CN105112440A - 一种与重组酶介导的体内基因叠加相兼容的体外基因叠加技术及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与重组酶介导的体内基因叠加相兼容的体外基因叠加技术及其应用。本发明内容包括体外基因叠加系列载体的元件组成及体外基因叠加方法，该方法首先利用一个非可逆的位点特异性重组系统进行两个DNA分子间的共整合，然后利用一个可逆的位点特异性重组系统将不需要的DNA序列删除，最后利用第二个不可逆的位点特异性系统将体外叠加好的多基因载体转移到适合于农杆菌转化的双元载体中进行植物遗传转化，或者直接通过体内的位点特异性重组将多基因载体定点整合到基因组特定的座位上本发明既满足了体外基因叠加的需要，同时又可与体内重组酶介导的基因叠加系统相兼容。
Description
技术领域
本发明涉及一种适合体外基因叠加的载体及其应用。
背景技术
随着转基因技术的不断发展，含有多个转基因性状的转基因作物已成为未来发展的主流方向。当下，将多个转基因性状叠加到农作物品种中主要有四种方法：1，通过对含有不同转基因性状的的株系进行遗传杂交，从而将多个转基因性状聚合到同一株系中。2，通过对已有的转基因品种进行再转化（re-transformation）而将多个新的转基因性状整合到同一品种中。该方法中新的转基因性状是以随机的方式整合到植物染色体当中。3，通过位点特异性重组或者同源重组将多个转基因性状定点整合到已有的转基因座位上。4，将所有的转基因性状，通过打包的方式（体外基因叠加）以一段DNA的形式重新转化到植物基因组当中。
以上四种方法中，方法1和方法2会随着转基因数目的上升而增多可分离的转基因座位数。可分离的转基因座位的增加会对下游的育种工作带来不便。因为转基因育种过程中，不仅需要获得含有纯合转基因性状的株系，与此同时植物品种本身内在的优良性状也要保持纯合状态。因此对于二倍体植物或者遗传上类似于二倍的的多倍体植物，当含有三个不连锁的转基因性状时，获得纯合个体的概率为()3。若此时增加7个品种本身具有的、内在的优良性状，则获得具有纯合转基因性状和内在优良性状的株系的概率为()10，这需要育种学家在至少大于1000000的后代植株中寻找唯一的一株纯合个体。相比较于方法1和方法2，方法3随着转基因性状的增加，可分离的转基因座位不会增多，因此更受转基因育种者的青睐。在方法4中，若转基因性状全部为新的的基因，则该方法较为理想。若旧的转基因性状已获得监管部门批准，再次将旧的转基因性状与新的转基因性状打包并转化到基因组另外位置上，这虽然降低了可分离的转基因座位，但是之前通过监管部门认证的旧性状很可能会需要再次接受监管部门的重新审查。
将多个基因打包到同一个DNA载体上（体外基因叠加）有很多较为流行的方法：1，通过传统的酶切链接完成。2，运用sequenceandligation-independentcloning(SLIC)。3，运用Gatewaycloning。4，基于Cre-lox重组系统的多基因叠加。
方法1会随着需要操作的DNA片段的增多而难以找到可用的限制性内切酶酶切位点，因此，不适合于多基因的体外叠加。方法2运用的同源重组和DNA单链退火技术。SLIC首先将含有5’同源序列的DNA用DNA外切酶处理，然后不同的DNA片段通过单链退火而形成一个带有缺口的瞬时环形DNA。之后将带有缺口的环形DNA转化到大肠杆菌中。大肠杆菌通过自身的DNA修复机制将瞬时环形DNA的缺口补平，从而完成链接。该方法可以一次链接多个DNA片段。方法3是基于λ位点特异性重组系统。λ位点特异性重组系统有两个序列不同的重组位点attB和attP组成。在λ整合酶（integrase）和整合宿主因子（integrationhostfactor）的作用下，attB和attP之间发生重组，从而生成两个子位点attL和attR。而attL和attR位点在λ整合酶、整合宿主因子和删除酶（excisionase）的作用下重组，形成attB和attP。而Gateway技术运用开发了来源于attB和attP的的突变位点：attB1和attP1，attB2和attP2。不同序号的位点之间不会发生重组反应。因此一段被attB1和attB2夹在中间的DNA可以通过attBxattP重组转移到含有attP1和attP2的载体上，同理，位于attL1和位于attL2之间的DNA可以通过attLxattR重组反应转移到含有attR1和attR2的载体上。然而该方法受限于可用的突变的重组位点的数目。目前只研发出了4对突变的重组位点。方法4运用了Cre-lox位点特异性重组系统。其中Cre是重组酶，lox是它的识别位点。该体外基因叠加方法由一个含有lox位点的，基于可转化人工染色体的双元载体，和两个含有lox位点的供给载体组成。因此位于供给载体内的目的基因可通过Cre-lox重组而共整合到双元在体内，之后不需要的DNA序列可以通过归巢核酸内切酶切除掉。因此两种归巢核酸内切酶I-SceI和PI-SceI就可以满足循环式体外基因叠加。
如背景介绍第二段方法4所述，若体外叠加的基因全部为新基因，则将它们打包在一起转化是一个可取的方案，并且第三段中提到的体外基因叠加方法均可实施。然而，若将含有已通过审查部门认定的旧基因与新基因一起重新体外叠加再转化，则会增加额外的审查费用与时间。理想的方案为：若有旧的转基因性状，无需对其进行更多的修饰，只需将新的转基因进行体外叠加，然后定点整合到旧基因座位上。这样不仅旧转基因性状不需要再次经过审查部门的认证，并且还可以降低可分离的转基因座位。若无旧的转基因性状，则体外叠加的新基因可以直接通过传统方法转化到异源生物基因组中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种体外定点基因叠加系统。
本发明的另一目的在于提供上述基因叠加系统的应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种体外基因叠加系统，该系统含有3个载体，即载体A、B、C；
所述载体A中含有2个不同的不可逆重组位点A1和A2，A1与A2之间为外源目的基因插入区域；不可逆重组位点A1的另一端连有可逆的重组位点A’；
