CN1427079A

CN1427079A - 多基因载体的构建方法与应用

Info

Publication number: CN1427079A
Application number: CN02134869.3A
Authority: CN
Inventors: 刘耀光
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2002-09-30
Filing date: 2002-09-30
Publication date: 2003-07-02
Anticipated expiration: 2022-09-30
Also published as: CN1263860C; US20040126883A1; CA2439841A1; GB2393441A; GB0321392D0; JP2004121248A

Abstract

本发明提供了一个多基因组装载体系统及其多基因组装方法。本载体系统由1个接受载体和至少2个供给载体组成，利用特异重组方法使不同的供给载体交替地和接受载体进行多轮的基因组装，构建成多基因载体。本发明解决了用现有方法构建多基因载体的技术障碍，可应用于基因工程领域中的多基因载体和大型载体的构建，用于多个基因的转化以获得多种基因工程产物和多基因表达性状。

Description

多基因载体的构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是基因工程载体的构建及其应用。

背景技术

基因转化是生物基因工程的基本技术。现有的基因转化技术主要被用于向生物细胞导入少数，通常1-3个基因。近年来人们试图转化更多基因，但受现有技术的限制，多基因载体构建和多基因转化还很困难，效率很低。

目前的基因工程实践中进行多基因转化的可能方法有：

(1)把多个分别含不同基因的载体质粒混合，用基因枪轰击等方法进行共转化(Chen et al.，1998；Ye et al，2000)。

(2)把多个基因分组，如每组1-3个基因，分别亚克隆在载体上，对同一受体进行多轮转化(Lapierre et al，1999)；或将各个载体分别转化生物受体，再将转化体互相杂交使多个基因重组在一起(Ma andHiatt，1995)。

(3)用常规的分子克隆技术把尽可能多的基因连接在同一个载体上进行共转化(Van Engelen et al，1994；Daniell et al，2001)。

方法(1)虽然操作简单，但是基因数目越多，所有基因都能共转化一个细胞的频率越低。并且各个基因的导入拷贝数不能控制，有些基因的导入拷贝数可能很多，有些却没有导入。方法(2)要解决转化体的选择标记的剔除问题，或者要选用不同的选择标记，才能进行下一轮的转化。多轮转化或转化体相互杂交重组筛选需要的时间也较长，因而实际应用不多。方法(3)是最常用的方法。但现有的分子克隆技术一般只能将数目不多的基因，如2-4个基因连接在一个载体。要将更多的基因克隆到一个载体，用现有的分子克隆技术是很困难的。这种困难性主要在于：(1)把多个外源DNA片段顺次连接到一个载体时，随着插入片段数的增多，载体总长度增大，可利用的克隆位点即唯一的限制性内切酶切位点越少，直到没有酶切位点可用；(2)随着插入片段数的增多载体变得越大时，新的片段连接到载体的效率变得很低，特别是对平滑末端片段的连接就非常困难；(3)目前通常使用的多拷贝质粒载体如pUC系列及其衍生物的接受外源DNA的负载量较低，难以克隆多个基因片段。虽然有一类基于F因子或P1复制子的载体如细菌人工染色体(BAC、P1)、双元细菌人工染色体(BIBAC)、和可转化人工染色体(TAC)的负载量较大(Sternberg et al.，1990；Shizuya et al.，1992；Halmilton，1997；Liu et al.，1999)，但由于上述原因，这些载体只适合进行一次连接反应克隆一个大的DNA片段，不适合进行多次连接反应克隆多个不同来源的DNA片段。

DNA分子之间可以在特定的重组酶作用下发生重组交换，称为DNA重组。DNA重组是重组酶对2个DNA位点进行切割和交换连接的连续过程。现已发现了多种重组系统。特异重组系统如Cre/LoxP、RLP/FRT、R/R、attB/attP，Gin/Gix等可使2个特异重组位点之间在特异重组酶的作用下发生重组，因而可用于基因的整合或切除(Sternberg et al，1981；Nash，1981；Mcleod et al，1986；Merker et al，1993)。例如，Cre重组酶可使分别有1个LoxP特异重组位点(由34碱基对组成)的2个质粒之间发生重组，将它们整合成1个质粒。另一方面，这个整合质粒中存在的2个同向排列的LoxP位点之间又会发生重组即逆向重组，使整合质粒分离回2个质粒。虽然利用特异重组系统可以进行基因整合是周知的技术，但现有的方法只能用此技术进行1-2轮的基因整合，还没有进行2轮以上基因组装的有效方法。

本发明的目的是提供一种多基因载体的构建方法，将多个基因或DNA片段有效地组装到一个基因工程载体，构建成多基因载体，为基因工程研究和应用提供有效的工具。

发明内容

从原理上说，利用特异重组技术进行多轮的质粒载体整合，可以把多个基因或DNA片段组装在一起。但要进行第2轮或更多轮的基因整合，要解决的一个关键问题是每一轮基因整合时如何把整合质粒中的一个载体即供给载体的骨架序列切除，即将含有1个特异重组位点、质粒复制原点、以及选择标记如抗生素标记基因的骨架片段去除。只有去除了这个骨架片段，才能进行下一轮的整合。这是因为：(1)整合质粒是2个质粒的叠加，存在2个复制原点和2个同向排列的特异重组位点，因而在细菌宿主中不稳定，在宿主重组酶或外源重组酶的作用下会发生逆向重组分离成2个质粒；(2)必须用2个质粒分别携带的不同选择标记筛选整合质粒，不切除前一轮供给载体的选择标记，新一轮供给载体就必须使用新的选择标记，而可利用的选择标记种类是很有限的。

