CN106318961B

CN106318961B - 一种多dna片段载体的构建方法及其应用

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Publication number: CN106318961B
Application number: CN201610407066.1A
Authority: CN
Inventors: 刘军华; 毛冠凡
Original assignee: Weiminghu Bio Agriculture Group Ltd; Pioneer Overseas Corp
Current assignee: Weiminghu Bio Agriculture Group Ltd; Pioneer Overseas Corp
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2016-06-12
Publication date: 2019-07-09
Anticipated expiration: 2036-06-12
Also published as: CN106318961A

Abstract

本发明公开了一个组装载体和多DNA片段或多基因表达单元载体的构建方法。所述组装载体为一个基于切刻内切酶识别位点的组装载体，既可以用作接受载体也可以用作供给载体，所述方法包括利用切刻内切酶酶切和连接反应将作为供给载体的组装载体中目的DNA片段组装到作为接受载体的组装载体中构建成多DNA片段载体。本文中的组装载体和方法可用于构建任意的包含多DNA片段遗传工程载体，并在不同的细胞、组织或者器官中表达。

Description

一种多DNA片段载体的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于切刻内切酶的多DNA片段载体的构建方法及其应用。

背景技术

转基因技术是基因工程的基本技术，它在21世纪潜移默化地促使农业、工业、营养学甚至是医疗领域发生革命性的改变。目前大多数转基因技术主要被用于向生物细胞导入少数(通常1～3个)基因。然而，多数生命代谢进程是通过众多的基因互作来实现的，且有效的代谢过程将通过调控多个基因的时间和空间表达来实现。例如，尽管四类胡萝卜素合成基因中的三个基因已被成功导入“黄金大米”，使其能够产生维生素原A(Ye et al.(2000)Science 287:303-305),但是维生素A的高效吸收还需要引入另外三个基因来辅助完成。同样，据估计，产生一个真正意义上即耐用又可生物降解的塑料(聚羟基丁酸酯和聚羟基戊酸酯)，需要向作物中导入四到六个基因或几条代谢途径的通路(Slater et al.(1999)NatBiotechnol 17:1011-1016)。

近年来，随着分子生物学技术的发展，通过多基因转化改良动植物性状越来越受到重视，于是(1)有性杂交(Ma and Hiatt.(1995)Science 268:716-719)、(2)连续多次转化(Lapierre et al.(1999)Plant Physiol 119:153-164)、(3)多个质粒的共转化(Chenet al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95:2767-2772；Ye et al,(2000)Science 287:303-305)、(4)利用常规的分子克隆技术把尽可能多的基因连接在同一个载体上进行转化(Daniell et al,(2001)Trends Plant Sci 6:219-226)、(5)由Cre/LoxP介导的多基因转化体系(Dale EC.(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88:10558-10562；Muyrers et al.(2001)Trends Biochem Sci 26:325-331；Liu et al.(2003)Proc Natl Acad Sci USA100:5962-5967；and Patents CN02134869.1)、(6)由MultiSite-Gateway介导的多基因转化体系(Chen et al.(2006)Plant Mol Biol 62:927-36、(7)由Gibson assembly介导的多基因转化体系(Gibson et al.(2009)Nat Methods 2009 6:343-345)、和(8)SLiCE(Seamless Ligation Cloning Extract，无缝连接克隆提取)介导的多基因转化体系(Zhang et al.(2012)Nucleic Acids Res 40:e55)等方法应运而生。

方法(1)、(2)和(3)由于费时费力，稳定性不佳等原因不便于使用。方法(4)比较常用，但是传统的分子克隆技术一般只能将少数基因，通常1～3个基因连接到一个载体结构上，而要将更多的基因克隆连接到一个载体上时，随着插入片段数目的增加，载体总长度增加，可利用的克隆位点即唯一的限制性内切酶切位点减少，因此不适合进行多次连接反应将多个不同的DNA分子连接在一个载体上。方法(5)创建了不可逆的新型Cre-loxP重组系统，该方法具有高效、承载能力大和易于转化的优点，这一转化系统由1个接受载体与2个供给载体组成，通过交替使用2个供给载体，将多个基因连入接受载体中。方法(6)在进行重组反应时同样也存在需要交替使用多套不同的载体，而且需要用到特殊受体细胞和不同的抗性筛选方式，因此操作复杂。

