained in Addgene's ptCMV-153 / 47-VR-HD (ID: 50703) is artificially referred to. DNA was synthesized. Using the array plasmid and destination vector prepared above, Sakuma et al. A TALE expression plasmid was prepared by the Golden Gate method according to the method described in (2013).
  • TALE-deaminase expression plasmid (1) 104 Amino Acid Linker Series First, the AncBE4max gene (Kobran et al., "Improving cytodine and adenine base editors by expression optimilysis, plasmid, plasmid, plasmid. 2018)) and the Target-AID gene (Nucleotide et al., "Targeted nucleotide editing using hybrid plasmid and vertebrate digital and vertebrate adaptibe imemuneSite3, s. AncBE4max expression plasmid and Genet-AID expression plasmid were prepared by inserting them between the recognition site and the site, respectively.
  • a TALE-deaminase expression plasmid having 104 amino acid linker 1 was prepared by the following method. That is, using the AncBE4max gene of the above AncBE4max expression plasmid as a template and the primers shown in Table 2 below, the Anc689 deaminase gene (Anc689 departure: primer SEQ ID NOs: 7 to 8), 10 amino acid linkers 2 and the UGI gene twice. Repeated sequences (10aa linker- ⁇ -plasmase: primer SEQ ID NOs: 11-12) were amplified by PCR, respectively.
  • the PmCDA1 deaminase gene (PmCDA1: primer SEQ ID NOs: 9 to 10) and 104 amino acid linker 1 are encoded.
  • the sequence (104aa linker: primer SEQ ID NOs: 13 to 17) was amplified by PCR.
  • a sequence (primer SEQ ID NOs: 22-25) containing ⁇ -lactamase to the sequence encoding the N-terminal domain (WT, 63, or 47) of TALE was amplified by PCR.
  • Table 2 below shows each primer used to construct the TALE-deaminase expression plasmid and its SEQ ID NO:.
  • Table 2 shows each primer used to construct the TALE-deaminase expression plasmid and its SEQ ID NO:.
  • the C-terminal domain of TALE is WT
  • the 104 amino acid linker 1 and Anc689 deaminase (BE4) are used in the "WT-104-BE4" below the for of 104aa linker. It is shown that it is a sequence encoding the linker 1 for TALE-deaminase containing.
  • "AID" does not indicate that deaminase is AID, but indicates that it is PmCDA1 derived from "Taget-AID”.
  • a sequence containing from ⁇ -plasmase prepared in 1 to a sequence encoding the N-terminal domain of TALE (WT, 63, or 47) and a downstream (3') encoding the C-terminal domain of TALE (WT, 63, or 47). Inserted between the side) sequence and the In-Fusion method (TaKaRa Bio Inc, Shiga, Japan), and in order from the N-terminal, TALE (N-terminal domain (WT, 63, or 47) -TALE repeat domain-C-terminal domain.
  • TALE-deaminase expression plasmid A conceptual diagram showing the structure of the TALE-deaminase is shown in FIG.
  • TALE-deaminase expression plasmid having a 12 amino acid linker 1 (12aa) instead of the 104 amino acid linker 1 was prepared by the following method. That is, first, the oligonucleotides shown in Table 3 below were annealed to prepare a sequence encoding the 12 amino acid linker 1. In Table 3, below the for of 12aa linker (SEQ ID NOs: 18 to 21), for example, in "TALE_WT-12-AID", the C-terminal domain of TALE is WT and the 12 amino acid linker 1 is described above.
  • PmCDA1 deaminase are shown to be sequences encoding linker 1 for TALE-deaminase.
  • a 12 amino acid linker 1 is described in Yang L et al. , "Engineering and optimizing deaminase fusions for genome editing.”, Nat Commun 7 13330 (2016).
  • the sequences other than the sequence encoding 104 amino acid linker 1 of the TALE-deaminase expression plasmid were amplified by inverse PCR using the primers (SEQ ID NOs: 9, 22 to 24) shown in Table 4 below.
  • the sequence encoding the 12 amino acid linker 1 was inserted by the In-Fusion method.
  • Table 3 below shows the sequence encoding the 12 amino acid linker 1 and its SEQ ID NO:
  • Table 4 shows the primers used for inverse PCR and their SEQ ID NOs.
  • sequences other than the sequences encoding the amino acids to be deleted in the above TALE-deaminase expression plasmid were amplified by inverse PCR using the primers (SEQ ID NOs: 9, 26 to 31) shown in Table 5 below, and In- It was produced by self-ligation by the Fusion method.
  • Table 5 below shows the primers used to prepare the amino acid linker 1 deletion mutant of TALE-47-104-AID and their SEQ ID NOs.
  • TALE-deaminase-NC expression plasmid As a negative control (NC) for TALE-deaminase, the above 1. Instead of the TALE recognition sequence of the reporter plasmid prepared in 1. In the same manner as described above, plasmids expressing TALE-deaminase-NC corresponding to each TALE-deaminase (TALE-deaminase-NC expression plasmid) were prepared.
  • TALE-deaminase and its negative control TALE-deaminase-NC
  • sequence numbers SEQ ID NOs of the base sequence and amino acid sequence
  • Cas9 expression plasmid pX330_BS was prepared by inserting it between the EcoRV recognition site and the BamHI recognition site by the In-Fusion method.
  • a site-specific mutagenesis method by PCR was performed on the Cas9 gene of pX330_BS to prepare a nickase-type nCas9 (D10A) expression plasmid and a dCas9 (D10A + H840A) expression plasmid having no cleavage activity.
  • oligonucleotide designed as described above was annealed and inserted into pX330_BS- ⁇ Cas9 by BpiI treatment and ligation to prepare a plasmid (guide RNA expression plasmids 1 to 8) expressing each guide RNA (sgRNA-1 to 8). .. Table 7 below shows the complementary sequence (underlined) of the target sequence of the guide RNA and the PAM sequence (underlined) of Cas9.
  • Transformation into HEK cells (1) HEK293T cells grown in DMEM medium containing 10% FBS were seeded in each well of a 96-well plate with 5 ⁇ 10 4 cells each. 75 ng of any of the TALE-deaminase expression plasmid and the TALE-deaminase-NC expression plasmid shown in Table 6; NCas9 expression plasmid or dCas9 expression plasmid 50 ng prepared in 1. above; 10 ng of any of the guide RNA expression plasmids 1 to 8 and pX330_BS- ⁇ Cas9 (without guide RNA) prepared in 1.
  • the reference plasmid is a plasmid that expresses firefly luciferase (Fluc).
  • the NanoLuc luciferase activity score for cells into which the TALE-deaminase-NC expression plasmid was introduced was measured.
  • the positive control cells into which the AncBE4max expression plasmid was introduced
  • the activity score of the cells into which the pX330_BS- ⁇ Cas9 expression plasmid was introduced was measured and the negative control (AncBE4max-). NC).
  • each NanoLuc luciferase activity score was standardized using the firefly luciferase activity score from the reference plasmid. Then, using the standardized activity score, the activity score of the cell into which the TALE-deaminase expression plasmid was introduced was subtracted from the activity score of the cell into which the TALE-deaminase expression plasmid was introduced, and the activity value of the TALE-deaminase activity was obtained. In addition, AncBE4max-NC was subtracted from the activity score of the cells into which the AncBE4max expression plasmid was introduced to obtain the AncBE4max activity value.
  • the TALE-deaminase activity value is shown as a relative activity when the AncBE4max activity value under the condition of PAM2 described later is set to 1. The test was repeated at least 3 times and graphed with a standard deviation added to the mean.
  • the position of the PAM sequence is set one base at a time. It was moved to the 3'side (downstream) (PAM1 to PAM8), and the base editing activity was examined.
  • the AncBE4max expression plasmid prepared in 1. above and 5.
  • the reporter plasmid (spacer 1: 19bp) prepared in 1. and the reference plasmid pGL4.54 were combined and introduced into HEK293T cells, and the above 7.
  • the AncBE4max activity value was obtained from each of the above.
  • pX330_BS- ⁇ Cas9 was used instead of the guide RNA expression plasmid.
  • Fig. 5 The results are shown in Fig. 5.
  • the guide RNA expression plasmid 2 that is, when the AncBE4max activity value at the time of PAM2 is 1.0
  • the guide RNA expression plasmids 1 to 8 that is, when the guide RNA expression plasmids 1 to 8 are used, that is, when PAM1 to 8 are used.
  • the AncBE4max activity value is shown. As shown in FIG. 5, it was found that the AncBE4max activity value showed the maximum activity at the time of PAM2. Therefore, the AncBE4max activity value at the time of PAM2 was defined as the following positive control for activity evaluation.
  • TALE-deaminase (BE4 series)
  • WT-104-BE4, 47-104-BE4 the C-terminal domain of TALE is WT or 47
  • the amino acid linker 1 is 104 amino acids
  • the deaminase is BE4 (Anc689).
  • the position of the PAM sequence was fixed at PAM2 and the effect of the length of the reporter spacer 1 on activity was investigated.
  • the length of the spacer 1 was 7 bp, 13 bp, 19 bp, 25 bp, and 31 bp.
  • nCas9 As Cas9 / guide RNA, nCas9 (D10A) and guide RNA are expressed (nCas9), dCas9 (D10A + H840A) and guide RNA are expressed (dCas9), nCas9 is expressed and guide RNA is not expressed (nCas9 /).
  • nCas9 As Cas9 / guide RNA, nCas9 (D10A) and guide RNA are expressed (nCas9), dCas9 (D10A + H840A) and guide RNA are expressed (dCas9), nCas9 is expressed and guide RNA is not expressed (nCas9 /).
  • the TALE-deaminase expression plasmid (WT-104-BE4 or 47-104-BE4) prepared in (1) or the corresponding TALE-deaminase-NC expression plasmid and the above 4.
  • the nCas9 expression plasmid or dCas9 expression plasmid prepared in the above 5.
  • Guide RNA expression plasmid 2 or pX330_BS- ⁇ Cas9 prepared in 1. above.
  • the reporter plasmid (spacer 1: 7 to 31 bp) prepared in 1. was combined with pGL4.54, which is a reference plasmid, and introduced into HEK293T cells.
  • the TALE-deaminase activity value (ratio to the AncBE4max activity value) was obtained.
  • Fig. 6 As shown in FIG. 6, no activity was observed in any of the TALE-deaminase (BE4) in the absence of guide RNA, that is, when nCas9 was not bound near the target base. In addition, the activity of using nCas9 to put a nick in the bottom strand was higher than that of using dCas9 to put a nick. Regarding the length of the spacer 1, particularly high activity was shown in the case of 13 bp and 25 bp, and even higher activity was shown in the case of 25 bp. Regarding the C-terminal domain of TALE, 47 (0.29 ⁇ 0.03) was more active than WT (for example, nCas9, spacer 1 length: 25 bp, 0.19 ⁇ 0.01).
  • TALE-deaminase Six types of TALE-deaminase (WT-104 / 12-AID,) in which the C-terminal domain of TALE is WT, 63, or 47, the amino acid linker 1 is 104 amino acids or 12 amino acids, and the deaminase is AID (PmCDA1). For 63-104 / 12-AID, 47-104 / 12-AID), the effect of the length of the spacer 1 of the reporter on the activity was investigated in the same manner as in BE4 above.
  • Fig. 7 As shown in FIG. 7, no activity was observed in any of the TALE-deaminases (AIDs) in the absence of guide RNA, that is, when nCas9 was not bound near the target base. Further, in WT-104-AID, 63-104-AID, WT-12-AID, 63-12-AID, it is better to nick the bottom strand using nCas9 as in the case where the deaminase is BE4. , The activity was higher than when nick did not enter with dCas9. On the other hand, in 47-104-AID and 47-12-AID, the effect of Nick was not so remarkable.
  • AIDs TALE-deaminases
  • TALE-deaminase (AID) showed high activity at 25 bp, and 63-104-AID and 47-12 AID showed high activity at 19 bp.
  • the activity is WT (eg, nCas9, spacer 1 length: 25bp, 0.09 ⁇ 0.00), 63 (0.16 ⁇ 0.01). 47 (0.4 ⁇ 0.03) (FIGS. 7-A, B, C); for 12 amino acid linker 1, the activity is WT (0.32 ⁇ 0.02), 63 (0.38 ⁇ 0.03). , 47 (0.57 ⁇ 0.02) (FIGS.
  • the length of the spacer 1 of the reporter is fixed, and the position of the PAM sequence is moved to the 3'side (downstream) one base at a time to obtain the PAM sequence.
  • the effect of position (ie, corresponding to the position of Cas9) on the activity of TALE-deaminase was investigated.
  • the TALE-deaminase expression plasmid (AID series: WT-104 / 12-AID, 63-104 / 12-AID, 47-104 / 12-AID) prepared in (2) or the corresponding TALE-deaminase. -NC expression plasmid and 4. above.
  • the nCas9 expression plasmid prepared in 1. above and 5.
  • Guide RNA expression plasmids 1 to 8 prepared in 1 above and 1.
  • the reporter plasmid spacer 1:13, 19, or 25bp
  • prepared in 1. was combined with pGL4.54, which is a reference plasmid, and introduced into HEK293T cells.
  • the TALE-deaminase activity value (ratio to the AncBE4max activity value) was obtained.
  • TALE-deaminase (AID series) other than 47-12-AID showed high activity when the spacer 1 length was 19 bp.
  • the positions of the PAM sequences include PAM6 (eg, 0.42 ⁇ 0.08 for spacer 1 length: 19bp) or PAM7 (0.38 ⁇ 0.05) (FIG. 8-A) for WT-104-AID.
  • PAM7 (0.39 ⁇ 0.00)
  • Fig. 8-B for 63-104-AID
  • PAM7 (0.90 ⁇ 0.10
  • Fig. 8-C for 47-104-AID, WT-12.
  • AID also showed high activity with PAM7 (0.91 ⁇ 0.04) (Fig.
  • the ones with the highest activity were the spacer 1 length of 47-104-AID: 19bp / PAM7 (0.90 ⁇ 0.10) and the spacer 1 length of WT-12-AID: 19bp / PAM7 (0.91). ⁇ 0.04), 47-12 AID spacer 1 length 13 bp / PAM7 (0.96 ⁇ 0.03).
  • the reporter plasmid (spacer 1: 25bp) prepared in 1. and the reference plasmid pGL4.54 were combined and introduced into HEK293T cells, and the above 7.
  • the TALE-deaminase activity value (ratio to the AncBE4max activity value) was obtained.
  • Fig. 9 The results are shown in Fig. 9.
  • the TALE-deaminase expression plasmid the above 3.
  • the results when the 47-104-AID prepared in (1), the 47-12-AID prepared in (2), or the corresponding TALE-deaminase-NC expression plasmid are also shown.
  • the activity of TALE-deaminase (AID) was slightly lower when the length of amino acid linker 1 was shortened to 12 amino acids, but the effect of the length of amino acid linker 1 on the activity was not so great. There was found.
  • TALE-deaminase expression plasmid (2) (1) BE4 series (BE4-TALE) (A) 32 amino acid linker series (BE4-32-TALE) TALE-deaminase (hereinafter, "BE4-32-TALE” in some cases) arranged in the order of Anc689 deaminase (BE4), linker 1 (32 amino acids), and TALE (C-terminal domain: WT, 63, or 47) from the N-terminal.
  • BE4 series A
  • 32 amino acid linker series (BE4-32-TALE) TALE-deaminase (hereinafter, "BE4-32-TALE” in some cases) arranged in the order of Anc689 deaminase (BE4), linker 1 (32 amino acids), and TALE (C-terminal domain: WT, 63, or 47) from the N-terminal.
  • the expression plasmid of) was prepared by the following method. That is, first, 3.
  • deaminase (Anc689 deaminase (BE4)), linker 1 (32 amino acids), and TALE (C-terminal domain: WT, 63, or 47) are arranged in this order from the N-terminal.
  • Destination vectors (BE4-32-WT, BE4-32-63, BE4-32-47) for expressing the BE4-32-TALE expression plasmid to be expressed were prepared. With these, 1. Array plasmid to which the TALE sequence prepared in 1. Using the array plasmid to which the NC sequence prepared in 1.
  • each TALE-deaminase expression plasmid or TALE-deaminase-NC expression plasmid was prepared by the Golden Gate method.
  • a conceptual diagram showing the structure of the TALE-deaminase is shown in FIG. 11 (A).
  • SEQ ID NOs base sequence sequence numbers, amino acid sequence SEQ ID NOs showing the composition of TALE-deaminase and its negative control (TALE-deaminase-NC) and their sequences in each prepared expression plasmid. It is shown in Table 12 of.
  • An expression plasmid (linker 1 length: 135 or 234 amino acids including the linkage sequence added before and after the HTS95 amino acid sequence) was prepared by the following method. That is, 8. (1) A 32-amino acid linker using the destination vectors of BE4-32-WT, BE4-32-63, and BE4-32-47 prepared in (a) as templates and the primers shown in Table 9 below. The 5'side (primer SEQ ID NOs: 25 and 80) including the sequence encoding 1 and the 3'side (primer SEQ ID NOs: 12, 81 to 82) after the sequence encoding each TALE were amplified by PCR, respectively. Table 9 below shows each primer used and its SEQ ID NO:.
  • HTS95 nucleotide sequence SEQ ID NO: 105, amino acid sequence SEQ ID NO: 106
  • deaminase (Anc689 deaminase (BE4)), linker 1 (135 amino acids or 234 amino acids), TALE (C-terminal domain: WT, 63, or 47) in order from the N-terminal.
  • BE4-135-TALE or destination vector for expressing BE4-234-TALE (BE4-135-WT, BE4-135-63, BE4-135-47, BE4-234-WT, etc. BE4-234-63, BE4-234-47) were prepared, respectively. With these, 1. Array plasmid to which the TALE sequence prepared in 1. Using the array plasmid to which the NC sequence prepared in 1.
  • each TALE-deaminase expression plasmid or TALE-deaminase-NC expression plasmid was prepared by the Golden Gate method.
  • the conceptual diagram showing the structure of the TALE-deaminase is the same as in FIG. 11 (a).
  • the following is a list of SEQ ID NOs (SEQ ID NOs of base sequence, sequence number of amino acid sequence) showing the composition and sequence of TALE-deaminase and its negative control (TALE-deaminase-NC) in each prepared expression plasmid. It is shown in Table 12 of.
  • ABE8e series (ABE8e-TALE) First, the ABEmax gene (Koblan et al., Nat Biotechnol, 36, p.843-846 (2016)) prepared by artificial DNA synthesis is inserted between the BamHI recognition site and the EcoRV recognition site of cDNA 3.1s, respectively. As a result, ABEmax expression plasmid 2 was prepared.
  • ABE8e V106W
  • An expression plasmid was prepared. That is, using the ABEmax expression plasmid 2 as a template and the primers shown in Table 10 below, the sequence encoding the N-terminal NLS of the 3'-ABEmax gene to the sequence encoding the C-terminal of the 32 amino acid linker 1-5. 'Was amplified by PCR (primer SEQ ID NOs: 83-84) to form an acceptor.
  • a primer was designed to contain mutations such as V106W, A109S, T111R, D119N, H122N, Y147D, F149Y, T166I, and D167N on the ABE7.10 gene, and two fragments using the ABEmax expression plasmid 2 as a template.
  • A primer SEQ ID NOs: 85-86
  • fragment B primer SEQ ID NOs: 87-88
  • Table 10 shows each primer used and its SEQ ID NO:. In each table below, "ABE8e” indicates that the deaminase is TadA-8e (V106W).
  • ABE deaminase ABE8e
  • linker 1 32 amino acids, 135 amino acids, or 234 amino acids
  • TALE C-terminal domain: 47
  • the 5'side including the sequence encoding the N-terminal NLS and the 3'side including the sequence encoding the C-terminal side from the 32 amino acid linker were amplified by PCR including the vector (primer SEQ ID NO: 89). ⁇ 90) It was used as an acceptor. Further, the ABE8e (TadA-8e (V106W)) gene portion amplified by PCR using the ABE8e (TadA-8e (V106W)) expression plasmid as a template (primer SEQ ID NO: Addition 91 to 92) was used as the acceptor by the In-Fusion method. To create a destination vector for expressing ABE8e-32-47, ABE8e-135-47, or ABE8e-234-47. Table 11 below shows each primer used and its SEQ ID NO:.