因此，利用特异重组技术进行多次的基因重组及其切除供给载体骨架的过程要解决2个主要技术难题：(1)切除供给载体骨架时必须是不能切断已整合的基因和接受载体；(2)每一轮基因整合都有适当的切割位点用于将供给载体骨架的切除。但是每一轮整合时用于切除供给载体骨架的切割位点如果没有被破坏，该位点在以后的基因整合时就不能再用于供给载体骨架的切除。当已整合的基因越多，就越难找到可利用的切割位点。

基因工程所用的内切酶中，通常将对DNA序列切割频度较低的称为稀有内切酶。其中有一类内切酶称为homing endonuclease或meganuclease，如I-SceI、I-CeuI、I-PpoI、I-TliI、PI-SceI(VDE)、和PI-PspI。Homing endonuclease的识别切割位点有如下特点：(1)识别序列较长，如I-SceI识别18碱基对的位点，PI-SceI识别39碱基对的位点，因此在基因或DNA片段中自然出现与这些位点完全一致的序列的机率极低(I-SceI＝4^-18，PI-SceI＝4^-39)；(2)识别序列是非对称结构，当2个方向相反的位点之间的片段被homing endonuclease切除后再将两端连接，产生的连接点不再是一个完整的识别切割位点，不能被该酶识别和切割。特异重组通常是可逆的，但有些特异重组系统如attB/attP和一些经过修饰改变的特异重组位点也可以使重组单向进行，即重组交换后产生的新位点即连接点不能再参与回复重组，称为不可逆特异重组。不可逆特异重组可以用于切除2个重组位点之间的DNA片段，并同时完成2个末端的连接。

根据对以上技术问题的认识和理解，本发明设计了有效的多基因组装的解决方案。本发明的多基因组装方法是这样实现的：构建由1个接受载体和2个供给载体组成的多基因组装载体系统，利用特异重组方法使含有目的基因的不同供给载体交替地和接受载体进行多轮的质粒整合，并交替使用按特别方式设计在接受载体和2个供给载体上的2种稀有内切酶位点或不可逆特异重组位点切除整合质粒中的供给载体骨架片段，使多轮的基因整合能有效进行，直到完成多基因载体的构建。本发明的技术方案之一是利用homing endonucleas的上述特点，能有效地避免切除供给载体骨架时切断已整合的基因或接受载体。而交替重复地使用2种内切酶位点或不可逆特异重组位点，使每一轮基因整合时都有切割位点用于供给载体骨架的切除。

所述的接受载体是多基因组装过程中接受和承载外源基因片段的载体，其主要特征是：

(1)具有1个特异重组位点RS；

(2)在RS位点的近旁有1个位点S1，可以是内切酶homingendonuclease位点或限制性内切酶位点，也可以是不可逆特异重组位点；

(3)具有1个不同于供给载体含有的选择标记基因，可以是但不限于抗生素标记基因；

(4)载体的复制子是负载容量较大的复制子，可以使用但不限于P1复制子、F因子复制子、Ri复制子、pVSl复制子。

所述的2个供给载体即供给载体I和供给载体II是多基因组装过程中将目的基因往接受载体输送的载体，它们的主要特征是：

(1)具有1个特异重组位点RS，它与接受载体的RS相同或能够与接受载体的RS发生特异重组；

(2)具有1个位点S1和另1个位点S2，可以是内切酶homingendonuclease位点或限制性内切酶位点，也可以是不可逆特异重组位点；

(3)在2个供给载体中，RS、S1、S2、以及多克隆位点MCS按以下相对位置排列：

供给载体I： RS—S2—MCS—S1

供给载体II： RS—S1—MCS—S2

(4)供给载体I和供给载体II具有1个不同于接受载体含有的选择标记基因，可以是但不限于抗生素标记基因；供给载体I和供给载体II具有的选择标记基因可以相同，也可以不相同。

所述的特异重组位点RS可以是但不限于LoxP、FRT、R、attB、attP、或Gix。

所述的homing endonuclease位点可以是但不限于I-SceI、I-CeuI、I-PpoI、I-TliI、PI-SceI(VDE)、或PI-PspI。

