CN112921038B

CN112921038B - 同源重组机制介导的精准序列替换基因编辑方法及其元件结构

Info

Publication number: CN112921038B
Application number: CN202110325672.XA
Authority: CN
Inventors: 许永汉; 林新春; 马传喜; 李金才; 胡晓渝; 王晓波; 武德传; 齐泽宇; 吕蔺; 蒋欣瑜; 桂昊
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU; Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU; Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2021-02-23
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2041-03-26
Also published as: WO2022199553A1; CN112921038A

Abstract

本发明公开了同源重组机制介导的精准序列替换基因编辑方法及元件结构，所述方法包括：(1)以靶区段300‑400bp DNA序列为基础，其中插入或缺失多个DNA片断形成MsDFID序列，同时作为向导RNA和供体模板，也被称为MsDFID向导和供体RNA；(2)在所述MsDFID供体模板3’端连接成簇且规律间隔短重复DNA回文结构，即PCRISR，或Cas9向导RNA骨架，或大肠杆菌CRISPR‑Cas3回文重复序列。后面这三种序列均作为向导RNA骨架；(3)用上述融合序列构建供体载体，转化大肠杆菌，MsDFID供体模板内供体位点所含DNA片断插入或缺失被替换到靶区段对应位点。本发明成功实现以序列替换为唯一效果的基因编辑，解决当前基因编辑系统面临的几个主要问题：对PAM序列依赖、较高脱靶风险和难以实现精准序列替换。

Description

同源重组机制介导的精准序列替换基因编辑方法及其元件结构

技术领域

本发明涉及基因编辑领域，具体涉及一种全新的不依赖PAM、同源重组机制介导的精准序列替换基因编辑方法。

背景技术

基因编辑是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术或过程。基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，也称“分子剪刀”，在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂(DSB)，诱导生物体通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)来修复DSB，因为这个修复过程容易出错，从而导致靶向突变。这种靶向突变就是基因编辑。

目前，在基因编辑领域，一种非常惯用且有效的编辑技术就是CRISPR-Cas9技术。CRISPR是细菌遗传密码及其免疫系统的一个定义性特征，是细菌用来保护自己免受病毒攻击的防御系统。它也存在于古生物界(单细胞微生物)中的生物体中。CRISPR是一系列重复的DNA序列，并且这些DNA之间存在“spacers”。细菌利用这些基因序列来“记住”攻击它们的每种病毒。细菌会将病毒的DNA整合到自己的细菌基因组中。这种病毒DNA最终成为CRISPR序列中的“spacers”。这种防御系统可以在同种病毒再次发起攻击时给予细菌保护或免疫力。

虽然，CRISPR-Cas9技术存在着广泛的应用，但是综合目前的基因编辑研究报道，总的来看，仍面临几个重要问题。一是对PAM序列的依赖；二是较高的脱靶风险；三是很少有通过同源重组实现精准序列替换的基因编辑技术工具，不依赖PAM，且没有脱靶风险或脱靶风险很低。

发明内容

针对CRISPR-Cas9技术所存在的上述问题，本申请的发明人希望提供一种基因编辑技术，其能够在目标位点实现对特定片段的精准替换。

具体而言，本申请的发明人在进行基因编辑研究过程中注意到，水稻等自然界植物和微生物中存在着大量的、具有一种特殊规律的片段，这里发明人将其命名为PCRISR结构序列，该结构具有一共性，即均包含若干重复的“tcacaaaactaca”以及其反向互补序列，短重复序列之间包含20bp左右的间隔序列，整个结构对称折叠呈“发卡”状(参见图1)。

本申请的发明人在进一步研究中注意到，该特殊结构与特定的供体模板融合重组后，转入到大肠杆菌，能够实现一种唯一效果：序列替换。由于CRISPR-Cas9技术在基因编辑时是以基因功能敲除(knock out)的方式进行，所以其可能带来的效果存在多样性和不确定性，而采用本发明的方法，可以实现编辑的确定性效果，这是具有巨大研究价值和商业价值的。

本发明方案如下：

一种同源重组机制介导的精准序列替换基因编辑方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

(1)以靶区段的DNA序列为基础，通过在对应于靶区段的同源臂之间插入或缺失多个DNA片断来形成MsDFID供体模板，这些DNA片断插入或缺失位点则形成供体位点(donorsite)；

(2)在所述MsDFID供体模板3’端连接成簇且规律间隔短重复DNA回文序列(palindromic clustered regularly interspaced short repeats，PCRISR)，所述PCRISR序列包含若干重复的“tcacaaaactaca”以及其反向互补序列，并且对称折叠呈“发卡”状；

(3)将合成的MsDFID供体模板和PCRISR，或Cas9 gRNA scaffold，或大肠杆菌CRISPR-Cas3 gRNA scaffold融合序列，连接到表达载体，作为供体载体(donor vector)；

(4)利用含有MsDFID供体模板和PCRISR，或Cas9 gRNA scaffold，或大肠杆菌CRISPR-Cas3 gRNA scaffold融合序列的供体载体转化大肠杆菌，MsDFID供体模板内供体位点所含的那些DNA片断插入或缺失就能够被高效地替换到靶区段对应位点，即实现精准的序列替换。

优选地，所述MsDFID供体模板中包含5-6个通过插入或缺失形成的供体位点，最长DNA插入片断为65bp，最长DNA缺失片断为35bp。

优选地，所述PCRISR结构包括5-9个“tcacaaaactaca”的间断重复序列以及6-9个该重复序列的反向互补序列，该重复序列或其反向互补序列之间隔若干(20bp左右)碱基序列。

优选地，所述供体模板的序列如序列表中SEQ ID No.1-12之一所示。

优选地，所述PCRISR结构的序列如序列表中SEQ ID No.13所示。

另一方面，本发明提供一种用于同源重组机制介导的精准序列替换的MsDFID供体模板，其特征在于，所述MsDFID供体模板以靶区段的基因序列为基础，通过在其中插入或缺失DNA片断成为若干供体位点来形成。

