CN104673824A - 一种适合基因叠加的载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适合基因叠加的载体及其应用。该载体含有attP或attB位点及其一侧的lox位点；含有筛选和报告基因及其两侧的lox位点；在上述attP或attB、lox、标记和报告基因连接好的片段两侧还有RS2或MRS位点。将上述载体通过T-DNA序列整合到水稻基因组中，可获得产生用于水稻基因叠加的株系。其中适合基因叠加的水稻基因组位点有7个，在该7个位点中可以将多个目的基加叠加在此处得到高效表达，可减少分离位点的数目，大大降低了将转基因从实验室品系导入农田品种过程中的工作量，且几乎不影响其他基因的正常表达，使商业产品研发者能够将新的基因叠加到现有的转基因位点。

Description

一种适合基因叠加的载体及其应用

技术领域

本发明涉及一种适合基因叠加的载体及其应用。

背景技术

传统导入新基因到商业品种通常是通过经典育种的方法，产生一个纯合品系，该品系不仅要包括转基因，也包括大田品种的优良性状。 二倍体植物中，在没有遗传连锁的情况下，通过分离获得n个独立性状的纯合株系的比例是(?)ⁿ 。所以，如果要获得7个优良性状和1个转基因性状的纯合株系，需要16,000个单株以上才能获得，比例为(?)⁷。如果有3个转基因位点，那么纯合株系的比例为(?)¹⁰，需要在超过1,000,000个单株中才有可能筛选到纯合株系。由于大量地区特异品种和当地大田性状的众多育种目标要求，增加分离的转基因位点将需要投入巨大财力和时间成本用于转基因的作物改良。

为了保持单个转基因位点，一些发明者将新的基因和已经导入基因组的基因在体外融合，构建新的转化载体，重新进行转化。这种方法可以通过筛选转基因完整插入的植物株系达到目的。这种“重做”的方式可以在导入性状较少的情况下考虑。但是商业品种如果已有多个转基因性状，当每增加一个新的性状，就使得这种做法因重新转化和需要再次获得政府批准变得更加困难。

一般来说，避免多个分离位点的措施之一就是直接转化优良品种。这个捷径对育种来说可以加速新转基因品种的研发。然而，大多数商业品种的遗传转化比较困难，需要投入巨大的财力物力才能获得足够数量的转化体用于大田试验。不同地区的差异带来大量不同的适应当地的品种，需要针对该品种研发有效的转化方法。从监管来看，转化同样DNA的每一个商业品种需要当做单个独立事件，逐个进行安全评价。这与单个转化事件通过育种措施导入大田品种有着明显的不同。可见，现有的技术中，获得多个基因叠加的转基因植株的工作量非常庞大，且概率低。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明应用基因叠加手段，构建适用于基因叠加的载体，载体中含有用于基因叠加的目标位点，由attP或者attB序列组成，允许新的DNA分子通过重组酶Bxb1催化整合；并且确定了水稻染色体上适合整合新性状基因的基因组位点。本发明将相关基因通过位点特异性重组叠加在该基因位点处，不仅可以直接减少分离位点的数目，大大降低了将转基因从实验室品系导入大量的当地大田品种过程中的工作量。

本发明的目的在于提供一种适合基因叠加的载体。

本发明的另一目的在于提供一种适合水稻基因叠加的基因组位点。

本发明的再一目的在于提供一种产生用于水稻基因叠加的株系的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种适合基因叠加的载体，该载体含有DNA片段4，所述DNA片段4中含有DNA片段1和DNA片段2，以及MRS重组位点或RS2重组位点；

其中，所述DNA片段1含有attP或attB重组位点，以及位于attP或attB重组位点一侧的大肠杆菌噬菌体P1中的lox重组位点；

所述DNA片段2含有所感兴趣的基因，以及位于该兴趣基因两侧的大肠杆菌噬菌体P1中的lox重组位点，通过该2个lox重组位点的重组可以将所感兴趣的基因删去，该2个lox重组位点同向，且与片段1中的lox重组位点方向相反；

上述DNA片段1和片段2按任意顺序连接构成DNA片段3；

上述DNA片段3两侧连有能够删除该DNA片段3的MRS重组位点或RS2重组位点；所述MRS重组位点或RS2重组位点与DNA片段3构成所述的DNA片段4。

进一步的，上述MRS重组位点为RK2或P4质粒中能被重组酶ParA识别的MRS重组位点。

进一步的，上述RS2重组位点为Acetinetobacter质粒中能被重组酶CinH识别的RS2重组位点。

进一步的，上述attP或attB重组位点为Mycobacterium smegmati噬菌体Bxb1中的attP或attB重组位点。

进一步的，上述attP或attB重组位点用于通过Bxb1整合酶将1个或多个目的基因DNA整合到该位点。

进一步的，上述所感兴趣的基因为筛选标记基因或/和报告基因。

进一步的，上述筛选标记基因选自潮霉素磷酸转移酶基因HPT、新霉素磷酸转移酶基因NPTII、氯霉素乙酰转移酶基因CAT、PPT乙酰转移酶基因BAR、5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因EPSP中的至少一种。

进一步的，上述报告基因选自β-葡萄糖醛酸酶基因GUS、蓝绿色荧光蛋白基因CFP，蓝色荧光蛋白基因BFP，绿色荧光蛋白基因GFP，红色荧光蛋白基因RFP，橙色荧光蛋白基因OFP，黄色荧光蛋白基因YFP，荧光素酶基因Luc中的至少一种。