所述载体B中含有3个不可逆重组位点B1、B2和B3，B2、B3之间为外源目的基因插入区域；B2的另一端连有B1，B1的另一端连有可逆的重组位点B’；
所述载体C中含有3个不可逆重组位点C1、C2和C3，C2、C3之间为外源目的基因插入区域；C2的另一端连有C1，C1的另一端连有可逆的重组位点C’；
所述A1、C2和C3为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-1；
所述B2和B3为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-2；
所述A2、B1和C1为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-3；
所述SEQ-1、SEQ-2、SEQ-3的序列均不相同；其中SEQ-1与SEQ-2之间能够发生不可逆的位点特异性重组；
所述A’、B’和C’为相同的可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-4，两两之间均能发生可逆的位点特异性重组；
当B3与A1位点发生不可逆的特异性重组时获得载体AB，即可实现载体A和载体B中的外源目的基因的叠加；同时，载体AB中的可逆重组位点A’和B’能够在对应的重组酶的作用下发生重组，将位点A’和B’之间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得到的载体记为AB-；
当载体AB-中的B2与载体C中的C3位点发生不可逆的特异性重组时获得载体ABC，即可实现载体A、B、C中的外源目的基因的叠加；同时，载体ABC中的可逆重组位点和C’能够在对应的重组酶的作用下发生重组，将2个可逆重组位点间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得到的载体记为ABC-；
再将载体ABC-与带有另一目的基因的载体B进行重组，当载体ABC-的C2与载体B中的B3位点发生不可逆的特异性重组时，即可将这一目的基因再叠加进来；依次类推，若还需叠加其他目的基因，就交叉使用B、C载体携带目的基因，将携带目的基因B或C载体与重组后的载体再进行不可逆的位特异性重组，即可实现体外多基因的叠加。
进一步的，上述体外基因叠加系统还含有载体pZH36D，载体pZH36D为pZH36在体外重组酶Cre的催化作用下，使载体pZH36内同向的lox位点间发生重组，删除同向lox位点间的碱基序列，即可获得载体pZH36D。
进一步的，上述位点A1、C2和C3为phiC31、TP901-1、λ、Bxb1、phiBT1或TG1不可逆重组系统中的其中一个重组位点，位点B2和B3则为能与A1、C2或C3产生不可逆重组的重组位点。
进一步的，上述位点A2、B1和C1为phiC31、TP901-1、λ、Bxb1、phiBT1或TG1不可逆重组系统中的其中一个重组位点。
进一步的，根据位点A2、B1和C1的具体重组位点，载体pZH36D中的Bxb1attP重组位点还可以换成能与A2、B1和C1发生DNA整合的不可逆重组的重组位点。
进一步的，上述载体A中还含有筛选标记基因和复制起始位点。
进一步的，上述载体B、C中均还含筛选标记基因。
一种体外基因叠加系统的应用，所用的系统为上述所述的体外基因叠加系统，具体应用方法包括以下步骤：
1）将需要叠加的基因分别装入载体A、B、C中的外源目的基因插入区域；
2）将带有目的基因的载体A和B在对应重组酶的作用下进行重组反应，将产物转化细菌，筛选出位点B3与位点A1发生重组的产物载体AB，即实现了2个基因的叠加；
3）将载体AB在对应重组酶的作用下使可逆重组位点A’和B’发生切除重组，即将位点A’和B’间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得产物载体记为AB-；
4）将载体AB-与带有目的基因的C载体在对应重组酶的作用下使下进行重组反应，将产物转化细菌，筛选出位点B2与位点C3发生重组的产物载体ABC，即实现了3个基因的叠加；
5）同步骤3）使载体ABC中的2个可逆重组位点发生切除重组，得产物载体ABC-；
6）根据所需叠加基因的数量，交叉循环利用载体B和C依次将每个基因叠加到载体ABC-中，操作方法同上述步骤2）～5）；即可获得含多个目的基因的载体；
7）将上步所得的多基因载体中所含目的基因转入对应宿主体内。
进一步的，上述当步骤7）中所述的宿主为植物时，步骤7）的具体操作为：将体外叠加好的多基因载体转移到适合于农杆菌转化的双元载体中进行植物遗传转化，或者直接通过体内的位点特异性重组将多基因载体定点整合到植物基因组特定的座位上。
进一步的，上述双元载体为pZH36D，体外叠加好的多基因载体与载体pZH36D在对应重组酶的作用下进行重组反应，筛选出载体pZH36D中不可逆重组位点与A2位点发生重组的产物载体，记为pStack；然后利用农杆菌介导转化法将载体pStack中的多个目的基因插入植物基因组中。
本发明的有益效果是：
1）本发明包括进行体外基因叠加系列载体的元件组成及体外基因叠加方法，该方法首先利用一个非可逆的位点特异性重组系统进行两个DNA分子间的共整合，然后利用一个可逆的位点特异性重组系统将不需要的DNA序列删除，最后利用第二个不可逆的位点特异性系统将体外叠加好的多基因载体转移到适合于农杆菌转化的双元载体中进行植物遗传转化，或者直接通过体内的位点特异性重组将多基因载体定点整合到基因组特定的座位上。
2）本发明既满足了体外基因叠加的需要，同时又可与体内重组酶介导的基因叠加系统相兼容。
3）在催化体外重组反应过程中，只需将表达重组酶的大肠杆菌细胞破碎，便可利用大肠杆菌粗提取液催化体外重组反应。该重组酶制备方法快捷，廉价，易于应用。
附图说明
