CN111197056A - 棉花基因叠加目标系的建立及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了棉花起始目标系的获得及其应用方法，含有attP、Lox重组位点的起始目标系通过目标载体转化棉花下胚轴，分子分析及BLAST定位分析获得了有利于目的基因叠加的4个棉花起始目标系的基因组位点。本发明公开的4个适合棉花基因定点叠加的基因组位点，有利于将相关功能基因通过位点特异性重组定点叠加在该基因位点处，不仅可以直接减少分离位点的数目，大大降低了将转基因从实验室品系渗入当地大田品种过程中的工作量，而且几乎不影响其他基因的正常表达。

Description

棉花基因叠加目标系的建立及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及棉花起始目标系的建立及其应用。

背景技术

现有技术中，转基因一直通过传统的育种方法导入商业品种。但不同品种间的杂交可导致许多重要的农艺性状基因变成杂合状态。对于育种来说，一个育种品系性状必须要纯合，不仅是转基因性状，也包括与大田优良品种相关的所有其他优良性状。对于二倍体和类似二倍体的异源多倍体植物而言，在没有遗传连锁的情况下，通过分离获得n个独立性状的纯合株系的比例是(1/4)ⁿ。例如，要获得6个优良性状和1个转基因性状的纯合株系的概率为(1/4)⁷，但如果再添加3个转基因位点，那么获得纯合株系的比例为(1/4)¹⁰，需要在超过1,000,000个单株中才有可能筛选到纯合株系。自然地，回交越多，选出只占极少数比例的纯合体就越耗时耗力。对于大量区域性品种的选育及其相应的田间试验而言，增加分离的转基因位点的数量促使转基因作物改良的成本更高，时间更长。

为了保持单个转基因位点，现有技术将新的基因和之前导入的基因体外结合重构进行新一轮转化，再通过筛选单拷贝获得植物株系。如果之前导入性状较少，这种“重头来做”的方式值得考虑。但当商业品种已有许多转基因性状时，每增加一个新的性状，重新进行基因工程和重新释放之前的性状会变得更困难。

通常，避免多个分离位点的问题可通过直接转化优良品种来解决。这可省去育种过程，也可加速新转基因品种的开发。然而，多数商业品种的遗传转化更难转化，需要大量的投入才能获得足够的可大田评估的独立转化事件。更麻烦的是从监管角度而言，即使是同样的DNA的个体转化，不同品种都被认为是不同事件，释放评估要分别进行。而对一个整合事件渗入不同品种情况则被认为是同一个事件。

我们已经报道过一种在植物体内进行基因叠加的方法，该策略可以将一个新的基因定点整合在已有的转基因位点之后(Hou et al.,2014)。该方法可以通过分支杆菌噬菌体Bxb1-att位点特异性整合酶系统将含转基因的质粒定点整合到基因组重组位点，其中，Bxb1(整合酶)重组酶在不含其它蛋白质和高能辅助因子的作用下可以催化48bp的attP位点和38bp的attB位点发生重组，产生attL和attR位点(Ghosh et al.,2003)。Bxb1整合酶介导定点整合后不需要的DNA可以通过来源于大肠杆菌噬菌体P1中的Cre-lox重组系统删除，其中Cre蛋白能够使同向的34bp lox位点间发生重组。原则上，每个整合载体都会带入新的重组位点(attP或attB)用于下一轮整合，因此该叠加系统可无限地进行下去。

为使该基因叠加系统可操作，首先必须要有一个目标植株系(起始系)，该目标系必须含有一个位点，由attP或attB序列组成，从而允许整合酶Bxb1催化位点特异性重组，实现目的基因的定点整合。

为使该基因叠加系统可操作，首先必须要有一个起始目标系。该目标系基因组中必须设置一个重组位点(attP或attB序列)(起始位点)，从而允许通过整合酶Bxb1催化此位点进行特异性重组，实现定点整合。同时，为了适宜于整合基因的表达和后续的育种，这个起始位点需要插入到基因组的适宜位置上：(1)报告基因gfp表达良好；(2)单拷贝；(3)非着丝粒近处；(4)没有插入或靠近已知基因；(5)重组位点完整。在本工作中我们描述了适于籼稻的基因叠加系统的建立。

棉花是我国重要经济作物，基因工程是遗传改良的一个重要途径。然而，其遗传转化是一瓶颈，周期长(平均1年获得转化苗)，效率低(平均～5％)。因此根据现有技术，本发明致力于建立一种适用于目的基因定点整合的棉花起始目标系。