一种真核细胞，该真核细胞中转化了上述所述的载体。

一种产生用于水稻基因叠加的株系的方法，将上述所述载体中的片段4通过农杆菌双元载体中的T-DNA序列整合到水稻基因组中，即可。

水稻基因组中适合上述水稻基因叠加载体插入的基因组位点，该基因组位点包括：

1）水稻染色体8的长臂第16,669,154位碱基和第16,669,159碱基位之间；

2）水稻染色体5的长臂第27,601,556位碱基和第27,601,606位碱基之间；

3）水稻染色体1的短臂第9,639,408位碱基和第9,639,426位碱基之间；

4）水稻染色体2的短臂第5,187,205位碱基和第5,187,244位碱基之间；

5）水稻染色体5的长臂第27,877,812位碱基和第 27,877,843位碱基之间；

6）水稻染色体1的长臂第32,100,641位碱基和第 32,100,689位碱基之间；

7）水稻染色体1的长臂第35,913,934位碱基和第35,913,966位碱基之间；基因组信息参照水稻基因组数据库Os-Nipponbare-IRGSP-1.0。

本发明的有益效果是：

1）本发明包括在真核细胞基因组产生重组目标位点的载体构成元件和方法，可以在重组目标位点整合基因，DNA转化载体中的遗传元件用来目标位点的构建，并且获得了有利于水稻基因叠加的7个基因组位点。 

2）本发明研发的植物体内基因叠加系统，可显著促进商业产品研发者能够将新的转基因叠加到现有的转基因位点；本发明公开的7个适合水稻基因叠加的基因组位点，有利于将相关基因通过位点特异性重组叠加在该基因位点处，不仅可以直接减少分离位点的数目，大大降低了将转基因从实验室品系导入大量的当地大田品种过程中的工作量，而且几乎不影响其他基因的正常表达。

3）本发明的7个适合基因叠加的水稻基因组位点位于基因组中已知编码基因的上游1kb之外或者下游0.5kb之外，不会导致水稻内源基因功能的丧失；且对本发明获得的7株目标株系的T2株系的报告基因进行表达分析，其能够高效表达，说明在本发明的7个基因组位点处可以高效表达目的基因。

附图说明

图1为载体pZH37的具体构建流程；A为重组载体pZH11NM的构建过程，B为重组载体pZH35NM的构建过程，C为重组载体pZH37的构建过程；

图2为构建好的载体pZH36 和pZH37 的简要结构示意图；包括的基因有hpt，潮霉素磷酸转移酶基因；gus，β—葡萄糖醛酸酶；gus基因由左向右转录，hpt基因由右向左转录，字母方向同转录方向；启动子和终止子没标识；gus基因启动子为水稻actin2启动子和ubiquitin1终止子；hpt基因启动子为actin1启动子和CaMV 35s终止子；L和R代表T-DNA的左边界LB和右边界RB，载体经SacI酶切后的片段大小示意图由蓝色字母标识；pZH36载体下方的长方向框代表gus和hpt DNA探针；

图3为部分株系（株系281，367，766，131，284，325和537）的基因组与hpt探针和gus探针的杂交图谱，A为与hpt探针的杂交图谱，B为与gus探针的杂交图谱；ZH11表示野生型水稻中华11；

图4为本发明获得的7个转基因株系的GUS染色检测图，其中，281，367，766，131，284，325和537为7个转基因株系，ZH11表示野生型水稻中花11；

图5本发明7个株系中T-DNA在基因组的定位，水稻基因组图谱来自www.ricemap.com，空心蓝圆圈表示载体为pZH36，实心红色圆圈表示载体为pZH37；

图6为目标株系基因组插入位点侧翼序列；图中染色体的位置数目来自水稻基因组注释项目（ The Rice Annotation Project，http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）；由于载体的方向如图1A所示从左边界到右边界，所以染色体的位置数字可能增加，也可能减少；字母上方带有*的部分是T-DNA整合后基因组缺失的部分；下划线的代表小写字母代表该序列不是来源于插入位点或者载体；加粗大写字母代表T-DNA左边界LB；7个目标株系整合到染色体部分均未包括右边界RB； 小写字母表示与载体pZH36或pZH37载体一致的序列；长方向框中小写斜体字母代表与重组位点RS2一致的序列；

图7为 载体pZH36产生的目标位点：DNA序列从T-DNA的左边界或右边界到最里的lox位点处；加粗大写字母代表T-DNA左边界LB或右边界RB； 7个目标株系均不包括T-DNA右边界RB；小写字母代表与载体pZH36一致的序列；框格内小写斜体字母代表的是与标注重组位点MRS或者lox一致的序列；载体右边界包括大肠杆菌lacZ alpha部分编码区片段（其为pCambia载体的一部分，转化植株中整合有部分载体骨架）；

图8为载体pZH37产生的目标位点：DNA序列从T-DNA的左边界或右边界到最里的lox位点处；加粗大写字母代表T-DNA左边界LB或右边界RB； 7个目标株系均不包括T-DNA右边界RB；小写字母代表与载体pZH37一致的序列；框格内小写斜体字母代表的是与标注重组位点MRS或者lox一致的序列；载体右边界包括大肠杆菌lacZ alpha部分编码区片段（其为pCambia载体的一部分，转化植株中整合有部分载体骨架）。

具体实施方式

下面对结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1适合基因叠加的载体 

载体构建应用常规的重组DNA方法。所有的PCR反应采用高保真Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (NEB 北京，中国)。本实施例以水稻为例，说明一种适合水稻基因叠加的载体的构建过程，适合其他生物基因叠加的载体可以按照该方法进行类似的构建，如载体中的启动子序列、筛选基因等根据目标生物的特性进行选择。