所述的不可逆特异重组位点可以是但不限于attB、attP、修饰attB、修饰attP、修饰LoxP、修饰FRT、修饰R、或修饰Gix。

现结合附图及具体实施例对本发明的内容作进一步说明。本说明以实际构建的载体为例，但不构成对本发明权利要求的限制。

图1为多基因组装载体系统结构图，由A、B、C所示的3个载体组成。其中A为接受载体，命名为pYLTAC747；B为供给载体I，命名为pYLVS；C为供给载体II，命名为pYLSV。LoxP为所述的RS，是Cre重组酶的特异重组位点；I-SceI为所述的S1，是一种homing endonuclease内切酶I-SceI的识别切割位点；PI-SceI为所述的S2，是另一种homingendonuclease内切酶PI-SceI的识别切割位点；MCS为多克隆位点，有用于外源基因插入的多个限制性内切酶位点；LacZ为半乳糖苷酶基因选择标记；Kan为抗卡那霉素标记基因；Cm为抗氯霉素标记基因；RB，LB分别为转移DNA区即T-DNA区的右边界和左边界；Pl plasmid replicon为来源于发根农杆菌Ri质粒的复制子，可在发根农杆菌和根癌农杆菌起质粒复制作用；Ori为pUC质粒复制起始点。

图2为多基因组装的流程图，其中图2之一为基因1或单序数基因的组装过程，图2之二为基因2或双序数基因的组装过程。本图只示出2个组装循环。图中省略了pYLTAC747的RB与LB以外的载体骨架部分。

I-SceI的识别序列和切断点(箭头所示)为：

↓

5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3

3’-ATCCCTATTGTCCCATTA-5

↑

2个方向相反的I-SceI切割片段末端与寡核苷酸接头S(小写字母表示)连接产生的连接点为：

5’-TAGGGATAAnnn…nnnttatCCCTA-3

3’-ATCCCtattnnn…nnnAATAGGGAT-5

接头中的碱基数(n)一般8个或8个以上，n可以是任何碱基，但不能形成完整的I-SceI或PI-SceI识别序列。在本发明的实施例中(图5和图6)，接头S内设计了限制性内切酶NotI：

5’-gcggccgcttat-3’3-tattcgccggcg-5PI-SceI的识别序列和切断点(箭头所示)为：

↓5’-ATCTATGTCGGGTGCGGAGAAAGAGGTAATGAAATGGCA-33’-TAGATACAGCCCACGCCTCTTTCTCCATTACTTTACCGT-5

↑

2个方向相反的PI-SceI切割片段末端与寡核苷酸接头V(小写字母表示)连接产生的连接点为：5’-ATCTATGTCGGGTGCnnn…nnngcacCCGACATAGAT-33’-TAGATACAGCCcacgnnn…nnnCGTGGGCTGTATCTA-5

接头中的碱基数(n)一般8个或8个以上，n可以是任何碱基，但不能形成完整的PI-SceI或I-SceI识别序列。在本发明的实施例中(图5和图6)，接头V内设计了限制性内切酶NotI：

5’-gcggccgcgcac-3’

3-cagccgccggcg-5’

图3为构建接受载体pYLTAC747的示意图。

引物P1为：5’-CTCATG TCTAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGT-3，标下线部分为限制性内切酶XbaI位点。

引物P2为：5’-ACC GGATCCTGTTTACACCACAATATATCCTGCCACGTTAAAGACTTCAT-3，标下线部分为限制性内切酶BamHI位点，斜体部分是T-DNA左边界LB。

MCS-LoxP-I-SceI片段(序列表中的序列1)为：5’- GGATCCAAGCTTGTCGACGGCCGGCCGCGGCCGCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGGGCCGC ATTACCCTGTTATCCCTAGGCCCCAATTAGGCCTACCCACTAG-3’

标下线部分为由BamHI、HindIII、FseI、和NotI组成的多克隆位点MCS，斜体部分为Lox位点，斜体加下线部分是I-SceI位点。

图4为构建供给载体pYLVS和pYLSV的示意图。

pCAMBIA1200和pBluescript SK：质粒载体；Ori：质粒复制起始点；Cm：氯霉素抗性基因；Amp：氨苄青霉素抗性基因。LacZ：半乳糖苷酶基因选择标记。

引物P3为：5’-CTTCAATATTACGCAGCA-3

引物P4为：5’-GAGCAATATTGTGCTTAG-3

引物P5为：5’-GTTCTCGCGGTATCATTG-3

引物P6为：5’-CCATTCGCCATTCAGGCTG-3

供给载体I质粒pYLVS中的LoxP—PI-SceI—MCS—I-SceI区间序列(序列表中的序列2)为：5’-GCGCGCTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCAGATCTTTTTGGCTACCTTAAG TGCCATTTCATTACCTCTTTCTCCGCACCCGACATAGATGTTAAGAGAGTCATATCGATGCATGCGGCCGCTAGCTCGAGCTCTAGAATTCTGCAGGTACCGCGGATCCATGGGCCCGGGACTAGTCGACATGTACAAGCTTG TAGGGATAACAGGGTAATCCCTAAGATCTCAGCGCGC-3

供给载体II质粒pYLSV中的LoxP—I-SceI—MCS—PI-SceI区间序列(序列表中的序列3)为：5’-GCGCGCTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAACTTATCAGATCTTAGGG ATTAC CCTGTTATCCCTACAAGCTTGTACATGTCGACTAGTCCCGGGCCCATGGATCCGCGGTACCTGCAGAATTCTAGAGCTCGAGCTAGCGGCCGCATGCATCGATATGACTCTC TTAACATCTA TGTCGGGTGCGGAGAAAGAGGTAATGAAATGGCACTTAAGGTAGCCAAAAAGATCTCAGCGCGC-3