图1为与体内位点特异性重组酶介导的基因叠加相兼容的体外基因叠加。（a）为重组酶介导的体外基因叠加策略：来源于第一个不可逆的位点特异性重组系统的重组酶（该图中示例为phiC31重组酶）体外催化其相应的重组位点attP（分子A中）和attB（分子B中位于luc上游）的重组，生成分子AB；一个来源于可逆的重组系统的重组酶（该图中示例为Cre重组酶）删除位于同向位点(该图中示例为lox)间的不需要的DNA后，得到分子AB-；同理，分子C整合到分子AB-中，得到分子ABC；Cre删除ABC中不需要的DNA得到分子ABC-。接下来的分子D与分子E的叠加过程与B和C的叠加过程类似。分子ABCDE-和分子pZH36D在来源于第二个不可逆重组系统的重组酶（图中示例为Bxb1重组酶）的催化下，相应的attB（分子ABCDE-中bar基因后面）与attP（分子pZH36D，适合于农杆菌介导的遗传转化载体）发生重组，生成载体pStack；（b）pStack的T-DNA通过农杆菌介导的转化方法整合到植物基因组中，筛选标记基因bar和不需要的DNA分子序列可以通过体内的Cre-lox反应删除掉。此时，植物基因组中留下唯一的一个Bxb1的attB位点，该位点可做为目标位点用以定点叠加新得到的外源基因。例如通过体外基因叠加得到含有基因1，2和3的DNA分子。该策略中示例的重组位点及其代表符号位于图例右上角。除草剂抗性基因bar由cauliflowermosaicvirus(CaMV)35SRNA启动子和终止子启动转录的起始及终止；基因gus（分别由commelinayellowmottlevirus启动子和nopalinesynthase(nos)终止子起始和终止转录；基因luc和DsRed拥有同样的启动子和终止子，分别为含有两个增强子的(CaMV)35SRNA启动子和octopinesynthase(ocs)终止子；基因gfp和yfp拥有共同的启动子和终止子，分别为含有两个增强子的sugarcanebacilliformvirus启动子和nos终止子；
图2为第一轮的体外基因叠加图示及分子检测；
图3为第二轮的体外基因叠加图示及分子检测；
图4为第三轮的体外基因叠加图示及分子检测；
图5为第四轮的体外基因叠加图示及分子检测；
图6为将体外叠加获得的大分子DNA通过第二个不可逆的重组系统转移到适合农杆菌转化的双元载体中：分子ABCDE-和分子pZH36D在来源于第二个不可逆重组系统的重组酶（图中示例为Bxb1重组酶）的催化下，相应的attB（分子ABCDE-中bar基因后面）与attP（分子pZH36D）发生重组，生成载体pStack图示及分子检测。
具体实施方式
如图1所示，一种体外基因叠加系统，该系统含有3个载体，即载体A、B、C；
所述载体A中含有2个不同的不可逆重组位点A1和A2，A1与A2之间为外源目的基因插入区域；不可逆重组位点A1的另一端连有可逆的重组位点A’；
所述载体B中含有3个不可逆重组位点B1、B2和B3，B2、B3之间为外源目的基因插入区域；B2的另一端连有B1，B1的另一端连有可逆的重组位点B’；
所述载体C中含有3个不可逆重组位点C1、C2和C3，C2、C3之间为外源目的基因插入区域；C2的另一端连有C1，C1的另一端连有可逆的重组位点C’；
所述A1、C2和C3为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-1；
所述B2和B3为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-2；
所述A2、B1和C1为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-3；
所述SEQ-1、SEQ-2、SEQ-3的序列均不相同；其中SEQ-1与SEQ-2之间能够发生不可逆的位点特异性重组；
所述A’、B’和C’为相同的可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-4，两两之间均能发生可逆的位点特异性重组。
当B3与A1位点发生不可逆的特异性重组时获得载体AB，即可实现载体A和载体B中的外源目的基因的叠加；同时，载体AB中的可逆重组位点A’和B’能够在对应的重组酶的作用下发生重组，将位点A’和B’之间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得到的载体记为AB-；
当载体AB-中的B2与载体C中的C3位点发生不可逆的特异性重组时获得载体ABC，即可实现载体A、B、C中的外源目的基因的叠加；同时，载体ABC中的可逆重组位点和C’能够在对应的重组酶的作用下发生重组，将2个可逆重组位点间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得到的载体记为ABC-；
再将载体ABC-与带有另一目的基因的载体B进行重组，当载体ABC-的C2与载体B中的B3位点发生不可逆的特异性重组时，即可将这一目的基因再叠加进来；依次类推，若还需叠加其他目的基因，就交叉使用B、C载体携带目的基因，将携带目的基因B或C载体与重组后的载体再进行不可逆的位特异性重组，即可实现体外多基因的叠加。
优选的，上述体外基因叠加系统还含有载体pZH36D，载体pZH36D为pZH36在体外重组酶Cre的催化作用下，使载体pZH36内同向的lox位点间发生重组，删除同向lox位点间的碱基序列，即可获得载体pZH36D。
优选的，上述位点A1、C2和C3为phiC31、TP901-1、λ、Bxb1、phiBT1或TG1不可逆重组系统中的其中一个重组位点，位点B2和B3则为能与A1、C2或C3产生不可逆重组的重组位点。
优选的，上述位点A2、B1和C1为phiC31、TP901-1、λ、Bxb1、phiBT1或TG1不可逆重组系统中的其中一个重组位点。
优选的，根据位点A2、B1和C1的具体重组位点，载体pZH36D中的Bxb1attP重组位点还可以换成能与A2、B1和C1发生DNA整合的不可逆重组的重组位点。
优选的，上述载体A中还含有筛选标记基因和源于质粒pBR322的复制起始位点。
优选的，上述筛选标记基因选自氯霉素抗性基因cat、抗除草剂基因bar中的至少一个。
优选的，上述载体B、C中均还含筛选标记基因。
一种体外基因叠加系统的应用，所用的系统为上述所述的体外基因叠加系统，具体应用方法包括以下步骤：
