CN112501252A - 一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法 - Google Patents

Abstract

一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法，本发明涉及一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法。本发明的目的是为了解决现有检测sgRNA的在靶活性与脱靶效应的方法复杂，准确性低的问题，本发明基于体内脱靶检测GUIDE‑seq开发了高通量的细胞内脱靶检测手段。具体方法为：1.针对目标基因设计sgRNA；2.合成sgRNA文库；3.将sgRNA文库克隆到带有SpCas9表达蛋白的质粒上；4.文库细胞转染；5.GUIDE‑seq建库测序。本发明检测结果更加精确，文库大大减小，在保证检测准确性的同时大大减少实验的复杂性，本发明应用于体内在靶活性评估及脱靶检测领域。

Description

一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法

技术领域

本发明涉及一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法。

背景技术

CRISPR-Cas9系统源自细菌及古生菌的获得性免疫系统，由于操作简单高效而成为一种强大的基因编辑工具。相对于ZFN、TALEN等基因编辑技术来说，其更加简单、经济、容易操作，令其成为迄今为止最为有效、低廉和容易的基因编辑方法，其在基因编辑(包括基因敲除、敲入、点突变)、基因治疗(镰状细胞贫血HBB基因修复等)、活细胞成像(如Cas-FISH)、功能基因筛选(CRISPRi/a正负向筛选)、靶向捕获(CRISPR-capture)等方面具有极重要的应用意义。但是，在其广泛应用的背后，CRISPR/Cas9系统有一个致命的缺点——容易脱靶，即在预期靶点以外的位点上产生额外的DNA剪切或编辑。

脱靶效应验证影响了CRISPR基因编辑工具的常规应用和临床治疗效果。目前也开发出了多种基因编辑脱靶检测手段，例如体外脱靶检测的SITE-seq，CIRCLE-seq，DIG-seq等，体内脱靶检测的GUIDE-seq，DISCOVER-seq等。但是这些脱靶检测方法都是每次只能检测一条sgRNA的脱靶，不仅耗时耗力而且成本昂贵。CRISPR文库筛选在药物发现、靶向基因调控、表观遗传调控、染色质操纵和活细胞染色质成像等广泛领域具有巨大的潜力。但是由于无法确定哪个sgRNA是真正能发挥作用的，因此只能每个基因设计多条靶向sgRNA(目前的文库一般是2-10条)。但是这会有很多缺点，首先是会导致文库大小很大，进而让实验变得困难和不确定性增加，成本昂贵，耗时耗力。其次是不同的sgRNA切割和脱靶效应不同，脱靶效应会导致筛选结果不准确及不可靠。因此，如何筛选出针对每个基因最优的sgRNA(切割效率最高，脱靶效应最少或者无脱靶)，构建出精准且小巧的CRISPR筛选文库至关重要。不仅能节约成本，还能保证数据的准确性。

另外，随着基因编辑临床转化的火热进行，CRISPR的安全性及效性始终是我们关注的重点。有效性的影响因素之一为靶点的基因编辑的效率，也就是其在靶活性。sgRNA的在靶活性越高，其基因治疗越有效。另外安全性也是临床临床转化过程中的另一个阻碍，尤其是“脱靶毒性”引起的安全性问题。脱靶毒性是指由于脱靶反应引起的细胞毒性，可以偏离靶点进行基因编辑导致基因突变、染色体缺失、甚至癌变的风险。因此如何降低脱靶毒性也是要解决的关键问题。在临床前可以针对靶点基因筛选出切割效率最高、脱靶效应最低的sgRNA，并且同时也可鉴定出其潜在脱靶位点，进而最大程度保证安全有效性的同时，实时监控潜在脱靶位点是否发生脱靶，为基因编辑临床治疗保驾护航。然而，如何快速、高效、准确的筛选出最优的sgRNA用于基因治疗，这是亟待解决的关键问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有检测sgRNA的在靶活性与脱靶效应的方法复杂，准确性低的问题，提供一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法。

本发明一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法，按以下步骤进行：

一、针对靶基因设计并合成sgRNA文库寡核苷酸片段；

二、PCR扩增sgRNA文库，然后纯化，得到扩增纯化后的sgRNA文库；

三、将扩增纯化后的sgRNA文库克隆到带有SpCas9蛋白表达质粒上，构建CRISPR文库；

四、将CRISPR文库与dsODN标签一起电转入细胞；

五、转染3天后收取细胞提DNA，进行GUIDE-seq建库；

六、进行生物信息学分析，得到每一条sgRNA具体的在靶活性与脱靶情况，即完成在靶活性评估及脱靶检测的方法。

本发明的有益效果为：

1、检测的通量更高：相较于传统的单次反应只能检测一条sgRNA的反应来说，我们的检测通量显著提高，可以同时检测成百上千条sgRNA的切割活性及脱靶效应，明确具体的脱靶位点。极大的缩短了脱靶检测时间，有效减少了不必要的人力物力浪费。