一、适合水稻基因叠加的pZH37载体的构建

pZH37载体的构建流程如图1所示，结合图1对其构建的具体方法进行如下的描述：

1）重组载体pZH2的构建

构建pZH37的骨架载体来自于pCambia系列的载体pC13Bar（来自 Ow lab）。 通过PCR的方法将AscI和SpeI限制性内切酶位点放入骨架载体用于后续的DNA克隆。具体操作为：以pC13Bar为模板，用引物5’-cggtgatcacaggcagcaacgctctgtcat-3’ （SEQ ID NO：1）和 5’-atatgcatactagtggcgcgccttaattcagtacattaaaaacgt-3’ （SEQ ID NO：2）扩增获得330bp片段，经BclI和NsiI酶切，利用琼脂糖凝胶纯化； 同时用BclI和PstI酶切pC13Bar，纯化大片段；将纯化后的这两个片段用T4 DNA连接酶连接得到重组载体pZH2（如图1A）；

2）重组载体pZH3的构建

通过两步PCR从pYWP72中获得片段MRS-lox-T35S，pYWP72的相关信息 参见Yau, Y.Y., Wang, Y., Thomson, J.G., and Ow, D.W. (2011) Method for Bxb1-mediated site-specific integration in planta. In: Methods Mol Biol. 701, 147-66. (Ed. J.A. Birchler), Humana Press (Book Chapter)。具体操作为：先以pYWP72为模板，分别用引物1和2、引物3和4分别扩增得到片段1和片段2，然后以片段1和片段2为模板，用引物1和引物4 PCR扩增得到目的片段MRS-lox-T35s，用AscI和SpeI分别对片段MRS-lox-T35s和pZH2进行双酶将切，将酶切后所得的2个片段用T4 DNA连接酶连接得到重组载体pZH3（如图1A）；

上述引物1～4的序列分别为：

引物1：5’-aaggcgcgccctcatatgtgggcgtgagg-3’（SEQ ID NO：3）；

引物2：5’-atgtatgctatacgaagttatttaattaatcaaattgggtatacccattt-3’（SEQ ID NO：4）；

引物3：5’-taacttcgtatagcatacattatacgaagttattaattcgggggatctgg-3’（SEQ ID NO：5）；

引物4：5’-ccactagtccatgggatctgtcgatcgacaagct-3’（SEQ ID NO：6）。

3）重组载体pZH10的构建

潮霉素磷酸转移酶基因hpt基因片段用引物5’-tcccatggctatttctttgccctcggacga-3’ （SEQ ID NO：7）和5’-actagtagattctagaatgaaaaagcctgaactcaccgcg-3’ （SEQ ID NO：8）进行PCR扩增获得hpt基因片段，用NcoI和SpeI分别对片段hpt和pZH3进行双酶将切，将酶切后所得的2个片段用T4 DNA连接酶连接得到重组载体pZH10（如图1A）；

4）重组载体pZH11NM的构建

1.4 kb大小的水稻Actin1启动子基因片段用水稻中花11的基因组DNA为模板、用引物5’-cattctagaatcttctacctacaaaaaagctcc-3’ （SEQ ID NO：9）和5’-ccactagtccttaggtcaagctt cgaggtcattca-3’（SEQ ID NO：10）进行PCR扩增获得Actin1基因片段，用XbaI和SpeI分别对片段Actin1和pZH10进行双酶将切，将酶切后所得的2个片段用T4 DNA连接酶连接得到重组载体pZH11NM（如图1A）；

上述水稻Actin1启动子的具体信息可参见文章McElroy, D., Zhang, W., Cao, J., and Wu, R. (1990) Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation. Plant Cell. 2, 163-171. 和Zhang, W., McElroy, D., and Wu, R. (1991). Analysis of rice Act1 5’ region activity in transgenic rice plants. Plant Cell. 3, 1155-1165。

5）重组载体pZH7的构建

用与扩增MRS-lox-T35s相似的方法，从pYWP72质粒中扩增获得attP (P’P)-lox-MRS片段，具体操作方法为：先以pYWP72为模板，分别用引物2-1和2-2、引物2-3和2-4分别扩增得到片段2-1和片段2-2，然后以片段2-1和片段2-2为模板，用引物2-1和引物2-4 PCR扩增得到目的片段attP (P’P)-lox-MRS；用AscI和SpeI分别对片段attP (P’P)-lox-MRS和pZH2进行双酶将切，将酶切后所得的2个片段用T4 DNA连接酶连接得到重组载体pZH7（如图1B）；

引物2-1：5’-aaggcgcgcccctgcagggggtttgtaccgtacaccac-3’（SEQ ID NO：11），

引物2-2：5’-gtatagcatacattatacgaagttatcagtggtttgtctggtcaaccacc-3’ （SEQ ID NO：12），

引物2-3：5’-tcgtataatgtatgctatacgaagttatcccgggctcatatgtgggcgtg-3’ （SEQ ID NO：13）， 

引物2-4：5’-ggactagttcaaattgggtatacccatt-3’ （SEQ ID NO：14）。

6）重组载体pZH12的构建

将566 bp的水稻Ubiquitin终止子（简称Tubi）片段(具体信息可参见Kuroda, M., Kimizu, M., and Mikami, C. (2010) A simple set of plasmids for the production of transgenic plants. Biosci. Biotechinol. Biochem. 74, 2348-2351)通过PCR方法与34 bp的lox融合，具体的操作过程为：以水稻中花11的基因组为模板，用引物5’-aaggcgcgccggtaccatggagctgctgctgttcta-3’ （SEQ ID NO：15）和5’-atcctgcaggataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattgccaagtgccaag-3’ （SEQ ID NO：16）进行PCR扩增，获得目的片段lox-Tubi，用AscI和SbfI分别对片段lox-Tubi和pZH7进行双酶将切，将酶切后所得的2个片段用T4 DNA连接酶连接得到重组载体pZH12（如图1B）。 