发明内容

本发明的目的在于提供用于目的基因定点整合的棉花起始目标系。

本发明的进一步目的在于提供棉花起始目标系定点整合的方法。

为了在棉花中实现精确、高效的多基因聚合，本发明将重组酶Bxb1和Cre介导的基因定点整合系统应用到在棉花作物中。本发明通过农杆菌转化法将含有attP、lox重组酶位点、筛选标记基因表达盒及报告基因表达盒的目标系载体转入棉花，进行分子分析及基因组插入位点分析，获得4个适于目的基因定点整合的棉花起始目标系；并在两个起始目标系中进行了功能基因定点整合，初步证明该系统在棉花中可行性及有效性。

本发明所采取的技术方案是：

棉花基因组位点在插入棉花叠加载体中的应用，该棉花基因组位点为：

1)棉花基因组Scalfold1148.1的第345,872位碱基和第345,904碱基位之间；

2)棉花染色体8的第75,355,569位碱基和第75,355,618位碱基之间；

3)棉花染色体12的第59,038,164位碱基和第59,038,179位碱基之间；

4)棉花染色体9的第45,024,430位碱基和第45,025,368位碱基之间；基因组信息参考陆地棉TM-1。

一种建立棉花起始目标系的方法，包括以下步骤：

农杆菌介导法转化含有attP、lox重组酶位点，gfp报告基因表达盒，筛选标记基因nptII表达盒以及RS2重组酶位点的目标载体，并获得转基因植株；

检测上述转基因植株T-DNA左右边界完整性，转基因片段在基因组中的插入位点，获得棉花起始目标系；

构建含有attB、lox重组酶位点和目的基因的叠加载体；

将叠加载体和Bxb1重组酶DNA共转化棉花起始目标系胚性愈伤；

获得目的基因定点整合植株。

进一步的，所述attP重组位点为Mycobacterium smegmati噬菌体Bxb1整合酶识别的attP重组位点。

进一步的，所述同向的attP和attB重组位点用于通过Bxb1整合酶将1个或多个目的基因DNA定点整合到棉花基因组目标位点。

进一步的，所述lox重组酶位点能够被来源于bacteriophage P1的Cre重组酶识别。

进一步的，所述RS2重组位点为Acetinetobacter质粒中能被重组酶CinH识别的RS2重组位点。

棉花基因组中适合上述目的基因定点整合的棉花起始目标株系，T-DNA插入基因组的位点包括以下4个：

1)棉花基因组Scalfold1148.1的第345,872位碱基和第345,904碱基位之间；

2)棉花染色体8的第75,355,569位碱基和第75,355,618位碱基之间；

3)棉花染色体12的第59,038,164位碱基和第59,038,179位碱基之间；

4)棉花染色体9的第45,024,430位碱基和第45,025,368位碱基之间；

基因组信息参考陆地棉TM-1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv/？org＝gossypium-hirsutum&group＝malvids)。

本发明的有益效果：

1)棉花遗传转化普遍困难，平均转化率5％左右。本发明将含有attP、lox重组位点的目标载体转化棉花下胚轴，通过分子及BLAST定位分析获得了有利于目的基因定点整合的4个棉花起始目标系(目标位点)。

2)本发明研发棉花体内基因定点整合系统，可显著促进棉花功能基因聚合及缩短棉花转基因商业产品研发和推广时间；本发明公开的4个适合目的基因定点整合的棉花目标位点，有利于将相关功能基因通过位点特异性重组定点整合在该基因位点处，不仅可以直接减少分离位点的数目，大大降低了将转基因从实验室品系渗入当地大田品种过程中的工作量，而且几乎不影响其他基因的正常表达。

3)本发明的4个适合目的基因定点整合的棉花目标位点有3个位于棉花基因组中已知编码基因的上游1kb之外或者下游0.5kb之外，命名为CTS(Cotton target site)1-3，理论上不会导致棉花内源基因功能的丧失；1个目标位点命名为CTS4插入到已知基因编码区，但植株的表型更好(数据未列出)。因此，这有可能是一个有用的可产生有利插入突变的其实目标系。以上4个棉花目标株系都来源于目标载体pZH84(包含两个lox位点)和pZH95(含Cre)共转化。直到T2代，所有目标系植株GFP都表达良好。