2、基于高通量脱靶检测技术获得靶点安全性及有效性更好：既往的靶点筛选只能通过单条sgRNA进行细胞实验进行筛选，筛选的sgRNA不全面，并且由于目前市面上的脱靶检测服务昂贵，约2万元/sgRNA。如此高昂的成本限制了更多的靶点筛选，因此无法全面的评估靶点的安全性及有效性。基于高通量体内脱靶检测策略筛选出的靶点，相对于体外切割脱靶检测，由于是基于细胞内环境检测，其更加符合临床实际应用场景，更能代表细胞内真实发生的脱靶反应。并且基于高通量脱靶检测，我们可以在众多靶点候选者中挑选出切割效率更高、脱靶更少甚至无脱靶的位点，最大程度的保证了临床转化的安全性及有效性。

3、基于高通量脱靶检测技术获得的CRISPR文库检测结果更加精确，文库大大减小，在保证检测准确性的同时大大减少实验的复杂性。目前的CRISPR文库动辄都是上万条sgRNA，这是由于不知道具体哪条sgRNA是真正发挥作用的，因此只能每个基因设计2-10条sgRNA。但是这些基因中有的是切割效率差，有的是脱靶副反应高，这都会导致检测结果的偏差。并且sgRNA条数越多，需要的实验规模就越大，如从质粒提取到细胞转染，为了保证每条sgRNA都有一定的覆盖丰度，实验规模往往会非常大，整个流程下来周期长，耗费大量的人力物力。最关键的是检测结果由于受表现差的sgRNA的影响，导致检测的准确性降低。因此，通过高通量在靶活性鉴定及脱靶检测的方法，可以在全基因组水平筛选出切割效率最高，脱靶反应最少的sgRNA，一般为每个基因1条sgRNA，在大大减少文库大小的同时，也可以最大程度的保证文库筛选的准确性。

附图说明

图1为本发明高通量体内脱靶检测示意图；

图2为实施例1中的脱靶检测图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法，按以下步骤进行：

一、针对靶基因设计并合成sgRNA文库寡核苷酸片段；

二、PCR扩增sgRNA文库，然后纯化，得到扩增纯化后的sgRNA文库；

三、将扩增纯化后的sgRNA文库克隆到带有SpCas9蛋白表达质粒上，构建CRISPR文库；

四、将CRISPR文库与dsODN标签一起电转入细胞；

五、转染3天后收取细胞提DNA，进行GUIDE-seq建库；

六、进行生物信息学分析，得到每一条sgRNA具体的在靶活性与脱靶情况，即完成在靶活性评估及脱靶检测的方法。

本实施方式的有益效果为：

1、检测的通量更高：相较于传统的单次反应只能检测一条sgRNA的反应来说，我们的检测通量显著提高，可以同时检测成百上千条sgRNA的切割活性及脱靶效应，明确具体的脱靶位点。极大的缩短了脱靶检测时间，有效减少了不必要的人力物力浪费。

2、基于高通量脱靶检测技术获得靶点安全性及有效性更好：既往的靶点筛选只能通过单条sgRNA进行细胞实验进行筛选，筛选的sgRNA不全面，并且由于目前市面上的脱靶检测服务昂贵，约2万元/sgRNA。如此高昂的成本限制了更多的靶点筛选，因此无法全面的评估靶点的安全性及有效性。基于高通量体内脱靶检测策略筛选出的靶点，相对于体外切割脱靶检测，由于是基于细胞内环境检测，其更加符合临床实际应用场景，更能代表细胞内真实发生的脱靶反应。并且基于高通量脱靶检测，我们可以在众多靶点候选者中挑选出切割效率更高、脱靶更少甚至无脱靶的位点，最大程度的保证了临床转化的安全性及有效性。