  • each destination vector and 1. Array plasmid to which the TALE sequence prepared in 1. Using the array plasmid to which the NC sequence prepared in 1. Similarly, each TALE-deaminase expression plasmid or TALE-deaminase-NC expression plasmid was prepared by the Golden Gate method.
  • a conceptual diagram showing the structure of the TALE-deaminase is shown in FIG. 11 (B).
  • SEQ ID NOs SEQ ID NOs of base sequence, sequence number of amino acid sequence
  • TALE-deaminase-NC negative control
  • TALE-deaminase expression plasmid targeting endogenous DNA (genomic DNA)
  • TALE recognition sequence the sequences on the eight types of endogenous DNA shown in Table 13 below are targeted.
  • An array plasmid in which the TALE sequence was ligated was prepared in the same manner as in the above.
  • endogenous DNA CCR5 and HBB in which highly homologous family genes (CCR2 and HBD) are present were set.
  • TALE-deaminase (AID) is arranged in the order of TALE (C-terminal domain: WT or 47), linker 1 (12 amino acids or 104 amino acids), and deaminase (AID) from the N-terminal by the Golden Gate method.
  • Expression plasmids (TALE-AID expression plasmids) of WT (*) -12-AID, 47 (*) -12-AID, 47 (*) -104-AID: * are targets) were prepared. In addition, except that each array plasmid was used, 8.
  • TALE is arranged in the order of deaminase (BE4 or ABE8e), linker 1 (32 amino acids or 135 amino acids), and TALE (C-terminal domain: 63 or 47) from the N-terminal by the Golden Gate method.
  • -Expression plasmids (BE4-TALE expression plasmid, ABE8e-TALE expression plasmid) of deaminase (BE4-32-47 (*), BE4-135-63 (*), ABE8e-135-47 (*): * are targets, respectively) ) was produced.
  • Table 13 below shows the target TALE recognition sequence
  • Table 14 shows the target, the composition of TALE-deaminase, and the sequence number (sequence number of the base sequence, amino acid sequence) in each prepared expression plasmid. A list of each of the sequence numbers) is shown.
  • reporter plasmids for BE4-TALE and ABE8e-TALE As reporters, 1. Insert the sequence shown in Table 15 below (N-CBE (for BE4-TALE) or N-ABE (for ABE8e-TALE)) into the pNLF-M / A prepared in 1 above, and insert it for BE4-TALE and ABE8e. -Reporter plasmids for TALE were prepared respectively.
  • the insertion sequence is a complementary sequence of the TALE recognition sequence (underlined (* 1) in Table 15: 5'-CCTTTGCCCGCTTCTGTa-3'; lower letters indicate the complementary base of thymine recognized by the N-terminal domain of TALE), target codon ( Underlined (* 2) in Table 15: 5'-ACG-3'or 5'-TAG-3'), and the spacer 1 sequence between them, the length of the spacer 1 is 5'of the target codon. 7 bp, 13 bp, 19 bp, 25 bp, or 31 bp including the bases in. Table 15 below shows each sequence inserted into the pNLF-M / A plasmid.
  • the target codon is located at the site corresponding to the start codon of Nano luciferase, and according to the reporter plasmid, the TALE-deaminase bound to the TALE recognition sequence at the target codon.
  • C which is a target base (target site)
  • TALE-deaminase bound to the TALE recognition sequence at the target codon.
  • the reporter plasmid for ABE8e-TALE the target codon is located at the position corresponding to the stop codon inserted upstream of NanoLuc luciferase, and according to the reporter plasmid, TALE- bound to the TALE recognition sequence.
  • TAG the target base (target site) A is replaced with G
  • NanoLuc luciferase is expressed.
  • Transformation into HEK cells (2) 10. When each reporter plasmid prepared in 1 is used as the target DNA, 6. It was performed in the same manner as shown in. That is, 8. 75 ng of either the BE4-TALE expression plasmid or the ABE8e-TALE expression plasmid prepared in 1. NCas9 expression plasmid or dCas9 expression plasmid 50 ng prepared in 1. Guide RNA expression plasmid 10 ng prepared in 10. 20 ng of any of the reporter plasmids prepared in 1; and pGL4.54 5 ng, which is a reference plasmid, were introduced into 5 ⁇ 10 4 HEK293T cells per well using Lipofectamine LTX and cultured for 24 hours.
  • 10 ng of the guide RNA expression plasmid prepared in the above was introduced into 3 ⁇ 10 4 HEK293T cells per well, and cultured for 48 hours. Further, as a control in this case, 30 ng of any of the Target-AID expression plasmid, the AncBE4max expression plasmid, and the ABE8e expression plasmid, and 11.
  • One of the combinations with the guide RNA expression plasmid 20 ng prepared in the above was introduced into HEK293T cells.
  • TALE-deaminase activity value (ratio to the AncBE4max activity value or the ABE8e activity value) was obtained.
  • BE4 series From N-terminal, Anc689 deaminase (BE4), linker 1 (32 amino acids, 135 amino acids, or 234 amino acids), TALE (C-terminal domain: WT, 63, or 47) are arranged in this order.
  • WT, BE4-TALE-63, BE4-TALE-47 the effect of the length of the spacer 1 of the reporter and the length of the linker 1 on the activity was investigated.
  • the length of the spacer 1 was 7 bp, 13 bp, 19 bp, 25 bp, and 31 bp.
  • nCas9 As Cas9 / guide RNA, nCas9 (D10A) and guide RNA are expressed (nCas9), dCas9 (D10A + H840A) and guide RNA are expressed (dCas9), nCas9 is expressed and guide RNA is not expressed (nCas9 /).
  • nCas9 As Cas9 / guide RNA, nCas9 (D10A) and guide RNA are expressed (nCas9), dCas9 (D10A + H840A) and guide RNA are expressed (dCas9), nCas9 is expressed and guide RNA is not expressed (nCas9 /).
  • the length of the spacer 1 particularly high activity was shown when the C-terminal domain of TALE was 25 bp in WT and 63, and when the C-terminal domain of TALE was 19 bp and 25 bp in 47, respectively.
  • the activity was particularly high when the C-terminal domain of TALE was 32 amino acids in WT and 47, and when the C-terminal domain of TALE was 135 amino acids in 63.
  • the combination with particularly high activity was when the C-terminal domain of TALE was WT, when the linker 1 length was 32 amino acids and the spacer 1 length was 25 bp (0.75 ⁇ 0.10), and when the C-terminal domain of TALE was 63.
  • the linker 1 length is 135 amino acids and the spacer 1 length is 25 bp (0.86 ⁇ 0.11)
  • the linker 1 length is 32 amino acids and the spacer 1 length is 19 bp and 25 bp (when the linker 1 length is 32 amino acids and the spacer 1 length is 19 bp and 25 bp). It was 0.80 ⁇ 0.14 and 0.85 ⁇ 0.13).
  • ABE8e series Also for TALE-deaminase (ABE8e-TALE-47) arranged in the order of ABE8e deaminase (ABE8e), linker 1 (32 amino acids, 135 amino acids, or 234 amino acids), and TALE (C-terminal domain: 47) from the N-terminal. Similar to the BE4 series, the effect of the length of the reporter spacer 1 and the length of the linker 1 on the activity was investigated.
  • the length of linker 1 is 135 amino acids (0.54 ⁇ 0.03) for nCas9, 32 amino acids (0.55 ⁇ 0.13) and 135 amino acids (0.57 ⁇ 0.09) for dCas9. Each showed particularly high activity.
  • TALE-AID (WT (*) -12-AID, 47) arranged in the order of TALE (C-terminal domain: WT or 47), linker 1 (12 amino acids or 104 amino acids), and deaminase (AID) from the N-terminal. 14 to 16 show the results when (*) -12-AID and 47 (*) -104-AID: * are targets).
  • the TALE recognition sequence is on AS3 (a), AS14 (b), S2 (c) shown in FIG. 13A, respectively.
  • FIG. 14 shows the ratio of T in the first base (A), the tenth base (B), and the eleventh base (C) of the complementary sequence of the target sequence of the guide RNA (sgRNA-AS3) on the target AS3 (that is,).
  • FIG. 15 shows the first base (A) and the fifth base (A) of the complementary sequence of the target sequence of the guide RNA (sgRNA-AS14) on the target AS14.
  • B) shows the proportion of T in the 6th base (C)
  • FIG. 16 shows the 1st base (A) and the 8th base of the complementary sequence of the target sequence of the guide RNA (sgRNA-S2) on the target S2.
  • B) shows the ratio of T in the 9th base (C).
  • TALE-AID showed the same or higher activity against the target CCR5 gene or HBB gene as compared with the existing Base editors Target-AID and AncBE4max.
  • Target-AID and AncBE4max showed base-editing activity against the non-target CCR2 gene or HBD gene, but TALE-AID showed almost no base-editing activity. Therefore, it was confirmed that TALE-AID has higher target specificity than the existing Target-AID and AncBE4max.
  • BE4 series BE4-TALE (BE4-32-47 (*), BE4) arranged in the order of deaminase (BE4), linker 1 (32 amino acids or 135 amino acids), and TALE (C-terminal domain: 47 or 63) from the N-terminal. -135-63 (*): * is the target), and the results are shown in FIGS. 17 to 20.
  • the TALE recognition sequence is on the complementary sequence of AS5 (d), AS14 (e), AS6 (f), AS7 (g) shown in FIG. 13B, respectively.
  • FIG. 17 shows the ratio of T in the 7th base (A) and the 8th base (B) of the complementary sequence of the target sequence of the guide RNA (sgRNA-AS5) on the target AS5, and FIG. 18 shows the ratio of T in the target.
  • the ratio of T in the first base (A), the fifth base (B), and the sixth base (C) of the complementary sequence of the target sequence of the guide RNA (sgRNA-AS14) on AS14 is shown, and FIG. 19 shows.
  • the ratio of T in the 5th base (A) and 6th base (B) of the complementary sequence of the target sequence of the guide RNA (sgRNA-AS6) on the target AS6 is shown
  • FIG. 20 shows the guide on the target AS7.
  • the ratio of T in the 6th base (A) and the 7th base (B) of the complementary sequence of the target sequence of RNA (sgRNA-AS7) is shown.
  • BE4-TALE showed approximately the same level of activity against the target CCR5 gene or HBB gene as compared with the existing Base editors Target-AID and AncBE4max.
  • Target-AID and AncBE4max showed base-editing activity against the non-target CCR2 gene or HBD gene, but BE4-TALE showed almost no base-editing activity. Therefore, it was confirmed that BE4-TALE has higher target specificity than the existing Target-AID and AncBE4max.
  • ABE8e series The results of using ABE8e-TALE (ABE8e-135-47) arranged in the order of ABE8e deaminase (ABE8e), linker 1 (135 amino acids), and TALE (C-terminal domain: 47) from the N-terminal are shown in FIGS. 21 to 21. It is shown in FIG. In each ABE8e-TALE, the TALE recognition sequence is on the complementary sequence of AS5 (d), AS6 (f), AS7 (g) shown in FIG. 13B, respectively. In FIG.
  • FIG. 21 shows the ratio of G in the third base (A) and the fourth base (B) of the complementary sequence of the target sequence of the guide RNA (sgRNA-AS5) on the target AS5 (that is, the base changes from A to G).
  • the edited ratio is shown, and FIG. 22 shows the ratio of G in the 4th base (A) and 7th base (B) of the complementary sequence of the target sequence of the guide RNA (sgRNA-AS6) on the target AS6.
  • FIG. 23 shows the ratio of G in the 4th base (A) and 8th base (B) of the complementary sequence of the target sequence of the guide RNA (sgRNA-AS7) on the target AS7.
  • ABE8e-TALE showed the same level of activity against the target CCR5 gene or HBB gene as compared with the existing Base editor ABE8e (TadA-8e (V106W)).
  • ABE8e (TadA-8e (V106W)) showed base editing activity against the non-target CCR2 gene or HBD gene, but ABE8e-TALE showed almost no base editing activity. Therefore, it was confirmed that ABE8e-TALE has higher target specificity than the existing ABE8e (TadA-8e (V106W)).
  • the present invention a method capable of specifically and efficiently editing a target DNA by a nucleobase converting enzyme, a method for producing a genome-edited cell using the method, And the DNA editing system used for them can be provided. Therefore, the present invention is expected to be utilized in fields such as gene editing therapy, which requires high editing efficiency and high safety.

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Abstract

標的ＤＮＡを編集する方法であり、 （１）ＴＡＬＥ及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、 （２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム を、標的ＤＮＡに接触させ、前記融合タンパク質の核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、　前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥが認識するＴＡＬＥ認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５'側に７～３１ｂｐの鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、　前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、 方法。

