WO2019039417A1 - ヌクレオチド標的認識を利用した標的配列特異的改変技術 - Google Patents

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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Definitions

  • the present invention provides a method of targeting a target nucleotide sequence, a method of specifically modifying a target nucleotide sequence, and expression of a target gene using nucleotide target recognition of a CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) type ID system. And a complex comprising the Cas (Crisps-associated (Crisps-related) protein and the guide RNA used in the method.
  • CRISPR Cirliciously Interspaced Short Palindromic Repeats
  • the CRISPR system utilizes small RNAs (referred to as guide RNAs or gRNAs) that have complementarity to the invading DNA sequences to promote targeting and degradation to the target foreign DNA.
  • gRNAs small RNAs
  • gRNAs guide RNAs
  • a Cas protein that binds to gRNA to form a complex is required.
  • Type I, Type II, Type III and Type V systems in the CRISPR system. Both systems interfere with viruses and foreign plasmids by the Cas protein-gRNA complex acting on the target sequence.
  • Type II and Type V systems DNA double strand break on target DNA is the mechanism of interference action by an integral protein having a protein domain retaining gRNA binding and a RuvC-like DNA cleavage protein domain.
  • Type III systems complexes of 5 to 8 Cas proteins and gRNA, unlike Type II, have been shown in vitro and in vivo to produce interference by cleaving target RNA sequences There is.
  • Cas9 and Cpf1 have been used as Cas proteins.
  • Cas9 and Cpf1 require a sequence of 2 to 5 bases or so called proto-spacer flanking motif (PAM) sequence in the vicinity of the target sequence in order to recognize the target DNA.
  • PAM proto-spacer flanking motif
  • Cas9-gRNA complex and Cpf1-gRNA complex are sequence-specific RNA-inducible endonucleases that cause DNA double-strand breaks at target sites near PAM sequences in vitro and in vivo Has been demonstrated.
  • CRISPR type I system systems classified into multiple subtypes from various fungi have been identified as genome sequences, and types IA, IB, IC, ID, I- It is classified and named as E, I-F, and I-U.
  • types IA, IB, IC, ID, I- It is classified and named as E, I-F, and I-U.
  • the type I-E system derived from E. coli is most advanced, and a complex consisting of six Cas proteins (Cas3, Cse1, Cse2, Cas7, Cas5, Cas6e) and gRNA promotes the degradation of target DNA sequences. has been proven.
  • RNA molecules that precede and follow the PAM sequence of about 2 bases to 5 bases that define target specificity are used for target targeting.
  • a new targeting system and a new RNA-inducible end that have problems in that there is a locus that can not be designed and in which similar sequences are cut. Development of nucleases is desired.
  • the present invention [1] A method of targeting a target nucleotide sequence, wherein the method comprises: (I) a nucleic acid encoding the CRISPR type I-D related protein Cas5d, Cas6d, and Cas7d, or these proteins, and (ii) sequences complementary to the target nucleotide sequence and from the CRISPR locus before and after the sequence A guide RNA containing a common repeat sequence, or a DNA encoding the guide RNA Methods, including introducing [2] A method of altering a target nucleotide sequence, which is in a cell, (I) CRISPR Type I-D Related Proteins Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d, or Nucleic Acids Encoding These Proteins, and (ii) Sequences Complementary to the Target Nucleotide Sequence and CRISPRs Before and After the Sequence A guide RNA comprising a common repeat sequence derived from a gene
  • [5] The method according to [2] or [4], further comprising introducing a donor polynucleotide into the cell.
  • [6] The method according to any one of [2], [4] and [5], wherein the modification is a deletion, insertion or substitution of a base
  • [8] (i) CRISPR Type I-D Related Proteins Cas5d, Cas6d, and Cas7d, and (ii) a Guide Comprises Sequences Complementary to the Target Nucleotide Sequence and Common Repeat Sequences Derived from the CRISPR Locus before and after the Sequence RNA Complex containing [9]
  • the complex according to [8], further comprising Cas3d and Cas10d [10] The complex according to [
  • nucleic acids encoding CRISPR type I-D related proteins Cas5d, Cas6d, and Cas7d, and (ii) sequences complementary to the target nucleotide sequence and the common repeat derived from the CRISPR locus before and after the sequence DNA encoding a guide RNA containing a sequence
  • An expression vector comprising [12] The expression vector according to [11], further comprising a nucleic acid encoding Cas3d and Cas10d, and a DNA molecule encoding the complex according to any one of [13] [8] to [10], 14) for targeting a target nucleotide sequence, (I) a nucleic acid encoding the CRISPR type I-D related protein Cas5d, Cas6d, and Cas7d, or these proteins, and (ii) sequences complementary to the target nucleotide sequence and from the CRISPR locus before and after the sequence A guide RNA containing a common repeat sequence, or a DNA en
  • the PAM sequences utilized by the CRISPR type I-D (hereinafter also referred to as "TiD") systems differ from the PAM sequences utilized by the CRISPR type II and type V systems.
  • the Cass protein of CRISPR type I-D is used to target loci that could not be designed by genome editing techniques using conventional CRISPR type II or type V RNA inducible endonucleases It became possible.
  • PAM sequences utilized by the CRISPR type I-D-derived RNA-inducible endonuclease of the present invention are found more on several genome sequences than PAM sequences utilized by CRISPR type II and type V.
  • the present invention it is possible to target more gene sequences than the genome editing techniques utilized by conventional CRISPR Type II and Type V systems. Still further, the present inventors have found that gRNA in the CRISPR type I-D system can target target sequences of 30 bases or more in length. On the other hand, the length of the sequence to which gRNA can be targeted in CRISPR Type II and Type V systems is around 20 bases. Therefore, the CRISPR type I-D system of the present invention is considered to exhibit more stable binding characteristics and target specificity than the prior art.
  • composition of the CRISPR type I-D system of this invention and the outline of the targeting to a target sequence and a cleavage mode are shown.
  • the vector for E. coli genome editing using TiD is shown. a) Structure of pEcTiD2 plasmid. b) Structure of pEcTiD3 plasmid.
  • Pro J23108 synthetic promoter, t1: terminator sequence STOP767, RBS: ribosome binding sequence, t2: terminator sequence STOP768 (1), t3: terminator sequence TOP768 (2), t7: T7 terminator sequence, 7d: derived from Microcystis aeruginosa (below , Abbreviated as Ma) Cas 7d, 6d: MaCas 6d, 5d: MaCas 5d, 3d: MaCas 3d, 10d: MaCas 10 d, T7 pro: T7 promoter, crRNA: CRISPR repeat sequence from TiD, Cm: chloramphenicol resistance gene, p15A ori: p15 Plasmid-derived origin of replication.
  • pMW_ccdB and pMW_ccdB-PAM library plasmid The structure of pMW_ccdB and pMW_ccdB-PAM library plasmid is shown.
  • Fig. 6 shows a plant genome editing vector using TiD. a) Structure of pEgPTiD1 plasmid. b) Structure of plant crRNA expression cassette. c) Structure of pEgPTiD2 plasmid.
  • RB Right border sequence
  • LB left border sequence
  • 2x35S 2x cauliflower mosaic virus 35S gene promoter and translation enhancer ⁇ sequence
  • 3d MaCas3d with added sequence encoding 2xNLS (nuclear translocation signal)
  • 10d 2xNLS added MaCas 10d
  • 7d MaCas 7d with 2xNLS added
  • 6d MaCas 6d with 2x NLS added
  • 5d MaCas 5d with 2x NLS added
  • (4) self-cleavage peptide 2A sequence (1) to (4)
  • Ter Arabidopsis thaliana heat shock protein 18.2 kDa gene terminator
  • Km kanamycin resistance gene expression cassette
  • U6-26 Arabidopsis thaliana U6 snRNA-26 gene promoter
  • crRNA TiD locus derived from CRISPR repeat sequences.
  • FIG. 7 shows mutation of tobacco PDS gene using pEgPTiD2-pds.
  • Target sequence 1 was selected from exon 3 and target sequence 2 was selected from exon 6.
  • the boxed portions indicate PAM sequences, and the underlined portions indicate target sequences.
  • FIG. 7 shows mutation of tobacco PDS gene using pEgPTiD2-pds.
  • FIG. 7 shows mutagenesis of tomato IAA9 gene using pEgPTiD2-iaa9.
  • Target sequence on the tomato IAA9 gene Target sequence 1 was selected from the second exon.
  • the boxed portions indicate PAM sequences, and the underlined portions indicate target sequences.
  • pEgPTiD2-iaa9 was introduced into a tomato disc by the Agrobacterium method to obtain transformed callus cells.
  • the region containing the IAA9 target sequence was amplified by PCR from genomic DNA prepared from transformed callus cells into which pEgPTiD2-iaa9 had been introduced, and mutation analysis was performed by the PCR-RFLP method using AccI. Open triangles indicate AccI digested fragments derived from wild type, and upper triangles indicate mutagenized fragments that do not undergo AccI digestion.
  • transduced callus is shown.
  • the upper row shows the wild type IAA9 sequence and the underline shows the target sequence.
  • the boxed sequences indicate PAM sequences.
  • the site where the mutation occurred is indicated by an insertion symbol or a hyphen. A hyphen indicates a base deletion.
  • FIG. 7 shows mutation analysis in pEcTiD2-iaa9 introduced and regenerated plants.
  • the results of mutation analysis by heteroduplex mobility analysis are shown. From the crRNA containing the target 2 target sequence on the EMX1 gene and the genome from cells into which the TiD gene had been introduced, a fragment thought to be derived from the mutant sequence was detected (black key line). The identification of the mutant sequence by sequence analysis is shown. The white letters in the black background indicate PAM (proto-spacer flanking sequences) recognized by TiD, and the sequences within the black frames indicate target sequences. The hyphen (-) indicates a base deletion, and the black bold and lowercase alphabets indicate a base insertion. To the right of each sequence, somatic mutation efficiency (number of clones in which the mutant sequence was confirmed / total number of analyzed clones) is shown.
  • the identification of the mutant sequence by sequence analysis is shown.
  • the white letters in the black background indicate PAM (proto-spacer flanking sequences) recognized by TiD, and the sequences within the black frames indicate target sequences.
  • the hyphen (-) indicates a base deletion, and the black bold and lowercase alphabets indicate a base insertion.
  • somatic mutation efficiency (number of clones in which the mutant sequence was confirmed / total number of analyzed clones) is shown.
  • the present invention provides genome editing technology using the CRISPR type I-D system.
  • Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d are used among the Cass of CRISPR type ID.
  • the CRISPR type I-D system comprises a target recognition module comprising Cas5d, Cas6d and Cas7d, and a polynucleotide cleavage module comprising Cas3d and Cas10d.
  • the operation principle of the present invention is as follows. 1) gRNA containing a sequence complementary to the target nucleotide sequence, which is necessary for targeting the target nucleotide sequence (hereinafter also referred to as “targeting”), and a common repetitive sequence present in the CRISPR type I-D locus, 2) Cas5d that recognizes PAM sequences present in the vicinity of the target nucleotide sequence, 3) Cas7d which binds to the gRNA of 1) above and is required for targeting of the target nucleotide sequence, and 4) Cas6d which processes the gRNA of 1) above And 5) providing the cell with a complex comprising Cas10d which interacts with the complex comprising 1) to 4) above to remodel the target nucleotide sequence, and Cas3d which performs degradation of the polynucleotide.
  • Targeting to a target nucleotide sequence by a complex comprising 1) to 4) above ie 7) Targeting to a target nucleotide sequence is performed by a complex consisting of a mature gRNA obtained by processing the gRNA of the above 1) by the Cas6d of the above 4) and the above 2) and 3), 8) The complex of 5) above cleaves the polynucleotide on the target nucleotide sequence.
  • the present invention provides a method of targeting a target nucleotide sequence using the CRISPR type I-D system (hereinafter, also referred to as “target sequence targeting method of the present invention”), a method of modifying a target nucleotide sequence (hereinafter referred to as " The present invention also provides a target sequence modification method of the present invention) and a method of suppressing the expression of a target gene (hereinafter, also referred to as a “target gene expression suppression method of the present invention”).
  • the present invention provides a complex (hereinafter also referred to as “the complex of the present invention”) comprising the CRISPR type ID-related Cas protein and gRNA, which is used in these methods of the present invention, and the complex Provided is a vector comprising the encoding nucleic acid molecule.
  • the cell may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, and is not particularly limited.
  • bacteria, archaea, yeast, plant cells, insect cells, animal cells (eg, human cells, non-human cells, non-mammalian vertebrate cells, invertebrate cells, etc.) can be mentioned.
  • RNA-inducible endonuclease comprises at least one nuclease domain and at least one domain that binds to gRNA, and the target nucleotide sequence (or An endonuclease which is derived at the target nucleotide site).
  • the RNA-inducible endonuclease used in the present invention is an RNA-inducible endonuclease derived from CRISPR type I-D, and includes the CRISPR type I-D related proteins Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d.
  • Cas5d, Cas6d, and Cas7d constitute a "target recognition module” that contributes to target recognition
  • Cas3d and Cas10d appear to constitute a "polynucleotide cleavage module” that contributes to the cleavage of a polynucleotide.
  • the RNA-inducible endonuclease used in the present invention comprises a target recognition module comprising Cas5d, Cas6d and Cas7d, and a polynucleotide cleavage module comprising Cas3d and Cas10d.
  • Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d and Cas10d used in the present invention may be derived from any bacteria or archaea, for example, Microcystis aeruginosa, Acetohalobium arabicum, Ammonifex degensii, Anabaena cylindrica, Anabaena variabilis, Caldicellulosiruptor lactoaceticus, Caldilinea aerophila, Clostridium algidicarnis, Crinium epipsammum, Cyanothece Sp.
  • Microcystis aeruginosa Acetohalobium arabicum
  • Ammonifex degensii Anabaena cylindrica
  • Anabaena variabilis Caldicellulosiruptor lactoaceticus
  • Caldilinea aerophila Clostridium algidicarnis, Crinium epipsammum, Cyanothece Sp.
  • Thermacetogenium phaeum, Thermofilum pendens, etc. may be from a strain.
  • the amino acid sequence and nucleotide sequence information of the above Cas protein can be obtained, for example, from public databases such as NCBI GenBank.
  • sequence acquisition from a novel microorganism species is also possible.
  • the nucleic acid encoding the above Cas protein may be constructed, for example, by selecting a codon optimized for translation in a host cell into which the nucleic acid is introduced based on amino acid sequence information, and synthesizing it by chemical synthesis or the like.
  • the above Cas protein may be chemically synthesized based on amino acid sequence information, or a nucleic acid encoding the above Cas protein may be introduced into cells via an appropriate vector or the like and produced in the cells.
  • Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d Cas proteins may be mutant Cas proteins as long as they retain the functions of the respective Cas proteins described in the above-described principle of the present invention.
  • a guide RNA is a molecule that forms a complex with the above target recognition modules (Cas5d, Cas6d and Cas7d) to target a target nucleotide sequence with these Cas proteins.
  • gRNA binds to Cas7d of the target recognition module.
  • gRNA binds to a complex comprising Cas5d, Cas6d, and Cas7d to direct the complex to a target nucleotide sequence.
  • gRNA binds to the target recognition module of the RNA inducible endonuclease and directs the RNA inducible endonuclease to the target nucleotide sequence.