3、基于高通量脱靶检测技术获得的CRISPR文库检测结果更加精确，文库大大减小，在保证检测准确性的同时大大减少实验的复杂性。目前的CRISPR文库动辄都是上万条sgRNA，这是由于不知道具体哪条sgRNA是真正发挥作用的，因此只能每个基因设计2-10条sgRNA。但是这些基因中有的是切割效率差，有的是脱靶副反应高，这都会导致检测结果的偏差。并且sgRNA条数越多，需要的实验规模就越大，如从质粒提取到细胞转染，为了保证每条sgRNA都有一定的覆盖丰度，实验规模往往会非常大，整个流程下来周期长，耗费大量的人力物力。最关键的是检测结果由于受表现差的sgRNA的影响，导致检测的准确性降低。因此，通过高通量在靶活性鉴定及脱靶检测的方法，可以在全基因组水平筛选出切割效率最高，脱靶反应最少的sgRNA，一般为每个基因1条sgRNA，在大大减少文库大小的同时，也可以最大程度的保证文库筛选的准确性。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中利用CRISPRRGEN软件设计针对靶基因组全长的sgRNA，通过引物或芯片合成的方式合成多条sgRNA。其他与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二中PCR的反应体系及反应程序如下：

反应程序：98℃45s；20cycles of(98℃15s，60℃30s，72℃2min)，72℃2min，4℃；PCR完成后进行PCR产物纯化。其他与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三中构建CRISPR文库的方法为：纯化后的PCR产物与带有SpCas9蛋白的质粒进行组装，组装方法为Gibson同源重组的方法；试剂盒为NEB Gibson assembly master mix，按照如下反应配置：

转化后的产物进行细菌转化，涂板，刮板收菌后进行质粒提取，即为CRISPR文库。其他与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤四中先细胞转染，转染3天后收细胞提取基因组DNA，进行GUIDE-seq建库，建库步骤为：a、超声打断基因组DNA，得到片段化的DNA；b、DNA片段化与末端修复；c、接头连接；d、依次进行GUIDE-Pro PCR 1和GUIDE-Pro PCR 2。其他与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：末端修复反应体系为：

末端修复反应程序为：20℃30min、65℃30min，降至4℃。其他与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：接头连接反应体系：

反应程序为22℃、15min。其他与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：GUIDE-ProPCR 1分为GSP+PCR和GSP-PCR。其他与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：GUIDE-ProPCR 2分为GSP+PCR和GSP-PCR。其他与具体实施方式一至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：dsODN的序列如下：

/5Phos/G*T*TTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGT*A*T；

/5Phos/A*T*ACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAA*A*C。

其他与具体实施方式一至九之一相同。其中/5Phos/代表5’端磷酸化修饰。

为验证本发明的有益效果进行了以下实验：

实施例：以筛选高危型HPV18靶点作为实施例

一.设计并合成HPV sgRNA文库

1.首先利用CRISPR RGEN软件(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计针对HPV18病毒基因组全长(7.8kb)的sgRNA，共230条；

2.通过芯片合成的方式合成sgRNA文库，其中sgRNA上游为60bp的U6启动子序列，下游为60bp的sgRNA骨架序列，用于CRISPR文库构建。sgRNA文库结构序列如序列表SEQ IDNO.1所示。序列表中单下划线的碱基表示为U6启动子，双下划线的碱基表示为上游引物；虚线下划线的碱基表示为sgRNA骨架序列，其中加粗下划线的碱基表示为下游引物；波浪线下划线的碱基表示为sgRNA序列。

二.PCR扩增

1.合成回来的sgRNA文库为单链DNA，需要进一步进行PCR扩增为双链DNA。KAPAHiFi HotStart Ready Mix(KK2602)

sgRNA文库	1μL
		H<sub>2</sub>O	22μL
U6引物(10μM)	1μL
		骨架引物(10μM)	1μL
KAPA HiFi热启动mix(2x)	25μL
		总体积	40μL

反应程序：98℃45s；20cycles of(98℃15s，60℃30s，72℃2min)，72℃2min，4℃

2.PCR完成后利用全式金

快速胶纯化试剂盒进行PCR产物纯化(EG101-01)。

三.CRISPR文库构建

1.纯化后的PCR产物与带有SpCas9蛋白的质粒进行组装，组装方法为Gibson同源重组的方法。试剂盒为NEB Gibson assembly master mix(E2611L)，按照如下反应配置：

sgRNA文库片段	150ng
		质粒模版	50ng
Gibson Assembly Master Mix(2X)	10uL
		无酶水	补齐至20uL
总体积	20uL

本实施例带有SpCas9蛋白的质粒的序列如序列表SEQ ID NO.2所示。序列表中单下划线的碱基表示为U6启动子，双下划线的碱基表示为BamHI位点；虚线下划线的碱基表示为sgRNA骨架；波浪线下划线的碱基表示为SpCas9。