Description

標的ＤＮＡの編集方法、標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法、及びそれらに用いるＤＮＡ編集システム
　本発明は、標的ＤＮＡの編集方法、標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法、及びそれらに用いるＤＮＡ編集システムに関し、より詳しくは、標的ＤＮＡを編集する方法、その方法を用いてゲノム編集された細胞を製造する方法、及びそれらに用いる組み合わせに関する。
　ＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９／ｎＣａｓ９とデアミナーゼ等の核酸塩基変換酵素とを組み合わせた塩基編集方法は、２０１６年に最初の報告（Ｋｏｍｏｒ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　５３３，４２０－４２４（２０１６），ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１７９４６（非特許文献１））がなされて以降、その編集効率の高さとドナーＤＮＡを必要としない簡便さとから、急速に利用が広まり、さまざまな生物や細胞での実施例が報告されると共に、改良システムも多数開発されている（Ｒｅｅｓ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ　Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．，Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔ　１９，７７０－７８８（２０１８），ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５７６－０１８－００５９－１（非特許文献２）等）。
　例えば、塩基ＣからＴへの塩基編集（Ｃ→Ｔ（Ｇ→Ａ））においては、ラットのＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１）を利用したシステム（上記初出論文でのＢＥ３から、現在ではＡｎｃＢＥ４ｍａｘと呼ばれるシステムへと改良が進められている；Ｋｏｂｌａｎ，Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　３６，８４３－８４６（２０１８），ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｂｔ．４１７２（非特許文献３））と、ヤツメウナギのＣＤＡ１（ＰｍＣＤＡ１）を利用したシステム（Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ；Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　３５３，ａａｆ８７２９（２０１６），ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ８７２９（非特許文献４））と、がよく用いられており、その他にＡＰＯＢＥＣ３ＡやＡＰＯＢＥＣ３Ｂなどが利用可能であることも報告されている（Ｇｅｈｒｋｅ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　３６，９７７－９８２（２０１８），ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｂｔ．４１９９（非特許文献５）；Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉ　Ｒｅｐ　９，４９７（２０１９），ＤＯＩ：　１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１８－３６７３９－９（非特許文献６））。また、例えば、塩基ＡからＧへの塩基編集（Ａ→Ｇ（Ｔ→Ｃ））システムとして、大腸菌に由来するＴａｄＡタンパク質をエンジニアリングして構築したＡｄｅｎｉｎｅ　Ｂａｓｅ　Ｅｄｉｔｏｒ（ＡＢＥ）システムも報告されている（Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　５５１，４６４－４７１（２０１７），ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２４６４４（非特許文献７））。
　しかしながら、これら全てのシステムにおいて、標的とするゲノム領域の特異性は、ＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９／ｎＣａｓ９の構成要素であるガイドＲＮＡ及びｄＣａｓ９／ｎＣａｓ９が認識するＰＡＭ配列のみに依存している。他方で、ジンクフィンガー（ＺＦ）やＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）にデアミナーゼを融合したシステムも報告されている（Ｙａｎｇ，Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ　７，１３３３０（２０１６），ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１３３３０（非特許文献８））が、ＺＦやＴＡＬＥといったＤＮＡ結合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９／ｎＣａｓ９と異なり、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に乖離させる性質を有さないことから、一本鎖ＤＮＡを基質とするデアミナーゼによる塩基編集の効率は極めて低い。
　このような状況の中、デアミナーゼをＮ末ドメインとＣ末ドメインとに分割（ｓｐｌｉｔ）し、ＺＦとｎＣａｓ９とにそれぞれ融合させることで、ＺＦ及びｎＣａｓ９の両者の標的配列が近傍に存在するときに初めて塩基編集が施されるようなシステムが報告されている（国際公開第２０１８／２１８１６６号）。このようなシステムを用いれば、従来のＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９／ｎＣａｓ９依存的システムと比較し、ＺＦの認識配列が加わる分、特異性を向上させることができると考えられる。
国際公開第２０１８／２１８１６６号
Ｋｏｍｏｒ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　５３３，４２０－４２４（２０１６） Ｒｅｅｓ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ　Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．，Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔ　１９，７７０－７８８（２０１８） Ｋｏｂｌａｎ，Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　３６，８４３－８４６（２０１８） Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　３５３，ａａｆ８７２９（２０１６） Ｇｅｈｒｋｅ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　３６，９７７－９８２（２０１８） Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉ　Ｒｅｐ　９，４９７（２０１９） Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　５５１，４６４－４７１（２０１７） Ｙａｎｇ，Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ　７，１３３３０（２０１６）
　しかしながら、特許文献１に記載のシステムによる塩基編集の効率は、最も高いものでも、従来の塩基編集システムであるＢＥ３（非特許文献１）の１／３程度であり、これは、ｓｐｌｉｔ化することによって活性の低下が引き起こされているものと考えられた。
　本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、特異的かつ効率的に、核酸塩基変換酵素による標的ＤＮＡの編集を行うことができる方法、その方法を用いてゲノム編集された細胞を製造する方法、及びそれらに用いるＤＮＡ編集システムを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、核酸塩基変換酵素をｓｐｌｉｔ化することなくＴＡＬＥに融合しつつ、かかるＴＡＬＥ－核酸塩基変換酵素融合タンパク質（好ましくはＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＵＧＩ融合タンパク質）と、ｄＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体又はｎＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体と、の両者を標的ＤＮＡの標的部位の近傍に結合させるシステムを開発した。核酸塩基変換酵素をｓｐｌｉｔ化しない構造は、例えばデアミナーゼの場合には既報の高活性システムであるＡｎｃＢＥ４ｍａｘに準拠しているが、これをｄＣａｓ９やｎＣａｓ９に直接連結するのではなく、ＴＡＬＥに連結させていることにより、ＴＡＬＥ－核酸塩基変換酵素（デアミナーゼ）融合タンパク質のみが標的ＤＮＡに結合しても、基質となる一本鎖ＤＮＡが露出していないために塩基編集は殆ど起こらない。また、ｄＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体のみや、ｎＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体のみが標的ＤＮＡに結合しても、前記核酸塩基変換酵素が存在しないために、やはり塩基編集は起こらない。そのため、ＴＡＬＥ－核酸塩基変換酵素融合タンパク質と、ｄＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体又はｎＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体と、の両者が、標的部位を中心として、特定の距離を置いて標的ＤＮＡにそれぞれ結合したときに初めて塩基編集が起こり、高い特異性が担保されること、及び前記核酸塩基変換酵素をｓｐｌｉｔ化していないことにより高い編集効率を実現できること、を本発明者らは見出した。
　また、本発明者らは、上記のＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９又はｎＣａｓ９とＴＡＬＥ－核酸塩基変換酵素融合タンパク質との組み合わせにおいて、標的ＤＮＡ上のＴＡＬＥ認識配列（又はその相補配列）～標的部位間のスペーサー１、及び標的ＤＮＡ上のＲＮＡ標的配列の位置の検討により、従来のＡｎｃＢＥ４ｍａｘシステムと同等の塩基編集効率を達成できることを実証し（レポーターアッセイによる最大活性）、本発明を完成するに至った。かかる知見により得られた本発明の態様は以下のとおりである。
　［１］
　標的ＤＮＡを編集する方法であり、
（１）ＴＡＬＥ及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム
を、標的ＤＮＡに接触させ、前記融合タンパク質の核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
　前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥが認識するＴＡＬＥ認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側に７～３１ｂｐの鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
　前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法。
　［２］
　標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法であり、
（１）ＴＡＬＥ及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム
を、細胞に導入又は細胞内で発現させて標的ＤＮＡに接触させ、前記融合タンパク質の核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
　前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥが認識するＴＡＬＥ認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側に７～３１ｂｐの鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
　前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法。
　［３］
　前記融合タンパク質がさらに、ＴＡＬＥと前記核酸塩基変換酵素とを結合するリンカー１を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
　［４］
　前記融合タンパク質がさらに、Ｃ末側にリンカー２を介して結合された塩基除去修復インヒビターを含む、［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載の方法。
　［５］
　前記融合タンパク質における核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、［１］～［４］のうちのいずれか一項に記載の方法。
　［６］
　前記デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ、ＰｍＣＤＡ１、Ａｎｃ６８９、及びＴａｄＡからなる群から選択される少なくとも１種である、［５］に記載の方法。
　［７］
　［１］～［６］のうちのいずれか一項に記載の方法に用いるためのＤＮＡ編集システムであり、
（１）ＴＡＬＥ及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム
を含む、ＤＮＡ編集システム。
　［８］
　前記融合タンパク質がさらに、ＴＡＬＥと前記核酸塩基変換酵素とを結合するリンカー１を含む、［７］に記載のＤＮＡ編集システム。
　［９］
　前記融合タンパク質がさらに、Ｃ末側にリンカー２を介して結合された塩基除去修復インヒビターを含む、［７］又は［８］に記載のＤＮＡ編集システム。
　［１０］
　前記融合タンパク質における核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、［７］～［９］のうちのいずれか一項に記載の方法。
　［１１］
　前記デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ、ＰｍＣＤＡ１、Ａｎｃ６８９、及びＴａｄＡからなる群から選択される少なくとも１種である、［１０］に記載のＤＮＡ編集システム。
　本発明によれば、特異的かつ効率的に、核酸塩基変換酵素による標的ＤＮＡの編集を行うことができる方法、その方法を用いてゲノム編集された細胞を製造する方法、及びそれらに用いるＤＮＡ編集システムを提供することが可能となる。
レポータープラスミドの構造を示す概念図である。 レポータープラスミドにおけるＮｈｅＩ認識サイトからＸｈｏＩ認識サイトまでの配列の構造を示す概念図である。 ＮａｎｏＬｕｃ発現レポーターの構造及びＴＡＬＥ－デアミナーゼによる塩基編集の一態様の模式図である。 ＴＡＬＥ－デアミナーゼの構造の一態様を示す概念図である。 試験１で得られたＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値を示すグラフである。 試験２で得られたＴＡＬＥ－デアミナーゼ活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）を示すグラフである（（Ａ）ＷＴ－１０４－ＢＥ４、（Ｂ）４７－１０４－ＢＥ４）。 試験２で得られたＴＡＬＥ－デアミナーゼ活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）を示すグラフである（（Ａ）ＷＴ－１０４－ＡＩＤ、（Ｂ）６３－１０４－ＡＩＤ、（Ｃ）４７－１０４－ＡＩＤ、（Ｄ）ＷＴ－１２－ＡＩＤ、（Ｅ）６３－１２－ＡＩＤ、（Ｆ）４７－１２－ＡＩＤ）。 試験３で得られたＴＡＬＥ－デアミナーゼ活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）を示すグラフである（（Ａ）ＷＴ－１０４－ＡＩＤ、（Ｂ）６３－１０４－ＡＩＤ、（Ｃ）４７－１０４－ＡＩＤ、（Ｄ）ＷＴ－１２－ＡＩＤ、（Ｅ）６３－１２－ＡＩＤ、（Ｆ）４７－１２－ＡＩＤ）。 試験４で得られたＴＡＬＥ－デアミナーゼ活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）とリンカー１の長さとの関係を示すグラフである。 ＮａｎｏＬｕｃ発現レポーターの構造及びＴＡＬＥ－デアミナーゼによる塩基編集の一態様の模式図である。 ＴＡＬＥ－デアミナーゼの構造の一態様（Ａ、Ｂ）をそれぞれ示す概念図である。 試験５で得られたＴＡＬＥ－デアミナーゼ活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）を示すグラフである（（Ａ）ＢＥ４－ＴＡＬＥ－ＷＴ：ＢＥ４－３２－ＷＴ、ＢＥ４－１３５－ＷＴ、ＢＥ４－２３４－ＷＴ、（Ｂ）ＢＥ４－ＴＡＬＥ－６３：ＢＥ４－３２－６３、ＢＥ４－１３５－６３、ＢＥ４－２３４－６３）。 試験５で得られたＴＡＬＥ－デアミナーゼ活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値又はＡＢＥ８ｅ活性値に対する割合）を示すグラフである（（Ｃ）ＢＥ４－ＴＡＬＥ－４７：ＢＥ４－３２－４７、ＢＥ４－１３５－４７、ＢＥ４－２３４－４７、（Ｄ）ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥ－４７：ＡＢＥ８ｅ－３２－４７、ＡＢＥ８ｅ－１３５－４７、ＡＢＥ８ｅ－２３４－４７）。 内因性ＤＮＡ（ＣＣＲ５、ＨＢＢ）上のターゲット領域（ＡＳ３（ａ）、ＡＳ１４（ｂ）、Ｓ２（ｃ））、ＴＡＬＥ認識配列の位置、ガイドＲＮＡの標的配列の相補配列の位置をそれぞれ示す概念図である。 内因性ＤＮＡ（ＣＣＲ５、ＨＢＢ）上のターゲット領域（ＡＳ５（ｄ）、ＡＳ１４（ｅ）、ＡＳ６（ｆ）、ＡＳ７（ｇ））、ＴＡＬＥ認識配列及びその相補配列の位置、ガイドＲＮＡの標的配列の相補配列の位置をそれぞれ示す概念図である。 試験６で得られた、ＴＡＬＥ－ＡＩＤを用いたときの、ターゲットＡＳ３上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ３）の標的配列の相補配列の１塩基目（Ａ）、１０塩基目（Ｂ）、１１塩基目（Ｃ）におけるＴの割合を示すグラフである。 試験６で得られた、ＴＡＬＥ－ＡＩＤを用いたときの、ターゲットＡＳ１４上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ１４）の標的配列の相補配列の１塩基目（Ａ）、５塩基目（Ｂ）、６塩基目（Ｃ）におけるＴの割合を示すグラフである。 試験６で得られた、ＴＡＬＥ－ＡＩＤを用いたときの、ターゲットＳ２上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－Ｓ２）の標的配列の相補配列の１塩基目（Ａ）、８塩基目（Ｂ）、９塩基目（Ｃ）におけるＴの割合を示すグラフである。 試験６で得られた、ＢＥ４－ＴＡＬＥを用いたときの、ターゲットＡＳ５上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ５）の標的配列の相補配列の７塩基目（Ａ）、８塩基目（Ｂ）におけるＴの割合を示すグラフである。 試験６で得られた、ＢＥ４－ＴＡＬＥを用いたときの、ターゲットＡＳ１４上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ１４）の標的配列の相補配列の１塩基目（Ａ）、５塩基目（Ｂ）、６塩基目（Ｃ）におけるＴの割合を示すグラフである。 試験６で得られた、ＢＥ４－ＴＡＬＥを用いたときの、ターゲットＡＳ６上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ６）の標的配列の相補配列の５塩基目（Ａ）、６塩基目（Ｂ）におけるＴの割合を示すグラフである。 試験６で得られた、ＢＥ４－ＴＡＬＥを用いたときの、ターゲットＡＳ７上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ７）の標的配列の相補配列の６塩基目（Ａ）、７塩基目（Ｂ）におけるＴの割合を示すグラフである。 試験６で得られた、ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥを用いたときの、ターゲットＡＳ５上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ５）の標的配列の相補配列の３塩基目（Ａ）、４塩基目（Ｂ）におけるＧの割合を示すグラフである。 試験６で得られた、ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥを用いたときの、ターゲットＡＳ６上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ６）の標的配列の相補配列の４塩基目（Ａ）、７塩基目（Ｂ）におけるＧの割合を示すグラフである。 試験６で得られた、ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥを用いたときの、ターゲットＡＳ７上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ７）の標的配列の相補配列の４塩基目（Ａ）、８塩基目（Ｂ）におけるＧの割合を示すグラフである。
　以下、本発明の好ましい実施形態を例に挙げてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
　＜標的ＤＮＡ編集方法＞
　本発明の標的ＤＮＡ編集方法は、
　標的ＤＮＡを編集する方法であり、
（１）ＴＡＬＥ及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム
を、標的ＤＮＡに接触させ、前記融合タンパク質の核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
　前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥが認識するＴＡＬＥ認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側に７～３１ｂｐの鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
　前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法である。
　（融合タンパク質）
　本発明に係る融合タンパク質は、ＴＡＬＥ及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質である。本明細書においては、前記本発明に係る融合タンパク質を、場合により、「ＴＡＬＥ－核酸塩基変換酵素融合タンパク質」又は「ＴＡＬＥ－核酸塩基変換酵素」という。前記融合タンパク質としては、Ｎ末から、ＴＡＬＥ、核酸塩基変換酵素の順に結合されていても、核酸塩基変換酵素、ＴＡＬＥの順に結合されていてもよい。また、本発明に係る融合タンパク質としては、２以上（好ましくは２つ）の核酸塩基変換酵素を含んでいてもよく、この場合の核酸塩基変換酵素としては、１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよい。例えば、本発明に係る融合タンパク質が２つの核酸塩基変換酵素（第１の核酸塩基変換酵素、第２の核酸塩基変換酵素）を含む場合、これらは、第１の核酸塩基変換酵素、ＴＡＬＥ、第２の核酸塩基変換酵素の順に結合されていてもよい。これらの中でも、本発明に係る融合タンパク質としては、Ｎ末から、ＴＡＬＥ、核酸塩基変換酵素の順に結合されているか、Ｎ末から、核酸塩基変換酵素、ＴＡＬＥの順に結合されていることが好ましい。
　〔ＴＡＬＥ〕
　ＴＡＬＥ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ：転写活性化因子様エフェクター）は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種プロテオバクテリアが分泌し宿主植物の遺伝子転写を活性化するタンパク質である。本発明に係る「ＴＡＬＥ」は、少なくとも、Ｎ末ドメイン及びＴＡＬＥリピートドメインを含み、Ｃ末ドメインをさらに含んでいてもよい。
　ＴＡＬＥリピートドメインは、右巻き超らせん（ｓｕｐｅｒｈｅｌｉｃａｌ）を形成するＴＡＬＥ配列の、複数、例えば１０～３０、好ましくは１３～２５、より好ましくは１５～２０のタンデムリピート（ＴＡＬＥリピート）で構成される。典型的なＴＡＬＥリピート１単位（１つのＴＡＬＥ配列）は、３３～３５アミノ酸からなり、その１２番目と１３番目の２アミノ酸残基からなる可変残基（ｒｅｐｅａｔ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ：ＲＶＤ）によって、ＤＮＡの特定の塩基を認識する。塩基を特異的に認識するＲＶＤの例としては、Ｃを認識するＨＤ、Ｔを認識するＮＧ、Ａを認識するＮＩ、Ｇ又はＡを認識するＮＮ、及びＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを認識するＮＳ等が挙げられる。かかるＴＡＬＥリピートドメインのＤＮＡ認識機構に基づき、特定の塩基を認識するＴＡＬＥ配列を人工的に連結することにより、ＤＮＡ上の所望の塩基配列（ＴＡＬＥ認識配列）を認識して結合できるＴＡＬＥを作成することができる。
