CN111118058B - 用于重组酶介导的特异性位点的基因叠加的籼稻目标系 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了适于籼稻的重组酶介导的特异性位点的基因叠加的5个起始目标系，每个起始目标系都具有精确的单拷贝转基因DNA，该DNA不影响内源基因、插入位点离最近的基因编码区至少1kb、远离着丝粒、且其报告基因gfp表达良好。该目标体系含有attP、Lox重组位点，有利于将相关功能基因通过位点特异性重组定点叠加在该基因位点处。因此，可减少分离位点，大大降低转基因从实验品系渗入到当地优良品种的育种工作量，另外，商业产品开发者也可将整合到现有的转基因位点上，从而大大降低释放评估费用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及用于重组酶介导的特异性位点的基因叠加的籼稻目标系。
背景技术
转基因技术，是利用传统的育种方法导入商业品种。但不同品种间的杂交可导致许多重要的农艺性状基因变成杂合状态。对于育种来说，一个育种品系性状必须要纯合，不仅是转基因性状，也包括与大田优良品种相关的所有其他优良性状。对于二倍体和类似二倍体的异源多倍体植物而言，在没有遗传连锁的情况下，通过分离获得n个独立性状的纯合株系的比例是(1/4)n。例如，要获得6个优良性状和1个转基因性状的纯合株系的概率为(1/4)7，但如果再添加3个转基因位点，那么获得纯合株系的比例为(1/4)10，需要在超过1,000,000个单株中才有可能筛选到纯合株系。自然地回交越多，选出只占极少数比例的纯合体就越耗时耗力。对于大量区域性品种的选育及其相应的田间试验而言，增加分离的转基因位点的数量促使转基因作物改良的成本更高，时间更长。
为保持单个转基因位点，一些研究学者将新的基因和之前导入的基因体外聚合(重新构建)进行新一轮转化，再通过筛选单拷贝获得植物株系。如果之前导入性状较少，这种“重头来做”的方式值得考虑。但当商业品种已有许多转基因性状时，每增加一个新的性状，重新进行基因工程和重新释放之前的性状会变得更困难。
通常，避免多个分离位点的问题可通过直接转化优良品种来解决。这可省去育种过程，也可加速新转基因品种的开发。然而，多数商业品种的遗传转化是很困难的，因此为进行大田评估，需要大量的投入才能获得足够数量的独立转化事件)。更麻烦的是从监管角度而言，即使是同样的DNA的个体转化，不同品种都被认为是不同事件，释放评估要分别进行。而对一个整合事件渗入不同品种情况则被认为是同一个事件。
有相关报道，一种在植物体内进行基因叠加的方法，该策略可以将一个新的基因定点整合在已有的转基因位点之后(Hou et al.,2014)。整合系统是来自分支杆菌噬菌体Bxb1-att 位点特异性整合酶系统。其中，Bxb1整合酶(重组酶)在不含其它蛋白质和高能辅助因子的作用下可以催化48bp的attP位点和38bp的attB位点发生重组，产生attL和attR位点(Ghosh P.,Kim Al.,Hatfull G.F.,2003.The Orientation of MycobacteriophageBxb1 integration is solely dependent on the central dinucleotide of attp andattB. Molecular Cell 12,1101-1111)。Bxb1整合酶介导定点整合后不需要的DNA可以通过来源于大肠杆菌噬菌体P1中的Cre-lox重组系统删除(Cre蛋白可使同向的34bp lox位点间发生重组)。原则上，当每个整合质粒带入下轮整合所需整合位点(attP或attB)时，叠加可持续地进行。
为使该基因叠加系统可操作，首先必须要有一个目标植株系(起始系)。该目标系基因组中必须设置一个重组位点(attP或attB序列)(起始位点)，从而允许通过整合酶Bxb1催化此位点进行特异性重组，实现定点整合。同时，为了适宜于整合基因的表达和后续的育种，这个起始位点需要插入到基因组的适宜位置上：(1)报告基因gfp表达良好；(2)单拷贝；(3)非着丝粒近处；(4)没有插入或靠近已知基因；(5)重组位点完整。
籼稻是我国主要粮食作物，其基因育种是重要的遗传改良途径。然而其遗传转化普遍困难，通常转化效率在5％左右。起始目标系在籼稻上的建立为后续的基因育种奠定了一个高效的平台。