另一方面，本发明提供一种用于同源重组机制介导的精准序列替换的基因序列，其特征在于，所述基因序列包括MsDFID供体模板和PCRISR，或Cas9 gRNA scaffold，或大肠杆菌CRISPR-Cas3 gRNA scaffold融合序列。其中，所述MsDFID供体模板以靶区段的基因序列为基础，通过在所述靶区段内插入或缺失若干供体位点来形成，所述PCRISR结构包含若干重复的“tcacaaaactaca”以及其反向互补序列，并且对称折叠呈“发卡”状，所述PCRISR结构连接在所述供体模板前端。

一种用于同源重组机制介导的精准序列替换的PCRISR结构，其特征在于，所述PCRISR结构包含若干重复的“tcacaaaactaca”序列以及其反向互补序列，并且所述PCRISR结构对称折叠呈“发卡”状。

技术效果

本发明提出了新型的MsDFID供体模板。在这种供体模板中，我们设计了多个DNA片断插入或缺失位点作为供体位点，其中最长DNA插入片断为65bp，最长DNA缺失断为35bp，这种供体模板的设计，可能有助于MsDFID供体模板与靶区段(target region)之间进行同源配对时形成程度更高的异质性(heterozygosity)，从而提高两者之间的片断交换(cross-over)或替换(replacement)事件发生概率，最终在使MsDFID供体模板内供体位点高效地被替换到对应靶区段位点，最终实现靶区段序列替换的效果。

本发明通过将所发现的自主开发的MsDFID供体模板与PCRISR，或Cas9 gRNAscaffold，或大肠杆菌CRISPR-Cas3 gRNA scaffold融合重组，构建供体载体转化大肠杆菌，成功实现以序列替换为唯一效果的基因编辑效果，解决了CRISPR-Cas9技术所无法实现的基因片段的准确替换问题。

附图说明

图1所示为来自水稻基因Ideal Plant Architecture1(IPA1)启动子区域PCRISR结构序列及其特点。

图2.PCRISR在12条水稻染色体中的分布。染色体左右两边分别是相应PCRISR所在位置和编号。

图3.PCRISR结构介导大肠杆菌基因aroA靶区段内序列替换(A)供体载体F7869实现基因aroA靶区段内序列替换的策略。

图4.PCRISR介导在大肠杆菌基因组转座子靶位点产生的序列替换。

图5.利用一系列包含MsDFID供体模板与PCRISR融合结构的载体在大肠杆菌基因dctA靶区段产生的序列替换。

图6.利用包含MsDFID供体模板与PCRISR融合结构的供体载体CY7869-25在大肠杆菌基因fadD内靶区段产生的序列替换。

图7.MsDFID供体模板与3种gRNA scaffold的融合结构依赖于大肠杆菌CRISPR-Cas3系统实现精准的序列替换。

图8为本发明的MsDFID供体模板和Cas9 gRNA scaffold融合结构在大肠杆菌基因靶区段实现精准的序列替换；

图9为MsDFID供体模板和大肠杆菌CRISPR-Cas3 gRNAscaffold序列融合结构在大肠杆菌实现精准的序列替换。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

图1示出了来自水稻基因Ideal Plant Architecture1(IPA1)启动子区域的PCRISR结构序列及其特点。如图1的(A)部分所示，可以看出，其中的上半部分为PCRISR及旁侧序列，下半部分为PCRISR反向互补的序列，其包含了8个正向序列和9个反向互补序列，任意两个重复序列之间具有16-19个碱基的间隔序列及对应反向互补序列。8个正向和9个反向互补的重复单元分别用不同深浅度标注，变异碱基也单独标注。

图1的B部分明确给出了PCRISR的预测的折叠结构；图1的C部分则是来自粳稻日本晴基因组内8+8、8+9和9+9单元结构组成的PCRISRs的进化树。

图2给出了PCRISR在12条水稻染色体中的分布。染色体左右两边分别是相应PCRISR所在位置和编号。从图中可以看出，申请人所发现的PCRISR结构的广泛存在性，因此，一旦本发明的方法可以广泛应用，其价值不可估量。

本申请中，发明人将自主开发的MsDFID供体模板与PCRISR，或Cas9gRNAscaffold，或大肠杆菌CRISPR-Cas3 gRNA scaffold序列融合，构建供体载体转化大肠杆菌，成功实现以序列替换为唯一效果的基因编辑效果。

发明人对大肠杆菌基因组4个靶标(targets)进行了试验，包括基因aroA、1个转座子(GenBank No.AY345595.2,1.34kilobase-pair)、基因dctA和基因fadD，效果均比较理想，如图3、图4、图5和图6所示。下面，申请人将结合不同的实施例来分别描述。

实施例1

本实施例中，以大肠杆菌基因aroA靶区段为示例，详细介绍如何利用本发明的PCRISR结构和供体模板进行序列替换。

(1)首先，准备供体模板，供体模板的获得方式为：

(1.1)确定靶区段的序列；

本实施例中，以大肠杆菌基因aroA作为靶区段，对其序列进行替换。

(1.2)在靶区段序列中插入或缺失5-6个供体位点，形成供体模板。本实施例中采用MsDFID供体模板，该MsDFID供体模板包含6个供体位点，其中5个位点是DNA片断插入，1个位点DNA片断缺失，同源臂长度为60bp，参见图3的(A)部分。优选地，最长DNA插入片断为65bp，最长DNA缺失片断为35bp。