  • the target recognition module is present as part of a fusion protein other than the RNA-inducible endonuclease, gRNA binds to the target recognition module and directs the fusion protein to the target nucleotide sequence.
  • gRNA is a sequence complementary to the target sequence so that it can form a base pair with the target nucleotide sequence, and before and after the sequence (5 'end and 3' end), at the CRISPR type I-D locus. Contains the common repeat sequence from which it is derived.
  • the common repeat sequence part of gRNA may have at least one hairpin structure.
  • the common repeat sequence portion at the 5 'end of the sequence complementary to the target nucleotide sequence has a hairpin structure, and the single common repeat sequence portion at the 3' end of the sequence complementary to the target nucleotide sequence It may be a chain.
  • gRNA preferably has one hairpin structure.
  • a consensus repeat sequence derived from the CRISPR type I-D locus can be found from the gRNA gene sequence region adjacent to the type I-D gene cluster using a tandem repeat search program.
  • the base length of the common repetitive sequence contained in gRNA is not particularly limited as long as the purpose of interacting with the target recognition module to target the target nucleotide sequence is achieved.
  • the common repeat sequences before and after the sequence complementary to the target nucleotide sequence may each be about 10 to 70 bases long, for example 30 to 50 bases long.
  • the gRNA can comprise a sequence of about 10 to 70 bases that is complementary to the target nucleotide sequence.
  • the sequence complementary to the target nucleotide sequence contained in gRNA is preferably a sequence consisting of 20 bases to 50 bases, more preferably a sequence consisting of 25 bases to 45 bases, still more preferably a sequence consisting of 30 bases to 40 bases, and still more preferably It is a sequence consisting of 32 bases to 37 bases, for example, a sequence consisting of 32 bases, 33 bases, 34 bases, 35 bases, 36 bases or 37 bases. It is believed that the longer the targetable target sequence, the greater the sequence specificity of target recognition by gRNA.
  • RNA-inducible endonucleases eg, Cas9 and Cpf1
  • Cas9 and Cpf1 used in conventional genome editing techniques (eg, Cas9 and Cpf1) have a length of about 20-24 bases to which gRNA can be targeted
  • the present invention is more sequence specific than conventional methods. It has excellent sex and stability.
  • the target nucleotide sequence (herein also simply referred to as “target sequence”) is a sequence of any nucleic acid, which is located in the vicinity of the protospacer proximity motif (PAM) There is no particular limitation except that it is selected as a target sequence.
  • the target nucleotide sequence may be either double stranded DNA sequence, single stranded DNA sequence, or RNA sequence. Examples of DNA include eukaryotic nuclear genomic DNA, mitochondrial DNA, plastid DNA, prokaryotic genomic DNA, phage DNA, or plasmid DNA.
  • the target nucleotide sequence is preferably double-stranded DNA on the genome.
  • "located in the vicinity” includes both adjacent and nearby.
  • proximal includes both adjacent positions or near positions.
  • the PAM sequences utilized for target recognition in the CRISPR system vary depending on the type of CRISPR system.
  • a sequence located in the vicinity downstream of the 3 'side of the PAM sequence is selected as a target nucleotide sequence.
  • the target nucleotide sequence may be a sequence located in the vicinity of the PAM sequence and present in the intron, coding region, non coding region or control region of the target gene.
  • the target gene is any gene and may be selected arbitrarily.
  • the PAM sequences of Cas9 and Cpf1 and the PAM sequences of TiD in the genomic sequences of higher plants are compared (ie, the number of candidate targets for the CRISPR system), the PAM sequence frequency of TiD is the highest, and Cas9 or Cpf1 It was found that the number of targets was larger than the conventional genome editing technology used (Table 1).
  • the target sequence targeting method of the present invention is characterized in that the target recognition modules (Cas5d, Cas6d, and Cas7d) and the gRNA are introduced into the cells. That is, the target sequence targeting method of the present invention comprises: (i) nucleic acids encoding Cas5d, Cas6d, and Cas7d or these proteins, and (ii) introducing the above gRNA or DNA encoding the gRNA into the above cells It is characterized by The target sequence targeting method of the present invention may be performed either in vitro or in vivo.
  • the target recognition module may be introduced into cells as an isolated complex containing Cas5d, Cas6d and Cas7d, or each of Cas5d, Cas6d and Cas7d may be single. It may be introduced into the cell alone as a released protein. Moreover, in the target sequence targeting method of the present invention, the target recognition module may be introduced into cells as a nucleic acid encoding the Cas protein Cas5d, Cas6d, and Cas7d. Examples of the nucleic acid include RNA such as mRNA or DNA.
  • the DNA encoding the above Cas protein may be contained, for example, in a vector, and the DNA sequence is preferably operably linked to regulatory sequences such as a promoter and a terminator.
  • regulatory sequences such as a promoter and a terminator.
  • a nuclear localization signal sequence is added to the DNA encoding the Cas protein.
  • Two or more or all of the above Cas proteins of Cas5d, Cas6d, and Cas7d may be contained in a single vector, or may be contained in separate vectors. There is no limitation on the number of vectors, and the type and combination of Cas proteins encoded by the DNAs incorporated into each vector.
  • DNA sequences encoding the above Cas protein When two or more DNAs encoding the above Cas protein are contained in one vector, these DNA sequences may be mutually expressed, for example, via a sequence encoding a self-cleavable peptide, etc. so as to express polycistronically. It may be linked to The order in which two or more DNAs encoding the Cas protein are linked may be in any order.
  • the gRNA may be introduced into cells as RNA or as DNA encoding gRNA.
  • the DNA encoding gRNA may be, for example, contained in a vector, and the DNA sequence is preferably operably linked to regulatory sequences such as a promoter and a terminator.
  • the DNA encoding the Cas protein and the DNA encoding the gRNA may be contained in the same vector or may be contained in separate vectors.
  • one or more or all of the DNAs encoding Cas5d, Cas6d, and Cas7d, and the DNA encoding gRNA may be contained in a single vector.
  • the regulatory sequences such as the promoter and the terminator, and the nuclear localization signal sequence are known in the art and can be appropriately selected according to the species from which the target recognition module and the cell into which the gRNA is introduced are derived.
  • the vector used for the introduction may also be appropriately selected depending on the species of the organism from which the introduced cell is derived, and is not particularly limited. For example, plasmid vectors, viral vectors, phagemids, cosmids, artificial / minichromosomes, transposons and the like can be mentioned.
  • the target recognition module and introduction of gRNA into cells can be performed by various means known in the art.
  • transfection for example, calcium phosphate-mediated transfection, electroporation, liposome transfection, etc., virus transduction, lipofection, gene gun, microinjection, Agrobacterium method, agroinfiltration method, PEG-calcium method, etc.
  • transfection for example, calcium phosphate-mediated transfection, electroporation, liposome transfection, etc.
  • the target recognition module and gRNA may be introduced into cells simultaneously or sequentially.
  • Cas5d, Cas6d, and Cas7d constituting the target recognition module, or nucleic acids encoding each of these Cas proteins may be introduced into cells simultaneously or sequentially.
  • the above Cas proteins Cas5d, Cas6d and Cas7d synthesized respectively in vitro or in vivo and gRNA synthesized in vitro or in vivo are incubated in vitro to form a complex, Complexes can be introduced into cells.
  • cells Upon introduction of the target recognition module and gRNA, cells are cultured under conditions suitable for targeting of the target nucleotide sequence. The cells are then cultured under conditions suitable for cell growth and maintenance.
  • the culture conditions may be culture conditions suitable for the species from which the target recognition module and the cell into which gRNA is introduced are derived, and can be appropriately determined by those skilled in the art based on known cell culture techniques, for example.
  • gRNA and Cas7d of the target recognition module are bound to form a complex between the target recognition module and the gRNA, and at the same time, the gRNA forms a base pair with the target nucleotide sequence
  • the target recognition module targets the target nucleotide sequence in a sequence-specific manner by recognizing PAM sequences near the target nucleotide sequence.
  • Cas10d may be further introduced into cells.
  • the target sequence modification method of the present invention is characterized in that the RNA-inducible endonuclease and the gRNA are introduced into the cells. That is, the target sequence modification method of the present invention comprises the steps of (i) Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d, or a nucleic acid encoding these proteins, and (ii) the above gRNA or said gRNA in cells. DNA is introduced into the cells.
  • the target sequence modification method of the present invention comprises cleaving a nucleotide sequence targeted by the target sequence targeting method of the present invention by the above-mentioned polynucleotide cleavage module.
  • the target sequence modification method of the present invention may be performed either in vitro or in vivo. In the present invention, modification includes deletion, insertion or substitution of at least one nucleotide, or a combination thereof.
  • a donor polynucleotide may be introduced into cells in addition to the above-described RNA-inducible endonuclease and gRNA.
  • the donor polynucleotide comprises at least one donor sequence comprising the modification that one wishes to introduce at the target site.
  • the donor polynucleotide is, in addition to the donor sequence, a sequence having high homology to the upstream and downstream sequences of the target sequence at each end of the donor sequence (preferably, a sequence substantially identical to the upstream and downstream sequences of the target sequence ) May be included.
  • the donor polynucleotide may be single stranded or double stranded DNA.
  • the donor polynucleotide can be appropriately designed by those skilled in the art based on techniques known in the art.
  • cleavage at the target nucleotide sequence can be repaired by non-homologous end joining (NHEJ).
  • NHEJ non-homologous end joining
  • the sequence may be altered at the target sequence site, thereby inducing a frameshift or an immature stop codon, which may inactivate or knock out expression of the gene encoded by the target sequence region.
  • the donor sequence of the donor polynucleotide is inserted into the target sequence site by homologous recombination repair (HDR) of the cleaved target nucleotide sequence, or The target sequence site is replaced with the donor sequence.
  • HDR homologous recombination repair
  • the RNA-inducible endonuclease may be introduced into the cell as an isolated complex comprising Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas3d, and Cas10d, or each of Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas3d, and Cas10d is It may be introduced into cells alone as an isolated protein.
  • the RNA-inducible endonuclease may be introduced into the cell as a nucleic acid encoding the Cas protein Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas3d, and Cas10d. Examples of the nucleic acid include RNA such as mRNA or DNA.
  • the DNA encoding the above Cas protein may be contained, for example, in a vector, and the DNA sequence is preferably operably linked to regulatory sequences such as a promoter and a terminator.
  • regulatory sequences such as a promoter and a terminator.
  • a nuclear localization signal sequence is added to the DNA encoding the Cas protein.
  • Two or more or all of the above Cas proteins of Cas protein, Cas5 d, Cas6 d, Cas7 d, and Cas10 d may be contained in a single vector, or may be contained in separate vectors. There is no limitation on the number of vectors, and the type and combination of Cas proteins encoded by the DNAs incorporated into each vector.
  • DNA sequences encoding the above Cas protein When two or more DNAs encoding the above Cas protein are contained in one vector, these DNA sequences may be mutually expressed, for example, via a sequence encoding a self-cleavable peptide, etc. so as to express polycistronically. It may be linked to The order in which two or more DNAs encoding the Cas protein are linked may be in any order.
  • the gRNA may be introduced into cells as RNA or as DNA encoding gRNA.
  • the DNA encoding gRNA may be, for example, contained in a vector, and the DNA sequence is preferably operably linked to regulatory sequences such as a promoter and a terminator.
  • the DNA encoding the Cas protein and the DNA encoding the gRNA may be contained in the same vector or may be contained in separate vectors. For example, all DNA encoding each of Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d, and DNA encoding gRNA may be contained in a single vector.
  • the regulatory sequences such as the promoter and terminator, and the nuclear localization signal sequence are known in the art, and can be appropriately selected according to the type of RNA-inducible endonuclease and cells into which the gRNA is introduced.
  • the vector used for introduction may also be selected appropriately according to the type of cells to be introduced, and is not particularly limited. For example, plasmid vectors, viral vectors, phagemids, cosmids, artificial / minichromosomes, transposons and the like can be mentioned.
  • RNA-inducible endonuclease for example, calcium phosphate-mediated transfection, electroporation, liposome transfection, etc., virus transduction, lipofection, gene gun, microinjection, Agrobacterium method, agroinfiltration method, PEG-calcium method, etc. Can be mentioned.
  • RNA inducible endonuclease gRNA and donor polynucleotide may be introduced into the cell simultaneously or sequentially.
  • Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d, which constitute the above-mentioned RNA-inducible endonuclease, or a nucleic acid encoding each of these Cas proteins may be introduced into cells simultaneously or sequentially.
  • RNA inducible endonuclease and gRNA At the time of introduction of the RNA inducible endonuclease and gRNA, or RNA inducible endonuclease, gRNA and donor polynucleotide, cells are cultured under conditions suitable for cleavage at the target sequence site. The cells are then cultured under conditions suitable for cell growth and maintenance.
  • the culture conditions may be any culture conditions suitable for the species from which cells introducing RNA-inducible endonuclease and gRNA, or RNA-inducible endonuclease, gRNA and donor polynucleotide are derived, for example, known cell culture techniques. It can be appropriately determined by those skilled in the art based on
  • the target sequence modification method of the present invention at the same time as the gRNA forms a base pair with the target nucleotide sequence, the interaction with the target recognition module of the RNA inducible endonuclease causes the RNA inducible endonuclease to become the target
  • the cleavage module of the RNA-inducible endonuclease cleaves the sequence at the target sequence site, and upon repair of the cleavage sequence, the target sequence is altered.
  • the target sequence modification method of the present invention can be used for modification of a target nucleotide sequence on the genome, whereby the double-stranded DNA on the genome is cleaved and the target site is modified.
  • Target gene expression suppression method of the present invention is characterized in that the target recognition modules (Cas5d, Cas6d, and Cas7d) and the gRNA are introduced into the cells. That is, the target sequence targeting method of the present invention comprises: (i) nucleic acids encoding Cas5d, Cas6d, and Cas7d or these proteins, and (ii) introducing the above gRNA or DNA encoding the gRNA into the above cells It is characterized by In the target gene expression suppression method of the present invention, as the target nucleotide sequence, the sequence of at least a part of the sequence of the target gene is selected, and gRNA containing a sequence complementary to the sequence is used.
  • the target gene expression suppression method of the present invention comprises the target sequence by targeting the nucleotide sequence by the target sequence targeting method of the present invention, by binding the complex of the target recognition module and gRNA to the target sequence. Including the suppression of gene expression.
  • the target gene expression suppression method of the present invention may be performed either in vitro or in vivo. According to the target gene expression suppression method of the present invention, the target gene sequence is not cleaved, but the complex of the target recognition module and gRNA binds to the target nucleotide sequence to function as a function of the gene region including the target sequence or The expression of the gene is inhibited.
  • Target recognition module and gRNA the method for introducing them into cells, and the cell culture at the time of introduction and after introduction are the same as those described in the above (5) Target sequence targeting method of the present invention. .
  • Cas10d may be further introduced into cells.
  • the complex of the present invention comprises the above-mentioned CRISPR type I-D Cas protein and the above-mentioned gRNA.
  • the present invention particularly provides a complex comprising the target recognition module and the gRNA, and a complex comprising the RNA-inducible endonuclease and gRNA. More specifically, a complex comprising Cas5d, Cas6d, and Cas7d and gRNA, and a complex comprising Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas3d and Cas10d and gRNA are provided. In addition, DNA molecules encoding the above complexes are also provided.
  • the complex of the present invention can be used for the target sequence modification method, target gene expression suppression method, and target sequence targeting method of the present invention described above.