序列中斜体字所示部分为LoxP位点；标下线部分为PI-SceI位点，斜体加下线部分为I-SceI位点；PI-SceI位点和I-SceI位点之间的序列是多克隆位点。

图5为构建多基因载体的限制性内切酶检测图。

组装过程中及完成后产生的含有不同数目基因的载体质粒用限制性内切酶NotI消化并电泳。图下的数字表示载体装载有目的基因和DNA片段的数目。第7-10泳道的5.2kb条带、第9-10泳道的1.2kb条带、以及第10泳道的3.0kb条带分别是2个基因片段的叠加(参见图6)。M泳道示λDNA/HindIII分子量标准。

图6为多基因载体pYLTAC747-10G的基因排列结构示意图。图中省略了接受载体pYLTAC747的骨架部分。括号内数字表示基因或DNA序列组装的次序，N表示在接头S和接头V中设计的限制性内切酶NotI位点，或载体中以及Xa21基因中存在的NotI位点。NotI位点之间的数字是DNA序列的长度(kb)。

图7为多基因载体pYLTAC747-10G转化水稻的分子杂交检测图。

将非转化体对照(泳道1)、多基因载体pYLTAC747-10G(泳道2)、和水稻转化体(泳道3-12)用限制性内切酶HindIII消化、凝胶电泳分离和转移到杂交膜后，用图中所示的基因探针作分子杂交。泳道M是λDNA/HindIII分子量标准。

本发明所述的载体系统可以按以下的步骤进行多基因的组装：

(1)把多个目的基因按实际需要组装的次序排号，即基因1、基因2、基因3、基因4……。用常规的分子克隆技术把单序数和双序数的基因分别亚克隆到供给载体IpYLVS和供给载体IIpYLSV中的多克隆位点。在技术难度上许可的情况下，也可以将2个或2个以上的基因亚克隆到一个供给载体，作为一个序号的基因用于以下的组装。所述的基因可以包括各种基因和DNA序列片段。

(2)如图2之一所示，把载有基因1的供给载体I质粒pYLVS-基因1和接受载体质粒pYLTAC747共转化到具有Cre重组酶基因的大肠杆菌宿主，Cre重组酶使2种质粒在大肠杆菌细胞内发生重组整合。在选择培养基中用卡那霉素和氯霉素双抗筛选已整合的质粒，再转化到不具有Cre酶基因的大肠杆菌宿主，使整合质粒中的2个LoxP位点不再发生逆向重组。也可以用纯化的Cre重组酶使质粒pYLVS-基因1和质粒pYLTAC747在试管内反应使之重组整合，再转化到不具有Cre重组酶基因的大肠杆菌宿主，用卡那霉素和氯霉素双抗筛选已整合的质粒。在整合质粒中有2个相反方向的I-SceI位点，用内切酶I-SceI将2个位点之间的供给载体pYLVS的骨架片段切除。由于I-SceI位点被切割后产生的粘性末端碱基是非对称结构，2个相同的粘性末端之间不能互补配对，因此要用一个与之具有互补粘性末端的寡核苷酸接头S把整合质粒片段在DNA T4连接酶的作用下连接成环状。所产生的连接点不再被I-SceI识别和切割，因此在以后单序号基因的组装时再用I-SceI切除供给载体pYLVS的骨架片段也不会切断这个连接点。把连接的质粒转化大肠杆菌，先用含卡那霉素的培养基选择抗卡那霉素的克隆，再用含氯霉素的培养基鉴定出不抗氯霉素的克隆，此为已切除了pYLVS骨架片段并把基因1装进pYLTAC747的新质粒，命名为pYLTAC747-基因1。原来pYLTAC747中的I-SceI位点在新质粒pYLTAC747-基因1中已被来源于pYLVS的PI-SceI位点取代。

(3)如图2之二所示，把载有基因2的供给载体II质粒pYLSV-基因2和载有基因1的新接受载体质粒pYLTAC747-基因1共转化到具有Cre重组酶基因的大肠杆菌宿主，使2种质粒在大肠杆菌细胞内发生重组整合。在选择培养基中用卡那霉素和氯霉素双抗筛选已整合的质粒，再转化到不具有Cre重组酶基因的大肠杆菌，使整合质粒中的2个LoxP位点不再发生逆向重组。也可以用纯化的Cre重组酶使质粒pYLSV-基因2和质粒pYLTAC747-基因1在试管内反应使之重组整合，再转化到不具有Cre重组酶基因的大肠杆菌宿主，用卡那霉素和氯霉素双抗筛选已整合的质粒。在整合质粒中有2个相反方向的PI-SceI位点，用内切酶PI-SceI将2个位点之间的供给载体pYLSV的骨架片段切除。由于PI-SceI位点被切割后产生的粘性末端碱基是非对称结构，因此要用一个与之具有互补粘性末端的寡核苷酸接头V把整合质粒在DNA T4连接酶的作用下连接成环状。所产生的连接点同样不再被PI-SceI识别和切割。把连接的质粒转化大肠杆菌，先用含卡那霉素的培养基选择抗卡那霉素的克隆，再用含氯霉素的培养基鉴定出不抗氯霉素的克隆，此为已切除了pYLSV骨架片段并把基因2也装进pYLTAC747的新质粒pYLTAC747-基因1-基因2。原来pYLTAC747-基因1中的PI-SceI位点在新质粒中已被来源于pYLSV的I-SceI位点取代。其状态为图2之二所示。