(2)在MsDFID供体模板3’端连接PCRISR“发卡”结构

在靶区段序列中插入多个供体位点之后，在其前端连接在所述MsDFID供体模板3’端连接一种由成簇且规律间隔短重复DNA序列形成的回文结构(序列)——PCRISR“发卡”结构(参见序列表中SEQ ID No.13)，该PCRISR“发卡”结构具有一共性，即均包含若干重复的“tcacaaaactaca”以及其反向互补序列，并且，短重复序列之间包含20bp左右的间隔序列，整个结构对称折叠呈“发卡”状。本实施例中所采用的PCRISR“发卡”结构如图1所示，其包含8个“tcacaaaactaca”重复序列和9个该结构的反向互补序列。这个重复序列指的是任意两个“tcacaaaactaca”序列或其反向互补序列之间间隔若干碱基序列，其间隔不超过20bp的间隔序列。

(3)将连接有PCRISR结构的靶区段序列连接到遗传转化载体

如图3的(A)部分所示，本实施例中采用F7869载体作为遗传转化载体，该载体中已经包含了彼此相连的MsDFID供体模板和PCRISR“发卡”结构。301为阴性对照载体F7869F5R5的MsDFID供体模板中没有融合PCRISR结构；302为供体载体F7869中MsDFID供体模板和PCRISR的融合结构；303为大肠杆菌aroA基因中靶区段及其旁侧序列；304为MsDFID供体模板。图3中还标出了genotyping引物的位置。图中的F5和R5为扩增MsDFID供体模板的引物，用来构建阴性对照供体载体F7869F5R5。

图3中B部分的(a)为用于鉴定目标区段基因型的PCR产物的电泳图。

本实施例中，采用的引物序列为：

FF2 5’agaaggtgccctggagttgttc 3’

FR4 5’atactgttacgtccaataccggtc 3’

(4)利用含有MsDFID供体模板和PCRISR“发卡”结构的遗传转化载体转化大肠杆菌。例如，可以采用热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将遗传转化载体转入到激活的感受态细胞中。

(5)基因aroA靶区段内精准的序列替换的鉴定。

为了验证本发明的精准序列替换基因编辑方法的有效性，本申请发明人对实验结果进行了验证，参见图3的(B)部分，其中，(a)为用F7869质粒转化后的大肠杆菌基因组DNA做模板得到的外围PCR(flanking PCR，genotyping PCR)产物的电泳图，所用的外围PCR(flanking PCR)配对引物是FF2和FR4(序列见上)。加样孔1-8:阳性结果；9：负对照。M:DNA分子量标准(DNA ladder marker)。(b)为外围PCR(flanking PCR)产物测序峰形图。下方箭头所指为清晰的双峰，表明从该处开始序列为杂合的。这意味着该处有来自供体模板中第1个供体位点内的DNA插入片断(箭头下方的横线所标注的9bp)已经替换到大肠杆菌基因组相应靶区段内。(C)基因aroA靶区段内序列替换类型。两种flanking PCR产物测序结果表明两种序列替换事件的发生，即第1个和第2个供体位点分别替换到相应的靶位点上。图3C部分中，306表示供体载体F7869中MsDFID供体模板和PCRISR的融合结构；307表示大肠杆菌基因中靶区段及其旁侧序列，308表示(同源重组机制)介导的序列替换；309表示第1类用于鉴定目标区段基因型的PCR产物，占全部PCR产物的22.5％；310表示第2类用于鉴定目标区段基因型的PCR产物，占全部PCR产物的2.5％。从PCR产物测序结果中可以看出，本发明成功实现了供体模板对靶基因序列的替换。

上述实验过程均进行过多次重复，具有统计学意义。

同时，从以上两种类型序列替换的比例来看，MsDFID供体模板中第一个供体位点精准替换到对应靶区段，即第1种genotyping PCRproduct产物鉴定的替换类型，比例最高，因为第一个供体位点离PCRISR结构最近。

因此，需要特别强调的是，在本方法中，真正被希望用来替换到靶区段的DNA插入或缺失片断要设计在MsDFID供体模板中第一个供体位点，即最靠近3种向导RNA骨架(PCRISR，或Cas9 gRNA scaffold，或大肠杆菌CRISPR-Cas3 gRNA scaffold)的供体位点。这样将确保更高效地获得预期的单一位点序列替换效果。以下同理。

实施例2

本实施例中，发明人以NJZL质粒作为供体模板，结合PCRISR“发卡”结构，实现了大肠杆菌基因组转座子靶位点的序列替换。

(1)首先，准备供体模板，供体模板的获得方式为：

(1.1)确定靶区段的序列；

本实施例中，以大肠杆菌1个转座子序列(GenBank No.CP026085.1(gene product＝“IS4 family transposase ISVsa5”)作为靶区段，以对其序列进行替换。

(1.2)在靶区段序列中插入或缺失若干供体位点，形成供体模板。本实施例中采用NJZL质粒供体模板，该供体模板包含5个供体位点，参见图4的(A)部分。

(2)在供体模板前端连接PCRISR“发卡”结构

在靶区段序列中插入多个供体位点之后，在其前端连接PCRISR“发卡”结构，本实施例中所采用的发卡结构如图1所示。其包含8个“tcacaaaactaca”的重复序列和9个该结构的反向互补序列，重复序列之间为20bp左右的间隔序列。

(3)将连接有PCRISR结构的靶区段序列连接到遗传转化载体

如图4的(A)部分所示，本实施例中采用NJZL载体作为遗传转化载体，该载体中已经包含了彼此相连的供体模板和PCRISR“发卡”结构。本实施例中，所采用的引物为：DNA2F2+F2-4R2(DNA2F2 5’GCATGATGCCGGAAGCCATC 3’；F2-4R2 5’GTTACTCGTGGCTG CAACCC 3’)，其是根据目标转座子序列的旁侧序列设计的genotyping引物，图中用绿色与红色线段混合组成的箭头和黑色箭头分别标出。