  • a complex containing an RNA-inducible endonuclease a complex containing Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas3d and Cas10d
  • gRNA RNA-inducible endonuclease
  • the complex is made to function in the cell to allow the cell to function.
  • the target sequence on the genome can be altered.
  • a target sequence in a cell is introduced by introducing a complex comprising a target recognition module (a complex containing Cas5d, Cas6d, and Cas7d) and gRNA into the cell to make the complex function in the cell.
  • the complex containing the target recognition module and gRNA may further contain Cas10d.
  • the complexes of the invention can be prepared in vitro or in vivo by conventional methods.
  • a nucleic acid encoding the above RNA-inducible endonuclease or Cas protein constituting the above target recognition module, and gRNA or DNA encoding gRNA may be introduced into cells to form complexes in the cells. .
  • Microcystis aeruginosa Cas5d (SEQ ID NO: 1), Cas6d (SEQ ID NO: 2), and Cas7d (SEQ ID NO: 3)
  • Microcystis aeruginosa Cas5d (SEQ ID NO: 1), Cas6d (SEQ ID NO: 2), Cas7d (SEQ ID NO: 3), Cas3 d (SEQ ID NO: 4) and Cas 10 d (SEQ ID NO: 5),
  • N is complex thereof comprising the gRNA consisting of the sequence shown in is any nucleotide) constituting a sequence complementary to the target nucleotide sequence.
  • the number of N in the sequence of the above gRNA may be changed in the range of 10 to 70, preferably 20 to 50, more preferably 25 to 45, still more
  • Expression vector of the present invention further provides a nucleic acid encoding RNA-inducible endonuclease comprising Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d, and a sequence complementary to the target sequence and the CRISPR before and after said sequence
  • An expression vector comprising a DNA encoding a guide RNA comprising a consensus repeat sequence derived from a genetic locus, and a nucleic acid encoding a CRISPR type I-D related protein Cas5d, Cas6d, and Cas7d, and a sequence complementary to a target sequence and said
  • an expression vector comprising a DNA encoding a guide RNA comprising a consensus repeat sequence derived from the CRISPR locus before and after the sequence.
  • the vector of the present invention is described in the above "(5) Target sequence targeting method of the present invention", “(6) Target sequence modification method of the present invention” and “(7) Target gene expression suppression method of the present invention” As described above, it is a vector for introducing the above Cas protein and gRNA into cells. After the introduction of the vector, the Cas protein and gRNA are expressed in the cells.
  • the vector of the present invention may also be a vector in which the target sequence contained in the above gRNA is replaced with any sequence containing a restriction site. Such a vector is used by incorporating a desired target nucleotide sequence at the arbitrary sequence site.
  • the arbitrary sequence may be, for example, a spacer sequence at a locus of CRISPR type I-D or a part thereof.
  • the present invention further provides a fusion protein comprising the above target recognition module and a functional polypeptide.
  • the fusion protein and the gRNA are introduced into cells, the fusion protein is induced to the target nucleotide sequence or target gene in the cell by the action of the target recognition module and gRNA, and the action of the functional polypeptide causes the target nucleotide sequence or the target nucleotide sequence or The target gene is altered or modified. Therefore, the present invention further provides a method for modifying or modifying a target nucleotide sequence or target gene, which comprises introducing the above fusion protein and the above gRNA into cells. Furthermore, the present invention also provides a complex comprising the fusion protein and the gRNA.
  • the functional polypeptide is a polypeptide that exhibits some function to the target sequence, and is a polypeptide other than Cas3d and Cas10d.
  • the functional polypeptide include, but are not limited to, restriction enzymes, transcription factors, DNA methylases, histone acetylases, fluorescent proteins, and nucleotide cleavage modules of restriction enzymes as polynucleotide cleavage modules, for example.
  • Gene expression regulatory modules include transcription activation modules and transcription repression modules of transcription factors
  • epigenome modification modules include methylation modules of DNA methylation enzymes and acetylation modules of histone acetylases.
  • fluorescent proteins include GFP.
  • a fusion protein containing the above target recognition module and a polynucleotide cleavage module can be modified with a target sequence by introducing it into cells together with gRNA, as in the target sequence modification method of the present invention.
  • a fusion protein with the above-mentioned target recognition module and a gene expression regulatory module or an epigenomic modification module can modify the target sequence and regulate the expression of a target gene by introducing it into cells together with gRNA.
  • a fusion protein with the above target recognition module and a fluorescent protein can be fluorescently labeled in the vicinity of a target sequence by introducing it into cells together with gRNA.
  • a gene group (Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas10d) derived from Microcystis aeruginosa-derived CRISPR type I (hereinafter also referred to as “TiD”) locus was cloned and used.
  • TiD Microcystis aeruginosa-derived CRISPR type I locus
  • any of artificial gene chemical synthesis, PCR method, restriction enzyme treatment, ligation, and Gibson Assembly method was used.
  • Sanger method or next-generation sequencing method was used to determine the base sequence.
  • Example 1 Genome Editing in E. coli
  • E. coli which is a typical bacterial model organism.
  • TiD locus The gene group derived from the CRISPR type I-D locus (hereinafter also referred to as "TiD locus") of Microcystis aeruginosa (hereinafter also referred to as "M. aeruginosa”) was cloned. From the TiD locus M. Based on the amino acid sequence information of Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas3d and Cas10d derived from aeruginosa, E. coli codon type sequences (SEQ ID NOS: 7 to 11) encoding each Cas protein were artificially synthesized.
  • a DNA fragment having a J23108 synthetic promoter (SEQ ID NO: 12) or synthetic ribosomal binding sequence (SEQ ID NO: 13) upstream of each gene and a terminator sequence (SEQ ID NO: 14 to 17) downstream of each gene is a plasmid vector pACYC184 ( It was ligated to Nippon Gene Co., Ltd.) to construct pEcTiD1. Furthermore, M.
  • the CRISPR repeat sequence (crRNA, SEQ ID NO: 18) present near the CRISPR type I-D locus from aeruginosa is extracted, and the crRNA expression cassette (SEQ ID NO: 20) is synthesized under the control of the T7 promoter (SEQ ID NO: 19) did.
  • the crRNA expression cassette contains the promoter region sequence of the E. coli ccdB gene to be the target sequence of this example.
  • the crRNA expression cassette sequence was incorporated into pEcTiD1 to construct pEcTiD2 (FIG. 2a).
  • construction of pEcTiD3 containing Cas5d, Cas6d and Cas7d gene expression cassettes was performed as a TiD expression plasmid vector performing genome editing without DNA double strand breaks (FIG. 2b).
  • the promoter, terminator, CRISPR repeat sequence, and crRNA expression cassette sequence used in this example are shown in Table 2.
  • the CRISPR system recognizes a protospacer flanking motif (PAM) sequence located near the target sequence and binds to the target sequence via gRNA.
  • PAM protospacer flanking motif
  • M. M. used in this example. Since the PAM sequence of aeruginosa TiD was unknown, first, M. aeruginosa TiD was unknown.
  • a PAM sequence library plasmid was constructed to determine the PAM sequence of aeruginosa TiD.
  • a random 4-base sequence was introduced into the pMW_ccdB1 T7 promoter upstream using artificial chemical DNA synthesis and PCR (FIG. 3 b).
  • the constructed pMW_ccdB-PAM library plasmid was introduced into a CcdB resistant E. coli ccdB resistant cell line (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and then a large amount of plasmid was prepared.
  • the Cas5d / Cas6d / Cas7d-crRNA complex recognizes the target sequence adjacent to the appropriate PAM sequence and does not cleave the target sequence, but binds to the target sequence to inhibit the function of the T7 promoter as a target sequence Do.
  • CcdB expression of pMW-ccdB-PAM introduced into strain BL21AI is induced in arabinose-added medium, and strain BL21AI not having CcdB resistance is killed.
  • pMW_ccdB-PAM library plasmid is introduced into BL21AI strain into which TiD expression plasmid has been introduced in advance
  • the pMW_ccdB-PAM library plasmid is prepared from the grown E. coli colonies and sequenced PAM sequence analysis. The PAM sequence of aeruginosa TiD is determined.
  • the pMW_ccdB-PAM library plasmid subjected to large-scale plasmid preparation was introduced into BL21AI [pEcTiD3-T7] strain by a chemical competent cell method.
  • BL21AI cells carrying pMW_ccdB-PAM library plasmid and pEcTiD3-T7 were selected on LB agar medium containing 25 mg / L chloramphenicol, 25 mg / L kanamycin and 1% glucose.
  • LB liquid medium containing no antibiotics and glucose
  • the suspension was cultured at 37 ° C. for 2 hours, and after induction of expression of crRNA and ccdB under the control of T7 promoter expression by arabinose, 200 ⁇ L of bacterial fluid was 25 mg / L chloramphenicol, 25 mg / L.
  • the cells were plated on an LB agar medium containing L kanamycin and 1% arabinose, and cultured overnight at 37 ° C. to obtain bacterial colonies obtained.
  • a plasmid was prepared from the recovered colonies of about 500 strains, and sequence analysis in the vicinity of the PAM sequence was performed.
  • BL21AI strain carrying the correct plasmid is applied to LB agar medium containing 25 mg / L chloramphenicol, 25 mg / L kanamycin and 1% arabinose and cultured overnight at 37 ° C. It was not recognized and was considered to be due to double strand breaks of plasmid DNA in the presence of Cas3 and Cas10d.
  • Example 2 Genome Editing in Higher Plants
  • the technique of the present invention works effectively in Nicotiana benthamiana and Solanum lycopersicum as an example of genome editing in higher eukaryotes.
  • Two cauliflower mosaic virus 35S gene promoters are arranged in tandem on the 5 ′ side upstream of the 5 TiD gene fragments linked by the 2A peptide sequence, and a promoter sequence (2 ⁇ 35S promoter; SEQ ID NO: 29) in which a translation enhancer ⁇ sequence is further added
  • a TiD gene expression cassette was prepared in which an Arabidopsis heat shock protein 18.2 kDa gene terminator sequence (SEQ ID NO: 30) was linked downstream of the 3 'side.
  • the TiD gene expression cassette was cloned into the binary plasmid vector pCAMBIA2300 to construct pEgPTiD1 (FIG. 4a).
  • a plant crRNA expression cassette was artificially synthesized with a DNA sequence in which a spacer sequence containing two restriction enzyme sites BsaI was placed between two crRNA sequences so that arbitrary 35 base sequences could be ligated (SEQ ID NO: 31 ).
  • a plant crRNA expression cassette was constructed in which a promoter sequence (SEQ ID NO: 32) of the Arabidopsis thaliana U6 snRNA-26 gene was added to the 5 'upstream side as an expression control sequence, and a poly T sequence was added to the 3' side downstream (Fig. 4b).
  • the plant crRNA expression cassette was ligated between the RB sequence of pEgPTiD1 and the 2x35S promoter to construct pEgPTiD2, which was used as a TiD gene expression binary plasmid vector for plant genome editing (Fig. 4c). Sequences of dicotyledonous codon types encoding each Cas protein to which a nuclear localization signal is added in pEgPTiD1 and pEgPTiD2 are shown in SEQ ID NOs: 33 to 37. The nuclear localization signal sequence, the autocleavage peptide 2A sequence, the promoter, the terminator, and the crRNA expression cassette sequence used in this example are shown in Table 4.
  • Target sequence 1 (Target 1, SEQ ID NO: 38) was selected from the third exon in the tobacco PDS gene, and pEgPTiD2-pds (1) was constructed by artificial chemical synthesis and incorporated into a plant crRNA expression cassette.
  • target sequence 2 (Target 2, SEQ ID NO: 39) was selected from exon 6, and pEgPTiD2-pds (2) was constructed by artificial chemical synthesis and incorporated into a plant crRNA expression cassette.
  • the constructed binary vector was introduced into Agrobacterium tumefaciens GV2260 strain, respectively.
  • the introduction of the TiD expression vector targeting tobacco PDS into tobacco cells was performed by the agroinfiltration method.
  • the Agrobacterium strain carrying pEgPTiD2-pds (1) or pEgPTiD2-pds (2) and the Agrobacterium strain carrying the GFP expression binary vector were respectively cultured to co-infect the true leaves of N. benthamiana ( Figure 5-1 b). After co-infection, 300-500 bp PDS gene fragment containing the target sequence was PCR amplified using genomic DNA prepared from the region emitting GFP fluorescence as a template in leaf pieces after 3 days.
  • a Cel-1 assay was performed using the amplified PCR fragment to analyze the presence or absence of a mutation introduced on the PDS gene.
  • a tobacco leaf into which only the GFP expression binary vector was introduced was used as a control.
  • mutation was introduced on the target sequence of each PDS gene. It was recognized (c in Figure 5-2).
  • Target sequences 1 and 2 are shown in Table 5.
  • Target sequence 1 SEQ ID NO: 40
  • pEgPTiD2-iaa9 was constructed by artificial chemical synthesis and incorporated into a plant crRNA expression cassette.
  • the constructed binary vector was introduced into Agrobacterium tumefaciens GV2260 strain.
  • the introduction of a TiD expression vector targeting tomato IAA9 gene into tomato cells was performed by the Agrobacterium method using a leaf disc derived from tomato cotyledon.
  • the genomic DNA prepared from the resulting transformed calli was used as a template, and the approximately 300b region containing the target sequence of IAA9 was amplified by PCR.
  • the callus culture-derived PCR fragment into which pEgPTiD2-iaa9 had been introduced contains a sequence that is not cleaved by AccI as a result of mutagenesis of the IAA9 target sequence.
  • Figure 6c The base sequence of the PCR fragment derived from the callus from which pEgPTiD2-iaa9 was introduced was determined, and mutations of 1b to 4b with deletion or insertion of bases were introduced immediately after the PAM sequence on the target sequence of IAA9. It became clear that there was (Fig. 7).
  • the callus to which pEgPTiD2-iaa9 had been introduced was further cultured on MS solidified medium containing 100 mg / L kanamycin and 1.0 mg / L t-zeatin to obtain transformed redifferentiated shoots.
  • genomic DNA prepared from the redifferentiated shoot obtained was used as a template and PCR-RFLP analysis was performed with AccI, as shown in FIG. 8a, the PCR fragment not subjected to cleavage with AccI, that is, the mutation in the IAA9 target sequence is nearly complete.
  • a 100% introduced transformed redifferentiated shoot was obtained.
  • the transformed and regenerated shoots of 14 individuals which were regenerated as shown in FIG.
  • Cytomegalovirus enhancer + avian ⁇ -actin gene promoter hybrid sequence (CBh promoter; SEQ ID NO: 41) upstream of 5 TiD gene fragments linked by 2A peptide sequence, and bovine derived growth downstream of 3 'side
  • a TiD gene expression cassette in which a hormone gene terminator sequence (bGH terminator SEQ ID NO: 42) was linked was prepared, and pCR_hTiD linked to a pCR8TOPO vector (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) was constructed.
  • a crRNA expression cassette As a crRNA expression cassette, a DNA (SEQ ID NO: 31) in which a spacer sequence including two restriction enzyme BsaI sites was arranged between two crRNA sequences so as to allow ligation of an arbitrary 35 base sequence was artificially synthesized.
  • the promoter sequence of human U6 snRNA gene (SEQ ID NO: 43) was added to the 5 'side as an expression control sequence, and the poly T sequence was added to the 3' side, and ligated to pCR8TOPO vector (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co.) pCR_crRNA was constructed.