7）重组载体pZH13的构建

以pCambia1305.1为模板，用引物5’-ggcgcgccgttatctagaggatccatggtaga tctgagggt-3’（SEQ ID NO：17） 和引物5’-ccactagtggtacctcacacgtgatggtgatggc-3’ （SEQ ID NO：18）进行PCR扩增，获得报告基因Gusplus(简称GUS)，用AscI和KpnI分别对报告基因Gusplus和pZH12进行双酶将切，将酶切后所得的2个片段用T4 DNA连接酶连接得到重组载体pZH13（如图1B）。

8）重组载体pZH35NM的构建

将2.6 kb的水稻actin2启动子（详细信息可参见He, C., Lin, Z., McElroy, D., and Wu, R. (2009) Identification of a rice actin2 gene regulatory region for high-level expression of transgenes in monocots. Plant Biotechnol. J. 7, 227–239.）从水稻中扩增得到，具体操作为：以水稻中花11的基因组为模板，用引物5’-ggcgcgccggcctaaggggatcctccatgcctacatc-3’（SEQ ID NO：19）和5’-tcctctagataactgatctgcataacac-3’（SEQ ID NO：20）进行PCR扩增，获得目的片段actin2（简称为Pact2），用AscI和XbaI分别对片段Pact2和pZH13进行双酶将切，将酶切后所得的2个片段用T4 DNA连接酶连接得到重组载体pZH35NM（如图1B）。

9）重组载体pZH37的构建

用AscI和Bsu36I酶切pZH11NM得到2.8kb的片段，AscI和Bsu36I酶切pZH35NM时，会将Pact2启动子中大小为1.5kb的片段切掉，先将来自pZH11NM的2.8kb片段与酶切后的pZH35NM大片段连接，再将连接后的重组载体用Bsu36I单酶切，把切掉的1.5kb片段再连入重组载体中得到质粒pZH37。

二、适合水稻基因叠加的pZH36载体的构建

pZH36重组载体与pZH37不同的是将pZH37中的MRS重组位点改成了RS2重组位点。具体操作为：用引物5’-cgggcgcgcccgtaaattataaatcttaaatatcaaagttacatgttatatatgg-3’（SEQ ID NO：21），5’-tataatgtatgctatacgaagttatttaattaacgttactttggggtatacccta-3’（SEQ ID NO：22），5’-ttcgtatagcatacattatacgaagttattaattcgggggatctggattt-3’（SEQ ID NO：23）和5’-ccactagtccatgggatctgtcgatcgacaagct-3’ （SEQ ID NO：24）从质粒pYWP72中扩增得到RS2-lox-T35s，扩增方法类似于MRS-lox-T35s的扩增；另外用引物5’-aaggcgcgcccctgcagggggtttgtaccgtacaccac-3’（SEQ ID NO：25），5’-cttcgtatagcatacattatacgaagttatc agtggtttgtctggtcaa-3’（SEQ ID NO：26），5’-gtatgctatacgaagttatcccgggcgtaaattataaatcttaaatatcaaagtt- 3’ （SEQ ID NO：27），和5’-ccactagtcgttactttggggtataccc-3’ （SEQ ID NO：28），从质粒pYWP72中扩增得到attP (P’P)-lox-RS2片段，扩增方法类似于attP (P’P)-lox-MRS的扩增；pZH36重组载体的其他构建步骤均与pZH37的类似。

上述制备的用于导入水稻基因组的载体pZH36和pZH37包括以下结构（如图2所示）：

1）遗传转化抗性筛选基因hpt（潮霉素磷酸转移酶基因）；hpt基因由右向左转录，字母方向同转录方向； hpt基因启动子为actin1启动子（简称Pact1）和CaMV 35s终止子（简称T35s），启动子和终止子没有在图2中标识，可参见图1；

2）监测基因表达的报告基因gus（β—葡萄糖醛酸酶）；gus基因由左向右转录；gus基因启动子为水稻actin2启动子（简称Pact2）和ubiquitin1终止子（简称Tubi1）；启动子和终止子没有在图2中标识，可参见图1；

3）hpt-gus DNA片段两侧是两个Cre-lox定点重组系统中的lox重组位点（为大肠杆菌噬菌体P1中的lox重组位点）。这两个lox位点，方向一致，目的是在整合的基因稳定表达验证之后，通过CRE重组酶删除hpt-gus DNA片段；

4）在lox-hpt-gus-lox片段的一端设有来自Bxb1-att重组系统的attP。attP重组位点是用于与新的包含attB位点的环形DNA发生重组反应；

5）在attP的另一端有一个lox重组位点，其方向与lox-hpt-gus-loxDNA中的lox方向相反；在整合目的基因DNA时，目的基因中连接上新的lox重组位点，则目的基因中的lox位点与attP一端的lox之间通过CRE重组酶发生重组反应，以便删除整合进来的目的基因；