图4中，标记1-5为碱基改变的位点；401表示用于鉴定目标区段基因型的PCR引物；m1，m2表示插入的DNA片断；401表示用于鉴定目标区段基因型的PCR引物；数字标号1-5表示碱基改变的位点；402表示供体载体NJZL中供体模板和PCRISR的融合结构；403表示大肠杆菌基因中靶标转座子及其旁侧序列；404表示用供体载体NJZL转化大肠杆菌；405表示提取大肠杆菌基因组DNA；406表示用引物对DNA2(1)F2+F2-4(Exch)R2并以转化的大肠杆菌基因组DNA作为模板进行PCR鉴定目标区段基因型；407表示基因型鉴定PCR产物代表3种靶标转座子内的序列替换事件；409表示供体载体F2-28中供体模板和PCRISR的融合结构；410表示大肠杆菌基因中靶标转座子及其旁侧序列；411表示鉴定基因型PCR的启动子；412表示HR(同源重组机制)介导的序列替换；413基因型鉴定PCR产物(目标区段内发生的基因组序列重组)；414表示鉴定基因型PCR产物的序列；415野生型的序列；416靶标转座子的边界。

(4)利用含有NJZL质粒供体模板和PCRISR“发卡”结构的遗传转化载体转化大肠杆菌。例如，可以采用热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将遗传转化载体转入到激活的感受态细胞中。

(5)靶区段内精准的序列替换的鉴定。

说明：引物F2-4R2是根据供体模板中插入的DNA片断序列设计的，DNA2F2是靶区段序列特异引物，因此，图中PCR产物阳性结果及测序结果表明供体模板中插入的DNA片断替换到了靶区段，也就是说靶区段内发生了精准的序列替换。

实施例3

按照实施例1和实施例2中类似的方式，本实施例中对大肠杆菌基因dctA靶区段进行了序列替换，替换结果如图5所示。

图5示出了利用一系列包含MsDFID供体模板与PCRISR融合结构的载体在大肠杆菌基因dctA靶区段产生的序列替换的实验过程图。

图5(A)中示出了供体载体结构及用这些载体转化大肠杆菌基因组DNA进行扩增得到的genotyping PCR产物的电泳图，其中，图中，501表示用于鉴定目标区段基因型的PCR引物；502表示供体载体CY7869-6中MsDFID供体模板和PCRISR的融合结构；503表示大肠杆菌基因dctA中靶区段及其旁侧序列；504表示基因型鉴定PCR产物；505表示MsDFID供体模板；506表示供体载体CY7869-5中MsDFID供体模板和PCRISR的融合结构；507表示大肠杆菌基因dctA中靶区段及其旁侧序列。

图5(A)中，(a)中的质粒CY7869-6只含有一个包含DNA插入片断的供体位点dctA(b)，而(b)中的CY7869-5中的供体模板上含有MsDFID供体模板。所用的PCR引物CY-2F1和CYR1分别是根据dctA基因序列和第一个供体位点插入片断设计的。电泳结果表明：在(a)所示方案中，用引物CY-2F1和CYR1配对并以CY7869-6质粒的大肠杆菌基因组DNA为模板PCR扩增没有获得期望的PCR产物；而在(b)所示方案中，同样用引物CY-2F1和CYR1配对，以CY7869-5质粒转化的大肠杆菌基因组DNA为模板PCR扩增，可以获得期望的PCR产物。

图5(B)中，示出了用质粒CY7869-9进行序列替换的效果，其中，508表示供体载体CY7869-9中MsDFID供体模板和PCRISR的融合结构；509表示大肠杆菌基因dctA中靶区段及其旁侧序列；510表示外围PCR(flanking PCR)产物的部分测序峰形图(中间部分)。图5(B)中的(a)部分中示出了供体质粒CY7869-9中的MsDFID供体模板与PCRISR融合。并且，示出了用质粒CY7869-9转化后的大肠杆菌基因组DNA做模板进行的目标区段基因型鉴定PCR(genotyping，PCR flanking PCR)产物电泳图。

说明：图中所采用的基因型鉴定(Genotyping)引物CYF2和CY3R1均是根据基因dctA中靶区段旁侧序列设计，因而是外围PCR(flanking PCR)。箭头标注处为第1个供体位点中DNA插入片断被替换到相应的基因组受体位点，也就是说靶区段内发生了精准的序列替换。

图5(C)中示出了用供体载体CY7869-21实现对基因dctA靶区段内序列替换类型的过程，其中511表示供体载体CY7869-21中MsDFID供体模板和PCRISR的融合结构；512表示大肠杆菌基因dctA中靶区段及其旁侧序列(flanking sequence)；513表示HR(同源重组机制)介导的序列替换。

图中左侧部分示出了供体质粒CY7869-21中MsDFID供体模板与PCRISR的融合。右侧部分示出了用质粒CY7869-21转化后的大肠杆菌基因组DNA做模板进行的PCR鉴定后的阳性结果，表明这种策略能够实现精准的序列替换。

说明：CY21F2是根据供体模板中第1个插入DNA片断序列设计的，CYF2是靶区段外围序列特异引物，因此，图中PCR产物阳性结果初步表明供体模板中插入的DNA片断替换到了靶区段，也就是说靶区段内发生了精准的序列替换。

实施例4

按照实施例1和实施例2中类似的方式，本实施例中在大肠杆菌基因fadD靶区段进行了序列替换，替换结果如图6所示。

图6中，601表示用于鉴定目标区段基因型的PCR引物；602表示供体载体CY7869-25中MsDFID供体模板和PCRISR的融合序列；603表示大肠杆菌fadD基因中靶区段及其旁侧序列；604表示MsDFID供体模板；605表示HR(同源重组机制)介导的序列替换；606表示基因型鉴定PCR产物。

从图6中606的产物中可以看出，这种策略能够实现精准的序列替换。

说明：CY25F2是根据供体模板中第1个插入DNA片断序列设计的，CY25R3是靶区段外围序列特异引物，因此，图左中PCR产物阳性结果表明供体模板中插入的DNA片断替换到了靶区段，也就是说靶区段内发生了精准的序列替换。