  • each Cas protein to which a nuclear localization signal has been added in pCR_hTiD is shown in SEQ ID NOs: 33 to 37.
  • the CBh promoter, bGH terminator, and human U6 snRNA gene promoter sequences are shown in Table 7.
  • coli HST08 strain manufactured by Takara Bio Inc.
  • PureYield registered trademark
  • Plasmid Miniprep System manufactured by Promega Corp.
  • a mixture of pCR_hTiD and pUC_crRNA-T1 or a mixture of pCR_hTiD and pUC_crRNA-T2 was transfected into HEK293 cell line and introduced.
  • the cell line on day 3 after plasmid vector introduction was recovered, and genomic DNA was prepared using Blood & Cell Culture DNA Mini Kit (manufactured by Qiagen).
  • the genomic sequence region containing target 1 and target 2 was amplified by PCR, and mutation analysis was performed by heteroduplex mobility analysis using an automated electrophoresis apparatus MultiNA (manufactured by Shimadzu Corporation) . Also, the amplified PCR fragment was cloned into pNEB193 vector (manufactured by New England Biolab), and the mutated sequence was identified by sequence analysis. The somatic mutation efficiency was calculated by the number of clones in which each mutant sequence was confirmed / the total number of analyzed clones.
  • FIG. 9 shows an experimental scheme of genome editing using the HEK 293 cell line.
  • FIGS. 10 and 11 show the results of the HEK 293 cell line transfected with the mixture of pCR_hTiD and pUC_crRNA-T1 or the mixture of pCR_hTiD and pUC_crRNA-T2, or the HEK 293 cell line (control) into which no plasmid was introduced.
  • FIG. 10 and FIG. 11 in the HEK 293 cell line transfected with a mixture of pCR_hTiD and pUC_crRNA-T1 or a mixture of pCR_hTiD and pUC_crRNA-T2, a peak that is thought to have a mutation introduced into the target sequence was detected .
  • the present invention it has become possible to target gene sequences that could not be targeted by genome editing technology using conventional CRISPR type II or type V-derived RNA inducible endonuclease. That is, according to the present invention, it is possible to realize generation of mutant alleles on gene regions that can not be targeted by the prior art, gene expression control by transcriptional activation and inactivation, and epigenetic modification by targeting of DNA modification / histone modification protein domain It became possible.
  • N is any nucleotide constituting a complementary sequence to a target nucleotide sequence.
  • SEQ ID NO: 7 Cas5 d nucleotide sequence for expression in Escherichia coli SEQ ID NO: 8; Cas 6 d nucleotide sequence for expression in Escherichia coli SEQ ID NO: 9; Cas7 d nucleotide sequence for expression in Escherichia coli SEQ ID NO: 10; Cas3d nucleotide sequence for expression in Escherichia coli SEQ ID NO: 11; Cas10 d nucleotide sequence for expression in Escherichia coli SEQ ID NO: 12; J23108 synthesis promoter SEQ ID NO: 13; Ribosomal binding sequence SEQ ID NO: 14; Terminator sequence STOP 767 SEQ ID NO: 15; Terminator sequence STOP 768 (1) SEQ ID NO: 16; Terminator sequence TOP768 (2) SEQ ID NO: 17; T7 terminator sequence SEQ ID NO: 18; CRISPR repeat sequence SEQ ID NO: 19; T7 promoter sequence SEQ ID NO: 20; crRNA

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Abstract

標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、細胞中に、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡ、または該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを導入することを含む方法等が提供される。

Description

ヌクレオチド標的認識を利用した標的配列特異的改変技術
　本発明は、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）タイプＩ－Ｄシステムのヌクレオチド標的認識を利用した、標的ヌクレオチド配列を標的化する方法、標的ヌクレオチド配列を特異的に改変する方法、標的遺伝子の発現を抑制する方法、および該方法に用いられるＣａｓ（CRISPR-associated（CRISPR関連））タンパク質およびガイドＲＮＡを含む複合体に関する。
　細菌および古細菌は、ウイルスおよび異種の外来プラスミドに対する適応免疫機構としてＣＲＩＳＰＲシステムを有している。ＣＲＩＳＰＲシステムは、侵入するＤＮＡ配列に対して相補性を有する低分子のＲＮＡ（ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡと称する）を利用して、標的となる外来ＤＮＡに対してターゲティングと分解を促す。このとき、ｇＲＮＡと結合して複合体を形成するＣａｓタンパク質が必要となる。ＣＲＩＳＰＲシステムには、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩおよびタイプＶシステムが存在する。いずれのシステムもＣａｓタンパク質－ｇＲＮＡ複合体が標的配列に作用することでウイルスおよび外来プラスミドに干渉作用を及ぼす。タイプＩＩおよびタイプＶシステムは、ｇＲＮＡ結合性を保持するタンパク質ドメインとＲｕｖＣ類似ＤＮＡ切断タンパク質ドメインを有する一体型タンパク質による、標的ＤＮＡ上のＤＮＡ二重鎖切断が干渉作用のメカニズムである。タイプＩＩＩシステムについては、５ないし８つのＣａｓタンパク質とｇＲＮＡの複合体が、タイプＩＩとは異なり、標的ＲＮＡ配列を切断することにより干渉作用をもたらすことがイン・ビトロおよびイン・ビボにおいて証明されている。
　近年、ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩおよびタイプＶシステムを利用したゲノム編集技術が開発され、Ｃａｓタンパク質としてＣａｓ９およびＣｐｆ１が利用されている。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１は、標的ＤＮＡを認識するために、標的配列の近傍にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列と呼ばれる２ないし５塩基程度の配列を必要とする。Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体およびＣｐｆ１－ｇＲＮＡ複合体は、イン・ビトロおよびイン・ビボにおいて、ＰＡＭ配列近傍の標的部位にＤＮＡ二重鎖切断をひき起こす、配列特異的なＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼであることが実証されている。
　一方、ＣＲＩＳＰＲタイプＩシステムについては、様々な菌類から複数のサブタイプに分類されるシステムがゲノム配列として同定されており、タイプＩ－Ａ、Ｉ－Ｂ、Ｉ－Ｃ、Ｉ－Ｄ、Ｉ－Ｅ、Ｉ－Ｆ、およびＩ－Ｕとして分類・命名されている。このうち大腸菌由来のタイプＩ－Ｅシステムはもっとも研究が進んでおり、６つのＣａｓタンパク質（Ｃａｓ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６ｅ）およびｇＲＮＡからなる複合体が標的ＤＮＡ配列の分解を促すことが証明されている。しかし、その他のサブタイプの干渉作用については、一部のサブタイプ（タイプＩ－Ｃ）を除き、必要なＣａｓタンパク質構成要素、ｇＲＮＡ配列、標的ＤＮＡを規定するＰＡＭ配列等についてほとんど解明されていない。また、ＣＲＩＳＰＲタイプＩシステム由来のＣａｓタンパク質を利用する技術として、ＣＲＩＳＰＲタイプＩシステム由来のＣａｓタンパク質をコードする組換え核酸分子を用いて標的遺伝子の発現を抑制する方法（特許文献１）や、ＣＲＩＳＰＲタイプＩシステム由来のＣａｓタンパク質と他のタンパク質との複合体を用いて標的核酸を改変する方法（特許文献２および特許文献３）等の報告はあるが、ＣＲＩＳＰＲタイプＩシステム由来のＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼにより標的ＤＮＡ分子の二本鎖を切断して改変する技術についての報告はない。
国際公開第ＷＯ２０１５／１５５６８６ 特表２０１５－５０３５３５ 国際公開第ＷＯ２０１７／０４３５７３
　従来のＣＲＩＳＰＲタイプＩＩおよびタイプＶシステムでは、標的特異性を規定する２塩基から５塩基程度のＰＡＭ配列の前後に続く約２０塩基のＲＮＡ分子が標的ターゲティングに利用されるという制限があるため、標的デザインが不可能な遺伝子座が存在するという点と、類似の配列を切断するという点で問題点を有しており、これらの問題点を有しない新たな標的化システムおよび新たなＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼの開発が望まれている。
　上記の課題を解決すべく、本発明者らは鋭意研究した。その結果、驚くべきことに、従来からゲノム編集技術に用いられているＣＲＩＳＰＲタイプＩＩまたはタイプＶ ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼよりも長い標的配列を有する新規の標的化システムおよび新規のＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼを、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄから見出し、標的ヌクレオチド配列上に改変を可能にするゲノム編集技術に利用できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、
［１］標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、細胞中に、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
　（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡ、または該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む方法、
［２］標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、細胞中に、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
　（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡ、または該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む方法、
［３］標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、細胞中に、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
　（ｉｉ）前記標的遺伝子の配列の少なくとも一部に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡ、または該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む方法、
［４］前記ガイドＲＮＡが、前記標的ヌクレオチド配列に相補的な２０～５０塩基からなる配列を含む、［１］～［３］のいずれか１項記載の方法、
［５］前記細胞中にドナーポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、［２］または［４］記載の方法、
［６］改変が塩基の欠失、挿入、または置換である、［２］、［４］および［５］のいずれか１項記載の方法、
［７］前記Ｃａｓ５ｄがプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列として５’－ＧＴＨ－３’（Ｈ＝Ａ、Ｃ、またはＴ）を認識する、［１］～［６］のいずれか１項記載の方法、
［８］（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、および
　（ｉｉ）標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡ
を含む複合体、
［９］Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄをさらに含む、［８］記載の複合体、
［１０］前記ガイドＲＮＡが、前記標的ヌクレオチド配列に相補的な２０～５０塩基からなる配列を含む、［８］または［９］記載の複合体、
［１１］（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄをコードする核酸、および
　（ｉｉ）標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含む発現ベクター、
［１２］Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄをコードする核酸をさらに含む、［１１］記載の発現ベクター、および
［１３］［８］～［１０］のいずれか１項記載の複合体をコードするＤＮＡ分子、ならびに
［１４］標的ヌクレオチド配列を標的化するための、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
　（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡ、または該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ
の使用、
［１５］標的ヌクレオチド配列を改変するための、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
　（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡ、または該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ
の使用、
［１６］標的遺伝子の発現を抑制するための、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
　（ｉｉ）前記標的遺伝子の配列の少なくとも一部に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡ、または該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ
の使用、
［１７］前記ガイドＲＮＡが、前記標的ヌクレオチド配列に相補的な２０～５０塩基からなる配列を含む、［１４］～［１６］のいずれか１項記載の使用、
［１８］改変が塩基の欠失、挿入、または置換である、［１５］または［１７］記載の使用、
［１９］前記Ｃａｓ５ｄがプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列として５’－ＧＴＨ－３’（Ｈ＝Ａ、Ｃ、またはＴ）を認識する、［１４］～［１８］のいずれか１項記載の使用、
［２０］標的ヌクレオチド配列を標的化するための、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、および
　（ｉｉ）標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡ
を含む複合体の使用、
［２１］標的ヌクレオチド配列を改変するための、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄおよび
　（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡ
を含む複合体の使用、
［２２］標的遺伝子の発現を抑制するための、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、および
　（ｉｉ）前記標的遺伝子の配列の少なくとも一部に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡ
を含む複合体の使用、および
［２３］前記ガイドＲＮＡが、前記標的ヌクレオチド配列に相補的な２０～５０塩基からなる配列を含む、［２０］～［２２］のいずれか１項記載の複合体の使用
を提供する。
　ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ（以下、「ＴｉＤ」ともいう）システムが利用するＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩおよびタイプＶシステムが利用するＰＡＭ配列と異なる。したがって、本発明によれば、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質を使用するので、従来のＣＲＩＳＰＲタイプＩＩまたはタイプＶ ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼを用いるゲノム編集技術ではデザインできなかった遺伝子座を標的とすることが可能となった。さらに本発明では、本発明のＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ由来ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼが利用するＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩおよびタイプＶが利用するＰＡＭ配列よりも、いくつかの生物ゲノム配列上において多く見出されることが分かった。したがって、本発明によれば、従来のＣＲＩＳＰＲタイプＩＩおよびタイプＶシステムの利用するゲノム編集技術よりも、多くの遺伝子配列を標的とすることが可能である。またさらに、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤシステムにおけるｇＲＮＡが、３０塩基以上の長さの標的配列を標的化できることを見出した。一方、ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩおよびタイプＶシステムにおけるｇＲＮＡが標的化できる配列の長さは約２０塩基前後である。したがって、本発明のＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムは、従来技術よりも安定な結合特性と標的特異性を示すと考えられる。