如上所述，上述方法存在一些的问题，如受可用限制性位点的限制、需使用不同的载体、具有复杂的过程等，因此需要一个高效的、可靠的能克服上述缺点的多DNA片段载体的组构建方法。

发明概述

本发明公开了一种组装载体和一种将多个DNA片段组装在一个载体中的构建方法。

在一个实施方案中，公开了一种组装载体，所述组装载体包含复制起始位点、抗性筛选标记基因，还包含一个nicking box循环组装单元，所述nicking box循环组装单元包含沿DNA 5’→3’方向排列的A、B、C、D四个nicking box，一个高效的DNA克隆位点MCS和三个间隔序列。

所述高效DNA克隆位点MCS包含限制性内切酶识别位点,位于A和B nicking box之间，用于DNA片段的插入。

所述三个间隔序列分别位于C和D nicking box之间，B和C nicking box之间，与Dnicking box之后，用于间隔相邻的nicking box。所述间隔序列为任意长度，不能形成不正常的二级结构，且不含有切刻内切酶识别位点。所述间隔序列的长度至少为30bp，C和Dnicking box之间的长度优选为40bp。B和C nicking box之间和D nicking box之后的间隔序列，含有归位内切酶识别位点的DNA序列，用于基因组装结束时切除由每轮基因组装所带进的供体骨架。所述归位内切酶包括但不限于I-CeuI、I-SceI、PI-PspI and PI-SceI。进一步的，归位内切酶是I-SceI。

所述A、B、C和D四个nicking box，均由一对同种切刻内切酶的识别位点和位于所述同种切刻内切酶识别位点之间的间隔碱基组成，且所述同种切刻内切酶的两个切刻位点分别位于双链DNA的上下两条链上；所述A和D nicking box各含有切刻内切酶M酶切位点，所述B和C nicking box各含有切刻内切酶N的酶切位点，所述切刻内切酶M和N不同，但为同类切刻内切酶。所述A、B、C和D nicking box中同种切刻内切酶识别位点之间的间隔碱基个数为任意排列方式的0～10个A、C、G或T，在切刻内切酶酶切后形成粘性末端的一部分；所述A nicking box中的粘性末端与所述B nicking box中粘性末端互补，所述C nicking box中的粘性末端与所述D nicking box中粘性末端互补，且所述A和B nicking box中的粘性末端与所述C和D nicking box中粘性末端不互补。

所述切刻内切酶M和N选自Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI和Nb.BtsI。进一步的，所述M和N为Nb.BsrDI或Nb.BtsI。

在其他的实施方案中，所述切刻内切酶M和N选自Nt.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI和Nt.CviPII。

在另一个实施方案中，公开了一种将多个DNA片段组装在一个载体中的构建方法，所述方法通过一个组装载体实现，其中，所述组装载体既可以用作接受载体也可以用作供给载体，并组成了多DNA片段组装系统；通过切刻内切酶酶切和连接反应将所述作为供给载体的组装载体中目的DNA片段组装到所述作为接受载体的组装载体中构建成多DNA片段载体。

所述组装载体是通过向初始载体中添加nicking box循环组装单元得到的，所述组装载体包含复制起始位点、抗性筛选标记基因，还包含nicking box循环组装单元。所述nicking box循环组装单元包含沿DNA 5’→3’方向排列的A、B、C、D四个nicking box，一个高效的DNA克隆位点MCS和三个间隔序列。

所述三个间隔序列分别位于C和D nicking box之间，B和C nicking box之间，与Dnicking box之后，用于间隔相邻的nicking box。所述间隔序列为任意长度，不能形成不正常的二级结构，且不含有切刻内切酶识别位点。所述间隔序列的长度至少为30bp，C和Dnicking box之间的长度优选为40bp。B和C nicking box之间和D nicking box之后的间隔序列，含有归位内切酶识别位点的DNA序列，用于基因组装结束时切除由每轮基因组装所带进的供体骨架。归位内切酶包括但不限于I-CeuI、I-SceI、PI-PspI and PI-SceI。进一步的，归位内切酶是I-SceI。