综合上述实施例，本发明的基因编辑新技术无PAM要求，也未检测到脱靶现象。

对比例

作为对比，申请人将大肠杆菌TOP10菌株内源CRISPR-Cas3系统中的1个关键蛋白Cas3敲除后，得到突变菌株TOP10ΔCas3，然后用包含PCRISR、Cas9 gRNA scaffold或CRISPR-Cas3 gRNA scaffold单元序列(type a)的“单一向导和供体RNA”(参见下列实施例5和实施例6)表达载体分别转化TOP10ΔCas3。如图7所示，鉴定结果表明，这些载体均不能实现序列替换，进而表明以上序列替换的基因编辑效果均依赖于大肠杆菌CRISPR-Cas3系统。

图7中的上下四条电泳图分别为CY7869-25(含PCRISR)、F7869CCOR(含Cas9 gRNAscaffold)、aroACC2(含CRISPR-Cas3 gRNA scaffold单元序列(type a))和dctACC2(含CRISPR-Cas3 gRNA scaffold单元序列(type a))载体实现的靶区段序列替换鉴定结果(基因型鉴定PCR产物)。

这表明，以上这些技术策略均依赖于大肠杆菌内源CRISPR-Cas3系统。换句话说，大肠杆菌内源CRISPR-Cas3系统能够与以上所用包括MsDFID供体模板分别和3种gRNAscaffold融合序列(单一向导和供体RNA)(参见下列实施例5和实施例6)共同实现对基因组进行精准的序列替换效果。

实施例5

如图8所示，其中示出了采用MsDFID供体模板和Cas9 gRNA scaffold融合结构在大肠杆菌基因靶区段实现精准的序列替换，具体操作过程参照上述实施例。

图8中标注的含义如下：801表示用于鉴定目标区段基因型的PCR引物802表示供体载体CY 7869CC中MsDFID供体模板和Cas9 gRNA scaffold的融合结构；803表示大肠杆菌基因aroA中靶区段及其旁侧序列；804表示MsDFID供体模板；805表示HR(同源重组机制)介导的序列替换；806表示基因型鉴定PCR产物；807表示用于鉴定目标区段基因型的PCR引物；808表示供体载体CY7869-25CC中MsDFID供体模板和Cas9 gRNA scaffold的融合结构；809表示大肠杆菌基因fadD中靶区段及其旁侧序列；810表示MsDFID供体模板；811表示HR(同源重组机制)介导的序列替换；812表示基因型鉴定PCR产物；

Cas9 gRNA scaffold序列如下：

5’Gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttt 3’

实施例6

本实施例示出了采用大肠杆菌CRISPR-Cas3系统回文重复序列(palindromicrepeat)结构用于同源重组基因编辑技术

本实施例中发明人将MsDFID供体模板与大肠杆菌CRISPR-Cas系统回文重复序列融合重组，构建供体载体转化大肠杆菌，成功实现以序列替换为唯一效果的基因编辑效果(图9)。

图中(A)和(B)分别为(左)利用MsDFID供体模板和大肠杆菌CRISPR-Cas回文重复单元序列(type a)融合结构构建得到载体aroACC2和dctACC2；(右)在基因aroA和dctA的靶区段实现预期的序列替换事件。所有结果均有多个生物学重复。

图9(A)中标注的含义如下：901表示用于鉴定目标区段基因型的PCR引物；902表示供体载体aroACC2中MsDFID供体模板和CRISPR-Cas3 gRNA scaffold序列的融合结构；903表示大肠杆菌基因aroA中靶区段及其旁侧序列；904表示MsDFID供体模板；905表示HR(同源重组机制)介导的序列替换；906表示基因型鉴定PCR产物；

图9(B)中标注的含义如下：908表示用于鉴定目标区段基因型的PCR引物；909表示供体载体dctACC2中MsDFID供体模板和CRISPR-Cas3 gRNA scaffold序列的融合结构；910表示大肠杆菌基因dctA中靶区段及其旁侧序列；911表示MsDFID供体模板；912表示HR(同源重组机制)介导的序列替换；913表示基因型鉴定PCR产物。

大肠杆菌CRISPR-Cas3 gRNA scaffold单元(type a)序列如下：

5’GTGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 3’

从大量实验可以证实，本发明的基因编辑新技术工具无PAM要求，也未检测到脱靶现象，具有重大的研究价值和应用价值。

虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 同源重组机制介导的精准序列替换基因编辑方法及其元件结构

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 523

<212> DNA

<213> MsDFID

<400> 1

ccgctggcgg cagctctttg tctgggtagc aatgatattg tgctgaccgg tgagccgcgt 60

atggtgagca tgaaagaacg cccgattggt catctggtgg atgcgctgcg cctgggcggg 120

gcgaagatct gaagttcatc tgcaacttac ctggaacaag aaaattatcc gccgttgcgt 180

ttacagggcg gctttactgg cggcatgaag cagcacgact tcttcaacgt tgacgttgat 240

ggctccgttt ccagccaatt cctcaccgca ctgttaatga ctgcgaccat cttcttcaag 300

gacgacggca actaccctct tgcgccggaa gatacggtga ttcgtattaa aggcgatctg 360

gtttctaaac cttatacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatatcga 420