1）将需要叠加的基因分别装入载体A、B、C中的外源目的基因插入区域；
2）将带有目的基因的载体A和B在对应重组酶的作用下进行重组反应，将产物转化细菌，筛选出位点B3与位点A1发生重组的产物载体AB，即实现了2个基因的叠加；
3）将载体AB在对应重组酶的作用下使可逆重组位点A’和B’发生切除重组，即将位点A’和B’间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得产物载体记为AB-；
4）将载体AB-与带有目的基因的C载体在对应重组酶的作用下使下进行重组反应，将产物转化细菌，筛选出位点B2与位点C3发生重组的产物载体ABC，即实现了3个基因的叠加；
5）同步骤3）使载体ABC中的2个可逆重组位点发生切除重组，得产物载体ABC-；
6）根据所需叠加基因的数量，交叉循环利用载体B和C依次将每个基因叠加到载体ABC-中，操作方法同上述步骤2）～5）；即可获得含多个目的基因的载体；
7）将上步所得的多基因载体中所含目的基因转入对应宿主体内。
优选的，当步骤7）中所述的宿主为植物时，步骤7）的具体操作为：将体外叠加好的多基因载体转移到适合于农杆菌转化的双元载体中进行植物遗传转化，或者直接通过体内的位点特异性重组将多基因载体定点整合到植物基因组特定的座位上。
优选的，上述双元载体为pZH36D，体外叠加好的多基因载体与载体pZH36D在对应重组酶的作用下进行重组反应，筛选出载体pZH36D中不可逆重组位点与A2位点发生重组的产物载体，记为pStack；然后利用农杆菌介导转化法将载体pStack中的多个目的基因插入植物基因组中。
下面对结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1体外基因叠加系统
体外基因叠加系统包含有3个基体的载体，即载体A、B、C，其构建过程如下所述。
本实施例载体构建应用常规的重组DNA方法。所有的PCR反应采用高保真PhusionHigh-FidelityDNAPolymerase(NEB北京，中国)。下文中载体pZH36D应用了质粒ColE1的复制起始位点和来源于质粒pVS1的复制起始位点分别在大肠杆菌和农杆菌中起始复制；下文中其余的载体包括分子A、B、C、D、E均用来源于质粒pBR322的复制起始位点起始复制。大肠杆菌DH5α(F - endA1glnV44thi-1recA1relA1gyrA96deoRnupGΦ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169hsdR17(r K - m K + ),λ–)被应用于重组分子的转化及回收。
）载体A的构建
载体A含有2个不同的不可逆重组位点A1和A2，A1与A2之间为外源目的基因插入区域；不可逆重组位点A1的另一端连有可逆的重组位点A’；载体A中还含有筛选标记基因。在本实施例中不可逆重组位点A1为phiC31attP重组位点，不可逆重组位点A2为Bxb1attB重组位点，可逆的重组位点A’为Crelox重组位点，筛选标记基因为氯霉素抗性基因cat和抗除草剂基因bar，插入的目的基因为Gus，如图1（a）所述。
载体A的具体构建过程如下所述：
来源于载体pYWSP3（LiliHou,Yuan-YeuYau,JunjieWei,ZhiguoHan,ZhichengDong,DavidW.OwAnOpen-SourceSystemforInPlantaGeneStackingbyBxb1andCreRecombinases.MolecularPlant,Dec2014）的phiC31attP-loxDNA片段由PCR扩增得到，引物为5’-CCCAAGCTTAAATATGATATCTGGGCCCC-3’（SEQIDNO：1）和5’-AGCTTTGTTTAAACTCGGTGATAACTTCGTATAATGTA-3’（SEQIDNO：2），并通过PmeΙ和HindΙΙΙ限制性酶切位点插入到pC35ScreB（来自Owlab）中，从而获得中间载体pDT01。P 35S (CaMV35Spromoter)-gus-nos3’(nopalinesynthasegeneterminator)DNA片段由PCR从pCAMBIA1301载体中扩增得到,引物为5’-CGAGCTCAGCCTGAATGGCGAATGCTAGA-3’（SEQIDNO：3）和5’-CCCAAGCTTCTCTTAGGTTTACCCGCCAATAT-3’（SEQIDNO：4），并插入到pDT01载体的HindIII和SacΙ位点之间，获得载体pDT02。pDT02中的P 35S 被从载体pYWSP72（Yuan-YeuYau.YuejuWang.JamesG.ThomsonandDavidW.OwMethodforBxb1-mediatedsite-specificintegrationinplanta.MethodsMol.Biol.2011）中通过PCR扩增而得到的竹节花黄斑驳病毒（CommelinaYellowMottleVirus,CoYMV）启动子所取代，从而得到载体pDT03。Cat基因（氯霉素抗性基因）由PCR从载体pACYCDuet-1(NOVAGEN)中扩增得到并插入到载体pYWJTSB2(Yuan-YeuYau.YuejuWang.JamesG.ThomsonandDavidW.OwMethodforBxb1-mediatedsite-specificintegrationinplanta.MethodsMol.Biol.2011)的SpeI和PvuI之间，得到载体pCat。由CaMV35Sterminator-bar-P 35S -P c -gus-nos3’-phiC31attP-lox所组成的DNA片段通过PCR的方法从载体pDT03中扩增得到，引物为5’-ATTTGCGGCCGCGACGCTTAGACAACTTAATAAC-3’（SEQIDNO：5）和5’-GGACTAGTTCGGTGATAACTTCGTATAATGTA-3’（SEQIDNO：6），并插入到载体pCat的NotΙ和SpeΙ之间，得到载体pDT04。然后把一段人工合成的Bxb1attB序列（5’-CCCGGCTTGTCGACGACGGCGGTCTCCGTCGTCAGGATCATCC-3’（SEQIDNO：7））插入到载体pDT04的EcoRI位点上，从而得到pDT05。最后，位于载体pDT05PstI和HindIII之间的lox重组位点被一段人工合成的lox位点所取代（用以改变lox的方向，序列不变），从而得到最终载体A。