6）全部DNA片段（包括lox-hpt-gus-lox片段和attP-lox片段）的两侧有一套基于CinH-RS2的RS2重组位点（pZH36）或者基于ParA-MRS的MRS重组位点（pZH36），预设重组位点RS2或者MRS的目的是，将来的转基因品种，可以通过定点重组系统删除全部转基因。

实施例2 产生水稻基因叠加株系的方法

一、水稻转化

将实施例1或2中所构建的载体pZH37、pZH36通过农杆菌转化水稻，水稻品种为中花11，水稻转化方法参照Li, M.R., Li, H.Q. (2003) A simple and highly efficient Agrobacterium mediated rice transformation system. Acta Biol Exp Sin. 36, 289-294。

二、筛选

（1）PCR筛选

上述农杆菌转化总共获得3953个再生植株用于目标株系的筛选。经PCR检测gus DNA有3136个为阳性转基因植株。

（2）qPCR筛选

1）Gus基因的qPCR筛选

针对上述筛选出的3136个植株，采用实时荧光定量PCR 作进一步的筛选，具体操作为：采用10ul的反应体系，包括2 × SYBR Premix Ex TaqⅡ(宝生物，大连，中国), 10 μM 引物, 1 μL DNA。标准曲线的模板是10⁹, 10⁸, 10⁷, 10⁶, 10⁵ copies/μL pMD20-SPS（为连接有SPS基因的T载）和 pZH36，其中SPS为水稻基因组单拷贝基因sucrose phosphate synthase gene （SPS，蔗糖磷酸合成酶基因）。样品中SPS, gus，hpt的拷贝数通过标准曲线和Cp值分析获得。转基因拷贝数通过计算gus或hpt的拷贝数与SPS的拷贝数的比值估算。

上述qPCR的引物如下：

基因SPS的qPCR引物：spsF: 5’-ttgcgcctgaacggatat-3’ （SEQ ID NO：29）和 spsR: 5’-cggttgatcttttcgggatg-3’ （SEQ ID NO：30）；

基因gus的qPCR引物：gusF:5’-cgtcccaagcagttacaatg-3’ （SEQ ID NO：31）和gusR: 5’-cgttcgtaccagacatatccg-3’ （SEQ ID NO：32）。

检测结果显示：以水稻基因组单拷贝基因sucrose phosphate synthase gene （SPS，蔗糖磷酸合成酶基因）为单拷贝参照，从上述3136个植株中筛选出有1444个株系有Gus基因的表达，其中包含了4个或4个以下的拷贝。

2）hpt基因的qPCR筛选

第二轮qPCR筛选是基于hpt基因的qPCR筛选，从上述1444个株系中进一步筛选出了471个株系，基中包含2个或2个以下拷贝数。

上述实时荧光定量PCR的具体操同上述步骤1），基因hpt的qPCR引物为hptF: 5’-tcgtccatcacagtttgcc-3’ （SEQ ID NO：33）和hptR: 5’-tcggtcaatacactacatggc-3’ （SEQ ID NO：34）。

（3）Southern blot筛选

1）DNA提取：将上述471个株系全部进行Southern检测。提取各个株系的基因组DNA，DNA的提取方法参照文章Lu, Y.J., and Zheng, K.L. (1992) A simple method for isolation of rice DNA, Chinese J. Rice Sci. 6:47-48。取水稻叶片100mg在液氮中研磨，然后转入1.7ml的离心管，加入1ml预热的提取液(100mM Tris-HCl，pH 8.0, 20mM EDTA, 500mM NaCl, 1.5% SDS)，在65℃水浴锅放置1小时，加0.6ml的异丙醇/乙醇、氯仿于离心管中，上下翻转10次。4000rpm离心15分钟，取上清到新的离心管，加等体积的异丙醇，上下翻转离心管沉淀DNA。试验台静置5分钟，然后4000rpm离心15分钟。倒掉上清，用75%乙醇洗涤DNA两遍，在超净台上干燥DNA，加100ul ddH₂O。琼脂糖电泳检测DNA的质量。

2）DNA酶切：将提取的DNA进行SacI 酶切，经限制性内切酶SacI酶切过夜，可以把T-DNA切成左右边界两个片段（图2），含有hpt DNA的片段的大小在2kb以上，含有gus DNA的片段的大小在6kb以上。

3）DNA杂交：取10ug SacI 酶切过夜的DNA于1%的琼脂糖凝胶电泳。电泳完成后，使用785真空转膜仪(Bio-Rad, USA)利用10xSSC溶液将DNA转到Hybond-N⁺膜上(GE Healthcare, USA)。³²P-dCTP标记的hpt和gus DNA分别与膜杂交。杂交的方法参照文章Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Y. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory。洗膜之后，将膜与磷屏上下叠放，5~12小时后扫描磷屏（Typhoon FLA 9500，GE Health，USA）。

实验结果显示：以hpt基因作探针，对上述471个株系进行检测发现有188个株系显示有单条带（如图3A所示）；对这188个株系再用gus基因作探针进行检测，发现其中有76个株系显示单条带（如图3B所示）。

（4）TAIL-PCR筛选及插入位点分析

应用TAIL-PCR方法检测上述76株转基因株系T-DNA的侧翼基因组序列，同时检测左右边界的重组酶位点序列，初步确定插入位点的结构。

1）TAIL-PCR

TAIL-PCR方法、扩增参数、随机引物和右边界端特异引物的设计等均参照文章Liu, Y.G., Chen, Y.L. (2007) High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplication of unknown flanking sequences. BioTechniques, 43, 649-656。Liu et al. (2007)。左边界特异引物根据转化载体pZH36（或pZH37）设计。回收纯化1%琼脂糖凝胶电泳的PCR产物测序，测序引物采用PCR反应的引物。