所述A、B、C和D四个nicking box，均由一对同种切刻内切酶的识别位点和位于所述同种切刻内切酶识别位点之间的间隔碱基组成，且所述同种切刻内切酶的两个切刻位点分别位于双链DNA的上下两条链上；所述A和D nicking box各含有切刻内切酶M酶切位点，所述B和C nicking box各含有切刻内切酶N的酶切位点，所述切刻内切酶M和N不同，但为同类切刻内切酶。所述A、B、C和D nicking box中同种切刻内切酶识别位点之间的间隔碱基个数为任意排列方式的0～10个A、C、G或T，在切刻内切酶酶切后形成粘性末端的一部分。所述A nicking box中的粘性末端与所述B nicking box中粘性末端互补，所述C nicking box中的粘性末端与所述D nicking box中粘性末端互补，且所述A和B nicking box中的粘性末端与所述C和D nicking box中粘性末端不互补。

所述通过切刻内切酶酶切和连接反应将所述作为供给载体的组装载体中目的DNA片段组装到所述作为接受载体的组装载体中构建成多DNA片段载体的方法，具体步骤如下：

(1)将目的DNA片段按需要组装的次序编号，并将所述目的DNA片段分别亚克隆到所述组装载体高效DNA克隆位点MCS；

(2)使用切刻内切酶N酶切所述作为接受载体的组装载体，获得含有DNA片段#1的载体骨架片段，使用切刻内切酶M酶切所述作为供给载体的组装载体，获得含有目的DNA片段#2的片段；获得的所述载体骨架片段和所述目的DNA片段#2含有互补的粘性末端，将两者连接，转化大肠杆菌感受态细胞，经过筛选培养，获得含有所述DNA片段#1和所述DNA片段#2的新载体；

(3)以步骤(2)构建的所述新载体为接受载体，不断重复步骤(2)可以将多个目的DNA片段组装，构建成含有多个DNA片段的载体。

进一步的，上述操作步骤还包括另外一个步骤，使用归位内切酶I-CeuI、I-SceI、PI-PspI或PI-SceI在多DNA片段组装结束时将装载在多DNA片段载体上的供体骨架去除。进一步的，所述的归位内切酶是I-SceI。

在另一个实施方案中，组装载体是pHSG396-URS-GW。

在一些实施方案中，为了节省时间，可以先将多个DNA片段载在组装载体上，然后，与另外一个组装了多个DNA片段的组装载体进一步组装。

在另一个实施方案中，本发明的方法可以用于将多个含有启动子、基因和终止子序列的基因表达单元组装在一个载体中。

在另一个实施方案中，本发明的方法可以构建含有多个DNA片段或多个目的基因的任意基因工程载体，并将基因转入且使基因在不同的细胞、组织和有机体中表达。

附图说明和序列表

根据以下的发明详述和附图及序列表，可以更全面地理解本发明，以下的发明详述和附图及序列表形成本申请的一部分。

序列描述以及关联的序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825中所列出的管理专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic AcidsRes.13：3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中列出的规则。

图1是基于切刻内切酶的nicking box循环组装单元排布示意图。本示意图以切刻内切酶M为Nb.BtsI(下划线标记的识别碱基)，N为Nb.BsrDI(波浪线标记的识别碱基)举例说明，nicking box循环组装单元由沿DNA 5’→3’方向排列的A、B、C、D四个nicking box，一个高效的DNA克隆位点MCS，和三个间隔序列组成。(1)A和D nicking box各含有切刻内切酶M的酶切位点，B和C nicking box各含有切刻内切酶N的酶切位点；(2)A和B nicking box之间有高效的DNA克隆位点MCS，用于DNA片段或者基因表达单元的插入；(3)C和D nickingbox之间为短间隔序列，用于间隔两个nicking box；(4)B和C nicking box之间和Dnicking box之后有间隔序列，用于间隔nicking box；(5)A和B nicking box中粗体碱基与C和D nicking box中斜体碱基为预先设计的，目的是产生粘性末端，且粗体碱基与斜体碱基的组成个数和排布方式不同；(6)MCS为设置在DNA双链上的多克隆位点，由多个限制性内切酶识别序列组成。