2.转化后的产物进行细菌常规转化，涂板，刮板收菌后用Omega

质粒小提试剂盒(SKU:D6945-01)进行质粒提取，即为CRISPR文库。

四.CRISPR文库电转

1.细胞转染：培养～8×10^6个HEK293细胞，使用LONZA 4D SE Kit DN-100程序进行电转，其中含有9ug的CRISPR文库、1ug HPV18质粒和5uL dsODN；

2.转染3天后收细胞提取基因组DNA，

Genomic DNAKit(全式金；货号：TEE101-01)。

3.进行GUIDE-seq建库，建库步骤如下：

3.1超声打断基因组DNA

3.1.1取1ug基因组DNA，体积用无酶水补足至100uL。设置运行参数，On:30”，OFF:30”，Cycles:3，运行。

3.1.2取1uL样品进行片段检测，完成打断后DNA的平均片段大小为400-700bp。

若偏大，则继续打断

3.1.3 1x磁珠纯化(120uL)，37uL TE buffer(即10mm Tris-HCL，无EDTA)洗脱。

3.2 DNA片段化与末端修复(试剂盒：ABclonal快速DNA建库试剂盒)

3.2.1在无菌PCR管中准备如下反应体系：

末端修复反应体系：

3.2.2使用移液器上下吹打6次，充分混匀，短暂离心；

3.2.3 PCR畅叙如下，PCR仪热盖设置为75℃；末端修复反应程序为：20℃30min、65℃30min，降至4℃。温度降至4℃，立即冰上进行下一步实验。

3.3接头连接

试剂盒：ABclonal快速DNA建库试剂盒

3.3.1准备如下反应体系：

接头连接反应体系：

End Prep Reaction Mix(末端反应混合物)	50uL
		Ligation MM	16.5uL
Ligase Mix	3uL
		Adaptor(A0X)：退火后	2.5uL
总体积	72uL

3.3.2将PCR管放置于PCR仪上，反应程序为22℃、15min，PCR仪不设热盖，之后12℃保存(立即进行下一步)。

3.3.3 0.8x磁珠纯化(120uL)，20uL TE buffer(即10mm Tris-HCL，无EDTA)洗脱。

3.4 PCR1

3.4.1将每个DNA(上步骤得到的DNA)样品分为2份，10uL做GSP+PCR，10uL做GSP-PCR

3.4.2按照如下反应配置GUIDE-Pro PCR 1体系(分为GSP+和GSP-两个反应)

GUIDE-Pro PCR 1 GSP+反应体系：

GUIDE-Pro PCR 1 GSP-反应体系：

无酶水	11.9μL
		Taq酶缓冲液,10X(无MgCl<sub>2</sub>)	3.0μL
dNTP 10mM	0.6μL
		MgCl<sub>2</sub>,50mM	1.2μL
Taq酶	0.3μL
		GSP 1-引物	1.0μL
TMAC(0.5M)	1.5μL
		p5-1引物	0.5μL
DNA样本	10.0μL
		总体积	30.0μL

3.4.3将样品置于PCR仪上，启动PCR程序，如下：

3.4.4 1.2x磁珠纯化(120uL)，20uL TE buffer(即10mm Tris-HCL，无EDTA)洗脱。

3.5 PCR 2

3.5.1按照如下反应配置GUIDE-Pro PCR 2体系(分为GSP+和GSP-两个反应)

GUIDE-Pro PCR 2 GSP+反应体系：

无酶水	5.4μL
		Taq酶缓冲液,10X(无MgCl<sub>2</sub>)	3.0μL
dNTP 10mM	0.6μL
		MgCl<sub>2</sub>,50mM	1.2μL
Taq酶	0.3μL
		GSP 2+引物	1.0μL
TMAC(0.5M)	1.5μL
		p5-2引物	0.5μL
P70N	1.5uL
		DNA样品(上步骤PCR1得到的DNA)	15.0μL
Total	13.5μL

GUIDE-Pro PCR 2 GSP-反应体系：

无酶水	5.4μL
		Taq酶缓冲液,10X(无MgCl<sub>2</sub>)	3.0μL
dNTP 10mM	0.6μL
		MgCl<sub>2</sub>,50mM	1.2μL
Taq酶	0.3μL
		GSP 2+引物	1.0μL
TMAC(0.5M)	1.5μL
		p5-2引物	0.5μL
P70N	1.5uL
		DNA样品(上步骤PCR1得到的DNA)	15.0μL
Total	13.5μL