附图说明

图1是策略1棉花基因叠加示意图。目标载体pZH83通过农杆菌转化随机插入棉花基因组中，建立棉花目标系(A)；叠加载体pGh10A(B)和Bxb1重组酶载体pYQ78(C)一同轰击入(A)中，bar-DsRed尾端重组位点attB与目标系上的重组位点attP发生重组反应的后预期的结构(D)；(E)为重组酶Cre的作用下同向lox位点间DNA片段发生删除后的结构。重组酶位点如图所示。npt：新霉素磷酸转移酶基因，gfp：增强版的绿色荧光蛋白基因，bar-DsRed：PPT乙酰转移酶基因编码区融合红色荧光报告基因编码区，Vdal黄萎菌(Verticilliumdahlia)分泌蛋白基因；LB和RB分别代表T-DNA的左右边界；启动子与终止子未显示，详见方法；除了npt倒写，基因转录方向均从左到右。

图2是策略2棉花基因叠加示意图。目标载体pZH84与图1中pZH83不同，该载体只有两个反向lox位点，与Cre重组酶共转化可以删除串联多拷贝插入，获得如图A所示单拷贝结构。流程为：pZH84通过农杆菌转化随机插入棉花基因组中，建立棉花目标系(A)；在bar-DsRed尾端带有一个额外lox位点的叠加载体pGh10B(B)和Bxb1重组酶载体pYQ78(C)一同轰击入(A)中，获得bar-DsRed尾端重组位点attB与目标系上的重组位点attP发生重组反应的预期的结构(D)；(E)重组酶Cre的作用删除同向lox位点间的DNA片段的结构。重组酶位点如图所示。npt：新霉素磷酸转移酶基因，gfp：增强版的绿色荧光蛋白基因，bar-DsRed：PPT乙酰转移酶基因编码区融合红色荧光报告基因编码区，Vdal黄萎菌(Verticillium dahlia)分泌蛋白基因；LB和RB分别代表T-DNA的左右边界；启动子与终止子未显示，详见实例；除了npt倒写，基因转录方向均从左到右。图3是棉花目标系结构及其在棉花基因组中的位置。其中(A)和图(B)：目标载体pZH84结构及其获得的插入位点，位点方向表示插入方向；重组酶位点如图所示。左右两端染色体位置由蓝色数字表示，括号中的数字表示染色体中缺失或插入的碱基数，LB和RB表示左和右边界；线上的数字为左右边界到左右RS2的距离，负值表示缺失；图(C)表示棉花基因组图谱中的插入位置，基因组图谱参考NCBI陆地棉TM-1数据库，红色字体表示转化pZH84筛选获得的目标系；BamHI：用于Southern Blot酶切位点，用蓝色线条及带箭头线条表示；线条间数字表示酶切后片段大小；浅灰色:npt探针位置；绿色：gfp探针位置。

图3棉花起始目标系结构示意图和在基因组中位置。(A)和(B)：目标载体pZH84结构及其获得的插入位点，位点方向表示插入方向；重组酶位点如图所示。左右两端染色体位置由蓝色数字表示，括号中的数字表示染色体中缺失或插入的碱基数，LB和RB表示左和右边界；线上的数字为左右边界到左右RS2的距离，负值表示缺失；(C)表示棉花基因组图谱中的插入位置，基因组图谱参考NCBI陆地棉TM-1数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genome/gdv/？org＝gossypium-hirsutum&group＝malvids.)红色字体表示转化pZH84筛选获得的目标系；BamHI：用于Southern Blot酶切位点，用蓝色线条及带箭头线条表示；线条间数字表示酶切后片段大小；蓝色小矩形:npt探针位置；绿色小矩形：gfp探针位置。

图4是Southern blot分析转基因植株T-DNA拷贝数。其中用BamHI酶切基因组DNA以探测左右边界的拷贝数。探针为：(A)npt探针，预期片段大小>3kb；(B)gfp探针，预期片段大小>2.6kb；红色箭头所指为单拷贝插入；红色字母为筛选的目标系；WT：野生型棉花Coker312；M：分子标记。

图5棉花目标系插入位点两侧的DNA序列。染色体的位置数目来自NCBI陆地棉TM-1数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv/？org＝gossypium-hirsutum&group＝malvids)，由于目标载体T-DNA的方向如图3A所示是从左边界到右边界，所以染色体的位置数字有可能增加或减少；序列上的*表示T-DNA整合后基因组缺失的碱基部分；大写粗体表示T-DNA的左边界和右边界；蓝色小写字母表示T-DNA左边界或右边界以内缺失碱基序列；序列下有小黑点的为RS2缺失的序列；全长T-DNA未显示。

图6是来自目标载体pZH84的位点。(A)pZH84的重组位点，位点符号如图所示；基因：npt新霉素磷酸转移酶基因II；gfp增强版的绿色荧光蛋白基因；除了hpt基因倒写，基因转录方向从左到右；(B)和(C)分别为T-DNA左边界或右边界到最内端重组位点lox的碱基序列；大写粗体表示T-DNA左右边界序列；红色小写字母表示RS2位点碱基序列；黑色加粗小写字母表示lox位点；褐色小写字母表示attP位点；虚线表示目标系T-DNA缺失的碱基序列。