图2是基于切刻内切酶的多DNA片段组装的流程图。本图省略nicking box循环组装单元以外的载体骨架部分。A.切刻内切酶M(例如Nb.BtsI)酶切后，可将供给载体上的目标DNA片段unit 2酶切下，并产生粘性末端；B.切刻内切酶N(例如Nb.BsrDI)酶切后，可获得带有目标DNA片段unit 1的接受载体骨架，并产生粘性末端；C.连接后产生的含有目的DNA片段unit1和目的DNA片段unit2的新的nicking box循环组装片段的排布；D.经归位内切酶I-SceI处理掉冗余结构后自连，得到的含有目的DNA片段unit 1和目的DNA片段unit 2的结构；unit 1和unit 2分别表示目的DNA片段或者目的基因表达单元。

图3是pMD19-GW-T载体图。本载体在质粒pMD19的基础上添加了gateway重组位点产生的。

图4是pHSG396初始载体图。

图5是pMA-RQ-Seqone载体图和nicking box循环组装单元中各个酶切位点的排布。BtsI和BsrDI分别表示切刻内切酶Nb.BtsI和Nb.BsrDI；XcmI限制内切酶用于将该位点之间的序列通过酶切连接的方式转移到pHSG396–GW–T-XcmI中；AscI与SpeI位点之间可以引入启动子，AsiSI与NotI位点之间可以引入终止子，SpeI与AsiSI位点之间可以引入目的基因或者DNA片段，AscI、SpeI、AsiSI和NotI位点之间均可引入目的DNA片段或者目的基因；Nb.BtsI(404、407)对应A nicking box(第一个Nb.BtsI nicking box)，Nb.BsrDI(458、461)对应B nicking box(第一个Nb.BsrDI nicking box)，Nb.BsrDI(493、495)对应Cnicking box(第二个Nb.BsrDI nicking box)，Nb.BtsI(549、551)对应D nicking box(第二个Nb.BtsI nicking box)。

序列表：

SEQ ID NO:1是质粒pMA-RQ-Seqone中nicking box循环组装单元的核苷酸序列。

SEQ ID NO:2是目的基因DsRed的核苷酸序列。

SEQ ID NO:3是Actin启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO:4是Ubiquitin启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO:5是KT250启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO:6是K630p启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO:7是35SMini启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO:8是P-LTPII启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO:9是CaMV35S启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO:10是OCS终止子的核苷酸序列。

SEQ ID NO:11是CaMV 3’UTR终止子的核苷酸序列。

SEQ ID NO:12是NOS终止子的核苷酸序列。

SEQ ID NO:13是T-PINⅡ终止子的核苷酸序列。

SEQ ID NO:14是引物CHECK-R-DsRed的核苷酸序列。

SEQ ID NO:15是引物UCSeq的核苷酸序列。

SEQ ID NO:16是引物KT250Seq的核苷酸序列。

SEQ ID NO:17是引物KT630Seq的核苷酸序列。

SEQ ID NO:18是引物35SSeq的核苷酸序列。

SEQ ID NO:19是引物LTPIISeq的核苷酸序列。

SEQ ID NO:20是引物Check-PinII的核苷酸序列。

详细描述

本发明公开了一种组装载体和用于构建含多个DNA片段的载体的方法。多DNA片段或者多基因表达盒可以定向的组装在一个基因工程载体中，为基因工程的研究和应用提供了高效工具。本发明中的组装载体可以灵活的将多DNA片段或者基因表达盒组装在一个载体中。与其它基因组装方法相比，本发明中的方法具有多个优点，包括但不限于：在多基因或者多DNA片段组装过程中(1)转化过程不依赖于特殊受体细胞，(2)重组子筛选时不依赖多种不同的筛选抗性基因，(3)使用一套载体完成多DNA片段或者基因表达盒的组装，(4)简化实验步骤，(5)降低成本、提高效率。

应该理解，本发明中的描述是可变的，并不局限于特定的实施方式。同时也应该理解，本文中的术语仅是为了描述特定实施方式，而不是用于限制。如本文所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。