catcacactc aatctgatga agacgtttgg tgttgaaatt gaaaatcagc actatgtaaa 480

aggcgggcag tcttatcagt ctccgggtac ttatttggtc gaa 523

<210> 2

<211> 1665

<212> DNA

<213> NJZL

<400> 2

aaccatgtgt gaataaattt tgagctagta gggttgcagc cacgagtaac tctctcctcg 60

ttattgtgta gccagaatgc cgaccaactt ccatgcctaa gcgaactgtt gagagtacgt 120

ttcgatttct gactgtgtta gcctgcaaag tacttgtccc aaccttgttt ctgagcctct 180

ctcctcgcaa gccaacatgt tagttgtagc ctcagggcga ccagcagcat gatatcaaaa 240

cgctctgagc tgctcgttcg gctatggcgt aggcctagtc cgtaggcagg acttttcaag 300

tctcggaagg tttcttcaat ctgcattcgc ttcgaataga tattaacaag ttgtttgggt 360

gttcgaattt caacaggtaa gttagttgct agaatccatg gctcctttgc cgacgctgag 420

tagattttag gtgacgggtg gtgacaatga gtccgtgtcg agcgctgatt ttttcggcct 480

ttagagcgag atttatacaa tagaatttgg catgagattg gattgctttt agtcagcctc 540

ttatagccta aagtctttga gtgactagat gacatatcat gtaagttgct gataggtttc 600

cagttttccg ctcctaggtc tgcatattgt acttttcctc ttactcgact taaccagtac 660

caacccagct tctcaacgga tttataccat ggcactttaa agccagcatc actgacaatg 720

agcggtgtgg tgttactcgg tagaatgctc gcaaggtcgg ctagaaattg gtcatgagct 780

ttctttgaac attgctctga aagcgggaac gctttctcat aaagagtaac agaacgaccg 840

tgtagtgcga ctgaagctcg caataccata agccgttttt gctcacggat atcagaccag 900

tcaacaagta caatgggcat cgtattgccc gaacagataa agctagcatg ccaacggtat 960

acagcgagtc gctctttgtg gaggtgacga ttacctaaca atcggtcgat tcgtttgatg 1020

ttatgttttg ttctcgcttt ggttggcagg ttacggccaa gttcggtaag agtgagagtt 1080

ttacagtcaa gtaaggcgtg gcaagccaac gttaagctgt tgagtcgttt taagtgtaat 1140

tcggggcaga attggtaaag agagtcgtgt aaaatatcga gttcgcacat tttgttgtct 1200

gattattgat ttttggcgaa accatttgat catatgacaa gatgtgtatc taccttaact 1260

taatgatttt gataaaaatc attaggggat tcatcagtgc aaagtatctg tagttttatg 1320

aaatttactc tttaaaaaaa taaaggaaga gagaagagcg gcgggttaca aatctgtagc 1380

ctgctttgct tctctctcct cttttttctc ttccacatgt gcttatagct gacttgtagc 1440

ctgctattgt acctgctcta aacgagattc aataaaatgt tactattaaa taatgggcac 1500

ttattaaatc tttacgtaga cctctactcg atctcgtagg agaaataaaa gagaaattat 1560

attgtgaatc tttgctgaga cttttactcg atcttgtagg ggagtagaag aggaaaggat 1620

gttgagatga acattgggat aagggctctc tcctcaatct ctaga 1665

<210> 3

<211> 1410

<212> DNA

<213> F2-28

<400> 3

aaccatgtgt gaataaattt tgagctagta gggttgcagc cacgagtaac tctctcctcg 60

ttattgtgta gccagaatgc cgaccaactt ccatgcctaa gcgaactgtt gagagtacgt 120

ttgcttatag ccgatttctg actgtgttag cctgcaaagt acttgtccca accttgtttc 180

tgagcctctc tcctcgcaag ccaacatgtt agttgtagcc tcagggcgac cagcagcatg 240

atatcaaaat catatgaccg ctctgagctg ctcgttcggc tatggcgtag gcctagtccg 300

taggcaggac ttttcaagtc tcggaaggtt tcttcaatct gcattcgctt cgaatagata 360

ttaacaagtt gtttgggtgt tcgaatttca acaggtaagt tagttgctag aatccatggc 420

tcctttgccg acgctgagta gattttaggt gacgggtggt gacaatgagt ccgtgtcgag 480

cgctgatttt ttcggccttt agagcgagat ttatacaata gaatttggca tgagattgga 540

ttgcttttag tcagcctctt atagcctaaa gtctttgagt gactagatga catatcatgt 600

aagttgctga taggtttcca gttttccgct cctaggtctg catattgtac ttttcctctt 660

actcgactta accagtacca acccagcttc tcaacggatt tataccatgg cactttaaag 720

ccagcatcac tgacaatgag cggtgtggtg ttactcggta gaatgctcgc aaggtcggct 780

agaaattggt catgagcttt ctttgaacat tgctctgaaa gcgggaacgc tttctcataa 840

agagtaacag aacgaccgtg tagtgcgact gaagctcgca ataccataag ccgtttttgc 900

tcacggatat cagaccagtc aacaagtaca atgggcatcg tattgcccga acagataaag 960

ctagcatgcc aacggtatac agcgagtcgc tctttgtgga ggtgacgatt acctaacaat 1020

cggtcgattc gtttgatgtt atgttttgtt ctcgctttgg ttggcaggtt acggccaagt 1080

tcggtaagag tgagagtttt acagtcaagt aaggcgtggc aagccaacgt taagctgttg 1140

agtcgtttta agtgtaattc ggggcagaat tggtaaagag agtcgtgtaa aatatcgagt 1200

tcgcacattt tgttgtctga ttattgattt ttggcgaaac catttgatca tatgacaaga 1260

tgtgtatcta ccttaactta atgattttga taaaaatcat taggggattc atcagtgcaa 1320

agtatctgta gttttatgaa atttactctt taaaaaaata aaggaagaga gaagagcggc 1380

gggttacaaa tctgtagcct gctttgcttc 1410

<210> 4

<211> 639

<212> DNA

<213> CY7869-5

<400> 4

cctggtgccg gaatgaacgt cgatccggca acgcttgatg cgaaagcggt cttcttcaag 60

gacgacggca actacagcgg tttacgccga tcaggcgaaa gaccagggca ttgtcgcctt 120

cattactaca acagccacaa cgtctatatc attggatgtc atcccggcga gcgtcattgg 180

cgcatttgcc agcggtaaca ttaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg 240