根据现有技术，本发明致力于研制一种适用于籼稻基因定点叠加的起始目标系。
发明内容
本发明的目的在于建立适于籼稻基因定点叠加的起始目标系。
本发明所采取的技术方案是：
将含有重组位点的目标载体通过农杆菌转化转入籼稻中，通过对转化植株进行荧光观测、 PCR检测、Southern Blot和Tail-PCR的一系列筛选，获得了5个适于籼稻基因定点叠加的目标系(起始位点)。每个起始目标株系都具有精确的单拷贝转基因DNA，该DNA不影响内源基因、插入位点离最近的基因编码区至少1kb、远离着丝粒、且其报告基因gus表达良好。
本发明第一方面，提供了籼稻基因组位点在构建籼稻基因定点叠加起始目标系中的应用，该籼稻基因组位点为：
1)籼稻12号染色体的长臂第24,920,581和第24,921,595位碱基之间；
2)籼稻11号染色体的短臂第2,871,024和第2,871,043位碱基之间；
3)籼稻12号染色体的短臂第10,433,672和第10,433,683位碱基之间；
4)籼稻2号染色体的短臂第9,598,791和第9,598,830位碱基之间；
5)籼稻2号染色体的长臂第25,994,985和25,995,025位碱基之间；
所述籼稻基因组信息参考水稻基因组数据库os-nipponbare-IRGSP-1。
本发明第二方面，提供了一种建立籼稻起始目标系的方法，包括以下步骤：
农杆菌介导法转化含有重组酶位点attP和lox，gfp报告基因表达盒，筛选标记基因nptII 表达盒以及RS2重组酶位点的目标载体，并获得转基因植株；
检测上述转基因植株T-DNA左右边界，转基因片段在基因组中的插入位点，获得用于目的基因叠加的籼稻起始目标系；
构建含有attB、lox重组酶位点和目的基因的叠加载体；
将叠加载体和Bxb1重组酶DNA共转化起始目标株系胚性愈伤；
获得目的基因定点整合到起始目标系的植株。
进一步的，所述attP重组位点为Mycobacterium smegmati噬菌体Bxb1重组酶识别的attP 重组位点。
进一步的，所述attP和attB重组位点能够被Bxb1整合酶识别，将1个或多个目的基因 DNA定点整合到籼稻基因组。
进一步的，所述lox重组酶位点能够被来源于bacteriophage P1的Cre重组酶识别。
进一步的，所述RS2重组位点为Acetinetobacter质粒中能被重组酶CinH识别的RS2重组位点。
籼稻基因组中适合上述叠加载体定点整合的籼稻起始目标系，所述起始目标系的基因组位点分别是：
1)籼稻12号染色体的长臂第24,920,581和第24,921,595位碱基之间；
2)籼稻11号染色体的短臂第2,871,024和第2,871,043位碱基之间；
3)籼稻12号染色体的短臂第10,433,672和第10,433,683位碱基之间；
4)籼稻2号染色体的短臂第9,598,791和第9,598,830位碱基之间；
5)籼稻2号染色体的长臂第25,994,985和25,995,025位碱基之间；
基因组信息参考水稻基因组数据库os-nipponbare-IRGSP-1
本发明的有益效果：
1)籼稻遗传转化普遍困难，通常转化效率在5％左右。本发明将含有attP、lox重组位点的目标载体转化籼稻幼胚，通过分子及BLAST定位分析获得了有利于目的基因定点整合的5个大豆起始目标系每个起始目标系都具有精确的单拷贝转基因DNA，该DNA不影响内源基因、插入位点离最近的基因编码区至少1kb、远离着丝粒、且其报告基因gfp表达良好。
2)该起始目标系含有attP等重组位点，有利于基因通过位点特异性重组持续地定点叠加在该基因位点处，从而减少分离位点，大大降低转基因从实验品系渗入到当地优良品种的育种工作量，另外，也可整合到现有的转基因位点上，从而大大降低释放评估费用。
附图说明
图1是籼稻目标系结构和在基因组中位置。(A)和(B)：目标载体pZH109结构及其获得的插入位点，位点方向表示插入方向；重组酶位点如图所示。左右两端染色体位置由蓝色数字表示，括号中的数字表示染色体中缺失或插入的碱基数，L和R表示左和右边界；线上的数字为左右边界和左右RS2之间的距离；pZH108的DNA探针和酶切图和pZH109一样；(C)籼稻基因组图谱中的插入位置。黑圆点表示转化pZH109获得的目标系；桔色圆点表示转化pZH108获得的目标系；(D)(E)Southern blot分析中用SacI酶切基因组DNA以hpt 为探针探测到的单个左边界和用SacI酶切基因组DNA以gfp为探针探测到的单个右边界。片段和分子标记大小单位为kb。hpt:潮霉素磷酸转移酶；egfp:增强版的绿色荧光蛋白基因； SacI：用于Southern Blot酶切位点，用蓝色线条及带箭头线条表示；线条间数字表示酶切后片段大小；白色:hpt探针位置；绿色：gfp探针位置。启动子与终止子未显示，详见本发明；除了hpt倒写，基因转录方向均从左到右。