图7是目标系定点整合示意图及其PCR分析。棉花起始目标系(A)的重组位点attP与叠加载体pGh10B、pGh2、pGh3或pGh6上的DsRed、bar或hpt尾端的重组位点attB发生重组，产生第一类型结构(C)或目的基因尾端的重组位点attB发生重组产生第二类结构(D)。定点整合由pYQ78载体表达的Bxb1重组酶介导完成。(E)：整合植株的PCR分析。除了GbAt7和GhAt11为抗棉花黄萎病候选基因，其他基因如图1所示；M：分子标记；片段大小用kb表示；+：目标载体与叠加载体的体外重组；-:H2O。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。

实施例1棉花起始目标系(目标位点)的获得

载体构建

目标载体和叠加载体的结构如图1和2所示，其构建参照标准的重组DNA方法。所有PCR反应采用KOD FX高保真聚合酶(TOYOBO，日本)。

目标载体基因的启动子和终止子：

npt的启动子为棉花泛素(Ubiquitin)启动子，终止子为花椰菜病毒(CaMV35s)终止子。绿色荧光报告基因gfp的启动子为甘蔗杆状病毒(ScBV)启动子，终止子为章鱼碱合成酶(ocs)终止子。cre重组酶基因的启动子为CaMV35S启动子，终止子为胭脂碱合酶(nos)终止子。

叠加载体的启动子和终止子：

筛选标记基因bar、bar-DsRed或DsRed-bar的启动子为CaMV 35S，终止子为CaMV35S。GbAt7基因是抗棉花黄萎病(verticillium wilt)候选基因，该基因的启动子为nos，终止子为nos。GhAt11基因也是棉花抗黄萎病候选基因，该基因的启动子为Superpromoter(Boulin T,Bessereau J-L,2007.Mos1-mediated insertional mutagenesis inCaenorhabditis elegans.Nat Protoc2,1276-87.)，简称Super，终止子为ocs。Vdal基因是黄萎菌(Verticillium dahlia)的一种分泌蛋白基因，启动子为鸭拓草黄斑病毒(CoYMV)，终止子为水稻泛素(OsUbi)终止子。筛选标记基因hpt的启动子为CaMV35S，终止子为CaMV35S。

共转化载体中Bxb1重组酶基因的启动子为CaMV35S，终止子为nos。

为了产生基因组上的整合位点，发明人采用了两套不同DNA载体：目标载体pZH83以及目标载体pZH84。

依据策略1目标系载体pZH83构建的环形整合载体。如图1A所示，目标载体pZH83包含一段用于棉花转化的DNA片段，包括筛选基因如用于卡那霉素筛选筛选的新霉素磷酸转移酶II(nptII)，和一个报告基因组成，如用于监测基因表达绿色荧光蛋白基因gfp(增强版)。该DNA片段两侧含有两个同向的lox位点，来源于Cre-lox特异性重组系统。当转化成功并转基因稳定表达后，该系统Cre重组酶可催化两个同向lox位点重组删除npt-gfp DNA片段。在lox-npt-gfp-lox的右侧含有一个来源于Bxb1-att位点特异性重组系统的attP位点。该位点能够与包含attB位点(来源于同一位点特异性重组系统)的环状DNA发生重组。attB位点的另一侧是第三个lox位点，方向与npt-gfp DNA片段两侧的lox位点相反，该位点用于删除后续整合后带进的不需要的DNA。整个DNA片段两侧有两个同向来源于CinH-RS2位点特异性删除系统的RS2位点，该位点在CinH重组酶作用下，可以删除整个转基因片段。最后为便于转化，将包含RS2的整个DNA片段插入的农杆菌双元载体T-DNA左边界(LB)和右边界(RB)之间(图1A)。