cgccgaggtg aactgcaggt gctgctgttt gccgtactgt ttggttttgc gctccaccgt 300

ctcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acgggcagca aaggccaact 360

gatttttaac gtcatcgaaa gtttctcgca ggacaagctg gagtacaact acaacagcca 420

caacgtctat attcatcttc ggcatcatca atatgatcat gcgtctggca cctattggtg 480

cgcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagctt cggggcaatg 540

gcgtttacca tcggtaaata cggcgtcggc acactggtat gaagcagcac gacttcttcg 600

caactggggc agctgattat ctgtttctac attacctgt 639

<210> 5

<211> 476

<212> DNA

<213> CY7869-9

<400> 5

cctggtgccg gaatgaacgt cgatccggca acgctgcggt ttacgccgat caggcgaaag 60

accagggcat tgtctgaagt tcatctgcag ccttcattat ggatgtcatc ccggcgagcg 120

tcattggcgc atttgccaga tgaagcagca cgacttcttc cggtaacatt ctgcaggtgc 180

tgctgtttgc cgtactgttt accatcttct tcaaggacga cggcaactac ggttttgcgc 240

tccaccgtct gggcagcaaa ggccaactga acaagctgga gtacaactac aacagccaca 300

acgtctatat tttttaacgt catcgaaagt ttctcgcagg tcatcttcgg catcaaggtg 360

aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagccatc atcaatatga tcatgcgtct 420

ggcacctatt ggtgcgcatc ggtaaatacg gcgtcggcac actggtgcaa ctgggg 476

<210> 6

<211> 438

<212> DNA

<213> CY7869-21

<400> 6

cctggtgccg gaatgaacgt cgatccggca acgctgcggt ttacgccgat caggcgaaag 60

accagggcat tgtctgaagt tcatctgcag ccttcattat ggatgtcatc ccggcgagcg 120

tcatttaaca ttctgcaggt gctgctgttt gccgtactgt ttaccatctt cttcaaggac 180

gacggcaact acggttttgc gctccaccgt ctgggcagca aaggccaact gaacaagctg 240

gagtacaact acaacagcca caacgtctat attttttaac gtcatcgaaa gtttctcgca 300

ggtcatcttc ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcca 360

tcatcaatat gatcatgcgt ctggcaccta ttggtgcgca tcggtaaata cggcgtcggc 420

acactggtgc aactgggg 438

<210> 7

<211> 468

<212> DNA

<213> CY7869-25

<400> 7

cttatcacta acccgcgcga tattccaggg ttggtaaaag ccgcatcgag ctgaaagtta 60

gcgaaatatc cgtttaccgc tatcacgggc gttaattgct gaacaataaa gagttccagc 120

agctggattt ctccagtctc aagctgaccc tgaagttcag catctttccg caggcggtgg 180

gatgccagtg cagcaagtgc tacaacagcc acaacgtcta tatcatgggt ggcagagcgt 240

tgggtgaaac tgaccggaca gtatctgccg ctggtcagcg ttaacccata tgatattgat 300

tatcatagag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag 360

cgtgcagctg gtagcatcgg tttgccggtg ccgtcgacgg aagccaaacc aggtcaaccg 420

ggtgagcttt gtgtcaaagg accgcaggtg atgctgggtt actggcag 468

<210> 8

<211> 475

<212> DNA

<213> F7869CC

<400> 8

ccgctggcgg cagctctttg tctgggtagc aatgatattg tgctgaccgg tgagccgcgt 60

atggtgagca tgaaagaacg cccgattggt catctggtgg atgcgctgcg cctgggcggg 120

gcgaagatct gaagttcatc tgatacttac ctggaacaag aaaattatcc gccgttgcgt 180

ttacagggcg gctttactgg cggcatgaag cagcacgact tcggcaacgt tgacgttgat 240

ggctccgttt ccagccaatt cctcaccgca ctgttaatga ctgcgaccat cttcttcaag 300

gacgacggca aagaccctct tgcgccggaa gatacggtga ttcgtattaa aggcgatctg 360

gtttctaaac cttatacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtg aatatatcga 420

catcacactc aatctgatga agacgtttgg tgttgaaatt gaaaatcagc actat 475

<210> 9

<211> 516

<212> DNA

<213> CY7869-25CC

<400> 9

gtaaaaggcg ggcagtctta tcagtctccg ggtacttatt tggtcgaact tatcactaac 60

ccgcgcgata ttccagggtt ggtaaaagcc gcatcgagcc caaagttagc gaaatatccg 120

tttaccgcta tcacgggcgt taattgctga acaataaaga gttccagcag ctggatttct 180

ccagtctcaa gctgaccctg aagttctgca tctttccgca ggcggtggga tgccagtgca 240

gcaagtgcta caacagccac aacgtctata tcatgggtgg cagagcgttg ggtgaaactg 300

accggacagt atctgccgct ggtcagcgtt aacccatatg atattgatta tcatagagaa 360

cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacggcgag gacggcagcg tgaagctggt 420