以装载有目的基因的新质粒为接受载体，不断交替重复所述步骤(2)和步骤(3)，即按步骤(2)操作将单序数基因整合进接受载体，按步骤(3)操作将双序数基因整合进接受载体，直到完成所有目的基因或DNA片段的组装，构建成多基因载体。

根据本发明的方法原理，多基因组装载体的结构及其组装方法也可以作一些改变。如可以用3个或3个以上的供给载体轮流与接受载体进行重组整合。以使用3个供给载体为例，可将接受载体和3个供给载体中的各种位点的位置关系可以设置为：

接受载体： RS—S1

供给载体I： RS—S2—MCS—S1

供给载体II： RS—S3—MCS—S2

供给载体III：RS—S1—MCS—S3

其中RS是特异重组位点；S1，S2，S3可以是内切酶位点，优选的是homing endonuclease位点，也可以是不可逆特异重组位点。多基因组装时各个供给载体的循环使用顺序是：供给载体I，供给载体II，供给载体III，供给载体I，供给载体II，供给载体III，供给载体I，……。

本发明所述的多基因载体构建方法有多方面的用途。本发明可以用于构建适合各种转化方法的多基因转化载体，以此载体将多个基因一起转化受体生物细胞，获得多种基因工程产品或多个基因表达性状。这些转化方法包括但不限于农杆菌介导转化法、微弹轰击法、显微注射法、电激法、聚乙二醇法、花粉管通道法、病毒载体感染法。例如，本发明所述的接受载体pYLTAC747含有农杆菌介导的双元转化载体所需的元件如T-DNA区的右边界RB和左边界LB、对细菌的抗生素选择标记卡那霉素抗性基因、以及农杆菌质粒复制子。因此在pYLTAC747载体中装载了植物抗生素选择标记和其它目的基因后，即可以用于农杆菌介导法转化，也适用于其它方法转化。本发明也可以用于构建各种用途的基因工程载体，特别是一些含有多个元件的大型载体如细菌人工染色体、酵母人工染色体、哺乳动物人工染色体、和植物人工染色体。

本发明具有的效果和优点：

(1)可有效地将多个不同来源的基因或DNA片段按所需的次序组装在一个载体，解决了现有方法所遇到的技术障碍。

(2)采用2个或2个以上的供给载体交替地与接受载体进行多轮的重组整合，可交替重复地使用2种或少数几种稀有内切酶位点或不可逆特异重组位点切除供给载体骨架，使多轮的基因组装能有效地进行。

(3)用负载容量大的复制子构建接受载体，可承载多个外源基因和较大的DNA片段。实施例

以下举例说明本发明的实施，但本发明不限于下面提供的应用，以下描述不对本发明的权利要求构成限制。

菌株和质粒：大肠杆菌菌株DH10B、NS3529、根癌农杆菌菌株EHA105、质粒载体pBluescript SK+、pUC18、pYLTAC7、pCAMBIA1200。

工具酶和化学试剂：限制性内切酶、homing endonuclease、小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)、T4 DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶购自NEB公司和TaKaRa公司，寡核苷酸引物和核苷酸片段的合成由Sangon生物技术公司定做，X-gal、IPTG、X-glue购自Sigma公司，α-P³²dCTP购自亚辉生物工程公司。

植物材料：水稻品种中花11。

要组装的基因或功能DNA序列：抗潮酶素基因HPT、核质附着区MAR、雪花莲凝集素基因GNA、马铃薯蛋白酶抑制剂基因PinII、水稻酸性几丁质酶基因RAC22、水稻碱性几丁质酶基因RCH10、水稻抗白叶枯病基因Xa21、抗除草剂基因Bar、β葡萄糖苷酸酶基因GUS。这些基因原分别装载在质粒载体pBluescript SK+或pUC18中。

本实施例所用的基因工程基本操作技术一般按Sambrook T等在分子克隆实验手册(Sambrook T，TanaKa K，Monma T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，1989)中提供的方法进行，或按照试剂产品使用说明书的操作方法进行。所有质粒转化大肠杆菌和农杆菌采用电激导入法。实施例1：接受载体的构建

如图3所示，根据可转化人工染色体载体pYLTAC7的序列(Liu et al.，1999)合成了含有XbaI和BamHI位点的引物P1和P2(见图3的说明)，用PCR方法扩增出15690bp的载体骨架片段，用XbaI和BamHI切出粘性末端，再与合成的双链DNA片段MCS—LoxP—I-SceI(序列表中的序列1)连接成环状，转化大肠杆菌DH10B，获得接受载体pYLTAC747。实施例2：供给载体I和供给载体II的构建