依据策略2目标载体pZH84构建相应的叠加载体，如图2B所示的pGh10B。包含一个筛选标记基因，例如bar与的DsRed的融合(既可抗抗生素双丙氨磷又可探测红色DsRed的荧光)。还有一个性状基因，如棉花抗黄萎病基因Vdal。同样，性状基因位于两个同向attB位点间，性状基因个数可以从一个到多个不等。除了一个位于性状基因与筛选标记基因之间的lox位点，第二个lox位点以相反的方向位于筛选标记基因的末端(性状基因的上游)。由pYQ78(图1C)载体表达的Bxb1整合酶将pGh10B(图2B)整合到基因组attP位点。基因组上的attP位点可以与叠加载体pGh10B上的任何的attB位点发生重组，与bar-DsRed末端(Vdal基因上游)的attB位点发生重组是我们所期望的结构(图2D)。该结构将两组同向的lox位点分别置于npt-gfp和bar-DsRed载体骨架两侧。如果随后引入Cre重组酶，它会催化产生图2E的结构，该结构只包含性状基因和周围的几个重组酶位点，而去掉非必要的筛选标记和载体骨架，

农杆菌转化

总共1471个Coker 312棉花下胚轴段(大约1.5cm长)进行农杆菌侵染。一部分为用含有目标系载体pZH83的农杆菌EHA105侵染，另一部分为含pZH84的农杆菌和含pZH95的农杆菌共同侵染。具体转化方法参考Wu等(Wu S-J,Wang H-H,Li F-F,et al.,2008.EnhancedAgrobacterium-mediated transformation of embryogenic calli of upland cottonvia efficient selection and timely subculture of somatic embryos.PlantMolecular Biology Reporter 26,174-85.)对分别所获转基因植株进一步地检测。

GFP荧光观测

通过莱卡倒置荧光显微镜DMI6000B(Leica,Wetzlar,Germany)观察GFP表达情况。GFP观察的激发滤光片的波长范围为440～520nm，屏障滤光片的波长为510nm LP。

T-DNA左右边界PCR分析

对GFP表达的植株用植物基因组提取试剂盒(Magen，中国)进行基因组DNA提取，凝胶电泳检测DNA质量。在标准条件下，PCR条件为1.1x Mix(擎科，中国)的标准条件。

目标系T-DNA左、右边界检测引物：

LB-F:5’CAACTTAATAACACATTGCGGACG3’(SEQ ID NO.1)；

LB-R:5’TCAGGATGATCTGGACGAAGAG3’(SEQ ID NO.2)；

RB-F:5’CGAACTAATAACGCTCACTGAAG3’(SEQ ID NO.3)；

RB-R:5’TCTCTTAGGTTTACCCGCCAAT3’(SEQ ID NO.4)。

Southern blot分析

取30mg基因组DNA用限制性内切酶BamHI酶切过夜，产物于0.8％的琼脂糖凝胶电泳。电泳完成后，使用785真空转膜仪(Bio-Rad,USA)利用10x SSC溶液将DNA转到Hybond-N⁺膜上(GE Healthcare,USA)。³²P-dCTP标记的npt和gfp DNA分别与膜杂交。杂交的方法参照文章Sambrook等(Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T,1989.Molecular cloning alaboratory manual(2nd ed).Cold Spring Harbor,N.Y Cold Spring HarborLaboratory.)。洗膜之后，将膜与磷屏上下叠放，5～12小时后扫描磷屏(Typhoon FLA9500，GE Health，USA)。

探针引物：

NPT-F:5’ATGGGGATTGAACAAGATGGATTGC3’(SEQ ID NO.5)；

NPT-R:5’TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG3’(SEQ ID NO.6)；

GFP-F:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAG3’(SEQ ID NO.7)；

GFP-R:5’TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC3’(SEQ ID NO.8)。

插入位点旁侧序列检测

单拷贝植株进行Inverse-PCR分析，方法参考Boulin和Bessereau(2007)。用限制性内切酶BamHI酶切单拷贝植株基因组DNA，然后用T4连接酶(TaKaRa，日本)连接，将连接产物进行Invers-PCR分析，两轮PCR后的产物经1％琼脂糖凝胶电泳，纯化回收进行测序，左边界测序引物为LSP2，右边界测序引物为RSP2。

左边界旁侧序列检测引物：

LSP1：5’-ATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTG-3’(SEQ ID NO.9)；

BL1-f：5’-GCTGAACACAAGCCTTCTGAGATC-3’(SEQ ID NO.10)；

LSP2：5’-TAGGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATGTG-3’(SEQ ID NO.11)；

BL2-f：5’-CCAGGCTCAAAGCCAAATTAGCTC-3’(SEQ ID NO.12)；

右边界旁侧序列检测引物：

RSP1：5’-CGGCGAACTAATAACGCTCACTGAAG-3’(SEQ ID NO.13)；

BR1-r：5’-GCCACCGGTCTTCAGAACTTCAAG-3’(SEQ ID NO.14)；

RSP2：5’-TAACCGACTTGCTGCCCCGAGAATTATGC-3’(SEQ ID NO.15)；

BR2-r：5’-CCTGGGTTGGCAGATGTTCTGGAC-3’(SEQ ID NO.16)。

棉花目标系插入位点的确定

利用农杆菌介导转化陆地棉Coker 312的下胚轴，将卡那霉素抗性愈伤再生苗进行GFP荧光检测。转化载体pZH83获得10个GFP表达抗性愈伤系(包括27株转基因植株)(表1)。转化载体PZH84获得46个GFP表达抗性愈伤系(125株转基因植株)(表1)。