图2和图3是籼稻目标系插入位点侧翼的DNA序列。染色体的位置源于数据库；目标载体T-DNA的方向如图1A所示是从左边界到右边界，所以染色体的位置数字有可能增加或减少；序列上的*表示T-DNA整合后基因组缺失的碱基部分；红色小写字母表示随机插入的不是来源于T-DNA也不是来源于插入位点处的碱基序列；大写粗体表示T-DNA的左边界和右边界；蓝色小写字母表示T-DNA左边界或右边界以内缺失碱基序列；全长T-DNA未显示。
图4是由目标载体pZH109获得的位点。(A)pZH109的重组位点，位点符号如图所示；基因：hpt潮霉素磷酸转移酶基因；gfp增强版的绿色荧光蛋白基因；除了hpt基因倒写，基因转录方向从左到右；(B)和(C)分别为T-DNA左边界或右边界到最内端重组位点lox的碱基序列；大写粗体表示T-DNA左右边界序列；框里的小写意大利斜体字母为重组位点序列，位点名称框上标出。
图5由目标载体pZH108获得的位点。(A)pZH108的重组位点，位点符号如图所示；基因：hpt潮霉素磷酸转移酶基因；gfp增强版的绿色荧光蛋白基因；除了hpt基因倒写，基因转录方向从左到右；(B)和(C)分别为T-DNA左边界或右边界到最内端重组位点lox的碱基序列；大写粗体表示T-DNA左右边界序列；框里的小写意大利斜体字母为重组位点序列，位点名称框上标出。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。
实施例1适合基因叠加的载体
载体pZH109、pZH108和pZH93结构如图1所示，其构建参照标准的DNA重组方法。所有PCR反应采用Phusion高保真聚合酶(北京NEB，美国)。甘蔗杆状病毒(ScBV)启动子和终止子章鱼碱合成酶(ocs)分别控制绿色荧光报告基因gfp的启动和中止。水稻肌动actin 启动子和终止子花椰菜病毒(CaMV35s)分别控制潮霉素基因hpt启动和终止。CaMV 35S启动子和终止子分别控制抗除草基因基因bar的启动和终止。cre重组酶基因的启动子为 CaMV35S启动子，终止子为胭脂碱合酶(nos)终止子。
本申请采用两种策略来获得籼稻叠加起始目标系。
如图1A所示，目标系载体pZH109有用于抗潮霉素地筛选标记基因hpt和增强版用来观测基因表达的的gfp报告基因。该DNA片段两侧有各有一个lox位点且同向。当稳定的整合确认后，lox位点存在可删除hpt-gfp DNA。在此片段外，设置了一个来自Bxb1-att定点重组系统的attP位点，当引入新含有从同一个系统来的attB位点的DNA时，两者即可发生重组。此attP位点的另一边即第三个lox位点，与前两个反向，用来删除整合后不需要的DNA。进一步，在整个片段两端设有两个从CinH-RS2特异性删除系统来的RS2位点。如果想删除这个转基因片段，可引入CinH-RS2重组特异性删除进行。最后将含有上述位点的片段置于农杆菌双元载体左右边界之间以进行转化。
第二种策略的目的为获得更多的单拷贝系(图1B)。与pZH109载体不同的是，gfp表达下游缺少一个lox位点。当与cre载体(pZH93,图1B)共转化时(即引入的Cre重组酶)，因为串联的多拷贝的lox位点方向相同，可删掉多个串联的拷贝，因此会获得更多单拷贝系。
实施例2起始目标系的筛选
方法：
农杆菌介导的转化
约2000个籼稻黄花占或500个籼稻R900的幼胚进行了农杆菌侵染。一部分为用含有目标系载体pZH109的农杆菌EHA105侵染，另一部分为用含pZH108的农杆菌和含pZH93的农杆菌共同转化。具体转化方法参考Hiei Y.and Komari T.2008.Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced frommature seed.Nature Protocol (3)824–834.