如果没有特殊说明，本文中的所有序列均是5'到3'方向。本文中详述的数字范围包括界定该数字范围的两端的数字，且包括界定范围内的任意整数或者非整数部分。除另有说明外，本文中所使用的所有技术和科学术语，与本领域中普通的技术人员目前的理解具有相同的含义。本发明中，下列术语将按照下列定义使用。本文中列出的每篇参考文献的公开内容的全文以引文方式并入本文。

下面的定义将有助于了解本发明。

“碱基”和“核苷酸”本发明中可互换使用，指单字母表示的核苷酸，“A”、“C”、“G”分别表示DNA或者RNA中的腺嘌呤核苷酸或者脱氧腺嘌呤核苷酸，胞嘧啶核苷酸或者脱氧胞嘧啶核苷酸，鸟嘌呤核苷酸或者脱氧鸟嘌呤核苷酸，“T”指脱氧尿嘧啶核苷酸。

“变性”也叫DNA熔解，是指氢键断裂使得双链DNA展开并分成单链的过程。

“间隔碱基”指位于nicking box中双链DNA上的两个切刻内切酶识别位点之间的碱基或者核苷酸。间隔碱基可以是A、T、C、G，间隔碱基将成为酶切后线性载体或者DNA片段粘性末端的一部分。

“基因表达单元”本发明中指包含启动子、基因和终止子序列的DNA片段。

“DNA片段”本文中指一段DNA，DNA片段包括一个DNA片段、一个基因、或者一个基因表达单元。

术语“上链”指图片中水平放置的DNA双链中位于上部5′到3′方向的核酸链。

术语“下链”指图片中水平放置的DNA双链中位于下部3′到5′方向的核酸链。

“接受载体”指多DNA片段组装过程中接受并承载外源DNA片段的载体。

“供给载体”指多DNA片段组装过程中提供亚克隆DNA片段或者基因表达盒给接受载体的载体。

“组装载体”用于多DNA片段或者基因表达盒的组装。组装载体包含nicking box循环组装单元，可以循环组装多DNA片段而不受选择标记的限制。本发明中，组装载体不仅可以用作接受载体也可以用作供给载体。另外，具有不同选择标记的组装载体在组装过程中可以用作接受载体和供给载体，并用于多DNA片段或者多基因表达单元组装的过程。

“设计的方向”指相对于另外一个DNA片段和组装载体的所期望的DNA片段的连接方向。通过改变nicking box中切刻内切酶识别位点之间的间隔碱基的数目和排列方式可以预设DNA片段等的排列方向，并在线性载体或者DNA片段的末端产生突出的核苷酸。一条DNA片段的突出部分与另一条DNA片段或者线性载体互补，并通过氢键配对，确保多DNA片段按照设计的方向连接。

“质粒”是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体外的脱氧核糖分子，大部分的质粒是环状构型。

“质粒载体”是指通常含有复制起始位点、抗性筛选标记，多克隆位点的人工改造质粒。现存的质粒载体可以用作“初始载体”，并经过本发明中的方法改造获得带有nickingbox循环组装单元的组装载体。初始载体可以选自PBR322、PUC系列、PGEM系列、pBluescript(简称pBS)、pMD19-T载体、pMD18-T载体、pMD19-T Simple载体、pMD18-T Simple载体等。

“引物对”由一个上游引物和一个下游引物组成，用于扩增目的DNA片段或者验证目的DNA片段是否插入目的质粒中。

“识别序列”、“识别位点”、和“酶切位点”可以互换使用，均指限制性内切酶、切刻内切酶或者归位内切酶识别的核苷酸序列。

限制性内切酶是指一类能够识别并切割双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列的核酸水解酶。Ⅱ型限制性内切酶为最常用的限制性内切酶，其特点为能够识别和切割4-8个碱基对的核苷酸序列，且大多数识别序列具有回文结构，没有甲基化修饰酶功能。Ⅱ型限制性内切酶的切割方式有三种，(1)切割产生5’突出末端，(2)切割产生3’突出末端，和(3)切割产生平末端。任意Ⅱ型限制性内切酶可以用于本文中描述的载体的构建方法中。