上述随机引物（Random primers）为：

LAD1-1: 5’-acgatggactccagagcggccgc(g/c/a)n(g/c/a)nnnggaa-3’ （SEQ ID NO：35）,

LAD1-D2: 5’-acgatggactccagagcggccgc(g/c/t)n(g/c/t)nnnggtt-3’ （SEQ ID NO：36）,

LAD1-D3: 5’-acgatggactccagagcggccgc(g/c/a)(g/c/a)n(g/c/a)nnnccaa-3’ （SEQ ID NO：37）,

LAD1-4: 5’-acgatggactccagagcggccgc(g/c/t)(g/c/t)n(g/c/t)nnncggt-3’ （SEQ ID NO：38）,

AC: 5’-acgatggactccagag-3’ （SEQ ID NO：39）.

上述右边界特异引物（RB specific primers）为：

RB-0b: 5’-cgtgactgggaaaaccctggcgtt-3’ （SEQ ID NO：40）,

RB-1b: 5’-acgatggactccagtccggcccaacttaatcgccttgcagcacatc-3’ （SEQ ID NO：41）,

RB-2b: 5’-gaagaggcccgcaccgatcgccctt-3’ （SEQ ID NO：42）。

上述左边界特异引物（LB specific primers）为：

LB1: 5’-ggatcgccacgactccgggcgta-3’（SEQ ID NO：43）,

LB2: 5’-acgatggactccagtccggccgtcgggcgtacacaaatcgcccgc-3’（SEQ ID NO：44）,

LB3: 5’- ccgagggcaaagaaatagccatggg-3’（SEQ ID NO：45）。

实验结果显示，上述76个株系中有62个可以成功获得序列信息。

2）插入位点分析

对上述62个成功获得的序列信息进行BLAST搜索水稻基因组数据库，显示34个插入已知基因区域，另外28个株系T-DNA插入非基因区域。左右边界的序列信息显示这28个中只有16个株系的重组酶位点与预期一致，即测序结果与转化载体中重组酶位点序列一致，重组酶位点lox之间的DNA序列可以不用测序，因为当报告基因可以稳定表达和遗传验证完成，抗性筛选基因和报告基因就可以被删除。

在上述筛选出的16个精确的单拷贝插入株系中，有4个位于着丝粒附近的重复区域，这将导致和着丝粒的遗传连锁，难以通过重组将转基因导入其它优良品种；另外有5个株系的T-DNA插入到基因的起始密码子ATG上游1kb或者翻译终止子0.5kb区域，可能会影响内源基因的表达；排除这9个株系，从3953个转化株系中最终筛选得到7个株系，即为产生水稻基因叠加的目标株系。这7个株系中有3个株系（281，367，766）来自转化pZH36载体（含RS2位点），另4个株系（131，284，325，537）来自转化pZH37载体（含MRS位点）。

上述筛选出的7个株系满足以下标准：（1）报告基因GUS可以表达，（2）单拷贝插入，（3）离着丝粒比较远，（4）非插入基因或基因附近，（5）位于右边界的重组酶位点RS2或者MRS，lox和attP无突变，（6）位于左边界的重组酶位点lox，RS2或者MRS无突变。

下面对本发明获得的7个株系作进一步的检测。

GUS染色检测

对本发明获得的7个转基因株系进行GUS染色。取适量叶片与X-GluC染液(50mM sodium phosphate buffer pH7.0, 10mM EDTA pH8.0, 0.1% (v/v) TritonX-100, 0.5mg/mL X-GluC)混合，置于37℃ 12~16小时，用75%乙醇脱色后，观察叶片的颜色，GUS染色的具体操作可参见Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A., Bevan, M.W. (1987) "GUS fusions: Beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants". The EMBO journal. 6, 3901-3907。

检测结果如图4所示，所有这7个株系（281，367，766，131，284，325和537）中的GUS报告基因在T2代稳定表达，均能被染成蓝色（图4）。

实施例3 适合水稻基因叠加的基因组位点

利用实施例2中有关本发明7个株系的TAIL-PCR获得的基因组序列信息，根据转基因T-DNA的左右边界插入的基因组序列信息，利用在线生物信息学软件搜索水稻基因组数据库，将目标株系T-DNA定位到水稻染色体上（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, http://rapdb.dna.affrc.go.jp/, http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_blast.shtml）。具体相关信息可参见Sakai, H., Lee, S.S., et al., (2013) Rice Annotation Project Database (RAP-DB): An integrative and interactive database for rice genomics Plant & Cell Physiol. 54, e6； Kawahara, Y., de la Bastide, M., Hamilton J. P., Kanamori, H., McCombie, W. R., Ouyang, S., Schwartz, D. C., Tanaka, T., Wu, J., Zhou, S., Childs, K. L., Davidson, R. M., Lin, H., Quesada-Ocampo, L., Vaillancourt, B., Sakai, H., Lee, S. S., Kim, J., Numa, H., Itoh, T., Buell, C. R., Matsumoto, T. (2013) Improvement of the Oryza sativa Nipponbare reference genome using next generation sequence and optical map data. Rice 6:4。将具有高相似性的序列再次搜索水稻表达基因数据库，排除插入基因区域的株系。