GFP观测
通过莱卡倒置荧光显微镜DMI6000B(Leica,Wetzlar,Germany)观察GFP表达情况。所用激发滤光波长范围为440～520nm，屏障滤光波长为510LP。
PCR分析
取约100mg新鲜或冻存的GFP表达的水稻幼嫩叶片用液氮速冻后在2ml离心管中碎至粉末，加入750μl、65℃预热的DNA提取缓冲液((100mM Tris-HCl，pH 8.0,20mM EDTA,500mM NaCl,1.5％SDS),65℃水浴30～60min，其间不时振摇混匀后，加入750μl氯仿、异戊醇、无水乙醇(76:4:20(V/V))混合液，上下颠倒混匀，室温放置几分钟，使其自然分层；在12000rpm，离心10min取上清液约700μl；再加入1/10体积的3M NaAc和6/10 体积的异丙醇，小心混匀，于-20℃30min；然后再12000rpm离心2min，弃上清，加500μl 70％乙醇润洗DNA，12000rpm离心5min，于超净台晾干DNA，溶于100μl水中(1ml ddH2O 加RNAaseA 1μl)若DNA量较多可在65℃溶解；最后凝胶电泳检查DNA质量。
PCR采用的是2x Star Mix(TaKaRa日本)的标准条件。潮霉素基因和左边界检测引物如下：
潮霉素基因检测引物，引物核苷酸序列如下：
hpt F:5’-atgaaaaagcctgaactcaccgcgac-3’(SEQ ID NO.1)；
hpt R:5’-ctatttctttgccctcggacgagtgc-3’(SEQ ID NO.2)；
左边界检测引物
LB F:5’-ggcgcgcccgtaaattataa-3’(SEQ ID NO.3)；
LB R:5’-cttgaccaactctatcagag-3’(SEQ ID NO.4)；
Southern blot分析
取30ug基因组DNA用限制性内切酶SacI酶切过夜，产物于0.8％的琼脂糖凝胶电泳。电泳完成后，使用785真空转膜仪(Bio-Rad,USA)利用10x SSC溶液将DNA转到Hybond-N+膜上(GE Healthcare,USA)。32P-dCTP标记的npt和gfp DNA分别与膜杂交。杂交的方法参照Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning A LaboratoryManual.2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York。洗膜后，将膜与磷屏上下叠放，24至 28小时后扫描磷屏(Typhoon FLA 9500，GE Health，USA)。
插入位点定位分析
将单拷贝植株进行TAIL-PCR分析(Liu,1995)。扩增参数和引物的设计参考(Liu,2007)。将PCR后的产物经1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收后进行测序。
随机引物：
LAD1:5’-acgatggactccagagcggccgc(g/c/a)n(g/c/a)nnnggaa-3’(SEQ IDNO.5)；
LAD2:5’-acgatggactccagagcggccgc(g/c/t)n(g/c/t)nnnggtt-3’(SEQ IDNO.6)；
LAD3:5’-acgatggactccagagcggccgc(g/c/a)(g/c/a)n(g/c/a)nnnccaa-3’(SEQID NO.7)；
LAD4:5’-acgatggactccagagcggccgc(g/c/t)(g/c/t)n(g/c/t)nnncggt-3’(SEQID NO.8)；
AC:5’-acgatggactccagag-3’(SEQ ID NO.9)；
右边界特异引物：
rb-2a:5’-atgagatatgcgagacgcctatgatcgc-3’(SEQ ID NO.10)；
rb-2b:5’-tctccgttcaatttactgattgtaccctac-3’(SEQ ID NO.11)；
rb-1ac:5’-acgatggactccagtccggttgaagttgagtattggccgtc-3’(SEQ ID NO.12)；
rb-1a:5’-tcaaaccttgacagtgacgacaaatcgttg-3‘(SEQ ID NO.13)；
左边界特异引物：
LB2a:5’-gaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcga-3’(SEQ ID NO.14)；
LB2b:5’-ggattcccaatacgaggtcgccaacatc-3’(SEQ ID NO.15)；
LB1ac:5’-acgatggactccagtccggccagataagggaattagggttccta-3’(SEQ IDNO.16)
LB1a:5’-tctaattcctaaaaccaaaatccagtactaaaatccagatc-3’(SEQ ID NO.17)；
LB0a:5’-gtatgctatacgaagttatttaattaacgttactttgg-3’(SEQ ID NO.18)；
结果:
通过对农杆菌介导的籼稻黄花占或R900幼胚转化，获得了抗潮酶素筛选再生植株，随后并进行GFP活性观测。对黄花占(HHZ)的pZH109转化中，共获得2704株GFP阳性植株，但由于每个胚可再生多个植株，因此只有172个独立事件(株系)。
从R900的转化中，获得26个独立株系共293株GFP阳性植株。其中19个株系是从pZH109转化获得。另外7个株系来自于pZH108和pZH93的共转化。如图1B所示，pZH108 与pZH109的不同之处在于只两个lox位点，它们位于hpt-gfp-attP片段的两侧且方向相反。这允许Cre重新组合删除多个串联插入，因为串联插入有同向的lox位点。由pZH93(图1B)产生Cre重组酶与pZH108共转。其目的是通过删除多个串联插入从而获得更多的单拷贝系。本发明没有筛选cre基因，但对有cre基因整合的事件，本发明会在后代中分离出去。