　本発明に係るＴＡＬＥの前記ＴＡＬＥ配列は、それぞれ、ＴＡＬＥリピートドメインがＴＡＬＥ認識配列を認識して結合できるものである限り、天然型のアミノ酸配列に対して、適宜改変されたものであってもよい。例えば、前記ＴＡＬＥ配列においては、それぞれ独立に、ＲＶＤの位置が変更されていても、ＲＶＤ以外のアミノ酸残基が１個又は複数個（例えば、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、好ましくは５個以下又は４個以下、さらに好ましくは３個以下又２個以下）置換、挿入、及び／又は欠失していてもよく、また、ＲＶＤの１２番目と１３番目の２アミノ酸残基は、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧに対する特異性を増強するために他のアミノ酸残基に置換されてもよい。
　また、本発明に係るＴＡＬＥのＴＡＬＥリピートドメインは、標的ＤＮＡの標的部位の５’側に７～３１ｂｐの鎖長のスペーサー１を介して存在する塩基配列又はその相補配列を認識するように、すなわち、ＴＡＬＥが認識するＴＡＬＥ認識配列又はその相補配列が、前記標的部位の５’側に７～３１ｂｐの鎖長のスペーサー１を介して存在する塩基配列となるように、設計される。このような所望のＴＡＬＥを設計、作製する技術は公知であり（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２９，１４３－１４８（２０１１）；Ｓａｋｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，３：３３７９（２０１３））、例えば、Ｓａｋｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．（２０１３）に記載のＰｌａｔｉｎｕｍ　Ｇａｔｅシステムによって、前記塩基配列に対する高い結合活性を有するＴＡＬＥを作製することができる。
　本発明に係るＴＡＬＥのＮ末ドメインとしては、天然型のアミノ酸配列（例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＴＦ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８５～３２１８８）に含まれるＮ末ドメインのアミノ酸配列）を用いることができるが、本発明に係る融合タンパク質の機能（ＴＡＬＥ認識配列への結合能、標的部位における編集能等）に負の影響を与えない限り、前記天然型のアミノ酸配列に対して、適宜改変されたものであってもよい。例えば、１個又は複数個（例えば、５０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、好ましくは５個以下又は４個以下、さらに好ましくは３個以下又２個以下）のアミノ酸残基が置換、挿入、及び／又は欠失していてもよい。また、精製や検出のためのフラグタグ、ＴＡＬＥ－核酸塩基変換酵素を細胞核へ移行するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）等を含んでいてもよい。
　このようなＮ末ドメインとしては、Ｎ末ドメインの鎖長が、４９～２８７アミノ酸残基であることが好ましく、８０～２００アミノ酸残基であることがより好ましく、１２０～１８０アミノ酸残基であることがさらに好ましい。前記Ｎ末ドメインの鎖長が前記下限未満であると、標的ＤＮＡに結合できなくなる傾向にあり、他方、前記上限を超えると、融合タンパク質を発現させる場合、その発現効率が低下する傾向にある。
　本発明に係るＴＡＬＥのＮ末ドメインの具体例としては、例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１３６／６３－ＶＲ－ＨＤ（ＩＤ：５０６９９）に含まれるＮ末ドメインのアミノ酸配列や、ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１５３／４７－ＶＲ－ＨＤ（ＩＤ：５０７０３）に含まれるＮ末ドメインのアミノ酸配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　本発明に係るＴＡＬＥがＣ末ドメインをさらに含む場合、かかるＴＡＬＥのＣ末ドメインとしても、天然型のアミノ酸配列（例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＴＦ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８５～３２１８８）に含まれるＣ末ドメインのアミノ酸配列）を用いることができるが、本発明に係る融合タンパク質の機能（ＴＡＬＥ認識配列への結合能、標的部位における編集能等）に負の影響を与えない限り、前記天然型のアミノ酸配列に対して、適宜改変されたものであってもよい。例えば、１個又は複数個（例えば、５０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、好ましくは５個以下又は４個以下、さらに好ましくは３個以下又２個以下）のアミノ酸残基が置換、挿入、及び／又は欠失していてもよい。
　本発明に係るＴＡＬＥがＣ末ドメインをさらに含む場合、前記ＴＡＬＥのＣ末ドメインとしては、天然型のアミノ酸配列においてＣ末側の一部のアミノ酸配列が除去されたものであってもよい。このようなＣ末ドメインとしては、Ｃ末ドメインの鎖長が、１～１８０アミノ酸残基であることが好ましく、２０～１００アミノ酸残基であることがより好ましく、４０～７０アミノ酸残基であることがさらに好ましい。前記Ｃ末ドメインの鎖長が前記上限を超えると、融合タンパク質を発現させる場合、その発現効率が低下する傾向にある。
　前記Ｃ末ドメインの具体例としては、例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＴＦ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８５～３２１８８）に含まれるＣ末ドメインのアミノ酸配列（ＷＴ：アミノ酸数＝１８０）、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＮ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８９～３２１９２）に含まれるＣ末ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸数＝６３）、ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１５３／４７－ＶＲ－ＮＧ（ＩＤ：５０７０４）に含まれるＣ末ドメインのアミノ酸配列（アミノ酸数＝４７）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　〔核酸塩基変換酵素〕
　本発明において、核酸塩基変換酵素とは、ＤＮＡ塩基のプリン又はピリミジン環上の置換基を他の基若しくは原子に変換、又は脱落させる反応を触媒することにより、ＤＮＡ鎖を切断することなく、標的のヌクレオチドを他のヌクレオチドに変換又は脱落させ得る酵素を意味する。
　このような核酸塩基変換酵素としては、上記の反応を触媒し得るものであれば特に制限はなく、例えば、デアミナーゼ、グリコシラーゼが挙げられ、これらのうちの１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよい。これらの中でも、本発明に係る核酸塩基変換酵素としては、デアミナーゼが好ましい。
　（デアミナーゼ）
　前記デアミナーゼは、塩基のアミノ基をカルボニル基に変換する脱アミノ化反応を触媒する酵素であり、核酸／ヌクレオチドデアミナーゼスーパーファミリーに属する。このようなデアミナーゼとしては、シトシン又は５－メチルシトシンをそれぞれウラシル又はチミンに変換し得るシチジンデアミナーゼ、アデニンをヒポキサンチンに変換し得るアデノシンデアミナーゼ、グアニンをキサンチンに変換し得るグアノシンデアミナーゼが挙げられ、目的の塩基置換に応じて、使い分けることができる。
　前記デアミナーゼの由来としては特に制限されず、例えば、ヤツメウナギ；ヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ、ラット、マウス等の哺乳動物が挙げられる。
　このようなデアミナーゼとして、シチジンデアミナーゼとしては、例えば、ＡＰＯＢＥＣ（ラット由来のｒＡＰＯＢＥＣ１、ヒト由来のｈＡＰＯＢＥＣ１、ｈＡＰＯＢＥＣ２、ｈＡＰＯＢＥＣ３（ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ（３Ｅ）、３Ｆ、３Ｇ、３Ｈ）、ｈＡＰＯＢＥＣ４等）；ＡＰＯＢＥＣの祖先アミノ酸配列であるＡｎｃ６８９；哺乳動物（例、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、サル等）由来のＡＩＤ（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｙｔｉｄｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＩＣＤＡ））；ＡＩＤのファミリーであり、ヤツメウナギ由来のＰｍＣＤＡ１（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ　ｍａｒｉｎｕｓ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ　１）が挙げられる。また、アデノシンデアミナーゼとしては、例えば、大腸菌由来のＴａｄＡが挙げられる。上記の各デアミナーゼには、それぞれ、その改変体（例えば、ＴａｄＡ－８ｅ、ＴａｄＡ７．１０、さらにこれらの改変体等）を含む。これらの中でも、前記デアミナーゼとしては、ＡＰＯＢＥＣ、ＰｍＣＤＡ１、Ａｎｃ６８９、及びＴａｄＡ（それぞれ、その改変体を含む）からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
　また、本発明に係る融合タンパク質がデアミナーゼを２以上含む場合、これらの組み合わせは、目的の塩基置換に応じて適宜選択することができ、例えば、同一又は異なるシチジンデアミナーゼの組み合わせ、同一又は異なるアデノシンデアミナーゼの組み合わせ、同一又は異なるグアノシンデアミナーゼの組み合わせ、シチジンデアミナーゼとアデノシンデアミナーゼとの組み合わせ、シチジンデアミナーゼとグアノシンデアミナーゼとの組み合わせ、アデノシンデアミナーゼとグアノシンデアミナーゼとの組み合わせが挙げられる。これらの中でも、デアミナーゼの組み合わせとしては、ＴａｄＡとＰｍＣＤＡ１との組み合わせが好ましい。なお、これらのデアミナーゼの塩基配列及びアミノ酸配列は公知であり、公共のデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ等）から取得することができる。
　また、前記デアミナーゼとしては、脱アミノ化活性（デアミナーゼ活性）を有する限り、これらの公知のデアミナーゼの塩基配列及びアミノ酸配列に基づいて、改変（例えば、アミノ酸残基の置換、挿入、及び／又は欠失の導入）がされたものであってもよい。デアミナーゼ活性の有無は、公知の方法を適宜用いて確認することができる。例えば、シチジンデアミナーゼでは、シチジンを基質として酵素反応を行い、シチジンの代謝産物であるウリジンを検出、定量することにより確認することができる。
　〔リンカー１〕
　本発明に係る融合タンパク質としては、リンカー１をさらに含むことが好ましい。この場合、本発明に係る融合タンパク質において、ＴＡＬＥ及び前記核酸塩基変換酵素は、リンカー１により連結される。また、本発明に係る融合タンパク質が前記核酸塩基変換酵素を複数含む場合には、それに対応してリンカー１は複数であることが好ましい。本発明に係る融合タンパク質がリンカー１を複数含む場合、これらは、１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよい。
　本発明に係る融合タンパク質がリンカー１をさらに含む場合、リンカー１の鎖長としては、特に制限されないが、１～４５０アミノ酸残基であることが好ましく、５～２５０アミノ酸残基であることがより好ましく、５～２００アミノ酸残基であることがより好ましく、１２～１５０アミノ酸残基であることがより好ましく、１２～１０４アミノ酸残基であることがさらに好ましい。前記リンカー１の鎖長が前記上限を超えると、融合タンパク質を発現させる場合、その発現効率が低下する傾向にある。
　本発明に係るリンカー１としては、例えば、Ｙａｎｇ　Ｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ　７　１３３３０（２０１６）に記載の１２アミノ酸、及びＮｉｓｈｉｄａ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　３５３，ａａｆ８７２９（２０１６）に記載の１０４アミノ酸、Ｋｏｂｌａｎ，Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　３６，ｐ．８４３－８４６（２０１８）に記載の３２アミノ酸、Ｓｕｎ，Ｎ．　ａｎｄ　Ｚｈａｏ，Ｈ．，Ｍｏｌ　ＢｉｏＳｙｓｔ　１０，ｐ．４４６－４５３（２０１４），Ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ３ｍｂ７０４１２ｂ）に記載のＨＴＳ９５アミノ酸配列（９５アミノ酸）及びその繰り返しが挙げられるが、これに限定されるものではない。
　また、本発明の融合タンパク質としては、前記核酸塩基変換酵素がＴＡＬＥのＣ末側に位置する場合には、ＴＡＬＥリピートドメインと、前記核酸塩基変換酵素との間が、１～６３０アミノ酸残基離れていることが好ましい。そのため、本発明の融合タンパク質としては、前記ＴＡＬＥのＣ末ドメイン及びリンカー１のうちの少なくとも１種を含むことが好ましい。この場合のＴＡＬＥリピートドメインと前記核酸塩基変換酵素との間の鎖長（ＴＡＬＥリピートドメインのＣ末端のＣ末側に隣接するアミノ酸残基を１残基目として、核酸塩基変換酵素のＮ末端のＮ末側に隣接する残基までのアミノ酸残基の数）としては、２５～３００アミノ酸残基であることがより好ましく、５２～１７４アミノ酸残基であることがさらに好ましい。前記鎖長が前記下限未満であると、塩基編集の効率が低下する傾向にあり、他方、前記上限を超えると、融合タンパク質を発現させる場合、その発現効率が低下する傾向にある。
　なお、このときの前記ＴＡＬＥリピートドメインのＣ末端の残基は、前記ＴＡＬＥリピートドメインのＣ末側に位置するｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｌａｓｔ　ｈａｌｆ－ｒｅｐｅａｔ（ＬＨＲ）の直前（Ｎ末側）に位置するＴＡＬＥ配列（好ましくは１単位：３３～３５アミノ酸）のＣ末端の残基（ＬＨＲが存在しない場合には前記ＴＡＬＥリピートドメインを構成する最後のＴＡＬＥ配列（好ましくは１単位：３３～３５アミノ酸）のＣ末端の残基）とすることができる。また、前記核酸塩基変換酵素のＮ末端の残基は、公知のデータベース（例えば、ＮＣＢＩ）から取得可能な典型的な核酸塩基変換酵素のアミノ酸配列と公知の手法（例えば、ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ））を用いた相同性検索で同一性が８５％以上（好ましくは９０％以上）であるアミノ酸配列の開始残基（通常はメチオニン）とすることができる。
　〔塩基除去修復インヒビター、リンカー２〕
　本発明に係る融合タンパク質としては、さらにＣ末側、すなわち、前記核酸塩基変換酵素のＣ末（前記核酸塩基変換酵素がＴＡＬＥのＣ末側に位置する場合）又はＴＡＬＥのＣ末（前記核酸塩基変換酵素がＴＡＬＥのＮ末側のみに位置する場合）に、リンカー２を介して結合された塩基除去修復インヒビターを含むことが好ましい。塩基除去修復インヒビターをさらに含む場合、当該塩基除去修復インヒビターは、前記融合タンパク質あたり、１つであっても、さらにリンカー２を介して２以上（好ましくは２つ）であってもよい。また、複数である場合には、１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよいが、１種であることが好ましい。
　本発明に係る塩基除去修復インヒビターとしては、塩基除去修復を阻害するものであれば特に制限はないが、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤が好ましい。前記ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤としては、チミンＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、アルキルグアニンＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤が挙げられる。例えば、前記核酸塩基変換酵素としてデアミナーゼであるシチジンデアミナーゼを用いる場合には、変異により生じたＤＮＡのＵ：Ｇ又はＧ：Ｕミスマッチの修復を阻害するため、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を用いることが適している。この場合、デアミナーゼとＵＧＩとが一つのポリペプチド上に存在することにより、塩基編集の効率がさらに向上する。
　このようなウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤としては、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バクテリオファージであるＰＢＳ１由来のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）又は枯草菌バクテリオファージであるＰＢＳ２由来のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）が挙げられるが、これらに制限されない。これらの塩基配列及びアミノ酸配列は公知であり、公共のデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ等）から取得することができる。また、本発明に係る塩基除去修復インヒビターとしては、上記ＤＮＡのミスマッチの修復阻害活性を有する限り、公知の塩基除去修復インヒビターの塩基配列及びアミノ酸配列に基づいて、改変（例えば、アミノ酸残基の置換、挿入、及び／又は欠失の導入）がされたものであってもよい。
　本発明に係る融合タンパク質が前記塩基除去修復インヒビターをさらに含む場合であって、前記塩基除去修復インヒビターが複数である場合には、融合タンパク質－リンカー２－第１の塩基除去修復インヒビター－リンカー２－第２の塩基除去修復インヒビター－・・・のように、リンカー２を介して連結することができる。このときの複数あるリンカー２としては、１種のみであっても２種以上の組み合わせであってもよいが、１種であることが好ましい。
　このようなリンカー２としては、特に制限されないが、鎖長が１～５０アミノ酸残基であることが好ましく、５～３０アミノ酸残基であることがより好ましく、８～１５アミノ酸残基であることがさらに好ましい。前記リンカー２の鎖長が前記下限未満であると、前記塩基除去修復インヒビターの機能性が低下する傾向にあり、他方、前記上限を超えると、融合タンパク質を発現させる場合、その発現効率が低下する傾向にある。
　本発明に係るリンカー２としては、例えば、ＡｄｄｇｅｎｅのｐＣＭＶ＿ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ＿Ｐ２Ａ＿ＧＦＰ（ＩＤ：１１２１００）に記載の１０アミノ酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　〔その他〕
　本発明に係る融合タンパク質としては、さらに、Ｎ末及び／又はＣ末に、精製や検出のためのフラグタグ、ＴＡＬＥ－核酸塩基変換酵素を細胞核へ移行するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）等を含んでいてもよく、これらは、上記のようにＴＡＬＥのＮ末ドメインに含まれていても、融合タンパク質のＮ末及び／又はＣ末に付加されていてもよい。
　本発明に係る融合タンパク質は、例えば、上記のＴＡＬＥ及び核酸塩基変換酵素、並びに、必要に応じてリンカー１、前記塩基除去修復インヒビター、リンカー２、及びその他アミノ酸をコードする遺伝子を一体として転写・発現させることで得ることができる。また、本発明に係る融合タンパク質は、従来公知の方法を適宜採用、改良することによって生産することができ、例えば、そのアミノ酸配列に基づいて市販の合成機によって化学的に合成する方法や、下記の標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法において述べるように、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は該融合タンパク質を発現するベクターを前記細胞に導入して発現させる方法によって得ることができる。
　（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム）
　本発明に係るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを含む。
　〔Ｃａｓ９タンパク質〕
　本発明に係るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおいて、Ｃａｓ９タンパク質としては、ヌクレアーゼ活性の一部を喪失しているＣａｓ９タンパク質（本明細書では「ｎＣａｓ９」という）、又はヌクレアーゼ活性の全部を喪失しているＣａｓ９タンパク質（本明細書では「ｄＣａｓ９」という）であることが必要である。すなわち、Ｃａｓ９タンパク質は、典型的には、標的鎖の切断に関与するドメイン（ＲｕｖＣドメイン）及び非標的鎖の切断に関与するドメイン（ＨＮＨドメイン）を含むが、本発明に係るＣａｓ９タンパク質としては、変異の導入等により、少なくとも一方のドメインのヌクレアーゼ活性が喪失していることが必要である。
　このような変異としては、ＳｐＣａｓ９タンパク質（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質）の場合には、例えば、Ｎ末端から１０番目のアミノ酸（アスパラギン酸）のアラニンへの変異（Ｄ１０Ａ：ＲｕｖＣドメイン内の変異）、Ｎ末端から８４０番目のアミノ酸（ヒスチジン）のアラニンへの変異（Ｈ８４０Ａ：ＨＮＨドメイン内の変異）、Ｎ末端から８６３番目のアミノ酸（アスパラギン）のアラニンへの変異（Ｎ８６３Ａ：ＨＮＨドメイン内の変異）、Ｎ末端から７６２番目のアミノ酸（グルタミン酸）のアラニンへの変異（Ｅ７６２Ａ：ＲｕｖＣＩＩドメイン内の変異）、Ｎ末端から９８６番目のアミノ酸（アスパラギン酸）のアラニンへの変異（Ｄ９８６Ａ：ＲｕｖＣＩＩＩドメイン内の変異）が挙げられる。その他、種々の由来のＣａｓ９タンパク質が公知であり（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３）、それらのｎＣａｓ９又はｄＣａｓ９を利用することができるが、これらに限定されるものではない。
　なお、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列及び塩基配列は、公開されたデータベース、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されており（例えば、アクセッション番号：ＫＸ１５１７３０．１等）、本発明においてはこれらを利用することができる。また、前記Ｃａｓ９タンパク質には、さらなる変異、例えば、ＰＡＭ配列の認識を改変するための変異が導入されていてもよく（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　５２３，４８１－４８５（２０１５）；Ｈｉｒａｎｏ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ　６１，８８６－８９４（２０１６））、さらに、細胞核へ移行するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）等を付加したものであってもよい。また、このようなＣａｓ９タンパク質としては、市販の入手可能なプラスミド内に含まれる配列にコードされるものであってもよい。
　前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおけるＣａｓ９タンパク質については、ガイドＲＮＡ標的配列が、前記標的ＤＮＡの標的部位の相補塩基を含むように、下記のガイドＲＮＡが設計される。なお、本発明において、前記標的ＤＮＡの標的部位の相補塩基とは、前記標的部位が存在する鎖の相補鎖上の、前記標的部位１塩基の相補塩基を示す。これにより、二本鎖である標的ＤＮＡにおいて、一本鎖ＤＮＡを露出させるヘリカーゼ活性により標的部位を特異的に露出させ、前記核酸塩基変換酵素による編集効率を向上させる。
　〔ガイドＲＮＡ〕
　本発明に係るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおいて、ガイドＲＮＡは、標的となるＤＮＡ上の配列（ガイドＲＮＡ標的配列）に相補的な塩基配列（以下、場合により「標的化塩基配列」という）を含むｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ）と、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｃｒＲＮＡ）と、の組み合わせである。前記ｃｒＲＮＡは、さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を３’側に含む。一方、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部の塩基配列と相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を５’側に含むため、前記ガイドＲＮＡは、これら塩基配列の相互作用により、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用する二重鎖ＲＮＡを形成する。このため、前記ガイドＲＮＡが、前記標的ＤＮＡのガイドＲＮＡ標的配列を認識して結合し、当該ガイドＲＮＡと複合体を形成するＣａｓ９タンパク質を当該標的ＤＮＡに誘導し、誘導されたＣａｓ９タンパク質が、そのヘリカーゼ活性によって、当該標的ＤＮＡの標的部位において一本鎖ＤＮＡを露出する。
　本発明に係るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムのガイドＲＮＡとしては、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であっても、ｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片とからなる二分子ガイドＲＮＡであってもよい。
　前記標的ＤＮＡにおいて、標的部位の塩基の編集は、前記ガイドＲＮＡの標的化塩基配列とガイドＲＮＡ標的配列との間の塩基対形成の相補性と、ガイドＲＮＡ標的配列の相補鎖の３’側に存在するＰＡＭ配列と、の両方によって決定される位置で起きる。本発明に係るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムのガイドＲＮＡは、そのガイドＲＮＡ標的配列が、前記標的部位の相補塩基を含む配列となり、当該標的部位の３’側のＰＡＭ配列をＣａｓ９タンパク質が認識可能となるように設計される。これにより、二本鎖である標的ＤＮＡにおいて、一本鎖ＤＮＡを露出させるヘリカーゼ活性により標的部位を特異的に露出させ、前記核酸塩基変換酵素による編集効率を向上させる。
　このようなＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列及びガイドＲＮＡ標的配列を設計する方法としては、種々の方法が知られており、例えば、Ｅ－ＣＲＩＳＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅ－ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ－ＣＲＩＳＰ／）、Ｚｉｆｉｔ　Ｔａｒｇｅｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｚｉｆｉｔ．ｐａｒｔｎｅｒｓ．ｏｒｇ／ＺｉＦｉＴ／）（Ｚｉｎｇ　Ｆｉｎｇｅｒコンソーシアム）、ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ／）（東京大学）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｉ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｒｉｓｐｒ／）（華中農業大学）、Ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ　Ｔａｒｇｅｔ　Ｄｅｓｉｇｎ　Ｔｏｏｌ．（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗｓ．ｂｌｕｅｈｅｒｏｎｂｉｏ．ｃｏｍ／ｅｘｔｅｒｎａｌ／ｔｏｏｌｓ／ｇＲＮＡＳｒｃ．ｊｓｐ）（Ｂｌｕｅ　Ｈｅｒｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）などを利用して決定することができる。
　本発明に係るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、例えば、下記の標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法において述べるように、上記のＣａｓ９タンパク質、及びガイドＲＮＡをコードする遺伝子をそれぞれ同時に転写・発現させることで得ることができる。本発明に係るＣａｓ９タンパク質、及びガイドＲＮＡは、従来公知の方法を適宜採用、改良することによって生産することができ、例えば、これらをコードするポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを前記細胞に導入して発現させる方法によって得ることができる。
　（標的ＤＮＡ）
　本発明においては、目的とするＤＮＡ編集の対象となる標的部位を含むＤＮＡを「標的ＤＮＡ」という。本発明に係る標的ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡであり、上記の融合タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムとの対応を示すために、便宜的に、少なくとも一方の鎖が、５’側から順に、ＴＡＬＥ認識配列又はその相補配列、スペーサー１、前記標的部位、ＰＡＭ配列、を含む構造であるものとする。５’側にＴＡＬＥ認識配列の相補配列を含むとは、当該鎖の相補鎖が、ＴＡＬＥ認識配列を含むことを示す。すなわち、ＴＡＬＥ認識配列は、前記標的部位と同じ鎖上に設定しても、その相補鎖上に設定してもよい。また、当該鎖の相補鎖が、前記標的部位の相補塩基を含むように、ガイドＲＮＡ標的配列を含むものとする。本発明に係る標的ＤＮＡの構成の一例を下記の図２に示すが、これに限定されるものではない。
　本発明に係る標的部位とは、前記核酸塩基変換酵素による編集（好ましくはデアミナーゼによる脱アミノ化）の標的とする１塩基を示す。ただし、当該１塩基の両側近傍の塩基（特に、デアミナーゼによる脱アミノ化の標的となる塩基が存在する場合。好ましくは、５’側及び３’側のそれぞれ１～１０塩基、より好ましくは１～５塩基、さらに好ましくは１～２塩基）がさらに編集（デアミナーゼの場合には脱アミノ化）されることを否定するものではない。
　ＴＡＬＥ認識配列は、前記ＴＡＬＥが認識する配列である。ＴＡＬＥ認識配列の塩基数としては、１０～３０塩基、好ましくは１３～２５塩基、より好ましくは１５～２０塩基である。前記ＴＡＬＥ認識配列は、前記標的部位の５’側に７～３１ｂｐの鎖長のスペーサー１を介して存在するように選択される。スペーサー１の鎖長がかかる範囲内にあることにより、特異的かつ高効率で前記標的部位の１塩基を脱アミノ化することができる。前記スペーサー１の鎖長は、標的部位の塩基の５’側に隣接する塩基を１塩基目として、前記ＴＡＬＥ認識配列の３’側に隣接する塩基までの長さである。このようなスペーサー１の鎖長としては、１０～３１ｂｐであることがより好ましく、１０～２８ｂｐであることがさらに好ましく、１３～２５ｂｐであることがさらにより好ましい。
　ＰＡＭ配列は、前記Ｃａｓ９タンパク質が認識する配列である。ＰＡＭ配列は、利用するＣａｓ９タンパク質の種類によって異なる。典型的なＰＡＭ配列としては、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ型）に対応するＰＡＭ配列は５’－ＮＧＧであり、Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ａ１型）に対応するＰＡＭ配列は５’－ＣＣＮであり、Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ａ２型）に対応するＰＡＭ配列は５’－ＴＣＮであり、Ｈ．ｗａｌｓｂｙｌ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｂ型）に対応するＰＡＭ配列は５’－ＴＴＣであり、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｅ型）に対応するＰＡＭ配列は５’－ＡＷＧであり、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｆ型）に対応するＰＡＭ配列は５’－ＣＣであり、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｆ型）に対応するＰＡＭ配列は５’－ＣＣであり、Ｓ．Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ－Ａ型）に対応するＰＡＭ配列は５’－ＮＮＡＧＡＡであり、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ－Ａ型）に対応するＰＡＭ配列は５’－ＮＧＧであり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭ配列は、５’－ＮＧＲＲＴ又は５’－ＮＧＲＲＮであり、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴであり、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭ配列は、５’－ＮＡＡＡＡＣである。なお、上記のとおり、Ｃａｓ９タンパク質を改変すること（例えば、変異の導入）により、ＰＡＭ認識を改変することも可能である。これにより標的部位の選択肢を拡大することが可能である。
　本発明において、前記ＰＡＭ配列は前記標的部位の３’側に存在し、前記ガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記ＰＡＭ配列の位置に応じて決定される。本発明において、前記ガイドＲＮＡ標的配列内における前記標的部位の相補塩基の位置は、特に限定されないが、例えば、第１位～第５０位の間であることが好ましく、第１位～第３０位の間であることがより好ましく、第１位～第２５位の間であることがさらに好ましい。なお、前記ガイドＲＮＡ標的配列内における塩基の位置は、前記ガイドＲＮＡ標的配列の３’末端の塩基を第１位として、前記ＰＡＭ配列の５’側に隣接する塩基の相補塩基までの位置である。前記塩基位置の上限及び下限は、前記ガイドＲＮＡ標的配列の長さに依存し、前記ガイドＲＮＡの長さを調節することにより調整可能である。
　前記ガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含む配列となるように選択される。ガイドＲＮＡ標的配列の位置をこのように選択することにより、特異的かつ高効率で前記標的部位の１塩基を編集することができる。本発明に係るガイドＲＮＡ標的配列の塩基数としては、好ましくは１２～５０塩基、より好ましくは１７～３０塩基、さらに好ましくは１７～２５塩基である。
　このような標的ＤＮＡの塩基配列としては、特に制限されず、ＴＡＬＥ認識配列又はその相補配列、スペーサー１、ガイドＲＮＡ標的配列の相補配列、前記相補配列に含まれる標的部位、及びＰＡＭ配列が、上記条件を満たすように、ＴＡＬＥ及びガイドＲＮＡの標的化塩基配列を設計し、及び必要に応じてＰＡＭの認識特異性を改変することにより、本発明のＤＮＡ編集方法の標的とすることができる。
　さらに、本発明に係る標的ＤＮＡとしては、目的に応じて、細胞内に存在するＤＮＡ（内在性ＤＮＡ）又は細胞外に存在するＤＮＡとすることができる。細胞内に存在するＤＮＡとしては、内因性ＤＮＡであっても、外因性ＤＮＡであってもよい。内因性ＤＮＡとしてはゲノムＤＮＡが挙げられ、外因性ＤＮＡとしては、例えば、細胞内に導入したＤＮＡが挙げられる。細胞外に存在するＤＮＡとしては、細胞に由来するＤＮＡであっても、細胞外で増幅、合成したＤＮＡであってもよい。
　（標的ＤＮＡ編集方法）
　本発明の標的ＤＮＡ編集方法では、前記融合タンパク質及び前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを、前記標的ＤＮＡに接触させ、前記融合タンパク質の核酸塩基変換酵素活性により、前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する。
　前記融合タンパク質及び前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを標的ＤＮＡに接触させると、融合タンパク質のＴＡＬＥが標的ＤＮＡ上のＴＡＬＥ認識配列を認識して結合し、ＴＡＬＥに連結された核酸塩基変換酵素を当該標的ＤＮＡに誘導する。他方、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムのガイドＲＮＡが標的ＤＮＡ上のガイドＲＮＡ標的配列を認識して結合し、当該ガイドＲＮＡと複合体を形成するＣａｓ９タンパク質を当該標的ＤＮＡに誘導する。これにより、標的部位において、Ｃａｓ９タンパク質がヘリカーゼ活性によって一本鎖ＤＮＡを露出するため、前記核酸塩基変換酵素により、目的の塩基の置換（例えば、塩基の脱アミノ化）を効率的に起こすことができる。これにより、標的部位で１塩基の置換が起こり（例えば、Ｃ→Ｕ）、また、例えば細胞内では、二本鎖ＤＮＡのミスマッチにより、置換が起こった鎖の反対鎖の塩基が置換塩基と対形成するように修復されたり（例えば、Ｇ→Ａ）、修復の際に他のヌクレオチドに置換されたり（例えば、Ｕ→Ａ、Ｇ）、或いは１塩基又は十数塩基の欠失若しくは挿入を生じることにより、種々の変異が導入され得る。
　したがって、本発明に係るＤＮＡの編集には、前記核酸塩基変換酵素で変換された標的部位及びそれを含む近傍における、１以上のヌクレオチドの欠失、他の１以上のヌクレオチドへの置換、若しくは１以上のヌクレオチドの挿入、又はこれらの変異の組み合わせを含む。
　本発明の標的ＤＮＡ編集方法は、細胞内において行っても、無細胞系において行ってもよい。本発明の標的ＤＮＡ編集方法の場となる「細胞内」としては、真核細胞内であっても原核細胞内であってもよく、好ましくは真核細胞内である。前記真核細胞としては、例えば、動物細胞（哺乳類、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類の細胞等）、植物細胞、藻細胞、酵母が挙げられ、前記原核細胞としては、例えば、大腸菌、サルモネラ菌、枯草菌、乳酸菌、高度好熱菌が挙げられる。
　「動物細胞」には、例えば、動物の個体を構成している細胞、動物から摘出された器官・組織を構成する細胞、動物の組織に由来する培養細胞などが含まれる。具体的には、例えば、卵母細胞や精子などの生殖細胞；各段階の胚の胚細胞（例えば、１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、桑実期胚など）；誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞や胚性幹（ＥＳ）細胞などの幹細胞；線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、脳細胞、腎細胞などの体細胞などが挙げられる。ゲノム編集動物の作成に用いられる卵母細胞としては、受精前及び受精後の卵母細胞を利用することができるが、好ましくは受精後の卵母細胞、すなわち受精卵である。特に好ましくは、受精卵は前核期胚のものである。卵母細胞は、凍結保存されたものを解凍して用いることができる。
　「植物細胞」には、例えば、植物の個体を構成している細胞、植物から分離した器官や組織を構成する細胞、植物の組織に由来する培養細胞などが含まれる。植物の器官や組織としては、例えば、葉、茎、茎頂（生長点）、根、塊茎、カルスなどが挙げられる。
　また、本発明の標的ＤＮＡ編集方法の場となる「無細胞系」とは、生きた細胞（前記真核細胞、原核細胞）のない系を示す。本発明に係る無細胞系としては、前記融合タンパク質及び前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと、前記標的ＤＮＡとが接触可能な系であれば特に制限されず、例えば、緩衝液内；前記真核細胞又は原核細胞の細胞破砕液内、細胞抽出液内等が挙げられる。
　前記融合タンパク質及び前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと、前記標的ＤＮＡとを接触させる方法としては特に制限されない。細胞内においては、例えば、下記の標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法のように、前記標的ＤＮＡを含む細胞に対して前記融合タンパク質及び前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを導入する又はこれらをコードするベクター等を細胞に導入して発現させる方法が挙げられる。無細胞系においては、例えば、標的ＤＮＡの溶液と前記融合タンパク質及び前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの溶液とを混合すればよい。これらの溶液の溶媒としては、特に制限されないが、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液が好ましい。
　＜標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法＞
　本発明の標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法は、
　標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法であり、
（１）ＴＡＬＥ及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム
を、細胞に導入又は細胞内で発現させて標的ＤＮＡに接触させ、前記融合タンパク質の核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
　前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥが認識するＴＡＬＥ認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側に７～３１ｂｐの鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
　前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
方法である。
　本発明の標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法（以下、場合により単に「製造方法」という）において、前記融合タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、及び標的ＤＮＡは、上記の本発明の標的ＤＮＡ編集方法で述べたとおりである。本発明の製造方法における標的ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡであり、当該ゲノムＤＮＡの編集目的に応じて、前記融合タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを設計することができる。
　また、本発明の製造方法において、融合タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと細胞内の標的ＤＮＡとの接触は、前記融合タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの、細胞へのタンパク質の形態での導入、細胞へのポリヌクレオチドの形態での導入、及び／又は、細胞へのポリヌクレオチドの形態での導入若しくは発現ベクターでの導入により細胞内で発現させることにより行う。したがって、前記融合タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムとしては、前記融合タンパク質及びＣａｓ９タンパク質を、それぞれ独立に、タンパク質の形態で細胞に導入しても、当該タンパク質をコードするＲＮＡやＤＮＡ（ポリヌクレオチド）の形態で細胞に導入して細胞内で発現させても、当該タンパク質を発現するベクター（発現ベクター）の形態で細胞に導入して細胞内で発現させてもよい。また、これと独立して、前記ガイドＲＮＡを、ＲＮＡの形態で細胞に導入しても、当該ＲＮＡをコードするＤＮＡ（ポリヌクレオチド）の形態で細胞に導入して細胞内で発現させても、当該ＲＮＡを発現するベクター（発現ベクター）の形態で細胞に導入して細胞内で発現させてもよい。
　前記融合タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを発現ベクターの形態で細胞に導入して細胞内で発現させる場合には、例えば、前記融合タンパク質を発現するベクター、前記Ｃａｓ９タンパク質を発現するベクター、及び前記ガイドＲＮＡを発現するベクターをそれぞれ細胞内に導入してもよく、また、これらのうちの２種以上を組み合わせて発現するベクターを細胞内に導入してもよい。
　また、前記融合タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを発現ベクターの形態で細胞に導入して細胞内で発現させる場合、前記融合タンパク質及び前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、それぞれ独立して、導入する細胞に応じて適宜コドン最適化されたものであってもよい。また、当該発現ベクターとしては、発現させるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結しているプロモーター及び／又はその他の制御配列を含むことが好ましい。さらに、当該発現ベクターとしては、宿主ゲノムに組み込まれることなく、コードするタンパク質を安定して発現することができるものであることが好ましい。このような発現ベクターは、適宜従来公知の方法に準じて作製することができる。
　前記融合タンパク質及び前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの、タンパク質、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、当該タンパク質を発現するベクターを細胞に導入する方法としては、タンパク質やＤＮＡ、ＲＮＡ断片を細胞に導入するための公知の方法を細胞の種類に応じて適宜採用することができ、このような方法としては、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム法、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法、リポソーム法（リポフェクション法）、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、ウイルス（アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウィルス等）、アグロバクテリウム法、酢酸リチウム法、スフェロプラスト法、熱ショック法（塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法）等が挙げられる。このような方法は、「Ｌｅｏｎａｒｄ　Ｇ．Ｄａｖｉｓｅｔ　ａｌ．，Ｂａｓｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６」等、多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
　前記融合タンパク質及び前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムが細胞に導入又は細胞内で発現すると、前記融合タンパク質及び前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと細胞内の標的ＤＮＡとが接触し、上記の本発明の標的ＤＮＡ編集方法で述べた標的ＤＮＡ編集により、標的部位で目的の１塩基の塩基の置換が起こり、その結果、標的ＤＮＡが編集された細胞を得ることが可能となる。
　本発明はまた、前記標的ＤＮＡの編集がされた細胞を含む非ヒト個体の作製方法を提供する。この方法は、上記の製造方法により得られた細胞から非ヒト個体を作製する工程を含む。前記非ヒト個体としては、例えば、非ヒト動物及び植物が挙げられる。前記非ヒト動物としては、哺乳類（マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、サル、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなど）、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類が挙げられる。モデル動物を作製する場合、哺乳動物は、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどのげっ歯類であり、特に好ましくはマウスである。前記植物としては、例えば、穀物類、油料作物、飼料作物、果物、野菜類が挙げられる。具体的な作物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、タバコ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーションを例示することができる。
　前記標的ＤＮＡの編集がされた細胞から非ヒト個体を作製する方法としては、公知の方法を利用することができる。動物において細胞から非ヒト個体を作製する場合、通常、生殖細胞又は多能性幹細胞が利用される。例えば、前記融合タンパク質及び前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを卵母細胞にマイクロインジェクションし、得られた卵母細胞を偽妊娠状態にした雌非ヒト哺乳動物の子宮に移植し、その後産仔を得ることができる。また、植物においては、古くから、その体細胞が分化全能性を有していることが知られており、例えば、前記融合タンパク質及び前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを植物細胞にマイクロインジェクションし、得られた植物細胞から植物体を再生することにより、所望のＤＮＡが編集された植物体を得ることができる。また、得られた非ヒト個体からは、所望のＤＮＡが編集された子孫やクローンを得ることもできる。
　標的ＤＮＡ編集の有無の確認、及び遺伝子型の決定は、従来公知の手法に基づいて行うことができ、例えばＰＣＲ法、配列決定法、サザンブロッティング法等を利用することができる。
　＜ＤＮＡ編集システム＞
　また、本発明は、上記本発明の標的ＤＮＡ編集方法、本発明の標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法、又は上記本発明の非ヒト個体の作製方法に用いるための、
（１）ＴＡＬＥ及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
（２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム
を含む、ＤＮＡ編集システムを提供する。
　前記融合タンパク質、及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、上記の本発明の標的ＤＮＡ編集方法及び製造方法で述べたとおりである。これらはそれぞれ独立して、タンパク質又はＲＮＡの形態であっても、当該タンパク質又はＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの形態であっても、当該タンパク質又はＲＮＡを発現するベクター（発現ベクター）の形態であってもよい。
　また、ベクターの形態である場合、本発明は、標的ＤＮＡの標的部位に応じて、ユーザーが前記融合タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを設計することができるように、
（ａ）ＴＡＬＥをコードするポリヌクレオチドの挿入部位と前記融合タンパク質のＴＡＬＥ以外をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、並びに、
（ｂ）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は、該ポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｃ）前記Ｃａｓ９タンパク質のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は、該ポリヌクレオチドを含むベクター若しくは該ポリヌクレオチドの挿入部位を含むベクター、
を含む、ＤＮＡ編集システムを提供する。なお、（ａ）～（ｃ）の各ベクターは、それぞれ、各ポリヌクレオチドを発現可能にする発現ユニットを含むものである。