　かくして、本発明により、従来技術では標的とすることが不可能な遺伝子領域上での変異アレルの作製、転写活性化および不活性化による遺伝子発現制御、ＤＮＡ修飾／ヒストン修飾タンパク質ドメインの標的化によるエピゲノム改変を実現することが可能となった。
本発明のＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムの構成および標的配列へのターゲティングと切断様式の概略を示す。 ＴｉＤを利用した大腸菌ゲノム編集用ベクターを示す。ａ）ｐＥｃＴｉＤ２プラスミドの構造。ｂ）ｐＥｃＴｉＤ３プラスミドの構造。Ｐｒｏ：Ｊ２３１０８合成プロモーター、ｔ１：ターミネーター配列ＳＴＯＰ７６７、ＲＢＳ：リボゾーム結合配列、ｔ２：ターミネーター配列ＳＴＯＰ７６８（１）、ｔ３：ターミネーター配列ＴＯＰ７６８（２）、ｔ７：Ｔ７ターミネーター配列、７ｄ：Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の（以下、Ｍａと略す）Ｃａｓ７ｄ、６ｄ：ＭａＣａｓ６ｄ、５ｄ：ＭａＣａｓ５ｄ、３ｄ：ＭａＣａｓ３ｄ、１０ｄ：ＭａＣａｓ１０ｄ、Ｔ７　ｐｒｏ：Ｔ７プロモーター、ｃｒＲＮＡ：ＴｉＤ由来ＣＲＩＳＰＲリピート配列、Ｃｍ：クロラムフェニコール耐性遺伝子、ｐ１５Ａ　ｏｒｉ：ｐ１５Ａプラスミド由来複製オリジン。 ｐＭＷ＿ｃｃｄＢおよびｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭライブラリープラスミドの構造を示す。ａ）ｐＭＷ＿ｃｃｄＢの構造。ｔ２：ｒｒｎＢ２ターミネーター配列、ｔ１：ｒｒｎＢ１ターミネーター配列、ＰＡＭ：プロトスペーサー隣接モチーフ配列、Ｔ７　ｐｒｏ：Ｔ７プロモーター、ｃｃｄＢ：ｃｃｄＢ遺伝子、Ｋｍ：カナマイシン耐性遺伝子、ｐＳＣ１０１　ｏｒｉ：ｐＳＣ１０１プラスミド由来複製オリジン。ｂ）ｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭプラスミドライブラリーの標的配列。ＮＮＮＮ箇所にランダムな４塩基を挿入し、ＰＡＭ配列スクリーニングライブラリープラスミドとした。四角で囲んだ領域はＴ７プロモーターを、下線はＴｉＤの標的配列を示す。大文字はｃｃｄＢ遺伝子座を示す。 ＴｉＤを利用した植物ゲノム編集用ベクターを示す。ａ）ｐＥｇＰＴｉＤ１プラスミドの構造。ｂ）植物用ｃｒＲＮＡ発現カセットの構造。ｃ）ｐＥｇＰＴｉＤ２プラスミドの構造。ＲＢ：ｒｉｇｈｔ　ｂｏｒｄｅｒ配列、ＬＢ：ｌｅｆｔ　ｂｏｒｄｅｒ配列、２ｘ３５Ｓ：２ｘカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子プロモーターおよび翻訳エンハンサーΩ配列、３ｄ：２ｘＮＬＳ（核移行シグナル）をコードする配列を付加したＭａＣａｓ３ｄ、１０ｄ：２ｘＮＬＳを付加したＭａＣａｓ１０ｄ、７ｄ：２ｘＮＬＳを付加したＭａＣａｓ７ｄ、６ｄ：２ｘＮＬＳを付加したＭａＣａｓ６ｄ、５ｄ：２ｘＮＬＳを付加したＭａＣａｓ５ｄ、２Ａ（１）～２Ａ（４）：自己開裂ペプチド２Ａ配列（１）～（４）、Ｔｅｒ：シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２ｋＤａ遺伝子ターミネーター、Ｋｍ：カナマイシン耐性遺伝子発現カセット、Ｕ６－２６：シロイヌナズナＵ６　ｓｎＲＮＡ－２６遺伝子プロモーター、ｃｒＲＮＡ：ＴｉＤ遺伝子座由来ＣＲＩＳＰＲリピート配列。 ｐＥｇＰＴｉＤ２－ｐｄｓを用いたタバコＰＤＳ遺伝子の変異導入を示す。ａ）タバコＰＤＳ遺伝子上の標的配列。標的配列１は第３エクソン上、標的配列２は第６エクソン上から選択した。パネル下段に示した標的配列中、四角で囲んだ部分はＰＡＭ配列を示し、下線部分が標的配列を示す。ｂ）アグロインフィルトレーション法によるｐＥｇＰＴｉＤ２－ｐｄｓおよびＧＦＰ発現バイナリーベクターの導入。ｐＥｇＰＴｉＤ２－ｐｄｓ（１）あるいはｐＥｇＰＴｉＤ－ｐｄｓ（２）を保持するアグロバクテリウムとＧＦＰ発現バイナリープラスミドを保持するアグロバクテリウムをアグロインフィルトレーション法により感染し、ＧＦＰ発現の認められる葉片を切り出し、ＰＤＳ変異導入解析に用いた。 ｐＥｇＰＴｉＤ２－ｐｄｓを用いたタバコＰＤＳ遺伝子の変異導入を示す。ｃ）Ｃｅｌ－１アッセイによるＰＤＳ変異導入解析。図５ｂにおいてＧＦＰ発現の認められた葉片部分からゲノムＤＮＡを調製し、Ｃｅｌ－１アッセイにより変異導入の有無を解析した。三角印は、Ｃｅｌ－１ヌクレアーゼにより切断された変異ＰＤＳ遺伝子断片を示す。 ｐＥｇＰＴｉＤ２－ｉａａ９を用いたトマトＩＡＡ９遺伝子の変異導入を示す。ａ）トマトＩＡＡ９遺伝子上の標的配列。標的配列１は第２エクソン上から選択した。パネル下段に示した標的配列中、四角で囲んだ部分はＰＡＭ配列を示し、下線部分が標的配列を示す。ｂ）アグロバクテリウム法によりトマトリーディスクにｐＥｇＰＴｉＤ２－ｉａａ９を導入し、形質転換カルス細胞を得た。ｃ）ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法による変異解析。ｐＥｇＰＴｉＤ２－ｉａａ９を導入した形質転換カルス細胞から調製したゲノムＤＮＡからＩＡＡ９標的配列を含む領域をＰＣＲにより増幅し、ＡｃｃＩを用いたＰＣＲ－ＲＦＬＰ法により変異解析を行った。白抜き三角印は野生型由来のＡｃｃＩ切断断片を示し、上の三角印はＡｃｃＩ切断を受けない変異導入断片を示す。 ｐＥｃＴｉＤ２－ｉａａ９導入カルスにおけるシーケンス法による変異解析を示す。上段が野生型のＩＡＡ９配列を示し、下線は標的配列を示す。四角で囲んだ配列はＰＡＭ配列を示す。変異の生じた部位を挿入記号またはハイフンで示した。ハイフンは塩基欠失を示す。 ｐＥｃＴｉＤ２－ｉａａ９導入再生植物体における変異解析を示す。ａ）ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法による変異解析。白抜き三角印は野生型由来のＡｃｃＩ切断断片を示し、上の三角印はＡｃｃＩ切断を受けない変異導入断片を示す。ｂ）ＩＡＡ９遺伝子破壊の結果、本葉形態異常を示す変異導入トマト植物体の写真。 ＨＥＫ２９３細胞株を用いたゲノム編集の実験スキームを示す。 ヘテロ二本鎖移動度分析による変異解析の結果を示す。ＥＭＸ１遺伝子上のターゲット１標的配列を含むｃｒＲＮＡおよびＴｉＤ遺伝子を導入した細胞由来のゲノムから、変異配列由来と考えられるフラグメントが検出された（黒鍵線）。 ヘテロ二本鎖移動度分析による変異解析の結果を示す。ＥＭＸ１遺伝子上のターゲット２標的配列を含むｃｒＲＮＡおよびＴｉＤ遺伝子を導入した細胞由来のゲノムから、変異配列由来と考えられるフラグメントが検出された（黒鍵線）。 シーケンス解析による変異配列の同定を示す。黒色背景中の白抜き文字はＴｉＤが認識するＰＡＭ（プロトスペーサー隣接配列）、黒枠線内の配列は標的配列を示す。ハイフン（－）は塩基欠失を、黒色太文字小文字アルファベットは塩基挿入を示す。各配列の右側に、体細胞変異効率（変異配列が確認されたクローン数／解析クローン総数）を示す。 シーケンス解析による変異配列の同定を示す。黒色背景中の白抜き文字はＴｉＤが認識するＰＡＭ（プロトスペーサー隣接配列）、黒枠線内の配列は標的配列を示す。ハイフン（－）は塩基欠失を、黒色太文字小文字アルファベットは塩基挿入を示す。各配列の右側に、体細胞変異効率（変異配列が確認されたクローン数／解析クローン総数）を示す。
　本発明は、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを利用したゲノム編集技術を提供する。具体的には、本発明では、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質のうち、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄが使用される。本発明において、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムは、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄを含む標的認識モジュールと、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄを含むポリヌクレオチド切断モジュールを含むことが見出された。
　すなわち、本発明の動作原理は以下のとおりである。
　１）標的ヌクレオチド配列の標的化（以下、「ターゲティング」ともいう）に必要な、該標的ヌクレオチド配列に相補的な配列と、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ遺伝子座に存在する共通繰り返し配列とを含むｇＲＮＡ、
　２）標的ヌクレオチド配列の近傍に存在するＰＡＭ配列を認識するＣａｓ５ｄ、
　３）上記１）のｇＲＮＡに結合し、標的ヌクレオチド配列のターゲティングに必要なＣａｓ７ｄ、および
　４）上記１）のｇＲＮＡのプロセシングを行うＣａｓ６ｄ
を含む複合体、および
　５）上記１）から４）を含む複合体に相互作用し、標的ヌクレオチド配列のリモデリングを行うＣａｓ１０ｄと、ポリヌクレオチドの分解を行うＣａｓ３ｄを含む複合体
が細胞に提供され、該細胞において、
　６）上記１）から４）を含む複合体による標的ヌクレオチド配列へのターゲティング、すなわち、
　７）上記４）のＣａｓ６ｄにより上記１）のｇＲＮＡがプロセシングされて得られる成熟型ｇＲＮＡと、上記２）および３）とからなる複合体による、標的ヌクレオチド配列へのターゲティングが行われ、
　８）上記５）の複合体により、標的ヌクレオチド配列上のポリヌクレオチドが切断される。
　したがって、本発明は、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを利用した標的ヌクレオチド配列を標的化する方法（以下、「本発明の標的配列ターゲティング方法」ともいう）、標的ヌクレオチド配列を改変する方法（以下、「本発明の標的配列改変方法」ともいう）、および標的遺伝子の発現を抑制する方法（以下、「本発明の標的遺伝子発現抑制方法」ともいう）を提供する。さらに、本発明は、これらの本発明の方法に使用される、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連Ｃａｓタンパク質およびｇＲＮＡを含む複合体（以下、「本発明の複合体」ともいう）、および該複合体をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。
（１）細胞
　本発明において、細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれの細胞であってもよく、特に限定されない。例えば、細菌、古細菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ヒト細胞、非ヒト細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞等）が挙げられる。
（２）ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼおよびＣａｓタンパク質
　本発明において、「ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ」とは、少なくとも１つのヌクレアーゼドメイン、およびｇＲＮＡと結合する少なくとも１つのドメインを含み、ｇＲＮＡによって標的ヌクレオチド配列（または標的ヌクレオチド部位）に誘導されるエンドヌクレアーゼをいう。本発明で使用されるＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ由来のＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄを含む。本発明において、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄは、標的認識に寄与する「標的認識モジュール」を構成し、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄは、ポリヌクレオチドの切断に寄与する「ポリヌクレオチド切断モジュール」を構成することが見出された。すなわち、本発明で使用されるＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄを含む標的認識モジュールと、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄを含むポリヌクレオチド切断モジュールとを含む。
　本発明で使用されるＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄは、いずれの細菌または古細菌由来のものであってもよく、例えば、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ　ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ　ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ａｎａｂａｅｎａ　ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ、Ａｎａｂａｅｎａ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ　ｌａｃｔｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ　ａｅｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｌｇｉｄｉｃａｒｎｉｓ、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ　ｅｐｉｐｓａｍｍｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ　Ｓｐ．、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ　ｓｔａｇｎａｌｅ、Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ　ｗａｌｓｂｙｉ、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ　ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｕｌｃａｎｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｎａｔｒｉａｌｂａ　ａｓｉａｔｉｃａ、Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ　ｐｈａｒａｏｎｉｓ、Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｐｈｏｒｍｉｄｅｓｍｉｓ　ｐｒｉｅｓｔｌｅｙｉ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ　ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ　ｔｏｒｒｉｄｕｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ　ｃｙａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　Ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ　ｐｈａｅｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ　ｐｅｎｄｅｎｓなどの菌株由来のものであってもよい。上記Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列情報は、例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ等の公開されたデータベースから入手可能である。また、メタゲノム解析などにより得られた微生物ゲノムデータからＢＬＡＳＴプログラムを利用することで、新規の微生物種からの配列取得も可能である。上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、例えば、アミノ酸配列情報を基に、該核酸を導入する宿主細胞における翻訳に最適化されたコドンを選択し、化学合成等により構築してもよい。宿主細胞において使用頻度の高いコドンを使用することにより、タンパク質の発現量の増加させることができる。上記Ｃａｓタンパク質は、例えば、アミノ酸配列情報を基に化学合成するか、または上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を適当なベクター等を介して細胞中に導入し、該細胞中で産生させてもよい。また、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄの各Ｃａｓタンパク質は、上記の本発明の動作原理において記載した各Ｃａｓタンパク質の機能を保持するかぎり、変異型Ｃａｓタンパク質であってもよい。
（３）ガイドＲＮＡ
　本発明において、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、上記標的認識モジュール（Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ）と複合体を形成して、これらのＣａｓタンパク質と共に標的ヌクレオチド配列をターゲティングする分子である。本発明において、ｇＲＮＡは、標的認識モジュールのＣａｓ７ｄに結合する。本発明において、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄを含む複合体に結合して、該複合体を標的ヌクレオチド配列に誘導する。例えば、ｇＲＮＡは、上記ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼの標的認識モジュールに結合し、該ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼを標的ヌクレオチド配列に誘導する。また、上記標的認識モジュールが上記ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ以外の融合タンパク質の一部として存在する場合、ｇＲＮＡは、該標的認識モジュールに結合し、当該融合タンパク質を標的ヌクレオチド配列に誘導する。
　ｇＲＮＡは、標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成し得るように該標的配列に相補的な配列、および該配列の前後（５’末端側および３’末端側）に、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含む。ｇＲＮＡの共通繰り返し配列部分は、少なくとも１つのヘアピン構造を有していてもよい。例えば、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列の５’末端側にある共通繰り返し配列部分がヘアピン構造を有し、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列の３’末端側にある共通繰り返し配列部分は一本鎖であってもよい。本発明において、ｇＲＮＡは、好ましくは１つのヘアピン構造を有する。
　ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列は、タイプＩ－Ｄ遺伝子群に隣接するｇＲＮＡ遺伝子配列領域から、タンデムリピート検索プログラムを利用して見出すことができる。ｇＲＮＡに含まれる共通繰り返し配列の塩基長は、標的認識モジュールと相互作用して標的ヌクレオチド配列をターゲティングするという目的が達成されるかぎり、特に限定されない。例えば、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列の前後の共通繰り返し配列が各々、約１０～７０塩基長であってもよく、例えば、３０～５０塩基長であってもよい。
　ｇＲＮＡは、標的ヌクレオチド配列に相補的な約１０塩基～７０塩基からなる配列を含むことができる。ｇＲＮＡに含まれる標的ヌクレオチド配列に相補的な配列は、好ましくは２０塩基～５０塩基、より好ましくは２５塩基～４５塩基からなる配列、さらに好ましくは３０塩基～４０塩基からなる配列、またさらに好ましくは３２塩基～３７塩基からなる配列、例えば、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、または３７塩基からなる配列である。ターゲティング可能な標的配列が長いほど、ｇＲＮＡによる標的認識の配列特異性が増すと考えられる。また、ターゲティング可能な標的配列が長いほど、ｇＲＮＡと標的配列との間に形成される塩基対のＴｍ値が高くなり、標的認識の安定性が増すと考えられる。従来のゲノム編集技術に用いられるＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１）ではｇＲＮＡが標的化できる配列の長さは約２０～２４塩基であるので、本発明は、従来法よりも配列特異性および安定性が優れている。
（４）標的ヌクレオチド配列