3.5.2将样品置于PCR仪上，启动PCR程序，如下：

3.5.3 1.2x磁珠纯化(120uL)，20uL TE buffer(即10mm Tris-HCL，无EDTA)洗脱。

3.5.4 Qubit HS测文库浓度

3.6 Illumina Hiseq2500进行二代测序及数据分析

采用高通量在靶活性评估及脱靶检测策略同时检测针对HPV18基因组的230条sgRNA的在靶活性和脱靶效应数据。结果如图2所示，最上面的碱基为靶点序列，最右侧的数字为每个在靶及脱靶位点对应的reads数。reads数越多，代表切割的越多。可以大致分为3类，第一类为切割活性高，脱靶副反应少；第二类为有在靶活性，但是切割活性更高；第三类是完全没有在靶活性，只有脱靶反应。在实际的HPV基因治疗中，主要会选择第一类的切割效果好、脱靶副反应少的sgRNA作为治疗靶点。

序列表

<110> 珠海舒桐医疗科技有限公司

<120>一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法

<160>10

<210> 1

<211> 141

<212> DNA

<213>sgRNA文库结构序列

gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc 60

gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 120

ccgttatcaa cttgaaaaag t 141

<210> 2

<211> 9888

<212> DNA

<213> PX330-U6-sgRNA-SpCas9质粒

tcttctctca tccgccaaaa cagccaagct ggagaccgtt tgacattacc ctgttatccc 60

tagatacatt accctgttat cccagatgac ataccctgtt atccctagat gacattaccc 120

tgttatccca gatgacatta ccctgttatc cctagataca ttaccctgtt atcccagatg 180

acataccctg ttatccctag atgacattac cctgttatcc cagatgacat taccctgtta 240

tccctagata cattaccctg ttatcccaga tgacataccc tgttatccct agatgacatt 300

accctgttat cccagatgac attaccctgt tatccctaga tacattaccc tgttatccca 360

gatgacatac cctgttatcc ctagatgaca ttaccctgtt atcccagatg acattaccct 420

gttatcccta gatacattac cctgttatcc cagatgacat accctgttat ccctagatga 480

cattaccctg ttatcccaga tgacattacc ctgttatccc tagatacatt accctgttat 540

cccagatgac ataccctgtt atccctagat gacattaccc tgttatccca gatgacatta 600

ccctgttatc cctagataca ttaccctgtt atcccagatg acataccctg ttatccctag 660

atgacattac cctgttatcc cagatgacat taccctgtta tccctagata cattaccctg 720

ttatcccaga tgacataccc tgttatccct agatgacatt accctgttat cccagataaa 780

ctcaatgatg atgatgatga tggtcgagac tcagcggccg cggtgccagg gcgtgccctt 840

gggctccccg ggcgcggaat tccgagggcc tatttcccat gattccttca tatttgcata 900

tacgatacaa ggctgttaga gagataattg gaattaattt gactgtaaac acaaagatat 960

tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat 1020

tatgttttaa aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg 1080

ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccgggatccg ttttagagct agaaatagca 1140

agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt 1200

tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgtttttag cgcgtgcgcc 1260

aattctgcag acaaatggct ctagaggtac ccgttacata acttacggta aatggcccgc 1320

tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata gtaacgccaa tagggacttt 1380

ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 1440

gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 1500

ttgtgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 1560

catcgctatt accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc 1620

cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg 1680

ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg 1740

ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt 1800

tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt 1860

cgctgcgacg ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 1920

ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 1980

gctgtaatta gctgagcaag aggtaagggt ttaagggatg gttggttggt ggggtattaa 2040

tgtttaatta cctggagcac ctgcctgaaa tcactttttt tcaggttgga ccggtgccac 2100

catggactat aaggaccacg acggagacta caaggatcat gatattgatt acaaagacga 2160

tgacgataag atggccccaa agaagaagcg gaaggtcggt atccacggag tcccagcagc 2220

cgacaagaag tacagcatcg gcctggacat cggcaccaac tctgtgggct gggccgtgat 2280

caccgacgag tacaaggtgc ccagcaagaa attcaaggtg ctgggcaaca ccgaccggca 2340

cagcatcaag aagaacctga tcggagccct gctgttcgac agcggcgaaa cagccgaggc 2400

cacccggctg aagagaaccg ccagaagaag atacaccaga cggaagaacc ggatctgcta 2460

tctgcaagag atcttcagca acgagatggc caaggtggac gacagcttct tccacagact 2520

ggaagagtcc ttcctggtgg aagaggataa gaagcacgag cggcacccca tcttcggcaa 2580

catcgtggac gaggtggcct accacgagaa gtaccccacc atctaccacc tgagaaagaa 2640

actggtggac agcaccgaca aggccgacct gcggctgatc tatctggccc tggcccacat 2700

gatcaagttc cggggccact tcctgatcga gggcgacctg aaccccgaca acagcgacgt 2760

ggacaagctg ttcatccagc tggtgcagac ctacaaccag ctgttcgagg aaaaccccat 2820

caacgccagc ggcgtggacg ccaaggccat cctgtctgcc agactgagca agagcagacg 2880

gctggaaaat ctgatcgccc agctgcccgg cgagaagaag aatggcctgt tcggaaacct 2940

gattgccctg agcctgggcc tgacccccaa cttcaagagc aacttcgacc tggccgagga 3000

tgccaaactg cagctgagca aggacaccta cgacgacgac ctggacaacc tgctggccca 3060

gatcggcgac cagtacgccg acctgtttct ggccgccaag aacctgtccg acgccatcct 3120

gctgagcgac atcctgagag tgaacaccga gatcaccaag gcccccctga gcgcctctat 3180

gatcaagaga tacgacgagc accaccagga cctgaccctg ctgaaagctc tcgtgcggca 3240

gcagctgcct gagaagtaca aagagatttt cttcgaccag agcaagaacg gctacgccgg 3300

ctacattgac ggcggagcca gccaggaaga gttctacaag ttcatcaagc ccatcctgga 3360

aaagatggac ggcaccgagg aactgctcgt gaagctgaac agagaggacc tgctgcggaa 3420

gcagcggacc ttcgacaacg gcagcatccc ccaccagatc cacctgggag agctgcacgc 3480

cattctgcgg cggcaggaag atttttaccc attcctgaag gacaaccggg aaaagatcga 3540

gaagatcctg accttccgca tcccctacta cgtgggccct ctggccaggg gaaacagcag 3600

attcgcctgg atgaccagaa agagcgagga aaccatcacc ccctggaact tcgaggaagt 3660

ggtggacaag ggcgcttccg cccagagctt catcgagcgg atgaccaact tcgataagaa 3720

cctgcccaac gagaaggtgc tgcccaagca cagcctgctg tacgagtact tcaccgtgta 3780

taacgagctg accaaagtga aatacgtgac cgagggaatg agaaagcccg ccttcctgag 3840

cggcgagcag aaaaaggcca tcgtggacct gctgttcaag accaaccgga aagtgaccgt 3900

gaagcagctg aaagaggact acttcaagaa aatcgagtgc ttcgactccg tggaaatctc 3960

cggcgtggaa gatcggttca acgcctccct gggcacatac cacgatctgc tgaaaattat 4020

caaggacaag gacttcctgg acaatgagga aaacgaggac attctggaag atatcgtgct 4080

gaccctgaca ctgtttgagg acagagagat gatcgaggaa cggctgaaaa cctatgccca 4140

cctgttcgac gacaaagtga tgaagcagct gaagcggcgg agatacaccg gctggggcag 4200

gctgagccgg aagctgatca acggcatccg ggacaagcag tccggcaaga caatcctgga 4260

tttcctgaag tccgacggct tcgccaacag aaacttcatg cagctgatcc acgacgacag 4320

cctgaccttt aaagaggaca tccagaaagc ccaggtgtcc ggccagggcg atagcctgca 4380

cgagcacatt gccaatctgg ccggcagccc cgccattaag aagggcatcc tgcagacagt 4440

gaaggtggtg gacgagctcg tgaaagtgat gggccggcac aagcccgaga acatcgtgat 4500

cgaaatggcc agagagaacc agaccaccca gaagggacag aagaacagcc gcgagagaat 4560

gaagcggatc gaagagggca tcaaagagct gggcagccag atcctgaaag aacaccccgt 4620

ggaaaacacc cagctgcaga acgagaagct gtacctgtac tacctgcaga atgggcggga 4680

tatgtacgtg gaccaggaac tggacatcaa ccggctgtcc gactacgatg tggaccatat 4740

cgtgcctcag agctttctga aggacgactc catcgacaac aaggtgctga ccagaagcga 4800

caagaaccgg ggcaagagcg acaacgtgcc ctccgaagag gtcgtgaaga agatgaagaa 4860