　本発明のＤＮＡ編集システムは、それぞれ、前記融合タンパク質及び前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを含む組み合わせからなる組み合わせ物としても、前記組み合わせを含むキットとしてもよい。キットとする場合、当該キットは、一つ又は複数の追加の試薬をさらに含んでいてもよい。このような追加の試薬としては、例えば、希釈緩衝液、再構成溶液、洗浄緩衝液、核酸導入試薬、タンパク質導入試薬、対照試薬（例えば、対照のデアミナーゼ）が挙げられるが、これらに制限されるものではない。また、当該キットは、本発明の方法を実施するための使用説明書をさらに含んでいてもよい。
　前記キットに含まれる各要素は、それぞれ別個の容器に収容されていてもよいし、同一の容器に収容されていてもよい。各要素は、一回の使用量ごとに容器に収容されていてもよいし、複数回分の量が一つの容器に収容されていてもよい。各要素は乾燥形態で容器に収容されていてもよいし、適当な溶媒（緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等を含む溶媒）中に溶解した形態で容器に収容されていてもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　１．レポータープラスミドの作製
　レポーターとして、ｐＮＬＦ１－Ｃ［ＣＭＶ　Ｈｙｇｒｏ］（ＰＲＯＭＥＧＡ社製，ＷＩ，ＵＳＡ）を用い、部位特異的変異導入法によって７１番目と１０７番目のメチオニンコドン（ＡＴＧ）をアラニンコドン（ＡＴＡ）に変更してｐＮＬＦ－Ｍ／Ａとした。次いで、ｐＮＬＦ－Ｍ／Ａに、先ず、下記の表１に示した配列（ＢＥｔａｇ）を挿入した。ＢＥｔａｇ配列は、ＴＡＬＥ認識配列（表１中の下線（＊１）：５’－ｔＡＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧ－３’；小文字はＴＡＬＥのＮ末ドメインが認識するチミンを示す）、ターゲットコドン（表１中の下線（＊２）：５’－ＡＣＧ－３’）、及びこれらの間のスペーサー１配列を含み、スペーサー１配列の長さは、ターゲットコドンの５’にある塩基（Ａ）を含めて、７ｂｐ、１３ｂｐ、１９ｂｐ、２５ｂｐ、又は３１ｂｐとした。各ＢＥｔａｇ配列（ＢＥｔａｇ－７～３１ｂｐ：配列番号１～５）には、両端にＮｈｅＩ認識サイト及びＳｂｆＩ認識サイトを付加できるように設計したオリゴヌクレオチドをアニールして、ＮｈｅＩ及びＳｂｆＩで処理したｐＮＬＦ－Ｍ／Ａに挿入し、ｐＮＬＦ－ＢＥｔａｇ（ｐＮＬＦ－ＢＥｔａｇ－７ｂｐ～３１ｂｐ）とした。
　なお、前記ＴＡＬＥ認識配列は、細胞内活性が確認されているｈｕｍａｎ　ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ　ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ　ｃｏｌｉ遺伝子に対するＴＡＬＥＮのＲｉｇｈｔ　ＴＡＬＥ　配列（Ｓａｋｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．，”Ｒｅｐｅａｔｉｎｇ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ｎｏｎ－ＲＶＤ　ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｄｕｌｅｓ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ＴＡＬＥＮ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．”，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，３：３３７９（２０１３））である。
　さらに、ｐＮＬＦ－ＢＥｔａｇにＰＡＭ配列（５’－ＮＧＧ－３’）を挿入するため、下記の表１に示したＰＡＭ部を含む配列（ＰＡＭ：配列番号６）のオリゴヌクレオチドと、そのアンチセンス配列の５’末端に５’－ＴＣＧＡ－３’を付加したオリゴヌクレオチドとをアニールして、ＥｃｏＲＶ及びＸｈｏＩで処理した各ｐＮＬＦ－ＢＥｔａｇに挿入し、レポータープラスミド（ｐＮＬＦ－ＢＥｔａｇ－７ｂｐ－ＰＡＭ、ｐＮＬＦ－ＢＥｔａｇ－１３ｂｐ－ＰＡＭ、ｐＮＬＦ－ＢＥｔａｇ－１９ｂｐ－ＰＡＭ、ｐＮＬＦ－ＢＥｔａｇ－２５ｂｐ－ＰＡＭ、ｐＮＬＦ－ＢＥｔａｇ－３１ｂｐ－ＰＡＭ）を作製した。
　ＰＡＭ部（表１中の下線（＊３））には、９個の連続した「Ｇ」が含まれるため、ＰＡＭ部の５’側に位置するガイドＲＮＡ標的配列の相補配列が１塩基ずつ３’側にずれるようにガイドＲＮＡを設計することにより、ＰＡＭ配列の位置を１塩基ずつ下流にずらすことができ、これにより、８箇所のＰＡＭ配列（下記の表７のＰＡＭ１～８）を設定することができる。下記の表１に、ｐＮＬＦ－Ｍ／Ａプラスミドに挿入した各配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　完成したレポータープラスミドの構造を示す概念図を図１に示す。また、ＴＡＬＥ認識配列、スペーサー１、標的部位、ＰＡＭ部、及びガイドＲＮＡ標的配列を含むＮｈｅＩ認識サイトからＸｈｏＩ認識サイトまでの配列を図２に示す。このレポータープラスミドにおいて、ターゲットコドンは、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼの開始コドンに相当する箇所に位置しており、かかるレポータープラスミドによれば、ＴＡＬＥ認識配列に結合したＴＡＬＥ－デアミナーゼにより、ターゲットコドンであるＡＣＧがＡＴＧに変換される（ターゲット塩基（標的部位）であるＣがＴに置換される）と、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼを発現する（図３）。
　２．ＴＡＬＥベクターセット及びＴＡＬＥ発現プラスミドの作製
　ＴＡＬＥベクターセットの配列及び構成は、ＴＡＬＥリピートユニットが上記１．で作製したレポータープラスミドのＴＡＬＥ認識配列に対応するように、Ｓａｋｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．（２０１３）にしたがって構築した。先ず、１２番目と１３番目の２アミノ酸で構成される可変残基の４種（ＲＶＤ：ＨＤ、ＮＧ、ＮＩ、ＮＮ）をコードする配列以外のモジュール配列（ｎｏｎ－ｒｅｐｅａｔ－ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅ（ｎｏｎ－ＲＶＤ））に改変（特に、４番目と３２番目）を加え、さらにその両端に制限酵素ＢｓＡＩ認識サイトを付加した配列（モジュール配列）を人工ＤＮＡ合成した（計１６種：１ＨＤ～４ＨＤ、１ＮＧ～４ＮＧ、１ＮＩ～４ＮＩ、１ＮＮ～４ＮＮ）。次いで、これらモジュール配列をｐＥＸ－Ａ２Ｊ２（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社製，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に挿入して、モジュールプラスミドセット（計１６種：ｐＥＸ１ＨＤ～ｐＥＸ４ＨＤ、ｐＥＸ１ＮＧ～ｐＥＸ４ＮＧ、ｐＥＸ１ＮＩ～ｐＥＸ４ＮＩ、及びｐＥＸ１ＮＮ～ｐＥＸ４ＮＮ）を作製した。
　また、アレイプラスミドを構成するＤＮＡ配列ＦＵＳ２＿ａＸＸ（計７種：ＸＸ＝１ａ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ）及びＦＵＳ２＿ｂ（１－４）（計４種）を人工ＤＮＡ合成により作製した。これらをｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）に挿入して、ｐＣＲ８＿ＦＵＳ２＿ａＸＸ及びｐＣＲ８＿ＦＵＳ＿ｂ（１－４）を作製した。次いで、これをＳａｋｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．（２０１３）に記載のＰｌａｔｉｎｕｍ　Ｇａｔｅシステムにおける最初のアセンブルステップ（ステップ１）の捕捉ベクターとして使用し、同文献に記載の方法にしたがって、ＴＡＬＥ配列を連結したアレイプラスミドを作製した。
　次いで、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）から薬剤耐性遺伝子発現ユニットを除去したｐｃＤＮＡ３．１ｓに、人工ＤＮＡ合成により作製した、ＴＡＬＥのＮ末ドメインをコードする配列に加え、前記モジュール配列を１つと、この３’末に続くＴＡＬＥのＣ末ドメインをコードする配列と、を挿入したデスティネーションベクター（ＴＡＬＥ－ＷＴ、ＴＡＬＥ－６３、ＴＡＬＥ－４７）を作製した。ＴＡＬＥのＣ末ドメインとしては、野生型（ＷＴ：Ｃ末ドメインのアミノ酸数＝１８０）、Ｃ末ドメインのアミノ酸数が６３のもの（６３）、Ｃ末ドメインのアミノ酸数が４７のもの（４７）、の３種を用い、「ＷＴ」をコードする配列はＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＴＦ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８５～３２１８８）に含まれるＣ末ドメインの配列を、「６３」をコードする配列はＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＮ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８９～３２１９２）に含まれるＣ末ドメインの配列を、「４７」をコードする配列はＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１５３／４７－ＶＲ－ＮＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ　ＩＤ：５０７０４）に含まれるＣ末ドメインの配列を、それぞれ参照して人工ＤＮＡ合成した。また、ＴＡＬＥのＮ末ドメインとしては、これらＣ末ドメインに対応させて、ＷＴ：ＡｄｄｇｅｎｅのｐＴＡＬＥＴＦ＿ｖ２（ＩＤ：３２１８５～３２１８８）に含まれるＮ末ドメインの配列；６３：ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１３６／６３－ＶＲ－ＨＤ（ＩＤ：５０６９９）に含まれるＮ末ドメインの配列；４７：ＡｄｄｇｅｎｅのｐｔＣＭＶ－１５３／４７－ＶＲ－ＨＤ（ＩＤ：５０７０３）に含まれるＮ末ドメインの配列を、それぞれ参照して人工ＤＮＡ合成した。上記で作製したアレイプラスミド及びデスティネーションベクターを用いて、Ｓａｋｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．（２０１３）に記載の方法にしたがい、Ｇｏｌｄｅｎ　Ｇａｔｅ法によってＴＡＬＥ発現プラスミドを作製した。
　３．ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドの作製（１）
　（１）１０４アミノ酸リンカーシリーズ
　先ず、人工ＤＮＡ合成により作製したＡｎｃＢＥ４ｍａｘ遺伝子（Ｋｏｂｌａｎ　ｅｔ　ａｌ．，”Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　ｃｙｔｉｄｉｎｅ　ａｎｄ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｂａｓｅ　ｅｄｉｔｏｒｓ　ｂｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎｃｅｓｔｒａｌ　ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．”，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３６，ｐ．８４３－８４６（２０１８））と、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ遺伝子（Ｎｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．，”Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ａｎｄ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ａｄａｐｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ．”，Ｓｃｉｅｎｃｅ　３５３，ａａｆ８７２９（２０１６））と、をｐｃＤＮＡ３．１ｓのＢａｍＨＩ認識サイトとＥｃｏＲＶ認識サイトとの間にそれぞれ挿入することにより、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ発現プラスミド及びＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤ発現プラスミドを作製した。
　次いで、１０４アミノ酸リンカー１を有するＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドを以下の方法により作製した。すなわち、上記ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ発現プラスミドのＡｎｃＢＥ４ｍａｘ遺伝子を鋳型として、下記の表２に記載のプライマーを用いて、Ａｎｃ６８９デアミナーゼ遺伝子（Ａｎｃ６８９　ｄｅａｍｉｎａｓｅ：プライマー配列番号７～８）、１０アミノ酸リンカー２及びＵＧＩ遺伝子の２回繰り返し配列（１０ａａ　ｌｉｎｋｅｒ－β－ｌａｃｔａｍａｓｅ：プライマー配列番号１１～１２）をそれぞれＰＣＲにより増幅した。また、上記Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ発現プラスミドのＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤ遺伝子を鋳型として、下記の表２に記載のプライマーを用いて、ＰｍＣＤＡ１デアミナーゼ遺伝子（ＰｍＣＤＡ１：プライマー配列番号９～１０）、及び１０４アミノ酸リンカー１をコードする配列（１０４ａａ　ｌｉｎｋｅｒ：プライマー配列番号１３～１７）をＰＣＲにより増幅した。さらに、β－ｌａｃｔａｍａｓｅからＴＡＬＥのＮ末ドメイン（ＷＴ、６３、又は４７）をコードする配列までを含む配列（プライマー配列番号２２～２５）をＰＣＲにより増幅した。下記の表２に、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドを構築するために使用した各プライマー及びその配列番号を示す。表２中、１０４ａａ　ｌｉｎｋｅｒのｆｏｒ以下は、例えば、「ＷＴ－１０４－ＢＥ４」は、当該配列が、ＴＡＬＥのＣ末ドメインがＷＴであり、かつ、前記１０４アミノ酸リンカー１及びＡｎｃ６８９デアミナーゼ（ＢＥ４）を含むＴＡＬＥ－デアミナーゼ用のリンカー１をコードする配列であることを示す。なお、下記の各表中、「ＡＩＤ」は、デアミナーゼがＡＩＤであることを示すものではなく、「Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ」に由来するＰｍＣＤＡ１であることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　各デアミナーゼ、１０４アミノ酸リンカー１をコードする配列、及び１０アミノ酸リンカー２及びＵＧＩ遺伝子の２回繰り返し配列を、上記２．で作製したβ－ｌａｃｔａｍａｓｅからＴＡＬＥのＮ末ドメイン（ＷＴ、６３、又は４７）をコードする配列までを含む配列と、ＴＡＬＥのＣ末ドメイン（ＷＴ、６３、又は４７）をコードする下流（３’側）配列との間にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法（ＴａＫａＲａ　Ｂｉｏ　Ｉｎｃ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）により挿入し、Ｎ末から順に、ＴＡＬＥ（Ｎ末ドメイン（ＷＴ、６３、又は４７）－ＴＡＬＥリピートドメイン－Ｃ末ドメイン（ＷＴ、６３、又は４７））、１０４アミノ酸リンカー１（１０４ａａ）、デアミナーゼ（Ａｎｃ６８９デアミナーゼ（ＢＥ４）又はＰｍＣＤＡ１デアミナーゼ（ＡＩＤ））、１０アミノ酸リンカー２（１０ａａ）、ＵＧＩ遺伝子（ＵＧＩ）、１０アミノ酸リンカー２（１０ａａ）、及びＵＧＩ遺伝子（ＵＧＩ）の順で結合されたＴＡＬＥ－デアミナーゼを発現するプラスミド（ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド）を作製した。前記ＴＡＬＥ－デアミナーゼの構造を示す概念図を図４に示す。
　（２）１２アミノ酸リンカーシリーズ
　また、前記１０４アミノ酸リンカー１に代えて、１２アミノ酸リンカー１（１２ａａ）を有するＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドは以下の方法で作製した。すなわち、先ず、下記の表３に記載のオリゴヌクレオチドをそれぞれアニーリングさせて１２アミノ酸リンカー１をコードする配列を作製した。表３中、１２ａａ　ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１８～２１）のｆｏｒ以下は、例えば、「ＴＡＬＥ＿ＷＴ－１２－ＡＩＤ」は、当該配列が、ＴＡＬＥのＣ末ドメインがＷＴであり、かつ、前記１２アミノ酸リンカー１及びＰｍＣＤＡ１デアミナーゼ（ＡＩＤ）を含むＴＡＬＥ－デアミナーゼ用のリンカー１をコードする配列であることを示す。かかる１２アミノ酸リンカー１は、Ｙａｎｇ　Ｌ　ｅｔ　ａｌ．，”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｓｉｎｇ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ　ｆｕｓｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ．”，Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ　７　１３３３０（２０１６）に記載の１２アミノ酸からなる。次いで、上記ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドの１０４アミノ酸リンカー１をコードする配列以外を、下記の表４に示したプライマー（配列番号９、２２～２４）を用いて、それぞれ、インバースＰＣＲにて増幅し、前記１２アミノ酸リンカー１をコードする配列をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により挿入した。下記の表３に、１２アミノ酸リンカー１をコードする配列及びその配列番号を示し、表４に、インバースＰＣＲに使用したプライマー及びその配列番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（３）アミノ酸長調整リンカーシリーズ
　さらに、ＴＡＬＥ－４７－１０４－ＡＩＤにおいて、１０４アミノ酸リンカー１に代えて、同１０４アミノ酸リンカー１のＣ末側から順にアミノ酸を欠失させ、アミノ酸長を１２、２４、３６、４８、６０、又は８４となるようにした各アミノ酸リンカー１をコードするＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドを以下の方法で作製した。すなわち、上記ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドの、欠失させるアミノ酸をコードする配列以外を、下記の表５に記載のプライマー（配列番号９、２６～３１）を用いてインバースＰＣＲにて増幅し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法によりセルフライゲーションさせることで作製した。下記の表５に、ＴＡＬＥ－４７－１０４－ＡＩＤのアミノ酸リンカー１欠失変異体作製に使用したプライマー及びその配列番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　また、ＴＡＬＥ－デアミナーゼのネガティブコントロール（ＮＣ）として、ＴＡＬＥリピートユニットがヒトゲノムに結合しないように、上記１．で作製したレポータープラスミドのＴＡＬＥ認識配列に代えて、次のＮＣ配列：５’－ｔＴＧＣＧＣＧＴＡＴＡＧＴＣＧＣＧ－３’（配列番号：３２）を認識して結合するように構築したＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣを発現するようにしたこと以外は上記と同様にして、各ＴＡＬＥ－デアミナーゼに対応するＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣを発現するプラスミド（ＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミド）をそれぞれ作製した。
　作製した各発現プラスミドにおける、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ、及びそのネガティブコントロール（ＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ）の構成及びその配列を示す配列番号（塩基配列の配列番号、アミノ酸配列の配列番号）の一覧を下記の表６にそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　４．Ｃａｓ９発現プラスミドの作製
　先ず、ｐＸ３３０（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；Ｐｌａｓｍｉｄ　４２２３０）のＵ６プロモーターからＢＧＨポリＡ付加配列までの領域を人工ＤＮＡ合成し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＳＫ＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＥｃｏＲＶ認識サイトとＢａｍＨＩ認識サイトとの間にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により挿入することでＣａｓ９発現プラスミドｐＸ３３０＿ＢＳを作製した。次いで、ｐＸ３３０＿ＢＳのＣａｓ９遺伝子に対してＰＣＲによる部位特異的変異導入法を行うことにより、ニッカーゼタイプのｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）発現プラスミド、及び切断活性のないｄＣａｓ９（Ｄ１０Ａ＋Ｈ８４０Ａ）発現プラスミドをそれぞれ作製した。
　５．ガイドＲＮＡ発現プラスミドの作製（１）
　先ず、上記４．で作製したｐＸ３３０＿ＢＳをＸｂａＩ及びＮｏｔＩで処理してＣａｓ９遺伝子を除去し、フィルイン反応後、セルフライゲーションによりプラスミド（ｐＸ３３０＿ＢＳ－ΔＣａｓ９）を作製した。次いで、下記の表７に示した、ガイドＲＮＡの標的配列（表７には、ガイドＲＮＡの標的配列（アンチセンス鎖上）の相補配列を示す）（表７の下線以外の配列）に対応するように設計したオリゴヌクレオチドをアニールさせ、ＢｐｉＩ処理とライゲーションとによってｐＸ３３０＿ＢＳ－ΔＣａｓ９に挿入して、各ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－１～８）を発現するプラスミド（ガイドＲＮＡ発現プラスミド１～８）を作製した。下記の表７に、ガイドＲＮＡの標的配列の相補配列（下線以外）及びＣａｓ９のＰＡＭ配列（下線）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　６．ＨＥＫ細胞への形質転換（１）
　１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で生育させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５×１０４細胞ずつ９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。表６に記載のＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド、及びＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミドのうちのいずれか７５ｎｇ；上記４．で作製したｎＣａｓ９発現プラスミド又はｄＣａｓ９発現プラスミド５０ｎｇ；上記５．で作製したガイドＲＮＡ発現プラスミド１～８及びｐＸ３３０＿ＢＳ－ΔＣａｓ９（ガイドＲＮＡなし）のうちのいずれか１０ｎｇ；上記１．で作製したレポータープラスミドのうちのいずれか２０ｎｇ；並びにリファレンスプラスミドであるｐＧＬ４．５４（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）５ｎｇ；をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。リファレンスプラスミドは、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）を発現するプラスミドである。
　また、ポジティブコントロールとして、上記３．で作製したＡｎｃＢＥ４ｍａｘ発現プラスミド７５ｎｇ；上記５．で作製したガイドＲＮＡ発現プラスミド１～８及びｐＸ３３０＿ＢＳ－ΔＣａｓ９（ガイドＲＮＡなし）のうちのいずれか１０ｎｇ；上記１．で作製したレポータープラスミドのうちのいずれか２０ｎｇ；ｐＧＬ４．５４　５ｎｇ；を組み合わせてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。
　７．ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ活性値の測定
　形質転換してから２４時間培養後に培地を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄後、Ｐａｓｓｉｖｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）で処理して細胞を溶解し、細胞溶解液とした。前記細胞溶解液をＤＭＥＭ培地で１００倍に希釈し、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ　Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて、ＴｒｉＳｔａｒ　Ｓ　ＬＢ９４２　プレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製，Ｂａｄ　Ｗｉｌｄｂａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ活性スコア及びホタルルシフェラーゼ活性スコアを測定した。
　各スコアのネガティブコントロールとしては、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミドを導入した細胞についてのＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ活性スコアを測定した。なお、ポジティブコントロール（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ発現プラスミドを導入した細胞）に対しては、ｐＸ３３０＿ＢＳ－ΔＣａｓ９発現プラスミドを導入した細胞（ガイドＲＮＡを発現させていない細胞）についての活性スコアを測定してネガティブコントロール（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ－ＮＣ）とした。