　本発明において、標的ヌクレオチド配列（本明細書において、単に「標的配列」ともいう）は、任意の核酸の配列であり、プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）の近傍に位置する配列を標的配列として選択することを除き、特に限定されない。標的ヌクレオチド配列は、二本鎖ＤＮＡ配列、一本鎖ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ配列のいずれであってもよい。ＤＮＡとしては、例えば、真核生物核ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、原核生物ゲノムＤＮＡ，ファージＤＮＡ，あるいはプラスミドＤＮＡ等が挙げられる。本発明において、標的ヌクレオチド配列は、好ましくは、ゲノム上の二本鎖ＤＮＡである。なお、本明細書において、「近傍に位置する」とは、隣接すること、および近くにあることの両方を包含する。また、本明細書において、「近傍」とは、隣接する位置または近くの位置の両方を包含する。
　ＣＲＩＳＰＲシステムの標的認識に利用されるＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムの種類によって異なる。本発明では、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムが利用するＰＡＭ配列が５’－ＧＴＨ－３’（Ｈ＝Ａ、ＣまたはＴ）であることを明らかにした（実施例１）。好ましくは、上記ＰＡＭ配列の３’側下流の近傍に位置する配列を標的ヌクレオチド配列として選択する。例えば、標的ヌクレオチド配列は、上記ＰＡＭ配列の近傍に位置し、かつ、標的遺伝子のイントロン内、コーディング領域内、非コーディング領域内、または制御領域内に存在する配列であってもよい。標的遺伝子は、任意の遺伝子であり、随意に選択すればよい。
　従来のゲノム編集技術で使用されているＣａｓ９およびＣｐｆ１のＰＡＭ配列、それぞれ、５’－ＮＧＧ－３’（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）および５’－ＴＴＴＶ－３’（Ｖ＝Ａ、ＣまたはＧ）である。高等植物のゲノム配列中における、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１のＰＡＭ配列とＴｉＤのＰＡＭ配列の出現頻度（すなわち、ＣＲＩＳＰＲシステムのターゲット候補数）を比較したところ、ＴｉＤのＰＡＭ配列頻度が最も多く、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１を用いる従来のゲノム編集技術よりもターゲット数が多いことが分かった（表１）。
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（５）本発明の標的配列ターゲティング方法
　本発明の標的配列ターゲティング方法は、上記標的認識モジュール（Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ）と上記ｇＲＮＡとを上記細胞中に導入することを特徴とする。すなわち、本発明の標的配列ターゲティング方法は、（ｉ）Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および（ｉｉ）上記ｇＲＮＡ、または該ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを上記細胞中に導入することを特徴とする。本発明の標的配列ターゲティング方法は、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれで行ってもよい。
　本発明の標的配列ターゲティング方法において、上記標的認識モジュールは、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄを含む単離された複合体として細胞中に導入されてもよく、またはＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄの各々が単離されたタンパク質として単独で細胞中に導入されてもよい。また、本発明の標的配列ターゲティング方法において、上記標的認識モジュールは、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄをコードする核酸として細胞中に導入されてもよい。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
　上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、ベクターに含まれていてもよく、該ＤＮＡ配列は、好ましくは、プロモーターおよびターミネーター等の調節配列に作動可能に連結されている。上記標的認識モジュールを導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡに核移行シグナル配列が付加される。上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄをコードするＤＮＡの２以上または全てが単一のベクター中に含まれていてもよく、または別々のベクター中に含まれていてもよい。ベクターの数、ならびに各ベクターに組み込むＤＮＡがコードするＣａｓタンパク質の種類および組み合わせに制限はない。上記Ｃａｓタンパク質をコードする２以上のＤＮＡが一つのベクター中に含まれる場合、これらのＤＮＡ配列は、ポリシストロニックに発現するように、例えば自己開裂型ペプチドをコードする配列等を介して、相互に連結されていてもよい。なお、上記Ｃａｓタンパク質をコードする２以上のＤＮＡを連結する順番は、いずれであってもよい。
　上記ｇＲＮＡは、ＲＮＡとして、またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡとして細胞中に導入されてもよい。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、ベクターに含まれていてもよく、該ＤＮＡ配列は、好ましくは、プロモーターおよびターミネーター等の調節配列に作動可能に連結される。
　上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡと上記ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、同じベクター中に含まれていてもよく、または別々のベクター中に含まれていてもよい。例えば、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄをコードするＤＮＡの１以上または全て、およびｇＲＮＡをコードするＤＮＡが単一のベクター中に含まれていてもよい。
　上記プロモーターおよびターミネーター等の調節配列、および核移行シグナル配列は、当該分野で公知であり、上記標的認識モジュールおよび上記ｇＲＮＡを導入する細胞が由来する生物種に応じて適宜選択することができる。導入に用いるベクターもまた、導入する細胞が由来する生物種に応じて適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン等が挙げられる。
　上記標的認識モジュールおよびｇＲＮＡの細胞中への導入は、当該分野で知られた種々の手段によって行うことができる。例えば、トランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム仲介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション等、ウイルス形質導入、リポフェクション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム法、アグロインフィルトレーション法、ＰＥＧ－カルシウム法等が挙げられる。
　上記標的認識モジュールおよびｇＲＮＡは、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。また、上記標的認識モジュールを構成するＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、またはこれらの各Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。例えば、イン・ビトロまたはイン・ビボにおいてそれぞれ合成した上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＣａｓ７ｄと、イン・ビトロまたはイン・ビボにおいて合成したｇＲＮＡを、イン・ビトロにおいてインキュベートして複合体を形成させ、該複合体を細胞中に導入することができる。
　上記標的認識モジュールおよびｇＲＮＡの導入の際、細胞は、標的ヌクレオチド配列のターゲティングに適当な条件下で培養される。次いで、該細胞は、細胞増殖および維持に適当な条件下で培養される。培養条件は、標的認識モジュールおよびｇＲＮＡを導入する細胞が由来する生物種に適切な培養条件であればよく、例えば、既知の細胞培養技術に基づいて当業者により適宜決定可能である。
　本発明の標的配列ターゲティング方法によれば、ｇＲＮＡと、標的認識モジュールのＣａｓ７ｄが結合して上記標的認識モジュールとｇＲＮＡが複合体を形成し、同時に、該ｇＲＮＡが標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成し、該標的認識モジュールが標的ヌクレオチド配列近傍のＰＡＭ配列を認識することにより、配列特異的に標的ヌクレオチド配列を標的化する。本発明の標的配列ターゲティング方法では、さらにＣａｓ１０ｄを細胞中に導入してもよい。
（６）本発明の標的配列改変方法
　本発明の標的配列改変方法は、上記ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼと上記ｇＲＮＡとを上記細胞中に導入することを特徴とする。すなわち、本発明の標的配列改変方法は、細胞中に、（ｉ）Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および（ｉｉ）上記ｇＲＮＡまたは該ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを上記細胞中に導入することを特徴とする。本発明の標的配列改変方法は、本発明の標的配列ターゲティング方法により標的化したヌクレオチド配列を、上記ポリヌクレオチド切断モジュールにより切断することを含む。本発明の標的配列改変方法は、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれで行ってもよい。本発明において、改変には、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。
　本発明の標的配列改変方法においては、上記のＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡに加えて、ドナーポリヌクレオチドを細胞中に導入してもよい。ドナーポリヌクレオチドは、標的部位に導入したい改変を含む少なくとも１つのドナー配列を含む。ドナーポリヌクレオチドは、ドナー配列に加えて、該ドナー配列の両端に標的配列の上流および下流の配列と相同性の高い配列（好ましくは、標的配列の上流および下流の配列と実質的に同一の配列）を含んでいてもよい。ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡであってもよい。ドナーポリヌクレオチドは、当該分野で既知の技術に基づいて当業者が適宜設計することができる。
　本発明の標的配列改変方法においてドナーポリヌクレオチドが存在しない場合、標的ヌクレオチド配列における切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復されうる。ＮＨＥＪはエラーが発生しやすいことが知られており、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが該切断の修復中に起こりうる。かくして、該配列は、標的配列部位において改変され、それにより、フレームシフトや未成熟終止コドンを誘発し、標的配列領域がコードしている遺伝子の発現が不活性化またはノックアウトされうる。
　本発明の標的配列改変方法においてドナーポリヌクレオチドが存在する場合、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、切断された標的ヌクレオチド配列の相同組換え修復（ＨＤＲ）により、標的配列部位に挿入されるか、または標的配列部位がドナー配列に置換される。その結果、標的配列部位に所望の改変が導入される。
　上記ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄを含む単離された複合体として細胞中に導入されてもよく、またはＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄの各々が単離されたタンパク質として単独で細胞中に導入されてもよい。あるいは、上記ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼは、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸として細胞中に導入されてもよい。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
　上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、ベクターに含まれていてもよく、該ＤＮＡ配列は、好ましくは、プロモーターおよびターミネーター等の調節配列に作動可能に連結されている。上記ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼを導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡに核移行シグナル配列が付加される。上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡの２以上または全てが単一のベクター中に含まれていてもよく、または別々のベクター中に含まれていてもよい。ベクターの数、ならびに各ベクターに組み込むＤＮＡがコードするＣａｓタンパク質の種類および組み合わせに制限はない。上記Ｃａｓタンパク質をコードする２以上のＤＮＡが一つのベクター中に含まれる場合、これらのＤＮＡ配列は、ポリシストロニックに発現するように、例えば自己開裂型ペプチドをコードする配列等を介して、相互に連結されていてもよい。なお、上記Ｃａｓタンパク質をコードする２以上のＤＮＡを連結する順番は、いずれであってもよい。
　上記ｇＲＮＡは、ＲＮＡとして、またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡとして細胞中に導入されてもよい。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、ベクターに含まれていてもよく、該ＤＮＡ配列は、好ましくは、プロモーターおよびターミネーター等の調節配列に作動可能に連結される。
　上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡと上記ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、同じベクター中に含まれていてもよく、または別々のベクター中に含まれていてもよい。例えば、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄの各々をコードする全てのＤＮＡ、およびｇＲＮＡをコードするＤＮＡが単一のベクター中に含まれていてもよい。
　上記プロモーターおよびターミネーター等の調節配列、および核移行シグナル配列は、当該分野で公知であり、上記ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼおよび上記ｇＲＮＡを導入する細胞の種類に応じて適宜選択することができる。導入に用いるベクターもまた、導入する細胞の種類に応じて適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン等が挙げられる。
　上記ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、およびドナーポリヌクレオチドの細胞中への導入は、当該分野で知られた種々の手段によって行うことができる。例えば、トランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム仲介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション等、ウイルス形質導入、リポフェクション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム法、アグロインフィルトレーション法、ＰＥＧ－カルシウム法等が挙げられる。
　上記ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、およびドナーポリヌクレオチドは、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。また、上記ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼを構成するＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらの各Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。
　上記ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ、またはＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ、ｇＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドの導入の際、細胞は、標的配列部位での切断に適当な条件下で培養される。次いで、該細胞は、細胞増殖および維持に適当な条件下で培養される。培養条件は、ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ、またはＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ、ｇＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドを導入する細胞が由来する生物種に適切な培養条件であればよく、例えば、既知の細胞培養技術に基づいて当業者により適宜決定可能である。
　本発明の標的配列改変方法によれば、ｇＲＮＡが標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成するのと同時に、ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼの標的認識モジュールとの相互作用により、該ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼを該標的配列部位に誘導し、次いで、該ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼの切断モジュールが該標的配列部位における配列を切断し、該切断配列の修復時に、標的配列が改変される。例えば、本発明の標的配列改変方法は、ゲノム上の標的ヌクレオチド配列の改変のために用いることができ、該方法によりゲノム上の二本鎖ＤＮＡが切断され、標的部位が改変される。
（７）本発明の標的遺伝子発現抑制方法
　本発明の標的遺伝子発現抑制方法は、上記標的認識モジュール（Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ）と上記ｇＲＮＡとを上記細胞中に導入することを特徴とする。すなわち、本発明の標的配列ターゲティング方法は、（ｉ）Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および（ｉｉ）上記ｇＲＮＡ、または該ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを上記細胞中に導入することを特徴とする。本発明の標的遺伝子発現抑制方法では、標的ヌクレオチド配列として、標的遺伝子の配列の少なくとも一部の配列が選択され、該配列に相補的な配列を含むｇＲＮＡを使用する。本発明の標的遺伝子発現抑制方法は、本発明の標的配列ターゲティング方法によりヌクレオチド配列を標的化する際に、標的認識モジュールとｇＲＮＡとの複合体が標的配列に結合することにより、該標的配列を含む遺伝子の発現が抑制されることを含む。本発明の標的遺伝子発現抑制方法は、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれで行ってもよい。本発明の標的遺伝子発現抑制方法によれば、標的遺伝子配列は切断されないが、上記標的認識モジュールとｇＲＮＡとの複合体が標的ヌクレオチド配列に結合することにより、該標的配列を含む遺伝子領域の機能または該遺伝子の発現が阻害される。
　上記標的認識モジュールおよびｇＲＮＡ、それらの細胞中への導入方法、および導入時および導入後の細胞培養等については、上記「（５）本発明の標的配列ターゲティング方法」において記載したのと同様である。本発明の標的遺伝子発現抑制方法では、さらにＣａｓ１０ｄを細胞中に導入してもよい。
（８）本発明の複合体