如图4所示，根据氯霉素抗性基因的序列合成引物P3和P4(见图4的说明)，从质粒pCAMBIA1200(CAMBIA公司)以PCR扩增出826bp的氯霉素抗性基因Cm。根据质粒pBluescript SK(ClonTech公司)的序列合成引物P5和P6，从质粒pBluescript SK以PCR扩增出1660bp的Ori—MCS—LacZ片段。把这2个片段连接成环状，转化大肠杆菌DH10B，获得一个中间产物质粒pYL。用限制性内切酶BssHII切除质粒pYL中的MCS，与合成的双链的DNA片段LoxP—PI-SceI—MCS—I-SceI(序列表中的序列2)连接成环状，转化大肠杆菌DH10B，获得一个供给载体I质粒，命名为pYLVS。质粒pYLVS的LoxP与PI-SceI之间以及I-SceI与LacZ之间分别设有1个限制性内切酶BglII位点。用BgglII将pYLVS切成2个片段，再重新连接和转化，筛选出两个BglII位点之间的片段PI-SceI—MCS—I-SceI反向的质粒，即各个位点相对位置变成LoxP—I-SceI—MCS—PI-SceI(序列表中的序列3)的质粒，此为供给载体II，命名为pYLSV。实施例3：多基因转化载体的组装

(1)接受载体pYLTAC747上设置有多克隆位点，用常规分子克隆方法可将少数基因直接克隆到该载体。本实施例首先将抗潮酶素基因HPT直接亚克隆到pYLTAC747的克隆位点中的NotI位点。所产生的载体pYLTAC747HPT如图5的泳道2所示。

(2)将MAR序列(1.2kb)亚克隆到供给载体I质粒pYLVS，产生pYLVS-MAR。将pYLVS-MAR和pYLTAC747-HPT共转化到含有Cre重组酶基因的大肠杆菌NS3529感受态细胞，使2种质粒在大肠杆菌细胞内发生重组整合。用卡那霉素和氯霉素双抗选择整合的质粒，再转化到不含Cre酶基因的大肠杆菌DH10B。用I-SceI切除pYLVS骨架，用T4 DNA连接酶把整合载体和人工合成的寡核苷酸接头S(内设有1个NotI切点)连接成环状质粒。转化到DH10B，先用含卡那霉素的培养基选择抗卡那霉素的克隆，再转移到含氯霉素的培养基，鉴定出不抗氯霉素的克隆。这一步骤完成后获得新质粒pYLTAC747HPT—MAR，如图5的泳道3所示。

(3)将GNA基因(5.2kb)亚克隆到供给载体II质粒pYLSV，产生pYLSV-GNA。将pYLSV-GNA和pYLTAC747—MAR-HPT共转化到NS3529。用卡那霉素和氯霉素双抗选择整合的质粒，再转化到DH10B。用PI-SceI切除pYLSV骨架，用T4 DNA连接酶把整合载体和寡核苷酸接头V(内设有1个NotI切点)连接成环状质粒。转化到DH10B，先用含卡那霉素的培养基选择抗卡那霉素的克隆，再转移到含氯霉素的培养基，鉴定出不抗氯霉素的克隆。这一步骤完成后获得新质粒pYLTAC747HPT—MAR—GNA，如图5的泳道4所示。

(4)将PinII(3.0kb)亚克隆到pYLVS，产生pYLVS-PinII。将pYLVS-PinII和pYLTAC747HPT—MAR—GNA共转化到NS3529。用卡那霉素和氯霉素双抗选择整合的质粒，再转化到大肠杆菌DH10B。用I-SceI切除pYLVS骨架，用T4 DNA连接酶把整合载体和接头S连接成环状质粒。转化到DH10B，先用含卡那霉素的培养基选择抗卡那霉素的克隆，再转移到含氯霉素的培养基，鉴定出不抗氯霉素的克隆。这一步骤完成后获得新质粒pYLTAC747HPT—MAR—GNA—PinII，如图5的电泳图泳道5所示。

(5)将原来克隆在同一个质粒载体的2个基因RAC22/RCH10基因(6.4kb)亚克隆到pYLSV，产生pYLSV-RAC22/RCH10。将pYLSV-RAC22/RCH10和pYLTAC747HPT—MAR—GNA—PinII共转化到NS3529。用卡那霉素和氯霉素双抗选择整合的质粒，再转化到DH10B。用PI-SceI切除pYLSV骨架，用T4 DNA连接酶把整合载体和接头V连接成环状质粒。转化到DH10B，先用含卡那霉素的培养基选择抗卡那霉素的克隆，再转移到含氯霉素的培养基，鉴定出不抗氯霉素的克隆。这一步骤完成后获得新质粒pYLTAC747HPT—MAR—GNA—PinII—RAC22/RCH10，如图5的泳道6所示。