　活性の数値化は以下のように行った。先ず、リファレンスプラスミドによるホタルルシフェラーゼ活性スコアを用いて各ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ活性スコアを標準化した。次いで、標準化された活性スコアを用い、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドを導入した細胞の活性スコアからＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミドを導入した細胞の活性スコアを差し引き、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ活性の活性値とした。また、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘの発現プラスミドを導入した細胞の活性スコアからＡｎｃＢＥ４ｍａｘ－ＮＣを差し引き、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値とした。さらに、各試験間でＴＡＬＥ－デアミナーゼ活性を比較するために、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ活性値は、後述するＰＡＭ２の条件下でのＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値を１とした時の相対活性で示した。試験は少なくとも３回繰り返して行い、平均値に標準偏差を付与してグラフ化した。
　＜試験１＞　Ｂａｓｅ　ｅｄｉｔｏｒの活性に及ぼすＰＡＭ配列の位置の影響
　ポジティブコントロールとして、既存のＢａｓｅ　ｅｄｉｔｏｒであるＡｎｃＢＥ４ｍａｘが最も高い活性を示すＰＡＭ配列の位置を調べるために、ＰＡＭ配列の位置を１塩基ずつ３’側（下流）に移動させ（ＰＡＭ１～ＰＡＭ８）、塩基編集活性を調べた。
　ＡｎｃＢＥ４ｍａｘでは、ＰＡＭ配列の位置を標的ＤＮＡ配列において２１～２３番目の位置とした場合、塩基編集活性の高いターゲット塩基の位置は同標的ＤＮＡ配列の４～８番目となる関係であることが知られている（Ｒｅｅｓ，Ｈ．Ａ．　ａｎｄ　Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．，Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔ　１９，７７０－７８８（２０１８））。本研究で用いているレポーターでは、上記のようにガイドＲＮＡの標的配列が変わるように設計することによりＰＡＭ配列の位置を表７に記載のＰＡＭ１からＰＡＭ８まで変更することができるため、それに応じてターゲット塩基の位置が変更されることになる。
　上記６．において、上記３．で作製したＡｎｃＢＥ４ｍａｘ発現プラスミドと、上記５．で作製したガイドＲＮＡ発現プラスミド１～８のうちのいずれかと、上記１．で作製したレポータープラスミド（スペーサー１：１９ｂｐ）と、リファレンスプラスミドであるｐＧＬ４．５４と、を組み合わせてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、上記７．によりＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値をそれぞれ取得した。また、ネガティブコントロールとしては、ガイドＲＮＡ発現プラスミドに代えてｐＸ３３０＿ＢＳ－ΔＣａｓ９を用いた。
　結果を図５に示す。図５では、ガイドＲＮＡ発現プラスミド２を用いたとき、すなわち、ＰＡＭ２のときのＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値を１．０として、各ガイドＲＮＡ発現プラスミド１～８を用いたとき、すなわち、ＰＡＭ１～８のときのＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値を示す。図５に示したように、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値は、ＰＡＭ２の時に最大活性を示すことがわかった。したがって、ＰＡＭ２の時のＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値を以下の活性評価のためのポジティブコントロールと定めた。
　＜試験２＞　ＴＡＬＥ－デアミナーゼの活性に及ぼすスペーサー１長の影響
　（ＢＥ４シリーズ）
　ＴＡＬＥのＣ末ドメインがＷＴ又は４７であり、アミノ酸リンカー１が１０４アミノ酸であり、デアミナーゼがＢＥ４（Ａｎｃ６８９）である２種類のＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＷＴ－１０４－ＢＥ４、４７－１０４－ＢＥ４）について、ＰＡＭ配列の位置をＰＡＭ２に固定して、レポーターのスペーサー１の長さが活性に与える影響を調べた。スペーサー１の長さは、７ｂｐ、１３ｂｐ、１９ｂｐ、２５ｂｐ、３１ｂｐとした。また、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡとしては、ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）及びガイドＲＮＡの発現あり（ｎＣａｓ９）、ｄＣａｓ９（Ｄ１０Ａ＋Ｈ８４０Ａ）及びガイドＲＮＡの発現あり（ｄＣａｓ９）、ｎＣａｓ９の発現あり及びガイドＲＮＡの発現なし（ｎＣａｓ９／ガイドなし）の３条件について検討した。
　上記６．において、上記３．（１）で作製したＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド（ＷＴ－１０４－ＢＥ４又は４７－１０４－ＢＥ４）又はこれに対応するＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミドと、上記４．で作製したｎＣａｓ９発現プラスミド又はｄＣａｓ９発現プラスミドと、上記５．で作製したガイドＲＮＡ発現プラスミド２又はｐＸ３３０＿ＢＳ－ΔＣａｓ９と、上記１．で作製したレポータープラスミド（スペーサー１：７～３１ｂｐ）と、リファレンスプラスミドであるｐＧＬ４．５４と、を組み合わせてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、上記７．によりＴＡＬＥ－デアミナーゼ活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）をそれぞれ取得した。
　結果を図６に示す。図６に示したように、いずれのＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＢＥ４）においても、ガイドＲＮＡが存在しない場合、すなわちｎＣａｓ９がターゲット塩基付近に結合していない場合には活性が認められなかった。また、ｎＣａｓ９を用いてボトムストランドにニックを入れた方が、ｄＣａｓ９を用いてニックが入らない時よりも活性が高かった。スペーサー１の長さについては、１３ｂｐ及び２５ｂｐの場合に特に高い活性を示し、２５ｂｐの場合にさらに高い活性を示した。ＴＡＬＥのＣ末ドメインについては、ＷＴ（例えば、ｎＣａｓ９、スペーサー１長：２５ｂｐでは、０．１９±０．０１）より４７（０．２９±０．０３）の方が活性が高かった。
　（ＡＩＤシリーズ）
　ＴＡＬＥのＣ末ドメインがＷＴ、６３、又は４７であり、アミノ酸リンカー１が１０４アミノ酸又は１２アミノ酸であり、デアミナーゼがＡＩＤ（ＰｍＣＤＡ１）である６種類のＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＷＴ－１０４／１２－ＡＩＤ、６３－１０４／１２－ＡＩＤ、４７－１０４／１２－ＡＩＤ）について、上記のＢＥ４と同様にして、レポーターのスペーサー１の長さが活性に与える影響を調べた。
　結果を図７に示す。図７に示したように、いずれのＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＡＩＤ）においても、ガイドＲＮＡが存在しない場合、すなわちｎＣａｓ９がターゲット塩基付近に結合していない場合には活性が認められなかった。また、ＷＴ－１０４－ＡＩＤ、６３－１０４－ＡＩＤ、ＷＴ－１２－ＡＩＤ、６３－１２－ＡＩＤでは、デアミナーゼがＢＥ４である場合と同様に、ｎＣａｓ９を用いてボトムストランドにニックを入れた方が、ｄＣａｓ９を用いてニックが入らない時よりも活性が高かった。一方、４７－１０４－ＡＩＤ、４７－１２－ＡＩＤでは、ニックの効果がそれほど顕著ではなかった。
　スペーサー１の長さについては、全てのＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＡＩＤ）で２５ｂｐの場合に高い活性を示し、６３－１０４－ＡＩＤ、４７－１２－ＡＩＤでは、１９ｂｐでも同様に高い活性を示した。ＴＡＬＥのＣ末ドメインについては、１０４アミノ酸リンカー１の場合、活性はＷＴ（例えば、ｎＣａｓ９、スペーサー１長：２５ｂｐでは、０．０９±０．００）、６３（０．１６±０．０１）、４７（０．４±０．０３）（図７－Ａ、Ｂ、Ｃ）；１２アミノ酸リンカー１では、活性はＷＴ（０．３２±０．０２）、６３（０．３８±０．０３）、４７（０．５７±０．０２）（図７－Ｄ、Ｅ、Ｆ）となり、アミノ酸リンカー１の長さが同じ場合は４７＞６３＞ＷＴの関係にあった。また、ＴＡＬＥのＣ末ドメインが同様のもので比較した場合には、１２アミノ酸リンカー１の方が１０４アミノ酸リンカー１よりも活性が高かった。最も高い活性を示したＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＡＩＤ）は、４７－１２－ＡＩＤ（例えば、ｎＣａｓ９、スペーサー１長：１９ｂｐでは、０．５７±０．２）であった。
　＜試験３＞　ＴＡＬＥ－デアミナーゼの活性に及ぼすＰＡＭ配列の位置の影響
　レポーターのスペーサー１の長さを固定し、ＰＡＭ配列の位置を１塩基ずつ３’側（下流）に移動させて、ＰＡＭ配列の位置（つまり、Ｃａｓ９の位置に対応する）がＴＡＬＥ－デアミナーゼの活性に与える影響を調べた。スペーサー１長としては、試験２で活性評価を行った際に比較的活性が高かった１３ｂｐ、１９ｂｐ、２５ｂｐについて検討を行った。
　上記６．において、上記３．（１）（２）で作製したＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド（ＡＩＤシリーズ：ＷＴ－１０４／１２－ＡＩＤ、６３－１０４／１２－ＡＩＤ、４７－１０４／１２－ＡＩＤ）又はこれに対応するＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミドと、上記４．で作製したｎＣａｓ９発現プラスミドと、上記５．で作製したガイドＲＮＡ発現プラスミド１～８と、上記１．で作製したレポータープラスミド（スペーサー１：１３、１９、又は２５ｂｐ）と、リファレンスプラスミドであるｐＧＬ４．５４と、を組み合わせてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、上記７．によりＴＡＬＥ－デアミナーゼ活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）をそれぞれ取得した。
　結果を図８に示す。図８に示したように、４７－１２－ＡＩＤ以外のＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＡＩＤシリーズ）では、スペーサー１長が１９ｂｐの時に高い活性を示した。ＰＡＭ配列の位置としては、ＷＴ－１０４－ＡＩＤではＰＡＭ６（例えば、スペーサー１長：１９ｂｐでは、０．４２±０．０８）又はＰＡＭ７（０．３８±０．０５）（図８－Ａ）、６３－１０４－ＡＩＤではＰＡＭ７（０．３９±０．００）（図８－Ｂ）、４７－１０４－ＡＩＤでもＰＡＭ７（０．９０±０．１０）（図８－Ｃ）、ＷＴ－１２－ＡＩＤでもＰＡＭ７（０．９１±０．０４）（図８－Ｄ）、６３－１２－ＡＩＤではＰＡＭ６（０．４９±０．０２）（図８－Ｅ）で、それぞれ高い活性を示した。一方、４７－１２－ＡＩＤでは、スペーサー１長が１３ｂｐの時にはＰＡＭ４（０．８６±０．０２）又はＰＡＭ７（０．９６±０．０３）で、スペーサー１長が１９ｂｐの時にはＰＡＭ１（０．７９±０．０５）で、スペーサー１長が２５ｂｐの時にはＰＡＭ６（０．７４±０．１３）で、それぞれ高い活性を示した（図８－Ｆ）。その中で活性が高かったのは、４７－１０４－ＡＩＤのスペーサー１長：１９ｂｐ／ＰＡＭ７（０．９０±０．１０）、ＷＴ－１２－ＡＩＤのスペーサー１長：１９ｂｐ／ＰＡＭ７（０．９１±０．０４）、４７－１２－ＡＩＤのスペーサー１長１３ｂｐ／ＰＡＭ７（０．９６±０．０３）であった。
　＜試験４＞　ＴＡＬＥ－デアミナーゼの活性に及ぼすアミノ酸リンカー１長の影響
　上記試験３から、アミノ酸リンカー１として、１０４アミノ酸よりも１２アミノ酸の方が活性が高いことが判明したが、そのアミノ酸長自体については検討していない。そこで、上記３．（３）で作製したＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド（４７－１２’～８４’－ＡＩＤ：アミノ酸リンカー１長：８４アミノ酸、６０アミノ酸、３６アミノ酸、２４アミノ酸、１２アミノ酸）を用いて、アミノ酸リンカー１の長さの影響を調べた。
　上記６．において、上記３．（３）で作製した各ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド又はこれに対応するＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミドと、上記４．で作製したｎＣａｓ９発現プラスミドと、上記５．で作製したガイドＲＮＡ発現プラスミド２と、上記１．で作製したレポータープラスミド（スペーサー１：２５ｂｐ）と、リファレンスプラスミドであるｐＧＬ４．５４と、を組み合わせてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、上記７．によりＴＡＬＥ－デアミナーゼ活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値に対する割合）をそれぞれ取得した。
　結果を図９に示す。図９には、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドとして、上記３．（１）で作製した４７－１０４－ＡＩＤ若しくは（２）で作製した４７－１２－ＡＩＤ、又はこれに対応するＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミドを用いたときの結果も合わせて示す。図９に示したように、アミノ酸リンカー１の長さを１２アミノ酸まで短くした場合のＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＡＩＤ）の活性が若干低かったものの、活性に対するアミノ酸リンカー１の長さの影響はあまりないことが判明した。
　８．ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドの作製（２）
　（１）ＢＥ４シリーズ（ＢＥ４－ＴＡＬＥ）
　（ａ）３２アミノ酸リンカーシリーズ（ＢＥ４－３２－ＴＡＬＥ）
　Ｎ末から、Ａｎｃ６８９デアミナーゼ（ＢＥ４）、リンカー１（３２アミノ酸）、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：ＷＴ、６３、又は４７）の順に配置されるＴＡＬＥ－デアミナーゼ（以下、場合により「ＢＥ４－３２－ＴＡＬＥ」という）の発現プラスミドを以下の方法により作製した。すなわち、先ず、３．（１）において作製したＡｎｃＢＥ４ｍａｘ発現プラスミドを鋳型として、下記の表８に記載のプライマーを用いて、３２アミノ酸リンカー１をコードする配列を含めて５’側（プライマー配列番号２５、７３～７４）、１０アミノ酸リンカー２及びＵＧＩの２回繰り返しをコードする配列を含めて３’側（プライマー配列番号１２、７５～７７）をそれぞれＰＣＲにより増幅した。また、２．で作製したデスティネーションベクター（ＴＡＬＥ－ＷＴ、ＴＡＬＥ－６３、ＴＡＬＥ－４７）をそれぞれ鋳型として、各ＴＡＬＥをコードする配列（プライマー配列番号２２～２４、７８～７９）をＰＣＲにより増幅した。下記の表８に、ＢＥ４－３２－ＴＡＬＥ発現プラスミドを構築するために使用した各プライマー及びその配列番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　上記３断片を組み合わせて、３．（１）と同様に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により、Ｎ末から順に、デアミナーゼ（Ａｎｃ６８９デアミナーゼ（ＢＥ４））、リンカー１（３２アミノ酸）、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：ＷＴ、６３、又は４７）の順に配置されるＢＥ４－３２－ＴＡＬＥ発現プラスミドを発現するためのデスティネーションベクター（ＢＥ４－３２－ＷＴ、ＢＥ４－３２－６３、ＢＥ４－３２－４７）をそれぞれ作製した。これらと、１．で作製したＴＡＬＥ配列を連結したアレイプラスミド、又は、３．で作製したＮＣ配列を連結したアレイプラスミドとを用いて、２．と同様に、Ｇｏｌｄｅｎ　Ｇａｔｅ法により、各ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド、又は、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミドを作製した。前記ＴＡＬＥ－デアミナーゼの構造を示す概念図を図１１の（Ａ）に示す。また、作製した各発現プラスミドにおける、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ、及びそのネガティブコントロール（ＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ）の構成及びその配列を示す配列番号（塩基配列の配列番号、アミノ酸配列の配列番号）の一覧を下記の表１２にそれぞれ示す。
　（ｂ）アミノ酸長調整リンカーシリーズ（ＢＥ４－１３５／２３４－ＴＡＬＥ）
　次いで、デアミナーゼとＴＡＬＥとの間のリンカー１長（３２アミノ酸）をコードする配列の下流側に、既知のリンカー配列であるＨＴＳ９５アミノ酸配列（Ｓｕｎ，Ｎ．　ａｎｄ　Ｚｈａｏ，Ｈ．，Ｍｏｌ　ＢｉｏＳｙｓｔ　１０，ｐ．４４６－４５３（２０１４），Ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ３ｍｂ７０４１２ｂ）をコードする配列又はその２回繰り返しをコードする配列を挿入したＴＡＬＥ－デアミナーゼ（以下、場合により「ＢＥ４－１３５－ＴＡＬＥ」又は「ＢＥ４－２３４－ＴＡＬＥ」という）の発現プラスミド（リンカー１長：ＨＴＳ９５アミノ酸配列の前後に付加した繋ぎ配列を含めて、１３５又は２３４アミノ酸）を以下の方法により作製した。すなわち、８．（１）（ａ）で作製したＢＥ４－３２－ＷＴ、ＢＥ４－３２－６３、ＢＥ４－３２－４７の各デスティネーションベクターを鋳型として、下記の表９に記載のプライマーを用いて、３２アミノ酸リンカー１をコードする配列を含めて５’側（プライマー配列番号２５、８０）、各ＴＡＬＥをコードする配列以降の３’側（プライマー配列番号１２、８１～８２）をそれぞれＰＣＲにより増幅した。下記の表９に、使用した各プライマー及びその配列番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　また、合成したＨＴＳ９５アミノ酸配列と前後の繋ぎ配列とをコードする配列（ＨＴＳ９５：塩基配列の配列番号１０５、アミノ酸配列の配列番号１０６）を含むプラスミドを制限酵素ＡｌｅＩ及びＰｓｈＡＩで２重切断し、ＨＴＳ９５をコードする配列を含む目的ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により回収し、Ｔ４リガーゼによりライゲーションを行った後、制限酵素ＸｍａＩ及びＳａｃＩＩにより２重切断し、ＨＴＳ９５×２を含む目的ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により回収した。
　上記３断片を組み合わせて、３．（１）と同様に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により、Ｎ末から順に、デアミナーゼ（Ａｎｃ６８９デアミナーゼ（ＢＥ４））、リンカー１（１３５アミノ酸又は２３４アミノ酸）、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：ＷＴ、６３、又は４７）の順に配置されるＢＥ４－１３５－ＴＡＬＥ、又はＢＥ４－２３４－ＴＡＬＥを発現するためのデスティネーションベクター（ＢＥ４－１３５－ＷＴ、ＢＥ４－１３５－６３、ＢＥ４－１３５－４７、ＢＥ４－２３４－ＷＴ、ＢＥ４－２３４－６３、ＢＥ４－２３４－４７）をそれぞれ作製した。これらと、１．で作製したＴＡＬＥ配列を連結したアレイプラスミド、又は、３．で作製したＮＣ配列を連結したアレイプラスミドとを用いて、２．と同様に、Ｇｏｌｄｅｎ　Ｇａｔｅ法により、各ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド、又は、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミドを作製した。前記ＴＡＬＥ－デアミナーゼの構造を示す概念図は図１１の（ａ）と同様である。また、作製した各発現プラスミドにおける、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ、及びそのネガティブコントロール（ＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ）の構成及びその配列を示す配列番号（塩基配列の配列番号、アミノ酸配列の配列番号）の一覧を下記の表１２にそれぞれ示す。
　（２）ＡＢＥ８ｅシリーズ（ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥ）
　先ず、人工ＤＮＡ合成により作製したＡＢＥｍａｘ遺伝子（Ｋｏｂｌａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３６，ｐ．８４３－８４６（２０１８））を、ｐｃＤＮＡ３．１ｓのＢａｍＨＩ認識サイトとＥｃｏＲＶ認識サイトとの間にそれぞれ挿入することにより、ＡＢＥｍａｘ発現プラスミド２を作製した。
　次いで、ＡＢＥｍａｘの改良型であるＡＢＥ８ｅ（Ｖ１０６Ｗ）（Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｍ．Ｆ．，　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　３８，ｐ．８８３－８９１（２０２０），Ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２０－０４５３－ｚ）発現プラスミドを作製した。すなわち、ＡＢＥｍａｘ発現プラスミド２を鋳型として、下記の表１０に記載プライマーを用いて、３’－ＡＢＥｍａｘ遺伝子のＮ末のＮＬＳをコードする配列～３２アミノ酸リンカー１のＣ末迄をコードする配列－５’を、ＰＣＲにより増幅して（プライマー配列番号８３～８４）アクセプターとした。また、ＡＢＥ７．１０遺伝子上に、Ｖ１０６Ｗ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、Ｄ１６７Ｎとなる変異を含むようにプライマーをデザインし、ＡＢＥｍａｘ発現プラスミド２を鋳型として、２個の断片Ａ（プライマー配列番号８５～８６）と、断片Ｂ（プライマー配列番号８７～８８）とをＰＣＲにより増幅した。次いで、２個の断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により前記アクセプターに挿入し、ＡＢＥ８ｅ（ＴａｄＡ－８ｅ（Ｖ１０６Ｗ））発現プラスミドを作製した。下記の表１０に、使用した各プライマー及びその配列番号を示す。なお、下記の各表中、「ＡＢＥ８ｅ」は、デアミナーゼがＴａｄＡ－８ｅ（Ｖ１０６Ｗ）であることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　次いで、Ｎ末から、ＡＢＥデアミナーゼ（ＡＢＥ８ｅ）、リンカー１（３２アミノ酸、１３５アミノ酸、又は２３４アミノ酸）、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：４７）の順に配置されるＴＡＬＥ－デアミナーゼ（以下、場合により「ＡＢＥ８ｅ－３２－４７」、「ＡＢＥ８ｅ－１３５－４７」、又は「ＡＢＥ８ｅ－２３４－４７という」）の発現プラスミドを以下の方法により作製した。すなわち、８．（１）（ａ）及び（ｂ）で作製したＢＥ４－３２－４７、ＢＥ４－１３５－４７、ＢＥ４－２３４－４７の各デスティネーションベクターを鋳型として、下記の表１１に記載のプライマーを用いて、Ｎ末端のＮＬＳをコードする配列を含めた５’側と、３２アミノ酸リンカーからＣ末側をコードする配列を含めた３’側を、ベクターを含めてＰＣＲにより増幅して（プライマー配列番号８９～９０）アクセプターとした。また、ＡＢＥ８ｅ（ＴａｄＡ－８ｅ（Ｖ１０６Ｗ））発現プラスミドを鋳型としてＰＣＲにより増幅した（プライマー配列番号追加９１～９２）、ＡＢＥ８ｅ（ＴａｄＡ－８ｅ（Ｖ１０６Ｗ））遺伝子部分を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法により前記アクセプターに挿入し、ＡＢＥ８ｅ－３２－４７、ＡＢＥ８ｅ－１３５－４７、又はＡＢＥ８ｅ－２３４－４７を発現するためのデスティネーションベクターを作製した。下記の表１１に、使用した各プライマー及びその配列番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　各デスティネーションベクターと、１．で作製したＴＡＬＥ配列を連結したアレイプラスミド、又は、３．で作製したＮＣ配列を連結したアレイプラスミドとを用いて、２．と同様に、Ｇｏｌｄｅｎ　Ｇａｔｅ法により、各ＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミド、又は、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ発現プラスミドを作製した。前記ＴＡＬＥ－デアミナーゼの構造を示す概念図を図１１の（Ｂ）に示す。また、作製した各発現プラスミドにおける、ＴＡＬＥ－デアミナーゼ、及びそのネガティブコントロール（ＴＡＬＥ－デアミナーゼ－ＮＣ）の構成及びその配列を示す配列番号（塩基配列の配列番号、アミノ酸配列の配列番号）の一覧を下記の表１２にそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　９．内因性ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）をターゲットとするＴＡＬＥ－デアミナーゼ発現プラスミドの作製