表1：棉花起始目标系筛选情况

对上述152株转基因植株T-DNA左右边界(L端和R端)的存在进行PCR分析。结果显示4个和31个分别来自pZH83和pZH84的转化株系左右边界存在(表1)。为探测拷贝数，将这些株系的基因组DNA进行Southern blot分析，用BamHI酶切可将转化的T-DNA切成左右边界两个片段(图3A)，用npt做探针，预计的杂交片段大小会大于3.0kb。数据表明从共转pZH84和pZH95来的17个株系都是单拷贝(代表株系如图4A所示)。用gfp做探针,预期杂交片段大于2.6kb。结果显示17个株系12个株系有一条大于2.6kb的杂交片段(图4B，表1)。应用Inverse PCR检测两侧的序列，从而确定插入位点两侧以及重组位点和左/右边界之间的DNA序列。12个株系中10个Inverse-PCR得到成功扩增。将插入位点两侧序列信息与NCBIGenome Data Viewer陆地棉TM-1的数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv/？org＝gossypium-hirsutum&group＝malvids)进行搜索显示其中有3个株系插入到基因组重复序列区，无法确定插入位点；一个株系插入到已知基因编码区域；2个株系插入到已知基因内含子；1个株系插入到已知基因终止密码子TAG后三个碱基处。

因此，余下的3个株系满足了作为棉花目标系的要求：(1)报告基因gfp表达良好；(2)单拷贝；(3)非着丝粒近处；(4)没有插入或靠近已知基因；(5)T-DNA右边界的重组位点RS2、lox和attP位点精确；(6)T-DNA左边界重组位点RS2和lox精确。此外，尽管有一个株系插入到已知基因编码去，但植株的表型更好(数据未列出)。因此，这有可能是一个有用的可产生有利插入突变的目标株系。这4个棉花目标株系都来源于pZH84(包含两个lox位点)和pZH95共转化。直到T2代，所有目标系植株GFP都表达良好。

插入位点分析

用Invers-PCR分析获得的旁侧序列与NCBI中陆地棉TM-1基因组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv/？org＝gossypium-hirsutum&group＝malvids)进行搜索，确定株系在棉花基因组中的插入位点。目标株系中T-DNA序列与目标系载体序列通过在线软件Clustalw2进行相似性比较分析(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)。转基因插入位点图谱的绘制同样参考在线棉花基因组数据库

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv/？org＝gossypium-hirsutum&group＝malvids)。

目标系插入位点

图3A显示如果目标系载体pZH84在棉花基因组中精确插入，其左端有26bp，左边界与RS2之间的间隔序列为66bp，其右边界有26bp，右边界与RS2之间有37bp的间隔序列。图3B所示的目标系在棉花基因组中的插入位置，是通过左右端旁侧DNA序列与棉花基因组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv/？org＝gossypium-hirsutum&group＝malvids)比对确定。详细的DNA序列水平描述见图5和图6。4个目标株系中T-DNA在基因组中的精确定位信息如下，所有的插入位点都是如图3绘出的那样，从T-DNA的左边界到右边界进行描述。

CTS1的目标位点：位于Scaffold 1148.1的345,872和345,904之间，从345,873到345,903的31bp基因组碱基序列缺失(图3B)。在T-DNA的左端，缺失26bp LB和相邻的10bp载体序列。在T-DNA的右端，缺失26bp RB和相邻的19bp载体序列。

CTS2的目标位点：位于第8染色体75,355,569和75,355,618之间，从75,355,570到75,355,617的48bp基因组序列缺失(图3B)。在T-DNA的左端，缺失26bp LB和相邻的42bp载体序列。在T-DNA的右端，缺失26bp RB和相邻的17bp载体序列。

CTS3的目标位点：位于12号染色体59,038,164和59,038,179之间。从59,038,165到59,038,178的14bp基因组序列缺失(图3B)。在T-DNA的左端，缺失26bp LB和相邻的29bp载体序列。在T-DNA的右端，缺失26bp RB和相邻的16bp载体序列。