根据上述信息的比对，7个株系中T-DNA在基因组中的粗略定位结果如图5所示。水稻染色体图谱参照Rice-Map（www.ricemap.org），具体相关信息可参见 Wang, J., Kong L., et al., (2011) Rice-Map: a new-generation rice genome browser. BMC Genomics. 12,165。

目标株系中T-DNA序列与转化载体通过在线软件Clustalw2进行相似性比较分析(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)。上述7个转基因株系T-DNA序列信息与载体序列信息的比较情况见图6~8所示，序列信息按照转化载体T-DNA左边界到右边界方向（如图2所示）。

综合上述分析的结果，可获知上述7个株系中T-DNA在基因组中的精确定位信息如下：

株系281（TS281）的目标位点：位于第8染色体长臂16,669,154和16,669,159之间，从16,669,155到16,669,158的4bp基因组序列缺失（图6）。在T-DNA的左端，缺失了26bp LB的前8bp，被替换为10bp随机序列。在T-DNA的右端，缺失26bp RB和16bp载体序列，被替换为24bp随机序列。

株系367（TS367）的目标位点：位于第5染色体长臂27,601,556和27,601,606之间，从27,601,557到27,601,605的49bp基因组序列缺失（图6）。在T-DNA的左端，缺失了26bp LB和63bp载体序列。在T-DNA的右端，缺失26bp RB和16bp载体序列。

株系766（TS766）的目标位点：位于第1染色体短臂9,639,408和9,639,426之间。从9,639,409到9,639,425的17bp基因组序列缺失（图6）。在T-DNA的左端，缺失了26bp LB的前20bp。在T-DNA的右端，缺失26bp RB和16bp载体序列。

株系131（TS131）的目标位点：位于第2染色体短臂5,187,205和5,187,244之间。从5,187,206到5,187,243的38bp基因组序列缺失（图6）。在T-DNA的左端，缺失了26bp LB和附近的25bp载体序列。在T-DNA的右端，缺失26bp RB和16bp载体序列。

株系284（TS284）的目标位点：位于第5染色体长臂27,877,812和27,877,843之间。从27,877,813到27,877,842的30bp基因组序列缺失（图6）。在T-DNA的左端，缺失了26bp LB和附近的9bp载体序列。在T-DNA的右端，缺失26bp RB和16bp载体序列。

株系325（TS325）的目标位点：位于第1染色体长臂32,100,641和32,100,689之间。从32,100,642到32,100,688的47bp基因组序列缺失（图6）。在T-DNA的左端，缺失了26bp LB和附近的9bp载体序列，被替换为6bp的随机插入序列。在T-DNA的右端，缺失26bp RB全部和16bp载体序列。

株系537（TS537）的目标位点：位于第1染色体长臂35,913,934和35,913,966之间.从35,913,935到35,913,965的31bp基因组序列缺失（图6）。在T-DNA的左端，缺失26bp LB的前17bp序列。在T-DNA的右端，缺失26bp RB和16bp载体序列。

即水稻基因组中适合水稻基因叠加载体插入的基因组位点包括：

1）水稻染色体8的长臂第16,669,154位碱基和第16,669,159碱基位之间；

2）水稻染色体5的长臂第27,601,556位碱基和第27,601,606位碱基之间；

3）水稻染色体1的短臂第9,639,408位碱基和第9,639,426位碱基之间；

4）水稻染色体2的短臂第5,187,205位碱基和第5,187,244位碱基之间；

5）水稻染色体5的长臂第27,877,812位碱基和第 27,877,843位碱基之间；

6）水稻染色体1的长臂第32,100,641位碱基和第 32,100,689位碱基之间；

7）水稻染色体1的长臂第35,913,934位碱基和第35,913,966位碱基之间；基因组信息参照水稻基因组数据库Os-Nipponbare-IRGSP-1.0。

综上所述，本发明研发的植物体内基因叠加系统，是帮助商业产品研发者能够将新的转基因叠加到现有的转基因位点。本发明公开的7个适合水稻基因叠加的基因组位点，有利于将相关基因通过位点特异性重组叠加在该基因位点处，不仅可以直接减少分离位点的数目，大大降低了将转基因从实验室品系导入大量的当地大田品种过程中的工作量，而且几乎不影响其他基因的正常表达。

本发明的7个适合水稻基因叠加的基因组位点位于基因组中已知编码基因的上游1kb之外或者下游0.5kb之外，不会导致水稻内源基因功能的丧失。且对本发明获得的7株目标株系的T2株系的报告基因进行表达分析，其能够高效表达，说明在本发明的7个基因组位点处可以高效表达目的基因。

在本发明载体中，尽管左右边界的重组酶位点RS2和MRS与基因叠加没有关系，预先将其放置在目标株系中，是将来可以通过重组酶CinH和ParA把两个位点间的全部转基因删除。

为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。

<110>  中国科学院华南植物园

<120>一种适合基因叠加的载体及其应用

<130> 

<160>  45   

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  1

cggtgatcac aggcagcaac gctctgtcat                                        30

<210>  2

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<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  2

atatgcatac tagtggcgcg ccttaattca gtacattaaa aacgt                       45

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<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工引物

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aaggcgcgcc ctcatatgtg ggcgtgagg                                         29

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<212>  DNA

<213>  人工引物

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atgtatgcta tacgaagtta tttaattaat caaattgggt atacccattt                  50

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<212>  DNA

<213>  人工引物

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taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tattaattcg ggggatctgg                  50

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<212>  DNA

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ccactagtcc atgggatctg tcgatcgaca agct                                   34