并非所有植株都存活，从HHZ转化中存活了159个株系，R900的转化17株系存活。用PCR方法对存活的植株进行了hpt编码区和T-DNA左边界LB)的检测发现R900的17个株系和HHZ的157个株系为阳性。
为探测拷贝数，对这174个株系的基因组DNA进行了Southern blot分析，SacI酶切将转化的T-DNA切为为左右边界两个片段(图1A)。利用hpt做探针检测左边界片段，其中57个显示了预期大小为>1.9kb的单个杂交带(代表性克隆见图1D)。使用gfp探针对这57个克隆进行检测，发现其中52个显示出预期大小为>5.7kb的单条杂交带(图1E)。利用TAIL-PCR确定插入位点的侧翼DNA以及重组位点与左右边界之间的DNA序列，获得了37个克隆的插入位置，其中17个插入了编码区域。
余下的20个株系中有11个行具有正确的重组位点序列。在这11个株系中，3个接近着丝粒，2个靠近着丝粒(可能影响基因表达)。因此，余下5个性达到了起始目标系的标准(1) 报告基因gfp表达良好；(2)单拷贝；(3)非着丝粒近处；(4)没有插入或靠近已知基因；(5) T-DNA右边界的重组位点RS2、lox和attP位点精确；(6)T-DNA左边界重组位点RS2和lox精确。其中4个(H11,H57,H767,H1672)来自pZH109(有3个lox位点)，1个(R09)来自pZH108(有2个lox位点)和pZH93的共转化。在T2代植株中均继续表达绿色荧光报告基因。
实施例3起始目标系基因组定位图谱
图1C所示的插入位置是通过左右端旁侧DNA序列与水稻基因组数据库(Wang,J.,Kong, L.,Zhao,S.,Zhang,H.,Tang,L.,Li,Z.,Gu,X.,Luo,J.,and Gao,G.2011.Rice-Map:a new-generation rice genome browser.BMC Genomics.12,165)比对确定。详细DNA序列见图4 和图5。每个插入位点重要特征在此列出(插入位点都是如图1A和1B所绘从T-DNA左边界到右边界进行描述)，即本发明五个适合籼稻基因叠加的基因组位点：
目标系H11的目标位点：位于第12染色体长臂24,920,581和24,921,595之间，从24,921,594到24,920，581的21bp基因组序列缺失。在T-DNA的左端，缺失了26bp LB 的前24bp。在T-DNA的右端，缺失19bp载体序列和26bp RB。
目标系H57的目标位点：位于第11染色体短臂2,871,024和2,871,043之间，从 2,871,025到2,871,042的18bp基因组序列缺失。在T-DNA的左端，缺失了26bp LB的前12bp。在T-DNA的右端，缺失34bp载体序列和26bp RB。
目标系H767的目标位点：位于第12染色体短臂10,433,672和10,433,683之间，从10,433,673到10,433,682的10bp基因组序列缺失。在T-DNA的左端，缺失了26bp LB 和8bp载体序列。在T-DNA的右端，缺失16bp载体序列和26bp RB。
目标系H1672的目标位点：位于第02染色体短臂9,598,791和9,598,830之间,从9,598,792到9,598,829的38bp基因组序列缺失。在T-DNA的左端，缺失了26bp LB的前9bp。在T-DNA的右端，缺失16bp载体序列和26bp RB。
目标系R09位点：位于第2染色体长臂25,994,985和25,995,025之间，从 25,994,986到25,995,024的39bp基因组序列缺失。在T-DNA的左端，缺失了26bp LB的前7bp，被替换为7bp随机序列。在T-DNA的右端，缺失18bp载体序列和26bp RB。
总之，在此描述了本发明在籼稻基因组建立的5个目标系和可用于籼稻重组酶介导基因叠加的目标系载体。可通过基因枪的方法(Li,R.,2016.)，将新的DNA定点特异地整合到这些目标系上。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院华南植物园
<120> 用于重组酶介导的特异性位点的基因叠加的籼稻目标系
<130>
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaaaaagc ctgaactcac cgcgac 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctatttcttt gccctcggac gagtgc 26
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggcgcgcccg taaattataa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cttgaccaac tctatcagag 20
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 5
acgatggact ccagagcggc cgcvnvnnng gaa 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 6
acgatggact ccagagcggc cgcbnbnnng gtt 33
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
acgatggact ccagagcggc cgcvvnvnnn ccaa 34
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 8
acgatggact ccagagcggc cgcbbnbnnn cggt 34