CTS4的目标位点：位于第9号染色体45,024,430和45,025,368之间。从45,024,431到45,025,367的937bp基因组序列缺失(图3B)。在T-DNA的左端，缺失26bp LB和相邻的34bp载体序列。在T-DNA的右端，缺失26bp RB、相邻的37bp的载体序列和44bp RS2位点序列。

实施例2Bxb1介导棉花起始目标系定点整合

我们在棉花中测试了Bxb1重组酶介导定点整合性。如这些目标系的应用示意图一样，将起始目标系CTS1和CTS4诱导的胚性愈伤为外植体测试目标系定点整合性。叠加载体包含不同棉花抗黄萎病基因性状基因的组合，载体大小从7.6kb到11kb(图7A)不等，叠加载体与Bxb1重组酶表达载体pYQ78共转化目标系胚性愈伤，将性状基因定点整合到基因组attP位点(图7B)，该位点会与叠加载体(图7A)中的两个attB位点中的任一位点发生重组，产生图7C和7D两种性状基因定点整合后结构，结构7C是我们所期望的整合。

基因枪转化

基因枪轰击转化的外植体为棉花目标系下胚轴诱导的胚性愈伤。叠加载体和pYQ78与1.0uM金粉通过3mg/ml鱼精蛋白、2.5MMgCl₂进行包埋，可裂膜压为1100psi，轰击距离为6cm，基因枪型号为PDS-1000/He(Bio-Rad,CA,USA)。胚性愈伤在高渗培养基上预培养4小时后进行轰击。轰击后的愈伤在高渗培养基上继续培养18小时，然后转到筛选培养基进行筛选，一个月为1个筛选周期，3-5轮筛选后获得抗性愈伤，随后进行再生和生根。

DsRed荧光观测

通过莱卡倒置荧光显微镜DMI6000B(Leica,Wetzlar,Germany)观察DsRed表达情况。DsRed观察的激发滤光片的波长范围为525～565nm，屏障滤光片的波长范围为572～648nm。

定点整合结构PCR分析

对DsRed表达或hpt抗性的植株或愈伤组织用植物基因组提取试剂盒(Magen，中国)进行基因组DNA提取，凝胶电泳检测DNA质量。在标准条件下，PCR条件为1.1x Mix(擎科，中国)的标准条件。

叠加载体定点整合检测引物：

(1)定点整合结构a1、a2和a3检测引物

Gh1F:5’CCGACAACCACTACCTGAGCA3’(SEQ ID NO.17)；

Gh1R1:5’ATTTCGAATTCCCGGCTTGT3’(SEQ ID NO.18)；

Gh1R2:5’ACCATTCCCTGTCAAGTAACCAAT3’(SEQ ID NO.19)；

Gh1R3:5’CCAACCAGCTTCTCATACCTTCAG3’(SEQ ID NO.20)；

(2)定点整合结构b1、b2和b3检测引物：

Gh2F1:5’TATGGATGAACGAAATAGAC5’(SEQ ID NO.21)；

Gh2R1:5’GTTATCAGTGGTTTGTCTGG3’(SEQ ID NO.22)；

Gh2F:5’CCACTTCAAGAACTCTGTAGC3’(SEQ ID NO.23)；

Gh2R:5’CGCCCGGGATAACTTCGTATAG3’(SEQ ID NO.24)；

Gh2R3:5’TAATGTAGGAGGACGTGGGTTGAG3’(SEQ ID NO.25)；

(3)叠加载体随机插入检测引物：

Gh2F:5’CCACTTCAAGAACTCTGTAGC3’(SEQ ID NO.26)；

Gh2R1:5’ATTTCGAATTCCCGGCTTGT3’(SEQ ID NO.27)；

Gh1R2:5’ACCATTCCCTGTCAAGTAACCAAT3’(SEQ ID NO.28)。

起始目标系CTS1和CTS4的转基因DsRed表达愈伤与总的轰击愈伤数相比，DsRed阳性愈伤率为5.2％-43.3％(表2和表3)。转化效率差异较大可能是由转化批次不同或叠加载体大小不同造成，也有可能受整合的性状基因影响。这种转化可能包括定点整合或的随机插入或两者都有的情况。通过PCR检测基因组attP位点与叠加载体筛选标记基因尾端attB位点重组后的结构来探测重组与否。分别将叠加载体pGh2、pGh3、pGh10B和pYQ78共转化CTS4胚性愈伤，所获得的转化株系中各测到1个定点整合株系。叠加载体pGh6转化CTS1胚性愈伤，15个转化株系中获得1个定点整合株系。我们也测试了整合结构5D是否发生，均未测到这种结构。这意味着约8％的转化克隆有图7C所示的整合模式。