agcatcggtt tgccggtgcc gtcgacggaa gccaaaccag gtcaaccggg tgagctttgt 480

gtcaaaggac cgcaggtgat gctgggttac tggcag 516

<210> 10

<211> 479

<212> DNA

<213> AroACC2

<400> 10

ccgctggcgg cagctctttg tctgggtagc aatgatattg aaggtgagct gctgaccggt 60

gagccgcgta tgaaagaacg cccgattggt gttgttgttc tggctcatct ggtggatgcg 120

ctgcgcctgg gcggggcgaa gatcacttac cttatccgcc gttgcgttta cagggcggct 180

ttactggcgg cccgaagcag cacgtgttct tcaacgttga cgttgatggc tccgtttcca 240

gccaattcct caacgtactt cttcaaggac gagcgcaacg gcccgcactg taatgactgc 300

gcctcttgcg ccggaagata cacaaggcag agtacaacta caacagccac aaccactata 360

tggtgattcg tattaaaggc gatctggttt ctaaacctta tgatgaagac gtttggtgtt 420

gaaattgaaa atcagcacta tgtaaaaggc gggcagtctt atcagtctcc gggtactta 479

<210> 11

<211> 403

<212> DNA

<213> dctACC2

<400> 11

cctggtgccg gaatgaacgt cgatccggca acgcgcggtt tacgccgatc aggcgaaaga 60

ccagggcatt gtctgttgtt catgagcagc cttcattatg gatgtcatcc cggcgagcgt 120

catttaacat tctgcaggtg ctgctgtttg ccgtactgtt ttggatcgac ttcaaggacg 180

tgggcttctt gggttttgcg ctccaccgtc tgggcagcaa aggccaactg aacaagctgg 240

acatcaacta caacagcgtc aacgtctata ttttttaacg tcatcgaaag tttctcgcag 300

gtcatcttcg gctacaacct gaacttcaag taccgggaca acatcctgga cggcagccat 360

catcaatatg atcatgcgtc tggcacctat tggtgcgcat cgg 403

<210> 12

<211> 385

<212> DNA

<213> CY7869-6

<400> 12

cctggtgccg gaatgaacgt cgatccggca acgcttgatg cgaaagcggt cttcttcaag 60

gacgacggca actacagcgg tttacgccga tcaggcgaaa gaccagggca ttgtcgcctt 120

cattatggat gtcatcccgg cgagcgtcat tggcgcattt gccagcggta acattctgca 180

ggtgctgctg tttgccgtac tgtttggttt tgcgctccac cgtctgggca gcaaaggcca 240

actgattttt aacgtcatcg aaagtttctc gcaggtcatc ttcggcatca tcaatatgat 300

catgcgtctg gcacctattg gtgcgttcgg ggcaatggcg tttaccatcg gtaaatacgg 360

cgtcggcaca ctggtgcaac tgggg 385

<210> 13

<211> 526

<212> DNA

<213> PCRISR

<400> 13

tcacaaaact acaggtattt ttgtacaatt tatcacaaaa ctacagattt agtgtcttcg 60

ttttatcaca aaactacagg tactttgtac aatctatgac aaaactacat atttaagaac 120

ttgtttcaca aaaatataga tttagtgtat tcgtttataa caatgctaca catttagtgt 180

cttcatttat cacaaaacta cagattcagt gtctccattc tcataaaact atacgtttta 240

ataatagttt tagcattatt aaaacgtgta gttttatgag aatggagaca ctgaatctgt 300

agttttgtga taaatgaaga tattaaattt gtagttttgt gaaaaatgaa gatactaaac 360

ctgtagtttt gtgaaacaag ttcttaaatc tgtagttttg tgatatagtg ttcaaagtac 420

atgtagtttt gtgataaacg aacacattaa atctgtagtt ttgtgaaact agttctaaaa 480

tctgtagttt tgtgatagat catgcaaagt atctgtagtt ttatga 526

<210> 14

<211> 81

<212> DNA

<213> Cas9 gRNA scaffold

<400> 14

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgctttt t 81

Claims

1.一种同源重组机制介导的精准序列替换基因编辑方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

（1）以靶区段的DNA序列为基础，通过在对应于靶区段的同源臂之间插入或缺失多个DNA片断来形成MsDFID供体模板，这些DNA片断插入或缺失位点则形成供体位点，这些供体位点将会被替换到对应的靶区段位点；（2）在所述MsDFID供体模板3’端连接PCRISR，或Cas9gRNA scaffold，或大肠杆菌CRISPR-Cas3 gRNA scaffold序列，所述PCRISR结构包含若干重复的“tcacaaaactaca”以及其反向互补序列，并且对称折叠呈“发卡”状，所述PCRISR作为“向导RNA骨架”，所述PCRISR结构的序列如序列表SEQ ID No. 13所示；

（3）将MsDFID供体模板和PCRISR，或Cas9 gRNA scaffold，或大肠杆菌CRISPR-Cas3gRNA scaffold序列的融合序列，即“单一向导和供体RNA”序列连接到表达载体，作为供体载体；（4）利用含有MsDFID供体模板和PCRISR，或Cas9 gRNA scaffold，或大肠杆菌CRISPR-Cas3 gRNA scaffold序列的融合序列的供体载体转化大肠杆菌；

（5）供体载体转化后，MsDFID供体模板中供体位点，包括DNA插入或缺失序列，将会替换到对应的靶区段位点，发生精准的DNA序列替换。

2.根据权利要求1所述的基因编辑方法，其特征在于，所述MsDFID供体模板中包含5-6个通过插入或缺失形成的供体位点，最长DNA插入片断为65 bp，最长DNA缺失片断为35 bp。

3.根据权利要求1所述的基因编辑方法，其特征在于，所述MsDFID供体模板序列如序列表SEQ ID No. 1-12之一所示。

4.一种用于同源重组机制介导的精准序列替换的DNA融合序列，即“单一向导和供体RNA”序列，其特征在于，所述DNA序列包括MsDFID供体模板和PCRISR，或Cas9 gRNAscaffold，或大肠杆菌CRISPR-Cas3 gRNA scaffold序列的融合序列，其中，所述MsDFID供体模板以靶区段的基因序列为基础，通过在其中插入或缺失若干供体位点来形成，所述PCRISR结构包含若干重复的“tcacaaaactaca”以及其反向互补序列，并且对称折叠呈“发卡”状，所述PCRISR结构连接在所述MsDFID供体模板3’端，所述PCRISR结构的序列如序列表SEQ ID No. 13所示。