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acgatggact ccagag 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atgagatatg cgagacgcct atgatcgc 28
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tctccgttca atttactgat tgtaccctac 30
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acgatggact ccagtccggt tgaagttgag tattggccgt c 41
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tcaaaccttg acagtgacga caaatcgttg 30
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaccaactct atcagagctt ggttgacggc aatttcga 38
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggattcccaa tacgaggtcg ccaacatc 28
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
acgatggact ccagtccggc cagataaggg aattagggtt ccta 44
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tctaattcct aaaaccaaaa tccagtacta aaatccagat c 41
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gtatgctata cgaagttatt taattaacgt tactttgg 38
Claims (1)
1.籼稻基因组位点作为重组酶介导的基因编辑位点在插入籼稻叠加载体中的应用，其特征在于，所述籼稻基因组位点为：
籼稻11号染色体的短臂第2,871,024和第2,871,043位碱基之间；
基因组信息参考水稻基因组数据库os-nipponbare-IRGSP-1；
所述重组酶为Bxb1重组酶。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Publications (2)
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| CN111118058A CN111118058A (zh) | 2020-05-08 |
| CN111118058B true CN111118058B (zh) | 2022-07-22 |
Family
ID=70488542
Family Applications (1)
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| CN202010023631.0A Active CN111118058B (zh) | 2020-01-09 | 2020-01-09 | 用于重组酶介导的特异性位点的基因叠加的籼稻目标系 |
Country Status (1)
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104245939A (zh) * | 2012-01-27 | 2014-12-24 | 先锋国际良种公司 | 产生复合性状基因座的方法和组合物 |
| CN104673824A (zh) * | 2014-12-31 | 2015-06-03 | 中国科学院华南植物园 | 一种适合基因叠加的载体及其应用 |
| CN105112440A (zh) * | 2015-08-13 | 2015-12-02 | 中国科学院华南植物园 | 一种与重组酶介导的体内基因叠加相兼容的体外基因叠加技术及其应用 |
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2020
- 2020-01-09 CN CN202010023631.0A patent/CN111118058B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104245939A (zh) * | 2012-01-27 | 2014-12-24 | 先锋国际良种公司 | 产生复合性状基因座的方法和组合物 |
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| CN105112440A (zh) * | 2015-08-13 | 2015-12-02 | 中国科学院华南植物园 | 一种与重组酶介导的体内基因叠加相兼容的体外基因叠加技术及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| The long road to recombinase-mediated plant;David W. Ow等;《Plant Biotechnology Journal》;20150916;第14卷;441-447页 * |
| 基于位点特异性重组系统的籼稻目标株系的筛选与鉴定;李臻臻;《中国科学院大学论文数据库》;20200109;摘要 * |
| 水稻目标株系的鉴定和转基因的删除;梁海菲;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20200715;1-76页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111118058A (zh) | 2020-05-08 |
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