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<212>  DNA

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tcccatggct atttctttgc cctcggacga                                        30

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<212>  DNA

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actagtagat tctagaatga aaaagcctga actcaccgcg                             40

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<212>  DNA

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cattctagaa tcttctacct acaaaaaagc tcc                                    33

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ccactagtcc ttaggtcaag cttcgaggtc attca                                  35

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aaggcgcgcc cctgcagggg gtttgtaccg tacaccac                               38

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gtatagcata cattatacga agttatcagt ggtttgtctg gtcaaccacc                  50

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tcgtataatg tatgctatac gaagttatcc cgggctcata tgtgggcgtg                  50

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ggactagttc aaattgggta tacccatt                                          28

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aaggcgcgcc ggtaccatgg agctgctgct gttcta                                 36

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atcctgcagg ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttattgccaa gtgccaag         58

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ggcgcgccgt tatctagagg atccatggta gatctgaggg t                           41

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ccactagtgg tacctcacac gtgatggtga tggc                                   34

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ggcgcgccgg cctaagggga tcctccatgc ctacatc                                37

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tcctctagat aactgatctg cataacac                                          28

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cgggcgcgcc cgtaaattat aaatcttaaa tatcaaagtt acatgttata tatgg            55

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tataatgtat gctatacgaa gttatttaat taacgttact ttggggtata cccta            55

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ccactagtcc atgggatctg tcgatcgaca agct                                   34

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cttcgtatag catacattat acgaagttat cagtggtttg tctggtcaa                   49

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<213>  人工引物

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acgatggact ccagag                                                       16

<210>  40

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  40

cgtgactggg aaaaccctgg cgtt                                              24

<210>  41

<211>  46

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  41

acgatggact ccagtccggc ccaacttaat cgccttgcag cacatc                      46

<210>  42

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  42

gaagaggccc gcaccgatcg ccctt                                             25

<210>  43

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  43

ggatcgccac gactccgggc gta                                               23

<210>  44

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  44

acgatggact ccagtccggc cgtcgggcgt acacaaatcg cccgc                       45

<210>  45

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  45

ccgagggcaa agaaatagcc atggg                                             25

Claims (10)

1.一种适合基因叠加的载体，其特征在于：该载体含有DNA片段4，所述DNA片段4中含有DNA片段1和DNA片段2，以及MRS重组位点或RS2重组位点；

其中，所述DNA片段1含有attP或attB重组位点，以及位于attP或attB重组位点一侧的大肠杆菌噬菌体P1中的lox重组位点；

所述DNA片段2含有所感兴趣的基因，以及位于该兴趣基因两侧的大肠杆菌噬菌体P1中的lox重组位点，通过该2个lox重组位点的重组可以将所感兴趣的基因删去，该2个lox重组位点同向，且与片段1中的lox重组位点方向相反；

上述DNA片段1和片段2按任意顺序连接构成DNA片段3；

上述DNA片段3两侧连有能够删除该DNA片段3的MRS重组位点或RS2重组位点；所述MRS重组位点或RS2重组位点与DNA片段3构成所述的DNA片段4。

2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述的MRS重组位点为RK2或P4质粒中能被重组酶ParA识别的MRS重组位点。

3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述的RS2重组位点为Acetinetobacter质粒中能被重组酶CinH识别的RS2重组位点。

4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述的attP或attB重组位点为Mycobacterium smegmati噬菌体Bxb1中的attP或attB重组位点。

5.根据权利要求1或4所述的载体，其特征在于：所述的attP或attB重组位点用于通过Bxb1整合酶将1个或多个目的基因DNA整合到该位点。

6.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述的所感兴趣的基因为筛选标记基因或/和报告基因。

7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于：所述的筛选标记基因选自潮霉素磷酸转移酶基因HPT、新霉素磷酸转移酶基因NPTII、氯霉素乙酰转移酶基因CAT、PPT乙酰转移酶基因BAR、5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因EPSP中的至少一种；

所述的报告基因选自β-葡萄糖醛酸酶基因GUS、蓝绿色荧光蛋白基因CFP，蓝色荧光蛋白基因BFP，绿色荧光蛋白基因GFP，红色荧光蛋白基因RFP，橙色荧光蛋白基因OFP，黄色荧光蛋白基因YFP，荧光素酶基因Luc中的至少一种。

8.一种真核细胞，其特征在于：该真核细胞中转化了权利要求1～7中任一所述的载体。

9.一种产生用于水稻基因叠加的株系的方法，其特征在于：将权利要求1～7中任一所述载体中的片段4通过农杆菌双元载体中的T-DNA序列整合到水稻基因组中，即可。

10.水稻基因组中适合权利要求1～7中任一所述水稻基因叠加载体插入的基因组位点，其特征在于：该基因组位点包括：

1）水稻染色体8的长臂第16,669,154位碱基和第16,669,159碱基位之间；

2）水稻染色体5的长臂第27,601,556位碱基和第27,601,606位碱基之间；

3）水稻染色体1的短臂第9,639,408位碱基和第9,639,426位碱基之间；

4）水稻染色体2的短臂第5,187,205位碱基和第5,187,244位碱基之间；

5）水稻染色体5的长臂第27,877,812位碱基和第 27,877,843位碱基之间；

6）水稻染色体1的长臂第32,100,641位碱基和第 32,100,689位碱基之间；

7）水稻染色体1的长臂第35,913,934位碱基和第35,913,966位碱基之间；基因组信息参照水稻基因组数据库Os-Nipponbare-IRGSP-1.0。