ctactggcgg cagctgctga acgccaagct gattacccag agaaagttcg acaatctgac 4920

caaggccgag agaggcggcc tgagcgaact ggataaggcc ggcttcatca agagacagct 4980

ggtggaaacc cggcagatca caaagcacgt ggcacagatc ctggactccc ggatgaacac 5040

taagtacgac gagaatgaca agctgatccg ggaagtgaaa gtgatcaccc tgaagtccaa 5100

gctggtgtcc gatttccgga aggatttcca gttttacaaa gtgcgcgaga tcaacaacta 5160

ccaccacgcc cacgacgcct acctgaacgc cgtcgtggga accgccctga tcaaaaagta 5220

ccctaagctg gaaagcgagt tcgtgtacgg cgactacaag gtgtacgacg tgcggaagat 5280

gatcgccaag agcgagcagg aaatcggcaa ggctaccgcc aagtacttct tctacagcaa 5340

catcatgaac tttttcaaga ccgagattac cctggccaac ggcgagatcc ggaagcggcc 5400

tctgatcgag acaaacggcg aaaccgggga gatcgtgtgg gataagggcc gggattttgc 5460

caccgtgcgg aaagtgctga gcatgcccca agtgaatatc gtgaaaaaga ccgaggtgca 5520

gacaggcggc ttcagcaaag agtctatcct gcccaagagg aacagcgata agctgatcgc 5580

cagaaagaag gactgggacc ctaagaagta cggcggcttc gacagcccca ccgtggccta 5640

ttctgtgctg gtggtggcca aagtggaaaa gggcaagtcc aagaaactga agagtgtgaa 5700

agagctgctg gggatcacca tcatggaaag aagcagcttc gagaagaatc ccatcgactt 5760

tctggaagcc aagggctaca aagaagtgaa aaaggacctg atcatcaagc tgcctaagta 5820

ctccctgttc gagctggaaa acggccggaa gagaatgctg gcctctgccg gcgaactgca 5880

gaagggaaac gaactggccc tgccctccaa atatgtgaac ttcctgtacc tggccagcca 5940

ctatgagaag ctgaagggct cccccgagga taatgagcag aaacagctgt ttgtggaaca 6000

gcacaagcac tacctggacg agatcatcga gcagatcagc gagttctcca agagagtgat 6060

cctggccgac gctaatctgg acaaagtgct gtccgcctac aacaagcacc gggataagcc 6120

catcagagag caggccgaga atatcatcca cctgtttacc ctgaccaatc tgggagcccc 6180

tgccgccttc aagtactttg acaccaccat cgaccggaag aggtacacca gcaccaaaga 6240

ggtgctggac gccaccctga tccaccagag catcaccggc ctgtacgaga cacggatcga 6300

cctgtctcag ctgggaggcg acaaaaggcc ggcggccacg aaaaaggccg gccaggcaaa 6360

aaagaaaaag taagaattcc tagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc 6420

cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 6480

actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 6540

attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga gaatagcagg 6600

catgctgggg attttttggg gcccgcccca actggggtaa cctttgagtt ctctcagttg 6660

ggggtaatca gcatcatgat gtggtaccac atcatgatgc tgattataag aatgcggccg 6720

ccacactcta gtggatctcg agttaataat tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa 6780

ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca 6840

ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc 6900

cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat 6960

attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgctcgc 7020

cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc 7080

ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg 7140

gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat 7200

gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg tagatgacat ggagatcctg ccccggcact 7260

tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa 7320

ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct cgtcttgcag ttcattcagg 7380

gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac 7440

acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc 7500

acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt caatcatgcg aaacgatcct 7560

catcctgtct cttgatcaga gcttgatccc ctgcgccatc agatccttgg cggcgagaaa 7620

gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag agggcgcccc agctggcaat 7680

tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagct atcgccatgt aagcccactg 7840

caagctacct gctttctctt tgcgcttgcg ttttcccttg tccagatagc ccagtagctg 7900

acattcatcc ggggtcagca ccgtttctgc ggactggctt tctacgtgct cgaggggggc 7960

caaacggtct ccagcttggc tgttttggcg gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga 8020

ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg 8080

tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg 8140

tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag 8200

tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg 8260

acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca 8280

ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa attaagcaga aggccatcct gacggatggc 8340

ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 8400

gctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga 8460

aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac 8520

aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 8580

tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc 8640

gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat 8700

cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag 8760

acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc 8820

cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag 8840

cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac 8980

aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg 8940

gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 9000

atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 9060

tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 9120

gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 9180

agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg 9240

catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact 9300

ccgctatcgc tacgtgactg ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac 9360

gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc 9420

gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagcagatc 9480

aattcgcgcg cgaaggcgaa gcggcatgca taatgtgcct gtcaaatgga cgaagcaggg 9540

attctgcaaa ccctatgcta ctccgtcaag ccgtcaattg tctgattcgt taccaattat 9600

gacaacttga cggctacatc attcactttt tcttcacaac cggcacggaa ctcgctcggg 9660

ctggccccgg tgcatttttt aaatacccgc gagaaataga gttgatcgtc aaaaccaaca 9720

ttgcgaccga cggtggcgat aggcatccgg gtggtgctca aaagcagctt cgcctggctg 9780

atacgttggt cctcgcgcca gcttaagacg ctaatcccta actgctggcg gaaaagatgt 9840

gacagacgcg acggcgacaa gcaaacatgc tgtgcgacgc tggcgat 9888

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> GUIDE-seq dsODN-F的dsODN序列

G*T*TTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGT*A*T 38

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> GUIDE-seq dsODN-R的dsODN序列

A*T*ACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAA*A*C 38

<210>5

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> P5_1

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTA 26

<210>6

<211> 29

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> P5_2

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC 29

<210>7

<211> 48

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> GSP1+

GGATCTCGACGCTCTCCCTGTTTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAAC 48

<210>8

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> GSP1-

GGATCTCGACGCTCTCCCTATACCGTTATTAACATATGACA 41

<210>9

<211> 45

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> GSP2+

CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATACATATGACAACTCAATTAAAC 45

<210>10

<211> 50

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> GSP2-

CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATTTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGTA 50

Claims (10)

1.一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、针对靶基因设计并合成sgRNA文库寡核苷酸片段；

二、PCR扩增sgRNA文库，然后纯化，得到扩增纯化后的sgRNA文库；

三、将扩增纯化后的sgRNA文库克隆到带有SpCas9蛋白表达质粒上，构建CRISPR文库；

四、将CRISPR文库与dsODN标签一起电转入细胞；

五、转染3天后收取细胞提DNA，进行GUIDE-seq建库；

六、进行生物信息学分析，得到每一条sgRNA具体的在靶活性与脱靶情况，即完成在靶活性评估及脱靶检测的方法。

2.根据权利要求1所述的一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法，其特征在于步骤一中利用CRISPR RGEN软件设计针对靶基因组全长的sgRNA，通过引物或芯片合成的方式合成多条sgRNA。

3.根据权利要求1所述的一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法，其特征在于步骤二中PCR的反应体系及反应程序如下：

反应程序：98℃45s；20cycles of(98℃15s，60℃30s，72℃2min)，72℃2min，4℃；PCR完成后进行PCR产物纯化。

4.根据权利要求1所述的一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法，其特征在于步骤三中构建CRISPR文库的方法为：纯化后的PCR产物与带有SpCas9蛋白的质粒进行组装，组装方法为Gibson同源重组的方法；试剂盒为NEB Gibson assemblymaster mix，按照如下反应配置：

转化后的产物进行细菌转化，涂板，刮板收菌后进行质粒提取，即为CRISPR文库。

5.根据权利要求1所述的一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法，其特征在于步骤四中先细胞转染，转染3天后收细胞提取基因组DNA，进行GUIDE-seq建库，建库步骤为：a、超声打断基因组DNA，得到片段化的DNA；b、DNA片段化与末端修复；c、接头连接；d、依次进行GUIDE-Pro PCR 1和GUIDE-Pro PCR 2。

6.根据权利要求5所述的一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法，其特征在于末端修复反应体系为：

末端修复反应程序为：20℃30min、65℃30min，降至4℃。

7.根据权利要求5所述的一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法，其特征在于接头连接反应体系：

反应程序为22℃、15min。

8.根据权利要求5所述的一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法，其特征在于GUIDE-Pro PCR 1分为GSP+PCR和GSP-PCR。

9.根据权利要求5所述的一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法，其特征在于GUIDE-Pro PCR 2分为GSP+PCR和GSP-PCR。

10.根据权利要求1所述的一种准确的可批量进行体内在靶活性评估及脱靶检测的方法，其特征在于dsODN的序列如下：

/5Phos/G*T*TTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGT*A*T；

/5Phos/A*T*ACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAA*A*C。

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