　ＴＡＬＥ認識配列として、下記の表１３に記載の８種類の内因性ＤＮＡ上の配列がターゲットとなるように、２．と同様の方法でＴＡＬＥ配列を連結したアレイプラスミドを作製した。前記内因性ＤＮＡとしては、相同性の高いファミリー遺伝子（ＣＣＲ２及びＨＢＤ）が存在するＣＣＲ５とＨＢＢを設定した。
　上記各アレイプラスミドを用いたこと以外は、３．と同様にして、Ｇｏｌｄｅｎ　Ｇａｔｅ法により、Ｎ末から、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：ＷＴ、又は４７）、リンカー１（１２アミノ酸、又は１０４アミノ酸）、デアミナーゼ（ＡＩＤ）の順に配置されるＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＷＴ（＊）－１２－ＡＩＤ、４７（＊）－１２－ＡＩＤ、４７（＊）－１０４－ＡＩＤ：＊はそれぞれターゲット）の発現プラスミド（ＴＡＬＥ－ＡＩＤ発現プラスミド）を作製した。また、各アレイプラスミドを用いたこと以外は、８．と同様にして、Ｇｏｌｄｅｎ　Ｇａｔｅ法により、Ｎ末から、デアミナーゼ（ＢＥ４、又はＡＢＥ８ｅ）、リンカー１（３２アミノ酸、又は１３５アミノ酸）、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：６３、又は４７）の順に配置されるＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＢＥ４－３２－４７（＊）、ＢＥ４－１３５－６３（＊）、ＡＢＥ８ｅ－１３５－４７（＊）：＊はそれぞれターゲット）の発現プラスミド（ＢＥ４－ＴＡＬＥ発現プラスミド、ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥ発現プラスミド）を作製した。下記の表１３に、ターゲットとしたＴＡＬＥ認識配列を示し、表１４に、作製した各発現プラスミドにおける、ターゲット、ＴＡＬＥ－デアミナーゼの構成、及びその配列を示す配列番号（塩基配列の配列番号、アミノ酸配列の配列番号）の一覧をそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　１０．ＢＥ４－ＴＡＬＥ用及びＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥ用レポータープラスミドの作製
　レポーターとして、１．で作製したｐＮＬＦ－Ｍ／Ａに、下記の表１５に示した配列（Ｎ－ＣＢＥ（ＢＥ４－ＴＡＬＥ用）又はＮ－ＡＢＥ（ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥ用））を挿入し、ＢＥ４－ＴＡＬＥ用、及びＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥ用のレポータープラスミドをそれぞれ作製した。挿入配列は、ＴＡＬＥ認識配列の相補配列（表１５中の下線（＊１）：５’－ＣＣＴＴＴＧＣＣＣＧＣＴＴＣＴＧＴａ－３’；小文字はＴＡＬＥのＮ末ドメインが認識するチミンの相補塩基を示す）、ターゲットコドン（表１５中の下線（＊２）：５’－ＡＣＧ－３’又は５’－ＴＡＧ－３’）、及びこれらの間のスペーサー１配列を含み、スペーサー１の長さは、ターゲットコドンの５’にある塩基を含めて、７ｂｐ、１３ｂｐ、１９ｂｐ、２５ｂｐ、又は３１ｂｐとした。下記の表１５に、ｐＮＬＦ－Ｍ／Ａプラスミドに挿入した各配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　このＢＥ４－ＴＡＬＥ用のレポータープラスミドにおいて、ターゲットコドンは、Ｎａｎｏルシフェラーゼの開始コドンに相当する箇所に位置しており、かかるレポータープラスミドによれば、ＴＡＬＥ認識配列に結合したＴＡＬＥ－デアミナーゼにより、ターゲットコドンであるＡＣＧがＡＴＧに変換される（ターゲット塩基（標的部位）であるＣがＴに置換される）と、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼを発現する（図１０）。一方、ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥ用のレポータープラスミドにおいて、ターゲットコドンは、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼの上流に挿入された終始コドンに相当する箇所に位置しており、かかるレポータープラスミドによれば、ＴＡＬＥ認識配列に結合したＴＡＬＥ－デアミナーゼにより、ターゲットコドンであるＴＡＧがＴＧＧに変換される（ターゲット塩基（標的部位）であるＡがＧに置換される）と、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼを発現する。
　１１．ガイドＲＮＡ発現プラスミドの作製（２）
　ガイドＲＮＡを発現するプラスミドを、ガイドＲＮＡの標的配列（表１６には、ガイドＲＮＡの標的配列（アンチセンス鎖上）の相補配列を示す）に対応するように設計したこと以外は、５．と同様にして、各ガイドＲＮＡを発現するプラスミド（ガイドＲＮＡ発現プラスミド）を作製した。下記の表１６に、ガイドＲＮＡの標的配列の相補配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　１２．ＨＥＫ細胞への形質転換（２）
　上記１０．で作製した各レポータープラスミドを標的ＤＮＡとした場合は、６．に示した方法と同様に行った。すなわち、８．で作製したＢＥ４－ＴＡＬＥ発現プラスミド又はＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥ発現プラスミドのうちのいずれか７５ｎｇ；４．で作製したｎＣａｓ９発現プラスミド又はｄＣａｓ９発現プラスミド５０ｎｇ；１１．で作製したガイドＲＮＡ発現プラスミド１０ｎｇ、１０．で作製したレポータープラスミドのうちのいずれか２０ｎｇ；並びにリファレンスプラスミドであるｐＧＬ４．５４　５ｎｇを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＬＴＸを用いて、各ウェルあたり５×１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、２４時間培養した。
　また、上記９．に記載の内因性ＤＮＡを標的ＤＮＡとした場合には、次のとおりとした。すなわち、デアミナーゼとしてＡＩＤを用いる場合、９．で作製したＴＡＬＥ－ＡＩＤ発現プラスミドのうちのいずれか３０ｎｇ；４．で作製したｎＣａｓ９発現プラスミド又はｄＣａｓ９発現プラスミド２０ｎｇ；１１．で作製したガイドＲＮＡ発現プラスミド５ｎｇを、デアミナーゼとしてＢＥ４又はＡＢＥ８ｅを用いる場合、９．で作製したＢＥ４－ＴＡＬＥ発現プラスミド又はＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥ発現プラスミドのうちのいずれか６０ｎｇ；４．で作製したｎＣａｓ９発現プラスミド又はｄＣａｓ９発現プラスミド４０ｎｇ；１１．で作製したガイドＲＮＡ発現プラスミド１０ｎｇを、それぞれ、各ウェルあたり３×１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、４８時間培養した。また、この場合のコントロールとして、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ発現プラスミド、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ発現プラスミド、及びＡＢＥ８ｅ発現プラスミドのうちのいずれか３０ｎｇと、１１．で作製したガイドＲＮＡ発現プラスミド１０ｎｇとの組み合わせ、又は、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ発現プラスミド、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ発現プラスミド、及びＡＢＥ８ｅ発現プラスミドのうちのいずれか６０ｎｇと、１１．で作製したガイドＲＮＡ発現プラスミド２０ｎｇとの組み合わせのいずれかをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。
　１３．塩基編集活性の解析
　形質転換してから４８時間後に培地を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄後、ＤＮＡｚｏｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，ＩＮＣ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）５０μＬを添加して細胞を溶解した。細胞溶解液をテンプレートにして、下記の表１７に記載のプライマーを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ　Ｉｎｃ．，Ｓｉｇａ，Ｊａｐａｎ）により、前記内因性ＤＮＡのターゲットサイトを含む領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を精製後、株式会社ファスマックにシークエンスを依頼した。ＥｄｉｔＲ（Ｋｌｕｅｓｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｅ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｊ　１，ｐ．２３９－２５０（２０１８），ＤＯＩ：１０．１０８９／ｃｒｉｓｐｒ．２０１８．００１４）を用いてシークエンスデータを解析し、ターゲットサイトの塩基編集効率（Ｔ又はＧの割合）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　＜試験５＞　ＴＡＬＥ－デアミナーゼ（Ｎ末融合体）の活性に及ぼすスペーサー１長及びリンカー１長の影響
　上記１２．によりＨＥＫ細胞への形質転換を行い、上記７．によりＴＡＬＥ－デアミナーゼ活性値（ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ活性値又はＡＢＥ８ｅ活性値に対する割合）をそれぞれ取得した。
　（ＢＥ４シリーズ）
　Ｎ末から、Ａｎｃ６８９デアミナーゼ（ＢＥ４）、リンカー１（３２アミノ酸、１３５アミノ酸、又は２３４アミノ酸）、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：ＷＴ、６３、又は４７）の順に配置されるＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＢＥ４－ＴＡＬＥ－ＷＴ、ＢＥ４－ＴＡＬＥ－６３、ＢＥ４－ＴＡＬＥ－４７）について、レポーターのスペーサー１の長さ及びリンカー１の長さが活性に与える影響を調べた。スペーサー１の長さは、７ｂｐ、１３ｂｐ、１９ｂｐ、２５ｂｐ、３１ｂｐとした。また、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡとしては、ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）及びガイドＲＮＡの発現あり（ｎＣａｓ９）、ｄＣａｓ９（Ｄ１０Ａ＋Ｈ８４０Ａ）及びガイドＲＮＡの発現あり（ｄＣａｓ９）、ｎＣａｓ９の発現あり及びガイドＲＮＡの発現なし（ｎＣａｓ９／ガイドなし）の３条件について検討した。
　結果を図１２Ａの（Ａ）（Ｂ）、及び図１２Ｂの（Ｃ）にそれぞれ示す。いずれのＢＥ４－ＴＡＬＥにおいても、ガイドＲＮＡが存在しない場合、すなわちｎＣａｓ９がターゲット塩基付近に結合していない場合には活性が認められなかった。一方、ｎＣａｓ９又はｄＣａｓ９の存在下では活性が認められた。ｎＣａｓ９によるニックの活性促進効果については、ＴＡＬＥ－デアミナーゼのＣ末融合体（Ｃ末側にデアミナーゼが配置）ほど顕著ではなかった。
　スペーサー１の長さについては、ＴＡＬＥのＣ末ドメインがＷＴ及び６３では２５ｂｐのときに、ＴＡＬＥのＣ末ドメインが４７では１９ｂｐ及び２５ｂｐのときに、それぞれ特に高い活性を示した。リンカー１の長さについては、ＴＡＬＥのＣ末ドメインがＷＴ及び４７では３２アミノ酸のときに、ＴＡＬＥのＣ末ドメインが６３では１３５アミノ酸のときに、それぞれ特に活性が高かった。活性が特に高かった組み合わせは、ＴＡＬＥのＣ末ドメインがＷＴでは、リンカー１長が３２アミノ酸かつスペーサー１長が２５ｂｐのとき（０．７５±０．１０）、ＴＡＬＥのＣ末ドメインが６３では、リンカー１長が１３５アミノ酸かつスペーサー１長が２５ｂｐのとき（０．８６±０．１１）、ＴＡＬＥのＣ末ドメインが４７では、リンカー１長が３２アミノ酸かつスペーサー１長が１９ｂｐ及び２５ｂｐのとき（０．８０±０．１４及び０．８５±０．１３）であった。
　（ＡＢＥ８ｅシリーズ）
　Ｎ末から、ＡＢＥ８ｅデアミナーゼ（ＡＢＥ８ｅ）、リンカー１（３２アミノ酸、１３５アミノ酸、又は２３４アミノ酸）、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：４７）の順に配置されるＴＡＬＥ－デアミナーゼ（ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥ－４７）についても、上記ＢＥ４シリーズと同様にして、レポーターのスペーサー１の長さ及びリンカー１の長さが活性に与える影響を調べた。
　結果を図１２Ｂの（Ｄ）にそれぞれ示す。いずれのＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥにおいても、ガイドＲＮＡが存在しない場合、すなわちｎＣａｓ９がターゲット塩基付近に結合していない場合には活性が認められなかった。一方、ｎＣａｓ９又はｄＣａｓ９の存在下では活性が認められた。なお、ｎＣａｓ９とｄＣａｓ９との比較では，活性は同程度かむしろｄＣａｓ９の方が高かった。
　スペーサー１の長さについては、１９ｂｐのときに特に高い活性を示した。リンカー１の長さについては、ｎＣａｓ９では１３５アミノ酸（０．５４±０．０３）で、ｄＣａｓ９では３２アミノ酸（０．５５±０．１３）及び１３５アミノ酸（０．５７±０．０９）で、それぞれ特に高い活性を示した。
　＜試験６＞　内因性ＤＮＡにおける塩基編集活性
　上記で特に高い活性が得られたＴＡＬＥ－デアミナーゼについて、上記１２．及び１３．に記載の方法により、内因性ＤＮＡに対する塩基編集活性を調べた。前記内因性ＤＮＡとしては、相同性の高いファミリー遺伝子（ＣＣＲ２及びＨＢＤ）が存在するＣＣＲ５とＨＢＢを設定した。図１３Ａ及び図１３Ｂに、前記内因性ＤＮＡ（ＣＣＲ５、ＨＢＢ）上のターゲット領域（ＡＳ３（ａ：配列番号２２１）、ＡＳ１４（ｂ：配列番号２２２）（ｅ：配列番号２２５）、Ｓ２（ｃ：配列番号２２３）、ＡＳ５（ｄ：配列番号２２４）、ＡＳ６（ｆ：配列番号２２６）、ＡＳ７（ｇ：配列番号２２７））、ＴＡＬＥ認識配列又はその相補配列の位置、ガイドＲＮＡの標的配列の相補配列の位置をそれぞれ示す。また、図１３Ａ及び図１３Ｂには、（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）に示すＣＣＲ５と相同性の高いＣＣＲ２、（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）に示すＨＢＢと相同性の高いＨＢＤとのアラインメントとして、各領域の塩基と異なる塩基もそれぞれ示す。
　（ＡＩＤシリーズ）
　Ｎ末から、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：ＷＴ、又は４７）、リンカー１（１２アミノ酸、又は１０４アミノ酸）、デアミナーゼ（ＡＩＤ）の順に配置されるＴＡＬＥ－ＡＩＤ（ＷＴ（＊）－１２－ＡＩＤ、４７（＊）－１２－ＡＩＤ、４７（＊）－１０４－ＡＩＤ：＊はそれぞれターゲット）を用いたときの結果を図１４～図１６に示す。各ＴＡＬＥ－ＡＩＤにおいて、ＴＡＬＥ認識配列は、それぞれ、図１３Ａに示すＡＳ３（ａ）、ＡＳ１４（ｂ）、Ｓ２（ｃ）上にある。図１４には、ターゲットＡＳ３上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ３）の標的配列の相補配列の１塩基目（Ａ）、１０塩基目（Ｂ）、１１塩基目（Ｃ）におけるＴの割合（すなわち、塩基がＣからＴに編集された割合）を示し、図１５には、ターゲットＡＳ１４上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ１４）の標的配列の相補配列の１塩基目（Ａ）、５塩基目（Ｂ）、６塩基目（Ｃ）におけるＴの割合を示し、図１６には、ターゲットＳ２上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－Ｓ２）の標的配列の相補配列の１塩基目（Ａ）、８塩基目（Ｂ）、９塩基目（Ｃ）におけるＴの割合を示す。
　ＴＡＬＥ－ＡＩＤは、ターゲットであるＣＣＲ５遺伝子又はＨＢＢ遺伝子に対して、既存のＢａｓｅ　ｅｄｉｔｏｒであるＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤ及びＡｎｃＢＥ４ｍａｘと比べて、同程度かそれ以上の活性を示した。一方、ターゲットではないＣＣＲ２遺伝子又はＨＢＤ遺伝子に対して、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ及びＡｎｃＢＥ４ｍａｘは塩基編集活性を示したが、ＴＡＬＥ－ＡＩＤはほとんど塩基編集活性を示さなかった。したがって、ＴＡＬＥ－ＡＩＤは、既存のＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤやＡｎｃＢＥ４ｍａｘよりも、標的特異性が高いことが確認された。
　（ＢＥ４シリーズ）
　Ｎ末から、デアミナーゼ（ＢＥ４）、リンカー１（３２アミノ酸、又は１３５アミノ酸）、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：４７、又は６３）の順に配置されるＢＥ４－ＴＡＬＥ（ＢＥ４－３２－４７（＊）、ＢＥ４－１３５－６３（＊）：＊はそれぞれターゲット）を用いたときの結果を図１７～図２０に示す。各ＢＥ４－ＴＡＬＥにおいて、ＴＡＬＥ認識配列は、それぞれ、図１３Ｂに示すＡＳ５（ｄ）、ＡＳ１４（ｅ）、ＡＳ６（ｆ）、ＡＳ７（ｇ）の相補配列上にある。図１７には、ターゲットＡＳ５上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ５）の標的配列の相補配列の７塩基目（Ａ）、８塩基目（Ｂ）におけるＴの割合を示し、図１８には、ターゲットＡＳ１４上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ１４）の標的配列の相補配列の１塩基目（Ａ）、５塩基目（Ｂ）、６塩基目（Ｃ）におけるＴの割合を示し、図１９には、ターゲットＡＳ６上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ６）の標的配列の相補配列の５塩基目（Ａ）、６塩基目（Ｂ）におけるＴの割合を示し、図２０には、ターゲットＡＳ７上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ７）の標的配列の相補配列の６塩基目（Ａ）、７塩基目（Ｂ）におけるＴの割合を示す。
　ＢＥ４－ＴＡＬＥは、ターゲットであるＣＣＲ５遺伝子又はＨＢＢ遺伝子に対して、既存のＢａｓｅ　ｅｄｉｔｏｒであるＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤ及びＡｎｃＢＥ４ｍａｘと比べて、概ね同程度の活性を示した。一方、ターゲットではないＣＣＲ２遺伝子又はＨＢＤ遺伝子に対して、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ及びＡｎｃＢＥ４ｍａｘは塩基編集活性を示したが、ＢＥ４－ＴＡＬＥはほとんど塩基編集活性を示さなかった。したがって、ＢＥ４－ＴＡＬＥは、既存のＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤやＡｎｃＢＥ４ｍａｘよりも、標的特異性が高いことが確認された。
　（ＡＢＥ８ｅシリーズ）
　Ｎ末から、ＡＢＥ８ｅデアミナーゼ（ＡＢＥ８ｅ）、リンカー１（１３５アミノ酸）、ＴＡＬＥ（Ｃ末ドメイン：４７）の順に配置されるＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥ（ＡＢＥ８ｅ－１３５－４７）を用いたときの結果を図２１～図２３に示す。各ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥにおいて、ＴＡＬＥ認識配列は、それぞれ、図１３Ｂに示すＡＳ５（ｄ）、ＡＳ６（ｆ）、ＡＳ７（ｇ）の相補配列上にある。図２１には、ターゲットＡＳ５上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ５）の標的配列の相補配列の３塩基目（Ａ）、４塩基目（Ｂ）におけるＧの割合（すなわち、塩基がＡからＧに編集された割合）を示し、図２２には、ターゲットＡＳ６上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ６）の標的配列の相補配列の４塩基目（Ａ）、７塩基目（Ｂ）におけるＧの割合を示し、図２３には、ターゲットＡＳ７上の、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＡＳ７）の標的配列の相補配列の４塩基目（Ａ）、８塩基目（Ｂ）におけるＧの割合を示す。
　ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥは、ターゲットであるＣＣＲ５遺伝子又はＨＢＢ遺伝子に対して、既存のＢａｓｅ　ｅｄｉｔｏｒであるＡＢＥ８ｅ（ＴａｄＡ－８ｅ（Ｖ１０６Ｗ））と比べて、同程度の活性を示した。一方、ターゲットではないＣＣＲ２遺伝子又はＨＢＤ遺伝子に対して、ＡＢＥ８ｅ（ＴａｄＡ－８ｅ（Ｖ１０６Ｗ））は塩基編集活性を示したが、ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥはほとんど塩基編集活性を示さなかった。したがって、ＡＢＥ８ｅ－ＴＡＬＥは、既存のＡＢＥ８ｅ（ＴａｄＡ－８ｅ（Ｖ１０６Ｗ））よりも、標的特異性が高いことが確認された。
　以上説明したように、本発明によれば、特異的かつ効率的に、核酸塩基変換酵素による標的ＤＮＡの編集を行うことができる方法、その方法を用いてゲノム編集された細胞を製造する方法、及びそれらに用いるＤＮＡ編集システムを提供することが可能となる。そのため、本発明は、高い編集効率と共に高い安全性が求められる遺伝子編集治療などの分野での利活用が期待される。

Claims (11)

  1. 　標的ＤＮＡを編集する方法であり、
    （１）ＴＡＬＥ及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
    （２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム
    を、標的ＤＮＡに接触させ、前記融合タンパク質の核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
    　前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥが認識するＴＡＬＥ認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側に７～３１ｂｐの鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
    　前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
    方法。
  2. 　標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法であり、
    （１）ＴＡＬＥ及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
    （２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム
    を、細胞に導入又は細胞内で発現させて標的ＤＮＡに接触させ、前記融合タンパク質の核酸塩基変換酵素活性により前記標的ＤＮＡの標的部位の塩基を編集する工程を含み、
    　前記融合タンパク質におけるＴＡＬＥが認識するＴＡＬＥ認識配列又はその相補配列は、前記標的部位の５’側に７～３１ｂｐの鎖長のスペーサー１を介して存在し、かつ、
    　前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおけるガイドＲＮＡが認識するガイドＲＮＡ標的配列は、前記標的部位の相補塩基を含むように存在する、
    方法。
  3. 　前記融合タンパク質がさらに、ＴＡＬＥと前記核酸塩基変換酵素とを結合するリンカー１を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記融合タンパク質がさらに、Ｃ末側にリンカー２を介して結合された塩基除去修復インヒビターを含む、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記融合タンパク質における核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、請求項１～４のうちのいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ、ＰｍＣＤＡ１、Ａｎｃ６８９、及びＴａｄＡからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項５に記載の方法。
  7. 　請求項１～６のうちのいずれか一項に記載の方法に用いるためのＤＮＡ編集システムであり、
    （１）ＴＡＬＥ及び核酸塩基変換酵素を含む融合タンパク質、並びに、
    （２）ヌクレアーゼ活性の一部又は全部を喪失したＣａｓ９タンパク質及びそのガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム
    を含む、ＤＮＡ編集システム。
  8. 　前記融合タンパク質がさらに、ＴＡＬＥと前記核酸塩基変換酵素とを結合するリンカー１を含む、請求項７に記載のＤＮＡ編集システム。
  9. 　前記融合タンパク質がさらに、Ｃ末側にリンカー２を介して結合された塩基除去修復インヒビターを含む、請求項７又は８に記載のＤＮＡ編集システム。
  10. 　前記融合タンパク質における核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、請求項７～９のうちのいずれか一項に記載の方法。
  11. 　前記デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ、ＰｍＣＤＡ１、Ａｎｃ６８９、及びＴａｄＡからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１０に記載のＤＮＡ編集システム。
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