　本発明の複合体は、上記ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ Ｃａｓタンパク質および上記ｇＲＮＡを含む。本発明は、特に、上記標的認識モジュールと上記ｇＲＮＡを含む複合体、および上記ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼとｇＲＮＡを含む複合体を提供する。さらに具体的には、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄとｇＲＮＡを含む複合体、ならびにＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄとｇＲＮＡを含む複合体を提供する。さらに、上記複合体をコードするＤＮＡ分子も提供される。本発明の複合体は、上記した本発明の標的配列改変方法、標的遺伝子発現抑制方法、および標的配列ターゲティング方法に使用することができる。ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄを含む複合体）とｇＲＮＡとを含む複合体を細胞に導入して、該細胞内で該複合体を機能させることにより、該細胞のゲノム上の標的配列を改変することができる。また、標的認識モジュール（Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄを含む複合体）とｇＲＮＡとを含む複合体を細胞に導入して、該細胞内で該複合体を機能させることにより、該細胞中の標的配列を標的化することができ、また、該標的配列領域がコードする遺伝子の発現を抑制することができる。上記標的認識モジュールとｇＲＮＡとを含む複合体は、さらにＣａｓ１０ｄを含んでいてもよい。
　本発明の複合体は、常法により、イン・ビトロまたはイン・ビボで製造することができる。例えば、上記ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼまたは上記標的認識モジュールを構成するＣａｓタンパク質をコードする核酸、およびｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞中に導入し、該細胞内で複合体を形成させてもよい。
　本発明の複合体の例として、限定するものではないが、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＣａｓ５ｄ（配列番号１）、Ｃａｓ６ｄ（配列番号２）、およびＣａｓ７ｄ（配列番号３）と、GUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAAC（配列番号６；Ｎは、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を構成する任意のヌクレオチドである）で示される配列からなるｇＲＮＡとを含む複合体、およびＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＣａｓ５ｄ（配列番号１）、Ｃａｓ６ｄ（配列番号２）、Ｃａｓ７ｄ（配列番号３）、Ｃａｓ３ｄ（配列番号４）およびＣａｓ１０ｄ（配列番号５）と、GUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAAC（配列番号６；Ｎは、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を構成する任意のヌクレオチドである）で示される配列からなるｇＲＮＡとを含む複合体が挙げられる。上記ｇＲＮＡの配列中、Ｎの数は１０～７０の範囲で変更してもよく、好ましくは２０～５０、より好ましくは２５～４５、さらに好ましくは３０～４０、またさらに好ましくは３２～３７の範囲で変更してもよい。
（９）本発明の発現ベクター
　本発明はさらに、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄを含むＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および標的配列に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクター、ならびにＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄをコードする核酸、および標的配列に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを提供する。
　本発明のベクターは、上記「（５）本発明の標的配列ターゲティング方法」、「（６）本発明の標的配列改変方法」、および「（７）本発明の標的遺伝子発現抑制方法」に記載したような、上記Ｃａｓタンパク質およびｇＲＮＡを細胞中に導入するためのベクターである。該ベクターの導入後、該細胞中で上記Ｃａｓタンパク質およびｇＲＮＡを発現する。本発明のベクターは、また、上記ｇＲＮＡに含まれる標的配列を、制限部位を含む任意の配列に替えたベクターであってもよい。このようなベクターは、該任意の配列部位に所望の標的ヌクレオチド配列を組み込んで使用される。該任意の配列としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄの遺伝子座にあるスペーサー配列またはその一部であってもよい。
（１０）本発明の標的認識モジュールを含む融合タンパク質
　本発明は、さらに、上記標的認識モジュールおよび機能性ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。該融合タンパク質および上記ｇＲＮＡを細胞中に導入すると、標的認識モジュールおよびｇＲＮＡの作用により融合タンパク質が細胞中の標的ヌクレオチド配列または標的遺伝子に誘導され、上記機能性ポリペプチドの作用により該標的ヌクレオチド配列または標的遺伝子が改変または修飾される。したがって、本発明はさらに、上記融合タンパク質および上記ｇＲＮＡを細胞中に導入することを特徴とする、標的ヌクレオチド配列または標的遺伝子の改変または修飾方法を提供する。さらに、本発明では、上記融合タンパク質と上記ｇＲＮＡを含む複合体も提供される。
　上記機能性ポリペプチドは、標的配列に対して何らかの機能を示すポリペプチドであり、かつ、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄ以外のポリペプチドである。上記機能性ポリペプチドとしては、例えば、限定するものではないが、制限酵素、転写因子、ＤＮＡメチル化酵素、ヒストンアセチル化酵素、蛍光タンパク質、ならびに、ポリヌクレオチド切断モジュールとして制限酵素のヌクレオチド切断モジュール、遺伝子発現調節モジュールとして、転写因子の転写活性化モジュールおよび転写抑制モジュール、エピゲノム修飾モジュールとして、ＤＮＡメチル化酵素のメチル化モジュールおよびヒストンアセチル化酵素のアセチル化モジュールなどが挙げられる。蛍光タンパク質としては、例えば、ＧＦＰが挙げられる。例えば、上記標的認識モジュールとポリヌクレオチド切断モジュールとを含む融合タンパク質は、ｇＲＮＡと共に細胞中に導入することにより、本発明の標的配列改変方法と同様に、標的配列を改変することができる。例えば、上記標的認識モジュールと、遺伝子発現調節モジュールまたはエピゲノム修飾モジュールとを融合タンパク質は、ｇＲＮＡと共に細胞中に導入することにより、標的配列を修飾し、標的遺伝子の発現を調節することができる。例えば、上記標的認識モジュールと蛍光タンパク質とを融合タンパク質は、ｇＲＮＡと共に細胞中に導入することにより、標的配列近傍を蛍光標識化することができる。
　以下に、本発明の実施例を示した。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されない。
　実施の一形態として、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ（以下、「ＴｉＤ」ともいう）遺伝子座由来の遺伝子群（Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ１０ｄ）を、クローン化して用いた。実施例中のＤＮＡ配列の加工および構築操作には、人工遺伝子化学合成、ＰＣＲ法、制限酵素処理、ライゲーション、Ｇｉｂｓｏｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ法のいずれかを用いた。また、塩基配列の決定にはサンガー法あるいは次世代シーケンス法を用いた。
実施例１．大腸菌におけるゲノム編集
　本実施例では、代表的な細菌のモデル生物である大腸菌において本発明の技術が有効に機能することを実証した。
（１）ＴｉＤ遺伝子発現プラスミドの構築
　Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（以下、「Ｍ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ」ともいう）のＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ遺伝子座（以下、「ＴｉＤ遺伝子座」ともいう）由来の遺伝子群をクローン化した。ＴｉＤ遺伝子座からＭ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄのアミノ酸配列情報を基に、各Ｃａｓタンパク質をコードする大腸菌コドン型の配列（配列番号７～１１）を人工化学合成した。各遺伝子の上流にＪ２３１０８合成プロモーター（配列番号１２）、あるいは合成リボゾーム結合配列（配列番号１３）を、各遺伝子の下流にターミネーター配列（配列番号１４～１７）を付与したＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＡＣＹＣ１８４（Nippon gene社製）に連結し、ｐＥｃＴｉＤ１を構築した。さらにＭ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ遺伝子座の近傍に存在するＣＲＩＳＰＲリピート配列（ｃｒＲＮＡ、配列番号１８）を抽出し、Ｔ７プロモーター（配列番号１９）の制御下にｃｒＲＮＡ発現カセット（配列番号２０）を合成した。ｃｒＲＮＡ発現カセットには本実施例の標的配列となる大腸菌ｃｃｄＢ遺伝子のプロモーター領域配列を含んでいる。ｃｒＲＮＡ発現カセット配列をｐＥｃＴｉＤ１に組込み、ｐＥｃＴｉＤ２（図２ａ）を構築した。また、ＤＮＡ二重鎖切断を伴わないゲノム編集を行うＴｉＤ発現プラスミドベクターとして、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＣａｓ７ｄ遺伝子発現カセットを含むｐＥｃＴｉＤ３の構築を行った（図２ｂ）。本実施例で使用したプロモーター、ターミネーター、ＣＲＩＳＰＲリピート配列、およびｃｒＲＮＡ発現カセット配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（２）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）ライブラリーの構築
　本実施例においては、標的ＤＮＡとして大腸菌ｃｃｄＢ遺伝子の上流にＴ７プロモーター配列を連結した合成ｃｃｄＢ遺伝子カセット（配列番号２１）（表３）を利用し、ｃｃｄＢ遺伝子上流のＴ７プロモーター領域を含む３５塩基をＴｉＤの標的配列とした。合成ｃｃｄＢ遺伝子カセットをプラスミドベクターｐＭＷ２１９（Nippon gene社製）のマルチクローニングサイトに連結し、ｐＭＷ＿ｃｃｄＢ１を構築した（図３ａ）。
　ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列近傍に位置するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識し、標的配列とｇＲＮＡを介して結合する。しかし、本実施例に用いたＭ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＴｉＤのＰＡＭ配列は不明であったため、まず、Ｍ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＴｉＤのＰＡＭ配列の決定を行うためのＰＡＭ配列ライブラリープラスミドの構築を行った。ｐＭＷ＿ｃｃｄＢ１のＴ７プロモーター上流にランダムな４塩基の配列を人工化学ＤＮＡ合成およびＰＣＲ法を用いて導入した（図３ｂ）。構築したｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭライブラリープラスミドはＣｃｄＢ耐性を保持する大腸菌ｃｃｄＢ耐性細胞株（Thermo Fisher Scientific社製）に導入した後、大量プラスミド調製を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（３）Ｍ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＴｉＤシステムにおけるＰＡＭ配列の決定
　ｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭライブラリープラスミド上のＴ７プロモーター領域と相補的な３５塩基配列を組込んだｐＥｃＴｉＤ３－Ｔ７を用いて、ＴｉＤにおけるＰＡＭ配列決定を行った。ｐＥｃＴｉＤ３－Ｔ７を大腸菌ＢＬ２１ＡＩ株（Thermo Fisher Scientific社製）に導入し、ｃｃｄＢ遺伝子ゲノム編集用大腸菌ホスト株とした。ＢＬ２１ＡＩ［ｐＥｃＴｉＤ３－Ｔ７］株は、標的配列認識に必要なＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＣａｓ７ｄタンパク質を産生する。Ｃａｓ５ｄ／Ｃａｓ６ｄ／Ｃａｓ７ｄ－ｃｒＲＮＡ複合体は、適切なＰＡＭ配列に隣接する標的配列を認識し、標的配列の切断は行わないが、標的配列に結合することにより標的配列としたＴ７プロモーターの機能を阻害する。
　ＢＬ２１ＡＩ株に導入したｐＭＷ－ｃｃｄＢ－ＰＡＭのｃｃｄＢ発現はアラビノース添加培地において誘導され、ＣｃｄＢ耐性を持たないＢＬ２１ＡＩ株は死滅する。あらかじめＴｉＤ発現プラスミドを導入したＢＬ２１ＡＩ株にｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭライブラリープラスミドを導入すると、ＴｉＤが認識する適切なＰＡＭ配列を持つｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭライブラリープラスミドのＴ７プロモーター上に、ｐＥｃＴｉＤ３プラスミドから発現するＣａｓ５ｄ／Ｃａｓ６ｄ／Ｃａｓ７－ｃｒＲＮＡが結合することで、ＣｃｄＢタンパク質産生が阻害されるため、大腸菌細胞は生育することが可能となる。生育してきた大腸菌コロニーからｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭライブラリープラスミドを調製し、ＰＡＭ配列をシーケンス解析することによってＭ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＴｉＤのＰＡＭ配列が決定される。
　大量プラスミド調製を行ったｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭライブラリープラスミドを、ケミカルコンピテントセル法によりＢＬ２１ＡＩ［ｐＥｃＴｉＤ３－Ｔ７］株へ導入した。ｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭライブラリープラスミドおよびｐＥｃＴｉＤ３－Ｔ７を保持するＢＬ２１ＡＩ細胞は、２５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール、２５ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび１％グルコースを含むＬＢ寒天培地上で選抜した。得られた大腸菌コロニーのうち約１ｘ１０７コロニーを回収し、抗生物質およびグルコースを含まないＬＢ液体培地で数回洗浄を行った後、１％アラビノースを含むＬＢ液体培地に１ｘ１０６／ｍＬとなるように再懸濁した。懸濁菌液は３７℃、２時間浸透培養し、アラビノースによるＴ７プロモーターの発現制御下にあるｃｒＲＮＡおよびｃｃｄＢの発現誘導を行った後、２００μＬの菌体液を２５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール、２５ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび１％アラビノースを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養して得られた菌体コロニーを回収した。回収された約５００株のコロニーからプラスミドを調製し、ＰＡＭ配列近傍のシーケンス解析を行った。ＴｉＤ発現プラスミドの存在下でレスキューされたｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭライブラリープラスミドのＰＡＭ配列は、５’－ＮＧＴＨ－３’（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｈ＝Ａ、ＣまたはＴ）の配列を含み、使用頻度はＮＧＴＡが２８％、ＮＧＴＣが３３％、ＮＧＴＴが３８％であった。したがって、ＴｉＤが利用するＰＡＭ配列は、５’－ＧＴＨ－３’（Ｈ＝Ａ、ＣまたはＴ）であることが分かった。
（４）大腸菌におけるゲノム編集
　ｐＥｃＴｉＤ３－Ｔ７とｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭライブラリープラスミドを用いて決定した３種のＰＡＭ配列を含むｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭｇｔａ、ｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭｇｔｃおよびｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭｇｔｔを構築し、それぞれｐＥｃＴｉＤ２－Ｔ７とともにＢＬ２１ＡＩ株に導入した。ｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭｇｔａ／ｐＥｃＴｉＤ２－Ｔ７、ｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭｇｔｃ／ｐＥｃＴｉＤ２－Ｔ７およびｐＭＷ＿ｃｃｄＢ－ＰＡＭｇｔｔ／ｐＥｃＴｉＤ２－Ｔ７を保持するＢＬ２１ＡＩ株を２５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール、２５ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび１％グルコースを含むＬＢ寒天培地上で選抜し、それぞれの菌株に導入したプラスミドが含まれることをシーケンス解析により確認した。次いで、正しいプラスミドを保持するＢＬ２１ＡＩ株を２５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール、２５ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび１％アラビノースを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養したところ、すべての菌株において生育が認められず、Ｃａｓ３およびＣａｓ１０ｄの存在下によるプラスミドＤＮＡの二重鎖切断によるものと考えられた。
実施例２．高等植物におけるゲノム編集
　本実施例では、高等真核生物のゲノム編集の実施例の一形態として、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａおよびＳｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍにおいて本発明の技術が有効に機能することを実証した。
（１）高等植物細胞におけるＴｉＤ遺伝子発現バイナリーベクターの構築
　Ｍ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＴｉＤ遺伝子座からＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄのアミノ酸配列情報を基に、シロイヌナズナおよびタバコにおけるコドン頻度を参照し、各Ｃａｓタンパク質をコードする双子葉植物コドン型の配列を人工化学合成した。各遺伝子の５’側上流には、タンデムに並べられた２つの核移行シグナルを含む核移行シグナル配列（配列番号２２、配列番号２３）を付与し、さらに各遺伝子間を自己開裂ペプチド２Ａ配列（配列番号２４～２８）によりつなげたＤＮＡ断片を作製した。２Ａペプチド配列により連結した５つのＴｉＤ遺伝子断片の５’側上流に、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子プロモーターをタンデムに２つ並べ、さらに翻訳エンハンサーΩ配列を付加したプロモーター配列（２ｘ３５Ｓプロモーター；配列番号２９）を、また３’側下流にシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２ｋＤａ遺伝子ターミネーター配列（配列番号３０）を連結したＴｉＤ遺伝子発現カセットを作製した。ＴｉＤ遺伝子発現カセットをバイナリープラスミドベクターｐＣＡＭＢＩＡ２３００にクローン化し、ｐＥｇＰＴｉＤ１を構築した（図４ａ）。植物用ｃｒＲＮＡ発現カセットには、２つのｃｒＲＮＡ配列の間に、任意の３５塩基配列を連結出来るように２ヶ所の制限酵素ＢｓａＩサイトを含むスペーサー配列を配置したＤＮＡを人工化学合成した（配列番号３１）。発現制御配列として５’側上流にシロイヌナズナＵ６　ｓｎＲＮＡ－２６遺伝子のプロモーター配列（配列番号３２）を、また３’側下流にポリＴ配列を付加した植物用ｃｒＲＮＡ発現カセットを構築した（図４ｂ）。植物用ｃｒＲＮＡ発現カセットをｐＥｇＰＴｉＤ１のＲＢ配列と２ｘ３５Ｓプロモーターの間に連結し、ｐＥｇＰＴｉＤ２を構築し、植物ゲノム編集用のＴｉＤ遺伝子発現バイナリープラスミドベクターとした（図４ｃ）。ｐＥｇＰＴｉＤ１およびｐＥｇＰＴｉＤ２中における、核移行シグナルが付加された各Ｃａｓタンパク質をコードする双子葉植物コドン型の配列を配列番号３３～３７に示す。本実施例で使用した核移行シグナル配列、自己開裂ペプチド２Ａ配列、プロモーター、ターミネーター、およびｃｒＲＮＡ発現カセット配列を表４に示す。




































Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004






Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（２）Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおけるゲノム編集
　タバコにおける実施例においては、標的配列および該配列に導入する変異として、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）遺伝子を選んだ（図５－１のａ）。タバコＰＤＳ遺伝子中の第３エクソンから標的配列１（Ｔａｒｇｅｔ　１、配列番号３８）を選び、人工化学合成により植物用ｃｒＲＮＡ発現カセットに組込んだ、ｐＥｇＰＴｉＤ２－ｐｄｓ（１）を構築した。同様に、第６エクソンから標的配列２（Ｔａｒｇｅｔ　２、配列番号３９）を選び、人工化学合成により植物用ｃｒＲＮＡ発現カセットに組込んだ、ｐＥｇＰＴｉＤ２－ｐｄｓ（２）を構築した。構築したバイナリーベクターは、それぞれＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＧＶ２２６０株に導入した。タバコＰＤＳを標的とするＴｉＤ発現ベクターのタバコ細胞への導入は、アグロインフィルトレーション法により行った。ｐＥｇＰＴｉＤ２－ｐｄｓ（１）あるいはｐＥｇＰＴｉＤ２－ｐｄｓ（２）を保持するアグロバクテリウム菌株とＧＦＰ発現バイナリーベクターを保持するアグロバクテリウム菌株をそれぞれ培養し、ベンサミアナタバコ本葉に共感染を行った（図５－１のｂ）。共感染後、３日経過後の葉片においてＧＦＰ蛍光を発する領域から調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、標的配列を含む３００～５００ｂｐのＰＤＳ遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。増幅したＰＣＲ断片を用いてＣｅｌ－１アッセイを行い、ＰＤＳ遺伝子上に導入された変異の有無を解析した。コントロールとしてＧＦＰ発現バイナリーベクターのみを導入したタバコ葉片を用いた。ＧＦＰ発現ベクターのみを導入した場合には、ＰＤＳ遺伝子上に変異は認められなかったが、ｐＥｇＰＴｉＤ２－ｐｄｓおよびＧＦＰ発現ベクターを同時に導入した場合には、それぞれのＰＤＳ遺伝子の標的配列上に変異導入が認められた（図５－２のｃ）。標的配列１および２を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（３）Ｓｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍにおけるゲノム編集
　トマトにおける実施例においては、標的配列および該配列に導入する変異として、Ａｕｘ／ＩＡＡ転写因子　ＩＡＡ９遺伝子を選んだ（図６ａ）。トマトＩＡＡ９遺伝子中の第２エクソンから標的配列１（配列番号４０）（表６）を選び、人工化学合成により植物用ｃｒＲＮＡ発現カセットに組込んだ、ｐＥｇＰＴｉＤ２－ｉａａ９を構築した。構築したバイナリーベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＧＶ２２６０株に導入した。トマトＩＡＡ９遺伝子を標的とするＴｉＤ発現ベクターのトマト細胞への導入は、トマト子葉由来のリーフディスクをもちいたアグロバクテリウム法により行った。アグロバクテリウムと共存培養したリーフディスクを１００ｍｇ／Ｌ　カナマイシンおよび１．５ｍｇ／Ｌ　ｔ－ゼアチンを含むＭＳ固化培地上で培養することにより、ｐＥｇＰＴｉＤ２－ｉａａ９上のＴ－ＤＮＡ領域の遺伝子導入が生じたカルスを得た（図６ｂ）。ＩＡＡ９の標的配列には制限酵素ＡｃｃＩの認識配列が存在し、ＴｉＤによるゲノム編集の結果、変異が導入されればＡｃｃＩ認識部位が消失する。これを利用しＡｃｃＩを用いたＰＣＲ－制限酵素長多型（ＲＦＬＰ）解析により、ＩＡＡ９の標的配列に生じた変異解析を行った。得られた形質転換カルスから調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＩＡＡ９の標的配列を含む約３００ｂ領域をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ断片をＡｃｃＩにより制限酵素切断を行ったところ、ｐＥｇＰＴｉＤ２－ｉａａ９を導入したカルス培養物由来ＰＣＲ断片中には、ＩＡＡ９標的配列に変異導入が起きた結果、ＡｃｃＩにより切断を受けない配列が含まれていることがわかった（図６ｃ）。ｐＥｇＰＴｉＤ２－ｉａａ９導入を行ったカルス由来のＰＣＲ断片の塩基配列を決定したところ、ＩＡＡ９の標的配列上のＰＡＭ配列の直後に１ｂから４ｂまでの塩基欠失型あるいは塩基挿入型の変異が導入されていることが明らかとなった（図７）。
　ｐＥｇＰＴｉＤ２－ｉａａ９導入を行ったカルスを、さらに１００ｍｇ／Ｌ　カナマイシンおよび１．０ｍｇ／Ｌ　ｔ－ゼアチンを含むＭＳ固化培地上で培養を続け、形質転換再分化シュートを得た。得られた再分化シュートから調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＡｃｃＩによるＰＣＲ－ＲＦＬＰ解析を行ったところ、図８ａに示すように、ＡｃｃＩによる切断を受けないＰＣＲ断片、すなわちＩＡＡ９標的配列に変異がほぼ１００％導入された形質転換再分化シュートが得られた。再生させた１４個体の形質転換再生シュート中、１３個体において図８ａに示すとおりとなり、これらから再生した植物個体では、ＩＡＡ９遺伝子の欠損による表現型の一つである、トマト本葉が単葉形状を示した。以上の通り、ＴｉＤを用いたゲノム編集により、高効率に変異導入が可能であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例３．高等動物におけるゲノム編集
　本実施例では、高等動物におけるゲノム編集の実施例の一形態として、ヒト胚性腎細胞由来細胞株ＨＥＫ２９３細胞において本発明の技術が有効に機能することを実証した。
（１）高等動物細胞におけるＴｉＤ遺伝子発現ベクターの構築
　Ｍ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＴｉＤ遺伝子座からＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄのアミノ酸配列情報を基に、各Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子配列を人工化学合成した。各遺伝子の５’側上流には、タンデムに並べられた２つの核移行シグナルを含む核移行シグナル配列（配列番号２２、配列番号２３）を付与し、さらに各遺伝子間を自己開裂ペプチド２Ａ配列（配列番号２４～２８）によりつなげたＤＮＡ断片を作製した。２Ａペプチド配列により連結した５つのＴｉＤ遺伝子断片の５’側上流に、サイトメガロウィルスエンハンサー＋トリβ－アクチン遺伝子プロモーターハイブリッド配列（ＣＢｈプロモーター；配列番号４１）を、また３’側下流にウシ由来成長ホルモン遺伝子ターミネーター配列（ｂＧＨターミネーター配列番号４２）を連結したＴｉＤ遺伝子発現カセットを作製し、ｐＣＲ８ＴＯＰＯベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に連結したｐＣＲ＿ｈＴｉＤを構築した。ｃｒＲＮＡ発現カセットとして、２つのｃｒＲＮＡ配列の間に、任意の３５塩基配列を連結出来るように２ヶ所の制限酵素ＢｓａＩサイトを含むスペーサー配列を配置したＤＮＡ（配列番号３１）を人工化学合成した。発現制御配列として５’側上流にヒトＵ６　ｓｎＲＮＡ遺伝子のプロモーター配列（配列番号４３）を、また３’側下流にポリＴ配列を付加し、ｐＣＲ８ＴＯＰＯベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に連結したｐＣＲ＿ｃｒＲＮＡを構築した。ｐＣＲ＿ｈＴｉＤ中における核移行シグナルが付加された各Ｃａｓタンパク質をコードする配列を配列番号３３～３７に示す。ＣＢｈプロモーター、ｂＧＨターミネーター、およびヒトＵ６　ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモーター配列を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（２）動物培養細胞におけるゲノム編集
　動物培養細胞における実施例として、細胞株にヒト胚性腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞株）を用い、標的配列および該配列に導入する変異として、ＥＭＸ１遺伝子を選んだ。ＥＭＸ１遺伝子中の標的配列としてターゲット１（配列番号４４）およびターゲット２（配列番号４５）を選び、人工化学合成により、上記（１）で作製したヒト培養細胞用ｃｒＲＮＡ発現カセットに組込んだ、ターゲット１を含むｐＵＣ＿ｃｒＲＮＡ－Ｔ１およびターゲット２を含むｐＵＣ＿ｃｒＲＮＡ－Ｔ２を構築した。構築したプラスミドベクターはそれぞれ大腸菌ＨＳＴ０８株（タカラバイオ社製）において増幅しＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて精製を行った。精製したプラスミドのうち、ｐＣＲ＿ｈＴｉＤおよびｐＵＣ＿ｃｒＲＮＡ－Ｔ１の混合物あるいは、ｐＣＲ＿ｈＴｉＤおよびｐＵＣ＿ｃｒＲＮＡ－Ｔ２の混合物をそれぞれＨＥＫ２９３細胞株にトランスフェクションし、導入した。プラスミドベクター導入３日目における細胞株を回収し、Ｂｌｏｏｄ＆Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、ターゲット１およびターゲット２を含むゲノム配列領域をＰＣＲにより増幅し、自動電気泳動装置MultiNA（島津製作所製）を用いたヘテロ二本鎖移動度分析により変異解析を行った。また、増幅したＰＣＲ断片をｐＮＥＢ１９３ベクター（New England Biolab社製）にクローン化し、シーケンス解析により変異配列を同定した。体細胞変異効率は、それぞれ変異配列が確認されたクローン数／解析クローン総数により算出した。コントロールとして、プラスミド未導入、あるいはｐＣＲ＿ｈＴｉＤ、ｐＵＣ＿ｃｒＲＮＡ－Ｔ１またはｐＵＣ＿ｃｒＲＮＡ－Ｔ２を単独で導入した細胞株を用いて、同様に変異解析を行った。図９にＨＥＫ２９３細胞株を用いたゲノム編集の実験スキームを示す。
　図１０および図１１に、ｐＣＲ＿ｈＴｉＤおよびｐＵＣ＿ｃｒＲＮＡ－Ｔ１の混合物またはｐＣＲ＿ｈＴｉＤおよびｐＵＣ＿ｃｒＲＮＡ－Ｔ２の混合物をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞株、またはプラスミドを導入しなかったＨＥＫ２９３細胞株（コントロール）の結果を示す。図１０および図１１に示すとおり、ｐＣＲ＿ｈＴｉＤおよびｐＵＣ＿ｃｒＲＮＡ－Ｔ１の混合物あるいは、ｐＣＲ＿ｈＴｉＤおよびｐＵＣ＿ｃｒＲＮＡ－Ｔ２の混合物をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞株では、標的配列上に変異が導入されたと考えられるピークが検出された。一方、コントロールのプラスミド未導入細胞株では、変異導入と考えられるピークは検出されなかった。また、ｐＣＲ＿ｈＴｉＤ、ｐＵＣ＿ｃｒＲＮＡ－Ｔ１あるいはｐＵＣ＿ｃｒＲＮＡ－Ｔ２をそれぞれ単独でトランスフェクションした細胞から得たＤＮＡでも、プラスミド未導入細胞株を用いた場合と同様に、変異導入と考えられるピークは得られなかった。
　また、変異導入と考えられるピークがヘテロ二本鎖移動度分析により検出された配列サンプルをプラスミドベクターにクローン化し、シーケンス解析した結果、図１２および図１３に示すとおり、ターゲット１およびターゲット２上に欠失あるいは挿入型の変異が導入されていることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　本発明によれば、従来のＣＲＩＳＰＲタイプＩＩあるいはタイプＶ由来ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼを用いるゲノム編集技術では標的とすることができなかった遺伝子配列を標的とすることが可能となった。すなわち本発明により、従来技術ではターゲティング不可能な遺伝子領域上での変異アレルの作製、転写活性化および不活性化による遺伝子発現制御、ＤＮＡ修飾／ヒストン修飾タンパク質ドメインのターゲティングによるエピゲノム改変を実現することが可能となった。
SEQ ID NO:1 ; Microcystis aeruginosa Cas5d amino acid sequence
SEQ ID NO:2 ; Microcystis aeruginosa Cas6d amino acid sequence
SEQ ID NO:3 ; Microcystis aeruginosa Cas7d amino acid sequence
SEQ ID NO:4 ; Microcystis aeruginosa Cas3d amino acid sequence
SEQ ID NO:5 ; Microcystis aeruginosa Cas10d amino acid sequence
SEQ ID NO:6 ; TiDcrRNA containing direct repeat (37b) and spacer (35b of N). N is any nucleotide constituting a complementary sequence to a target nucleotide sequence.
SEQ ID NO:7 ; Cas5d nucleotide sequence for expression in Escherichia coli
SEQ ID NO:8 ; Cas6d nucleotide sequence for expression in Escherichia coli
SEQ ID NO:9 ; Cas7d nucleotide sequence for expression in Escherichia coli
SEQ ID NO:10 ; Cas3d nucleotide sequence for expression in Escherichia coli 
SEQ ID NO:11 ; Cas10d nucleotide sequence for expression in Escherichia coli
SEQ ID NO:12 ; J23108 synthesis promoter
SEQ ID NO:13 ; Ribosomal binding sequence
SEQ ID NO:14 ; Terminator sequence STOP767
SEQ ID NO:15 ; Terminator sequence STOP768(1)
SEQ ID NO:16 ; Terminator sequence TOP768(2)
SEQ ID NO:17 ; T7 terminator sequence
SEQ ID NO:18 ; CRISPR repeat sequence
SEQ ID NO:19 ; T7 promoter sequence
SEQ ID NO:20 ; crRNA expression cassette
SEQ ID NO:21 ; Synthesis cccdB gene expression cassette
SEQ ID NO:22 ; Nuclear localizing signal (NLS) amino acid sequence
SEQ ID NO:23 ; NLS nucleotide sequence
SEQ ID NO:24 ; Self-cleaving peptide 2A amino acid sequence
SEQ ID NO:25 ; Self-cleaving peptide 2A(1) coding sequence
SEQ ID NO:26 ; Self-cleaving peptide 2A(2) coding sequence
SEQ ID NO:27 ; Self-cleaving peptide 2A(3) coding sequence
SEQ ID NO:28 ; Self-cleaving peptide 2A(4) coding sequence
SEQ ID NO:29 ; 2 x cauliflower mosaic virus 35S gene promoter + omega sequence
SEQ ID NO:30 ; Arabidopsis shock protein 18.2kDa gene terminator
SEQ ID NO:31 ; crRNA expression cassette 
SEQ ID NO:32 ; Arabidopsis U6 snRNA-26 gene promoter sequence
SEQ ID NO:33 ; 2xNLS + Cas5d
SEQ ID NO:34 ; 2xNLS + Cas6d
SEQ ID NO:35 ; 2xNLS + Cas7d
SEQ ID NO:36 ; 2xNLS + Cas3d
SEQ ID NO:37 ; 2xNLS + Cas10d
SEQ ID NO:38 ; Target sequence 1 on tobacco PDS gene
SEQ ID NO:39 ; Target sequence 2 on tobacco PDS gene
SEQ ID NO:40 ; Target sequence on tomato IAA9 gene
SEQ ID NO:41 ; Cytomegalovirus enhancer + universal chicken beta-actin gene hybrid promoter
SEQ ID NO:42 ; Bovine-derived growth hormone gene terminator sequence
SEQ ID NO:43 ; Human U6 snRNA gene promoter
SEQ ID NO:44 ; Target 1 sequence on human EMX1 gene
SEQ ID NO:45 ; Target 2 sequence on human EMX1 gene

Claims (13)

  1. 　標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、細胞中に、
    　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
    　（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡ、または該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ
    を導入することを含む方法。
  2. 　標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、細胞中に、
    　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
    　（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡ、または該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ
    を導入することを含む方法。
  3. 　標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、細胞中に、
    　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
    　（ｉｉ）前記標的遺伝子の配列の少なくとも一部に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡ、または該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ
    を導入することを含む方法。
  4. 　前記ガイドＲＮＡが、前記標的ヌクレオチド配列に相補的な２０～５０塩基からなる配列を含む、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　前記細胞中にドナーポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項２または４記載の方法。
  6. 　改変が塩基の欠失、挿入、または置換である、請求項２、４および５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　前記Ｃａｓ５ｄがプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列として５’－ＧＴＨ－３’（Ｈ＝Ａ、Ｃ、またはＴ）を認識する、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、および
    　（ｉｉ）標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡ
    を含む複合体。
  9. 　Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄをさらに含む、請求項８記載の複合体。
  10. 　前記ガイドＲＮＡが、前記標的ヌクレオチド配列に相補的な２０～５０塩基からなる配列を含む、請求項８または９記載の複合体。
  11. 　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連タンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄをコードする核酸、および
    　（ｉｉ）標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ
    を含む発現ベクター。
  12. 　Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄをコードする核酸をさらに含む、請求項１１記載の発現ベクター。
  13. 　請求項８～１０のいずれか１項記載の複合体をコードするＤＮＡ分子。
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