）载体B的构建
载体B中含有3个不可逆重组位点B1、B2和B3，B2、B3之间为外源目的基因插入区域；B2的另一端连有B1，B1的另一端连有可逆的重组位点B’；载体B中还含有筛选标记基因。在本实施例中不可逆重组位点B1为Bxb1attB重组位点；B2和B3均为phiC31attB重组位点，二者同向；可逆的重组位点B’为Crelox重组位点，筛选标记基因为氨苄青霉素抗性基因Amp，插入的目的基因为Luc，如图1（a）所述。
载体B的具体构建过程如下所述：
由phiC31attB-lox组成的DNA片段通过PCR从载体pYWJTSB2中扩增得到，引物为5’-CGAGCTCCGGGATCCATGGACCAGATGGGTGAGGTG-3’（SEQIDNO：8）和5’-GGACTAGTAGTGTCGTGCTCCACCATGGT-3’（SEQIDNO：9），并通过TA连接插入到pMD18中，得到分子phiBB’-lox-T。一段人工合成的Bxb1attB序列被插入到位于phiC31attB和lox之间的SacII位点之间得到分子phiBB’-Bxb1BB’-lox-T。分子phiBB’-Bxb1BB’-lox-T中的phiC31attB-Bxb1attB-lox序列由SpeI和SacI酶切得到，并连接到载体pYWJTSB2的骨架（骨架也用SpeI和SacI双酶切）中，得到分子pDD01。由phiC31attB-Pd35S(CaMVpromoterwithduplicatedenhancer)-luc(fireflyluciferase)-ocs3’(octopinesynthaseterminator)组成的DNA序列由PCR的方法获得，并分两部分克隆到pDD01中得到分子pDD03。第一部分由引物5’-CGAGCTCGGGGTACCAAGCTTTCCATGGAAGACGC-3’（SEQIDNO：10）和5’-CGGGATCCTGAATGGTGCCCGTAACTTT-3’（SEQIDNO：11）PCR扩增得到，并通过SacI和BamHΙ位点克隆到pDD01中，获得载体pDD02。第二部分由引物5’-CGAGCGTGTCCTCTCCAAAT-3’（SEQIDNO：12）和5’-CGAGCTCCATCATGATGGACCAGATGG-3’（SEQIDNO：13）PCR扩增得到，并通过SacI和HindIIΙ位点克隆到pDD0中，获得pDD03。
然而，测序发现在P35S上游多了一phiC31attP位点，因此该位点通过NotI和PacI双酶切去掉并将粘性末端DNA用DNA聚合酶I大片段抹平，并进行平末端链接，进而得到分子pDD04。pDD04中的lox位点最后由一个人工合成的lox位点取代，用以改变其方向（序列不变），最终得到分子B。
）分子C的构建
载体C中含有3个不可逆重组位点C1、C2和C3，C2、C3之间为外源目的基因插入区域；C2的另一端连有C1，C1的另一端连有可逆的重组位点C’；载体C中还含有筛选标记基因。在本实施例中不可逆重组位点C1为Bxb1attB重组位点；C2和C3均为phiC31attP重组位点，二者同向；可逆的重组位点C’为Crelox重组位点，筛选标记基因为氨苄青霉素抗性基因Amp，插入的目的基因为GFP，如图1（a）所述。
载体C的具体构建过程如下所述：
由phiC31attP-lox组成的DNA片段通过PCR从载体pYWSP3中扩增得到，引物为5’-CGAGCTCCCCGGAATTCAAATATGATATCTGGGCCCC-3’（SEQIDNO：14）和5’-GGACTAGTTCGGTGATAACTTCGTATAATGTA-3’（SEQIDNO：15），并通过TA连接插入到pMD18中，得到分子phiPP’-lox-T；再将一段人工合成的Bxb1attB序列被插入到位于phiC31attP和lox之间的PstI位点之间得到分子phiPP’-Bxb1BB’-lox-T。分子phiPP’-Bxb1BB’-lox-T中的phiC31attP-Bxb1attB-lox序列由SpeI和SacI酶切得到，并连接到载体pYWJTSB2的骨架中，得到分子pDD05。由phiC31attP-sugarcaneBacilliformviruspromoter(P s )-greenfluorescentprotein(gfp)-nosterminator组成的DNA序列由PCR的方法从载体pYWSP3上扩增获得，引物为5’-CGAGCTCCCCTTGTGTCATGTCGGCGAC-3’（SEQIDNO：16）和5’-CGGAATTCACCCATGAGAGCCCTGGTAGTC-3’（SEQIDNO：17），并连接到pDD05的SacI和EcoRI中得到分子pDD06。pDD06中的Bxb1attB-lox序列被一段人工合成的Bxb1-AscI-lox序列所取代，该过程目的为改变原有lox位点的方向，从而得到分子C。
）载体D和E的构建
根据需要叠加基因的数目，再将其他需叠加的基因分别装入载体B或C中。在本实施例中，还需要将基因DsRed、YFP和上述GUS、LUC、GFP叠加在一起，故继续构建了载体D和E。其中载体D中除了插入的目的基因为DsRed非LUC外，其他结构均与载体B相同；载体E中除了插入的目的基因为YFP非GFP外，其他结构均与载体C相同。
载体D和E的具体构建过程如下所述：
将分子B中的HindIII-luc-XbaI片段用来源于pBluKSP中的HindIII-DsRed-nosterminator-XbaI（来自Owlab）取代，从而得到分子D。
将分子C中的gfp碱基序列更换成yfp碱基序列，即可得到分子E。
）分子pZH36D的构建
pZH36D是将质粒pZH36（见专利文件CN104673824A）在体外重组酶Cre的催化作用下，使载体pZH36内同向的lox位点间发生重组，即可获得质粒pZH36D。