“选择标记”是指当表达量足够高时可以对选择剂产生抗性的任意标记。选择标记和相应的选择剂包括，但不限于，除草剂抗性基因和除草剂、抗生素抗性基因和抗生素、化学抑制基因和相应的化学试剂。

多种试剂可以赋予除草剂抗性，包括氨基酸合成抑制剂、光合作用抑制剂、脂质抑制剂、生长调节剂、细胞膜扰乱剂、色素抑制剂、幼苗生长抑制剂。这些试剂包括，但不限于，咪唑啉酮、磺脲类药物、三唑并嘧啶类、草甘膦、稀禾定、精恶唑禾草灵、草铵膦、草丁膦、三嗪、溴苯腈等(Holt(1993)Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 44：203-229；和Mikiet al.(2004)J Biotechnol 107：193-232)。选择标记包括赋予除草剂抗性的序列，还包括，但不限于赋予草铵膦抗性的编码草丁膦乙酰转移酶(PAT)bar基因(Thompson et al.(1987)EMBOJ 6:2519-2523)，赋予草甘膦抗性的草甘膦氧化还原酶(GOX)、草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)和5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)(Barry et al.(1992)inBiosynthesis and Molecular Regulation of AminoAcids in Plants,B.K.Singh etal.(Eds)pp.139-145；Kishore et al.(1992)Weed Tech 6：626-634；Castle(2004)Science 304：1151-1154；Zhou et al.(1995)Plant Cell Rep15：159-163；WO97/04103；WO02/36782和WO03/092360)。其它的筛选标记包括赋予甲氨蝶呤(methotrexate)抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)(例如，Dhir et al.(1994)Improvements of Cereal Quality byGenetic Engineering,R.J.Henry(ed),Plenum Press，New York和Hauptmann et al.(1988)Plant Physiol 86:602-606)，和对咪唑啉酮(imidiazolinones)和/或磺脲类(sulfonylureas)如咪唑乙烟酸(imazethapyr)和/或氯磺隆(chlorsulfuron)产生抗性的乙酰羟酸合酶(AHAS或ALS)突变序列(例如Zu et al.(2000)Nat Biotechnol 18：555-558；美国专利6,444,875和6,660,910；Sathasivan et al.(1991)Plant Physiol 97：1044-1050；Ott et al.(1996)J Mol Biol 263：359-368；和Fang et al.(1992)Plant Mol Biol18：1185-1187)。

细菌抗药基因包括，但不限于，赋予卡那霉素、巴龙霉素、新霉素和G418抗性的新霉素磷酸转移酶(nptII)，赋予潮霉素B抗性的潮霉素磷酸转移酶(hph)(Bowen(1993)Markers for Plant Gene Transfer,Transgenic Plants,Vol.1,Engineering andUtilization；Everett et al.(1987)Bio/Technology 5：1201-1204；Bidney et al.(1992)Plant Mol Biol 18：301-313；和WO97/05829)。

另外，化学抗性基因还包括赋予4-甲基色氨酸(4-mT)抗性的色氨酸脱羧酶(Goodijn et al.(1993)Plant Mol Biol 22：907-912)和赋予溴苯腈抗性的溴苯腈水解酶。选择标记可以为氰酰胺水解酶(Cah)，例如，Greiner et al.(1991)Proc Natl AcadSci USA 88：4260-4264；和Weeks et al.(2000)CropSci 40：1749-1754。氰酰胺水解酶将氰胺转化成脲，从而赋予氰胺抗性。任何形式或者衍氰胺可以用作选择剂，包括，但不限于，氰胺化钙((SKW,Trotberg Germany))和单氰胺((SKW))(美国专利6,096,947和6,268,547)。氰酰胺水解酶的多核苷酸和/或多肽变体仍保留氰酰胺水解酶活性，一个氰酰胺水解酶生物活性变体仍保留将氰胺转变为脲的活性。这种活性的测试方法包括测定表达氰酰胺水解酶植物对氰胺的抗性，另外的测试包括氰酰胺水解酶比色法测试(Weekset al.(2000)Crop Sci 40：1749-1754；和美国专利6,268,547)。