为表明定点整合事件可恢复获得全植株，我们将目标系CTS4的整合愈伤再生获得了定点整合植株。这表明棉花重组酶介导的基因叠加可行。

表2.棉花起始目标系CTS4定点整合情况

*定点整合检测的是CTS4目标系上attP位点与叠加载体上bar基因末端attB位点的重组。

表3.棉花起始目标系CTS1定点整合情况

*定点整合检测的是CTS4目标系上attP位点与叠加载体上bar基因末端attB位点的重组。

综上所述，本发明公开的4个棉花起始目标系是适于体内目的基因定点叠加的目标位点，有利于将相关功能基因通过位点特异性重组定点整合(叠加)在该基因位点处，不仅可以直接减少分离位点的数目，大大降低了将转基因从实验室品系渗入当地大田品种过程中的工作量，而且几乎不影响其他基因的正常表达。该基因叠加体系可显著促进棉花功能基因聚合及缩短棉花转基因商业产品研发和推广时间。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院华南植物园

<120> 棉花基因叠加目标系的建立及其应用

<130>

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caacttaata acacattgcg gacg 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcaggatgat ctggacgaag ag 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgaactaata acgctcactg aag 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctcttaggt ttacccgcca at 22

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggggattg aacaagatgg attgc 25

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcagaagaac tcgtcaagaa ggcg 24

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggtgagca agggcgag 18

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttacttgtac agctcgtcca tgcc 24

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atcgccttct tgacgagttc ttctg 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gctgaacaca agccttctga gatc 24

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tagggttcct atagggtttc gctcatgtg 29

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccaggctcaa agccaaatta gctc 24

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cggcgaacta ataacgctca ctgaag 26

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gccaccggtc ttcagaactt caag 24

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

taaccgactt gctgccccga gaattatgc 29

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cctgggttgg cagatgttct ggac 24

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ccgacaacca ctacctgagc a 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atttcgaatt cccggcttgt 20

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

accattccct gtcaagtaac caat 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ccaaccagct tctcatacct tcag 24

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tatggatgaa cgaaatagac 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gttatcagtg gtttgtctgg 20

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ccacttcaag aactctgtag c 21

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cgcccgggat aacttcgtat ag 22

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

taatgtagga ggacgtgggt tgag 24

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ccacttcaag aactctgtag c 21

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

atttcgaatt cccggcttgt 20

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

accattccct gtcaagtaac caat 24

Claims (7)

1.棉花基因组位点在插入棉花叠加载体中的应用，其特征在于，该棉花基因组位点为：

1)棉花基因组Scalfold1148.1的第345,872位碱基和第345,904碱基位之间；

2)棉花染色体8的第75,355,569位碱基和第75,355,618位碱基之间；

3)棉花染色体12的第59,038,164位碱基和第59,038,179位碱基之间；

4)棉花染色体9的第45,024,430位碱基和第45,025,368位碱基之间；基因组信息参考陆地棉TM-1。

2.一种建立棉花起始目标系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

农杆菌介导法转化含有重组酶位点attP和lox，gfp报告基因表达盒，筛选标记基因nptII表达盒以及RS2重组酶位点的目标载体，并获得转基因植株；

检测上述转基因植株T-DNA左右边界，转基因片段在基因组中的插入位点，获得用于目的基因叠加的棉花起始目标系；

构建含有attB、lox重组酶位点和目的基因的叠加载体；

将叠加载体和Bxb1重组酶DNA共转化起始目标株系胚性愈伤；

获得目的基因定点整合到起始目标系的植株。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述attP重组位点为Mycobacteriumsmegmati噬菌体Bxb1重组酶识别的attP重组位点。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述attP和attB重组位点能够被Bxb1整合酶识别，将1个或多个目的基因DNA定点整合到棉花基因组。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述lox重组酶位点能够被来源于bacteriophageP1的Cre重组酶识别。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述RS2重组位点为Acetinetobacter质粒中能被重组酶CinH识别的RS2重组位点。

7.棉花基因组中适合上述叠加载体定点整合的棉花起始目标系，其特征在于，所述起始目标系的基因组位点分别是：

1)棉花基因组Scaffold 1148.1的345,872位碱基和345,904位碱基之间；

2)棉花基因组第8染色体的75,355,618位碱基和75,355,569碱基之间；

3)棉花基因组12号染色体的59,038,164位碱基和59,038,179位碱基之间；

4)棉花基因组第9号染色体的45,024,430位碱基和45,025,368位碱基之间；基因组信息参考陆地棉TM-1。

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