）重组酶表达载体的构建
通过把重组酶phiC31，Bxb1和Cre的编码基因分别克隆到表达载体pET28b中而获得三种重组酶原核表达载体。
实施例2重组酶粗提取液的制备及体外重组反应的条件
一、重组酶粗提取液制备
大肠杆菌BL21(Studier,F.W.andMoffatt,B.A.(1986)Useofbacteriophage-T7RNA-polymerasetodirectselectivehigh-levelexpressionofclonedgenes.J.Mol.Biol. 189,113-130)被选取为重组酶原核表达宿主。含有重组酶（phiC31，Bxb1或Cre）表达载体的大肠杆菌BL21首先在37摄氏度培养过夜，然后按1:100的比例稀释到含有50μg/ml卡那霉素的50ml新鲜BL培养基中，进而在15摄氏度培养至OD600达到0.3~0.4之间。然后向菌液中加入IPTG(isopropylthiogalactopyranoside)至终浓度为0.1mM。继续在15摄氏度培养菌液20小时后通过离心（4000转每分钟，30分钟）收集菌体。将菌体悬浮于10ml预冷的PBS（137mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNaH2PO4,2mMKH2PO4,pH7.50）溶液中，并置其于冰水混合物中超声破碎。在4摄氏度将裂解液于12000转离心30分钟，收集上清，即为重组酶提取物。并用该重组酶提取物催化相应的体外重组。
二、体外重组
体外重组均于50微升体系中进行。该体系包含R缓冲液（20mMHCl,pH7.5,30mMNaCl,10mMEDTA,10mMspermidine,10mMDTT,0.1mg/mlBSA）、约1微克底物DNA和15微升的重组酶提取物。将共整合反应体系置于30摄氏度孵育30分钟，删除反应体系置于37摄氏度反应30分总。反应结束后将反应体系置于75摄氏度加热10分钟以使重组酶失去活力。用TIANGENUniversalDNAPurificationKit试剂盒回收DNA并转化到大肠杆菌DH5α内。用合适的抗生素进行筛选，其浓度分别为氯霉素：34μg/ml，卡那霉素：50μg/ml，氨苄青霉素：100μg/ml。
实施例3体外基因叠加系统的应用
本实例以体外叠加5个外源目的基因（DsRed、YFP、GUS、LUC、GFP）并将其转入植物体内为例，应用实施例1所述叠加系统进行基因叠加，具体操作过程如下所述。
一、第一轮体外基因叠加
如图1和图2a所示，首先用phiC31重组酶提取液催化分子A和B间的重组（重组产物有AB和AB’两种），然后回收重组DNA并转化到大肠杆菌DH5α内。在含有氯霉素和氨苄青霉素的固体LB培养基上进行筛选。在20个既抗氯霉素又抗氨苄青霉素的克隆中，引物b+d和a+c检测到4个与分子AB构形一致，引物b+d2和a2+c检测到了2个与分子AB’构形一致（图2b）。然而另外2个克隆引物a+c和b+d2可以扩增到产物，但是引物b+d和a2+c没有扩增到产物（图2b，泳道X）。HindIII酶切检测进一步验证了PCR的结果：在HindIII酶切下，分子A应当出现0.9,2.5和5.0kb的片段；分子B会被切割成6.8kb的线性DNA；分子AB会产生0.9、1.5、2.5和10.2kb的片段；分子AB’则会产生0.9、2.5、4.5和7.2kb的片段（图2a）。事实证明4个假定的AB克隆和2个假定的AB’克隆在HindIII酶切下产生了预期的酶切样式（图2c）。
将上述得到的分子AB与Cre重组酶共同孵育后产物DNA转化到大肠杆菌中，在挑取的36个氯霉素抗性克隆中，8个对氨苄青霉素敏感。引物y+z对这8个克隆中扩增到了1.0kb的产物（图2d和e）。内切酶PvuI酶切检测也再次验证了PCR筛选的准确性：因为在PvuI酶切后，分子AB产生了0.9、3.0、4.4和6.7kb的DNA片段，而分子AB-只产生了5.4和6.7kb的DNA片段（图2f）。
二、第二轮体外基因叠加
如图3a所示，用phiC31催化AB-分子与C分子重组（重组产物有ABC和ABC’两种），转化大肠杆菌后挑取20个抗氯霉素和氨苄青霉素的克隆。其中引物e+h和g+f在5个克隆中检测了扩增产物（图3b），从而初步证明该5个克隆为ABC分子；引物g2+f和e+h2在另外5个克隆中检测到了扩增产物（图3b），从而初步证明这5个为ABC’分子。SphI酶切检测进一步验证了PCR的准确性分子ABC产生了2.5、7.1和8.7kb的片段；分子ABC’产生了5.5、5.7和7.1kb的片段（图3c）。
将上述得到的ABC分子与Cre重组酶孵育后，回收产物DNA并将其转化大肠杆菌，选取36个具有氯霉素抗性的单克隆，其中2个是氨苄青霉素敏感的克隆。对这两个克隆进行PCR验证发现：引物x+z成功扩增到了1.4kb的产物（图3d，e），由此初步证明这两个克隆为ABC-分子。NcoI酶切进一步证明这两个克隆确为ABC-分子（图3f）。
三、第三轮体外基因叠加
如图4a所示，分子ABC-与分子D重组后转化大肠杆菌。在选取的20个抗氯霉素和氨苄青霉素单克隆中，引物a+c和i+j扩增到了PCR产物，由此初步证明这两个克隆可能为ABCD分子（图4a，b）。另外两个克隆虽然引物a+c扩增呈阳性，但是引物i+j扩增为阴性（图4b中泳道X，图4a）。当用SalI酶切检测发现酶切图谱与预测的相同（图4c）。
ABCD-分子与Cre重组酶大肠杆菌粗体液混合孵育后，将获得的重组DNA转化大肠杆菌，选取36个氯霉素抗性克隆，其中4个克隆为氨苄青霉素敏感克隆。引物w+z在这4个克隆中成功扩增到了1.0kb的DNA片段（图4a和d）。并且SalI酶切检测也进一步验证了重组的精确性（图4e）。
四、第四轮体外基因叠加
与上述操作方法相同，如图5a所示，ABCD-分子与E重组生成ABCDE分子。将重组产物转化大肠杆菌，引物p+h和g+f可以在9/20的克隆可以扩增到目的片段（图5b）。SalI酶切检测再次验证了PCR阳性克隆确为ABCDE分子(图5c)。