(6)将Xa21(9.7kb)亚克隆到pYLVS，产生pYLVS-Xa21。将pYLVS-Xa21和pYLTAC747HPT—MAR—GNA—PinII-RAC22/RCH10共转化到NS3529。用卡那霉素和氯霉素双抗选择整合的质粒，再转化到大肠杆菌DH10B。用I-SceI切除pYLVS骨架，用T4 DNA连接酶把整合载体和接头S连接成环状质粒。转化到DH10B，先用含卡那霉素的培养基选择抗卡那霉素的克隆，再转移到含氯霉素的培养基，鉴定出不抗氯霉素的克隆。这一步骤完成后获得新质粒pYLTAC747HPT—MAR—GNA—PinII—RAC22/RCH10-Xa21，如图5的泳道7所示(注：Xa21基因内部有2个NotI位点)。

(7)将Bar基因(1.8kb)亚克隆到pYLSV，产生pYLSV-Bar。将pYLSV-Bar和pYLTAC747HPT—MAR—GNA—PinII—RAC22/RCH10—Xa21共转化到NS3529。用卡那霉素和氯霉素双抗选择整合的质粒，再转化到DH10B。用PI-SceI切除pYLSV骨架，用T4 DNA连接酶把整合载体和接头V连接成环状质粒。转化到DH10B，先用含卡那霉素的培养基选择抗卡那霉素的克隆，再转移到含氯霉素的培养基，鉴定出不抗氯霉素的克隆。这一步骤完成后获得把新质粒pYLTAC747HPT—MAR—GNA—PinII—RAC22/RCH10—Xa21—Bar，如图5的泳道8所示。

(8)将上述步骤(2)的pYLVS-MAR和pYLTAC747HPT—MAR—GNA—PinII—RAC22/RCH10—Xa21—Bar共转化到NS3529。用卡那霉素和氯霉素双抗选择整合的质粒，再转化到大肠杆菌DH10B。用I-SceI切除pYLVS骨架，用T4 DNA连接酶把整合载体和接头S连接成环状质粒。转化到DH10B，先用含卡那霉素的培养基选择抗卡那霉素的克隆，再转移到含氯霉素的培养基，鉴定出不抗氯霉素的克隆。这一步骤完成后获得新质粒pYLTAC747HPT—MAR—GNA—PinII—RAC22/RCH10—Xa21—Bar—MAR，如图5的泳道9所示。

(9)将LB/GUS/RB序列(3.0kb)亚克隆到pYLSV，产生pYLSV-LB/GUS/RB。将LB/GUS/RB和pYLTAC747HPT—MAR—GNA—PinII—RAC22/RCH10—Xa21—Bar—MAR共转化到NS3529。用卡那霉素和氯霉素双抗选择整合的质粒，再转化到DH10B。用PI-SceI切除pYLSV骨架，用T4 DNA连接酶把整合载体和接头V连接成环状质粒。转化到DH10B，先用含卡那霉素的培养基选择抗卡那霉素的克隆，再转移到含氯霉素的培养基，鉴定出不抗氯霉素的克隆。这一步骤完成后获得新质粒pYLTAC747HPT—MAR—GNA—PinII—RAC22/RCH10—Xa21—Bar—MAR—LB/GUS/RB，如图5的泳道10所示。

组装完成的多基因载体共含有10个外源基因和功能DNA序列，命名为pYLTAC747-10G(图6)。本实施例说明本发明所述的方法可有效地把多个基因和DNA序列组装到一个载体。实施例4：多基因转化载体的水稻转化

把质粒pYLTAC747-10G导入农杆菌EHA105，获得含有pYLTAC747-10G的农杆菌EHA105(pYLTAC747-10G)，用于转化水稻胚愈伤组织。pYLTAC747-10G含有由潮霉素抗性基因HPT和除草剂抗性基因Bar，因此水稻转化体可用潮霉素和除草剂Basta进行筛选。将水稻成熟种子或未成熟种子的胚在诱导培养基上，在25℃黑暗条件下诱导愈伤组织。成熟种子的愈伤组织14天后、未成熟种子的愈伤组织4天后转移到继代培养基培养。把EHA105(pYLTAC747-10G)在YM琼脂培养基28℃培养1天，收集在含有100μmol/L的乙酰丁香酮的40ml MB液体培养基，28℃培养至OD₅₅₀＝05-1.0。将水稻愈伤组织浸入菌液20分钟，吸干菌液后转移到MB琼脂培养基，25℃黑暗条件下培养3天。转移愈伤组织至含有50mg/L潮霉素的培养基培养，每14天继代一次，继代2次。抗性筛选后，转入再生培养基分化出转化苗，获得转化植株。实施例5：水稻转化植株的分子杂交鉴定

从水稻转化植株提取基因组DNA，用限制性内切酶HindIII酶切和琼脂糖凝胶电泳。以转化所用的一些基因和DNA序列为探针进行Southern印迹分子杂交，发现外源基因序列已导入到水稻基因组中(图7)。这些结果说明用本发明所述方法构建的多基因载体可有效地把所负载的多个基因导入植物基因组。