“间隔”和“间隔序列”本发明中互换使用，指一段DNA片段。

术语“粘性末端”指核酸链的突出部分，可以自由的与其它的DNA片段、组装载体的粘性末端进行碱基配对。

“目的DNA片段”指感兴趣的DNA片段，可以扩增、提取并连接到组装载体上。

使用切刻内切酶组装DNA片段的方法

切刻内切酶

切刻内切酶是NEB公司(NEW ENGLAND BioLabs Inc.)开发出的一类特殊的限制性内切酶，它仅切割双链DNA底物的一条链，不会切断DNA分子。切刻作用产生的3'-羟基及5'-磷酸基，可以进行许多其他反应的第一步：DNA的合成置换、链置换扩增、外切降解、产生小的间隔等。NEB公司开发的切刻内切酶包括Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII。这些切刻内切酶的来源和酶切位点可查询NEB公司的网站或者产品说明书，下面举例说明切刻内切酶及其酶切位点：

Nb.BtsI来源于重组大肠杆菌(E.coli)菌株，包含有来自嗜热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidasius)(X.Pan)克隆的的BtsI限制性基因的大亚基。识别序列如下：箭头处为切刻位置

Nb.BsrDI来源于重组大肠杆菌(E.coli)菌株，包含有来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)D70(Z.Chen)克隆的的BsrDI限制性基因的大亚基。识别序列如下：箭头处为切刻位置

在一个DNA片段中，当两个相同的切刻内切酶识别位点被0～10间隔碱基隔开，且切刻位点分别位于DNA双链的上链和下链上，切刻内切酶酶切将在DNA双链上产生切刻，经变性而使碱基间的氢键断裂，从而产生粘性末端。

例如，在一个nicking box中设计两个Nb.BtsI识别位点，箭头标识切刻位点，酶切后，间隔序列将形成3’粘性末端。

在另一个例子中，在一个nicking box中设计两个Nb.BsrDI识别位点，箭头标识切刻位点，酶切后，间隔序列将形成3’粘性末端。

如果Nb.BtsI酶切产生的3’粘性末端与Nb.BsrDI酶切产生的3’粘性末端互补，两个DNA片段能够连接，且产生的新的DNA片段被切刻内切酶酶切后在一条DNA链上产生切刻，而不会切断DNA双链。切刻内切酶识别位点之间的间隔碱基是以任意方式排列的A、T、C和G，间隔碱基的数目根据实验目的确定。

“同类切刻内切酶”指能在DNA双链的正义链(上链)或者能在DNA双链的反义链(下链)上产生切刻的切刻内切酶，如Nt.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII为能在DNA双链的正义链上产生切刻的同类切刻内切酶，酶切后产生5’粘性末端；Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI为能在DNA双链的反义链上产生切刻的同类切刻内切酶，酶切后可以产生3’粘性末端。

归位内切酶

归位内切酶是一种由内含子或内含肽编码的限制性内切酶，能识别较长的非回文序列(12～40bp)，该回文序列比较长，因此在基因组中出现的频率比较低(大约每7x10¹⁰bp出现一次)。目前的归位内切酶包括I-CeuI、I-SceI、PI-PspI、PI-SceI。

同尾酶

同尾酶(isocaudamer)指切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。该类限制酶来源各异，识别的靶序列不相同，但产生相同的粘性末端。如，SpeI和AvrII为同尾酶。由同尾酶(isocaudamer)产生的DNA片段，能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。当把同尾酶切割的DNA片断与原来的限制性内切酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能被原来的限制性内切酶所识别。

产生粘性末端的方法

本发明公开了基于切刻内切酶产生粘性末端的方法。在本方法中，一个或者两个nicking box添加在一段DNA片段的末端或者初始载体上，其中nicking box中设置两个邻近的且被间隔碱基见隔开的切刻内切酶识别位点，0～10个A、T、C和G以任意方式排列组成间隔碱基。通过改变nicking box中间隔碱基的数目和排列方式和切刻内切酶识别位点，能将DNA片段按照一定的方向连接。正如下面所述，该特点在多DNA片段或基因表达盒循环组装中特别有用。