Cre重组酶催化ABCDE分子内同方向lox位点重组，在重组产物转化的大肠杆菌中选取了36个氯霉素抗性克隆，其中3个为氨苄青霉素敏感克隆。其中2个克隆可以由引物x+z扩增到1.4kb的目的条带（图5a和d）。用SalI酶切检测2个PCR阳性克隆确实发现了1.3、3.5、4.8和11.8kb的条带，从而进一步证明了这两个克隆确实为ABCDE-分子（图5e）。
五、将叠加好的目的基因插入到植物基因组中
将上述载体ABCDE-中的目的基因转移到适合于农杆菌转化的双元载体中进行植物遗传转化，或者直接通过体内的位点特异性重组将多基因载体定点整合到植物基因组特定的座位上。
其中将目的基因转移到适合于农杆菌转化的双元载体中进行植物遗传转化的方法可以选择以下的操作：
1）如图6a所示，将载体ABCDE-与pZH36D分子、Bxb1重组酶混合后于30℃孵育30分钟，将重组产物转化到大肠杆菌中，并在含有卡那霉素和氯霉素的LB固体培养基中筛选。挑取20个单克隆，引物o+r和q+p1在5个克隆中都扩增到了PCR产物（图6b），证明这5个克隆为pStack分子，即载体pZH36D中的重组位点Bxb1attP与载体ABCDE-中的Bxb1attB发生了正确的重组。SphI酶切检测进一步验证了PCR的结果：SphI酶切重组产物后得到了0.3、1.7、2.5、5.6、6.3和12.1kb的DNA片段（图6c）。
2）利用农杆菌介导转化法将载体pStack中的目的基因插入到植物基因组中。
上述提到的引物序列为(5’-3’)：
a：CAATGATTACGAATTTGGCCA（SEQIDNO：18），
a2：CCGAGCGGCGAACTAATAACG（SEQIDNO：19），
b：TTGGCGGTAACAAGAAAGG（SEQIDNO：20），
c：CGCTTATGTCTATTGCTGGTTT（SEQIDNO：21），
d：GAATACCCGATTCTGCTCTG（SEQIDNO：22），
d2：GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAA（SEQIDNO：23），
e：CACCGAGCGGCGAACTAA（SEQIDNO：24），
f:GGTTCAGGGCAGGGTCGTTA（SEQIDNO：25），
g:CCCCAGGCTTTACACTTTATG（SEQIDNO：26），
g2：CACCGAGCGGCGAACTAA（SEQIDNO：27），
h:AAGCGTTCTCACCATTGTCTTG（SEQIDNO：28），
h2：GCAAGGCGATTAAGTTGGGT（SEQIDNO：29），
i：TGCTGGAGTTCGTGACCG（SEQIDNO：30），
j：TGCTGCTCTTGCCTCTGTAAT（SEQIDNO：31），
p:CCGCCACCACCTGTTCCT（SEQIDNO：32），
w：CCGATGATAAGCTGCCAAAC（SEQIDNO：33），
x：GACAAGCAGAAGAACGGCATCA（SEQIDNO：34），
y：GAGCACGGAAAGACGATGAC（SEQIDNO：35），
z：GGTGCTACGCCTGAATAAGTGA（SEQIDNO：36），
o:ACTGATGGGCTGCCTGTA（SEQIDNO：37），
r:CCAGCCAGTCATACAACC（SEQIDNO：38），
q:CTCTAGCCAATACGCAAAC（SEQIDNO：39），
p1:TAGCATTCGCCATTCAGG（SEQIDNO：40）。
实施例4体外基因叠加转基因在拟南芥中的表达
按照实施例3中所述的方法将体外叠加的目的基因通过农杆菌介导的方法转化到拟南芥基因组中。体外叠加载体转化拟南芥后，通过除草剂抗性筛选到50株转基因植株。其中43株中通过PCR扩增了到bar基因。我们通过半定量反转录PCR检验了其中21株转基因植株中转基因的表达。由于gfp和yfp在序列上有超过90%的同源性，我们通过PstI酶切定量反转录PCR产物来区分gfp和yfp的mRNA。半定量反转录PCR显示21株转基因植株中，一株没有表达yfp，另外一株没有表达gfp和DsRed，有四株没有表达gfp和yfp，还有一株没有表达gfp、yfp和DsRed。综上所述：14/21株检测的转基因植株表达了所有的体外叠加基因。另外，19/21株检测的植株中均通过PCR的方法扩增到了yfp下游的Bxb1attB位点。选取2个有代表性的PCR产物测序证明其含有完整的Bxb1attB位点。该位点的存在为之后通过运用含有Bxb1attP载体进行植物体内基因叠加奠定了基础。
实施例5体外基因叠加载体定点叠加到含有目标位点的转基因水稻中
将ABCDE-分子与一个表达Bxb1重组酶的载体通过基因枪的方法共转含有目标位点的转基因水稻愈伤组织（该水稻株系的基因组中含有Bxb1attP重组位点）。通过抗除草剂抗性筛选转化后的愈伤组织。在81个愈伤组织中，用引物wq2f+wq2r和wq3f+wq3r在其中30个愈伤组织中扩增到了至少一个目的DNA片段。该实验证明了体外基因叠加大分子DNA可以通过重组酶介导的体内基因叠加方法定点叠加到含有目标位点的转基因水稻中。
上述提到的引物序列为：
wq2f:5’-TCTAGGGTTCACAAGTCTGCCTAT-3’（SEQIDNO：41）,
wq2r:5’-GCTCGAATGTAACTGTGATTCCAA-3’（SEQIDNO：42）,
wq3f:5’-GTGCTCCACCATGTTATCACATC-3’（SEQIDNO：43）,
wq3r:5’-TTCAGGCTGCGCAACTGTTG-3’（SEQIDNO：44）。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>中国科学院华南植物园
<120>一种与重组酶介导的体内基因叠加相兼容的体外基因叠加技术及其应用
<130>
<160>44
<170>PatentInversion3.5
<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
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<400>44