序列表序列1(a)分子类型：DNA(b)长度：118碱基(c)序列：ggatccaagc ttgtcgacgg ccggccgcgg ccgcataact tcgtatagca tacattatac 60gaagttatgg gccgcattac cctgttatcc ctaggcccca attaggccta cccactag 118序列2(a)分子类型：DNA(d)长度：245碱基(c)序列：gcgcgctcat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atcagatctt tttggctacc 60ttaagtgcca tttcattacc tctttctccg cacccgacat agatgttaag agagtcatat 120cgatgcatgc ggccgctagc tcgagctcta gaattctgca ggtaccgcgg atccatgggc 180ccgggactag tcgacatgta caagcttgta gggataacag ggtaatccct aagatctcag 240cgcgc 245序列3(a)分子类型：DNA(b)长度：118碱基(c)序列：gcgcgctcat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atcagatctt agggattacc 60ctgttatccc tacaagcttg tacatgtcga ctagtcccgg gcccatggat ccgcggtacc 120tgcagaattc tagagctcga gctagcggcc gcatgcatcg atatgactct cttaacatct 180atgtcgggtg cggagaaaga ggtaatgaaa tggcacttaa ggtagccaaa aagatctcag 240cgcgc 245

Claims

1.一种多基因载体的构建方法，其特征在于由1个接受载体和至少2个供给载体组成的多基因组装载体系统，利用特异重组方法使不同的供给载体交替地和接受载体进行2轮以上的基因组装，构建成多基因载体。

2.根据权利要求1所说的方法，其特征在于所说的接受载体：

(1)具有1个特异重组位点RS；

(2)在RS近旁具有1个位点S1，可以是内切酶homing endonuclease位点，或是限制性内切酶位点，或是不可逆特异重组位点；

(3)具有1个不同于供给载体含有的选择标记基因；

(4)具有负载量大的复制子元件。

3.根据权利要求1所说的方法，其特征在于所说的供给载体I和供给载体II：

(2)具有1个位点S1和另1个位点S2，可以是内切酶homingendonuclease位点，或是限制性内切酶位点，或是不可逆特异重组位点；

(3)具有一个多克隆位点MCS；

(4)供给载体I中的RS、S1、S2、和MCS位点按RS-S2-MCS-S1的相对位置排列；

(5)供给载体II中的RS、S1、S2、和MCS位点按RS-S1-MCS-S2的相对位置排列；

(6)具有1个不同于接受载体含有的选择标记基因。

4.根据权利要求1所说的方法，其特征在于由所说的接受载体和供给载体I和供给载体II组成多基因组装载体系统，利用特异重组方法通过供给载体I和供给载体II交替地和接受载体进行2轮以上的基因组装，构建多基因载体，具体组装的步骤为：

(1)把目的基因或DNA片段按需要组装的次序排号，用常规的分子克隆技术把单序数和双序数的基因或DNA片段分别亚克隆到供给载体I和供给载体II的多克隆位点MCS；1个供给载体可以亚克隆1个以上的基因片段；

(2)把载有基因1的供给载体I质粒和接受载体质粒共转化到含有特异重组酶基因的大肠杆菌宿主，使2种质粒中的特异重组位点RS发生重组，或用分离纯化的特异重组酶进行试管内反应使2种质粒重组整合；用接受载体和供给载体的选择标记筛选整合质粒；用切割S1位点的内切酶切除整合质粒中2个S1位点之间的供给载体骨架片段，用T4 DNA连接酶和双链寡核苷酸接头把含有基因1的接受载体连接成环状；如S1是不可逆特异重组位点，用相应的特异重组酶去除整合质粒中2个S1位点之间的供给载体骨架片段并同时完成载体的环化；此步骤获得载有基因1的新接受载体；

(3)把载有基因2的供给载体II质粒和载有基因1的新接受载体质粒共转化到含有特异重组酶基因的大肠杆菌宿主，使2种质粒中的特异重组位点RS发生重组整合，或用分离纯化的特异重组酶进行试管内反应使2种质粒重组整合；用接受载体和供给载体的选择标记筛选整合质粒，用切割S2的内切酶切除整合质粒中2个S2位点之间的供给载体骨架片段，用T4 DNA连接酶和双链寡核苷酸接头把含有基因1的接受载体连接成环状；如S2是不可逆特异重组位点，用相应的特异重组酶去除整合质粒中2个S2位点之间的供给载体骨架片段并同时完成载体的环化；此步骤获得载有基因1和基因2的新接受载体；

5.根据权利要求1或2或3所说的方法构建的接受载体和供给载体，其特征在于接受载体为植物基因转化载体pYLTAC747，供给载体I为pYLVS，供给载体II为pYLSV。

6.根据权利要求5所说的接受载体和供给载体，其特征在于接受载体pYLTAC747具有序列表中序列1的DNA序列，供给载体pYLVS具有序列表中序列2的DNA序列，供给载体pYLSV具有序列表中序列3的DNA序列。

7.权利要求1所说的多基因载体构建方法的应用，其特征在于把多个基因或DNA片段装载到一个载体，构建成基因工程载体包括转化表达载体，用此载体把多个基因一起转化受体生物细胞，获得多种基因工程产品或多个基因的表达性状。