ttcaggctgcgcaactgttg20
Claims (10)
1.一种体外基因叠加系统，其特征在于：该系统含有3个载体，即载体A、B、C；
所述载体A中含有2个不同的不可逆重组位点A1和A2，A1与A2之间为外源目的基因插入区域；不可逆重组位点A1的另一端连有可逆的重组位点A’；
所述载体B中含有3个不可逆重组位点B1、B2和B3，B2、B3之间为外源目的基因插入区域；B2的另一端连有B1，B1的另一端连有可逆的重组位点B’；
所述载体C中含有3个不可逆重组位点C1、C2和C3，C2、C3之间为外源目的基因插入区域；C2的另一端连有C1，C1的另一端连有可逆的重组位点C’；
所述A1、C2和C3为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-1；
所述B2和B3为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-2；
所述A2、B1和C1为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-3；
所述SEQ-1、SEQ-2、SEQ-3的序列均不相同；其中SEQ-1与SEQ-2之间能够发生不可逆的位点特异性重组；
所述A’、B’和C’为相同的可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ-4，两两之间均能发生可逆的位点特异性重组；
当B3与A1位点发生不可逆的特异性重组时获得载体AB，即可实现载体A和载体B中的外源目的基因的叠加；同时，载体AB中的可逆重组位点A’和B’能够在对应的重组酶的作用下发生重组，将位点A’和B’之间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得到的载体记为AB-；
当载体AB-中的B2与载体C中的C3位点发生不可逆的特异性重组时获得载体ABC，即可实现载体A、B、C中的外源目的基因的叠加；同时，载体ABC中的可逆重组位点和C’能够在对应的重组酶的作用下发生重组，将2个可逆重组位点间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得到的载体记为ABC-；
再将载体ABC-与带有另一目的基因的载体B进行重组，当载体ABC-的C2与载体B中的B3位点发生不可逆的特异性重组时，即可将这一目的基因再叠加进来；依次类推，若还需叠加其他目的基因，就交叉使用B、C载体携带目的基因，将携带目的基因B或C载体与重组后的载体再进行不可逆的位特异性重组，即可实现体外多基因的叠加。
2.根据权利要求1所述的一种体外基因叠加系统，其特征在于：该系统还含有载体pZH36D，载体pZH36D为pZH36在体外重组酶Cre的催化作用下，使载体pZH36内同向的lox位点间发生重组，删除同向lox位点间的碱基序列，即可获得载体pZH36D。
3.根据权利要求1所述的一种体外基因叠加系统，其特征在于：所述位点A1、C2和C3为phiC31、TP901-1、λ、Bxb1、phiBT1或TG1不可逆重组系统中的其中一个重组位点，位点B2和B3则为能与A1、C2或C3产生不可逆重组的重组位点。
4.根据权利要求1所述的一种体外定点基因叠加系统，其特征在于：所述位点A2、B1和C1为phiC31、TP901-1、λ、Bxb1、phiBT1或TG1不可逆重组系统中的其中一个重组位点。
5.根据权利要求2或4所述的一种体外基因叠加系统，其特征在于：根据位点A2、B1和C1的具体重组位点，载体pZH36D中的Bxb1attP重组位点还可以换成能与A2、B1和C1发生DNA整合的不可逆重组的重组位点。
6.根据权利要求1所述的一种体外定点基因叠加系统，其特征在于：所述载体A中还含有筛选标记基因和复制起始位点。
7.根据权利要求1所述的一种体外基因叠加系统，其特征在于：所述载体B、C中均还含筛选标记基因。
8.一种体外基因叠加系统的应用，其特征在于：所用的系统为权利要求1～7任一所述的体外基因叠加系统，具体应用方法包括以下步骤：
1）将需要叠加的基因分别装入载体A、B、C中的外源目的基因插入区域；
2）将带有目的基因的载体A和B在对应重组酶的作用下进行重组反应，将产物转化细菌，筛选出位点B3与位点A1发生重组的产物载体AB，即实现了2个基因的叠加；
3）将载体AB在对应重组酶的作用下使可逆重组位点A’和B’发生切除重组，即将位点A’和B’间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得产物载体记为AB-；
4）将载体AB-与带有目的基因的C载体在对应重组酶的作用下使下进行重组反应，将产物转化细菌，筛选出位点B2与位点C3发生重组的产物载体ABC，即实现了3个基因的叠加；
5）同步骤3）使载体ABC中的2个可逆重组位点发生切除重组，得产物载体ABC-；
6）根据所需叠加基因的数量，交叉循环利用载体B和C依次将每个基因叠加到载体ABC-中，操作方法同上述步骤2）～5）；即可获得含多个目的基因的载体；
7）将上步所得的多基因载体中所含目的基因转入对应宿主体内。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：当步骤7）中所述的宿主为植物时，步骤7）的具体操作为：将体外叠加好的多基因载体转移到适合于农杆菌转化的双元载体中进行植物遗传转化，或者直接通过体内的位点特异性重组将多基因载体定点整合到植物基因组特定的座位上。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的双元载体为pZH36D，体外叠加好的多基因载体与载体pZH36D在对应重组酶的作用下进行重组反应，筛选出载体pZH36D中不可逆重组位点与A2位点发生重组的产物载体，记为pStack；然后利用农杆菌介导转化法将载体pStack中的多个目的基因插入植物基因组中。
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