组装载体的制备

本发明还公开了多DNA片段或多基因表达单元组装载体的制备方法。本发明中的组装载体带有预先设计的nicking box循环组装单元。将nicking box循环组装单元添加到初始载体上便可以得到组装载体，nicking box循环组装单元包含5’到3’方向排列的A、B、C和D四个nicking box，一个多克隆位点(MCS)和三个间隔序列组成。

所述多克隆位点MCS位于A和B nicking box之间，包含限制性内切酶识别位点，用于DNA片段的插入。MCS中的限制性内切酶为常规的Ⅱ型限制性内切酶。

所述三个间隔序列位于C和D nicking box之间、B和C nicking box之间与Dnicking box之后，用于间隔相邻的nicking box。间隔序列的长度至少为30bp；C和Dnicking box之间的间隔序列的长度最好为40bp；所述位于B和C nicking box之间和Dnicking box之后的间隔序列，可以为含有归位内切酶识别位点的DNA序列，用于基因组装结束时切除由每轮基因组装所带进的供体骨架。归位内切酶为，但不限于I-SceI、PI-SceI、I-CeuI、PI-PspI。

所述A、B、C和D四个nicking box，均由一对同种切刻内切酶的识别位点和位于该同种切刻内切酶识别位点之间的间隔碱基组成，且该同种切刻内切酶的两个切刻位点分别位于双链DNA的上下两条链上；A和D nicking box各含有切刻内切酶M酶切位点，B和Cnicking box各含有切刻内切酶N的酶切位点，切刻内切酶M和N不同，但为同类切刻内切酶；A、B、C和D四个nicking box中相同切刻内切酶识别位点之间的间隔碱基为任意排列方式的A、G、C或T，个数为0～10个，在切刻内切酶酶切后间隔碱基形成粘性末端的一部分。Anicking box中形成的粘性末端与B nicking box中形成的粘性末端互补，C nicking box中形成的粘性末端与D nicking box中形成的粘性末端互补，且A和B nicking box中形成的粘性末端与C和D nicking box中形成的粘性末端不互补。

初始载体用于构建组装载体，选自PBR322载体、PUC系列载体、PGEM系列载体、pBluescript载体、pMD19-T载体、pMD18-T载体、pMD19-T Simple载体、pMD18-T Simple载体或者其他本领域中普通技术人员知晓的常用克隆载体。

在一个实施例中，组装载体为pHSG396-URS-GW，组装载体的构建方法详见实施例2.

多DNA片段组装载体的构建方法

本发明公开的多DNA片段组装载体的构建方法如下：1)根据组装的顺序，将目的DNA片段编号，并将目的DNA片段亚克隆到组装载体的MCS上；2)使用切刻内切酶N酶切接受载体(组装载体1)，获得带有目的DNA片段#1的载体骨架，使用切刻内切酶M酶切供给载体(组装载体2)，得到目的DNA片段#2，带有目的DNA片段#1的载体骨架的粘性末端与目的DNA片段#2的粘性末端互补，将此载体骨架和目的片段连接，转化连接产物到受体细胞，获得含有目的DNA片段#1和目的DNA片段#2的新的载体；3)以步骤2)得到的新载体作为接受载体，重复步骤2)，完成多DNA片段的定向组装，并得到含有多DNA片段的期望载体。

另外，如果在B和C nicking box之间与D nicking box之后设置归位内切酶识别位点，多余的供给载体骨架在组装结束时可以通过归位内切酶去除。

本发明中公开的多DNA片段或者多基因表达单元组装载体的构建方法可用于构建任意的含有多DNA片段或者多基因的遗传工程载体，用于转化并使目的基因在不同的细胞、组织和器官中表达。转化方法包括但不限于农杆菌介导的转化法、微粒轰击法、显微注射法、电击法、聚乙二醇法、花粉管通道法、病毒载体浸染法等。本方法也可以用于构建各种用途的基因工程载体，特别是一些含有多个元件的大型载体如细菌人工染色体、酵母人工染色体、哺乳动物人工染色体和植物人工染色体。

具体实施方式

下面用实施例进一步说明本发明，但本发明并不受实施例的限制。应该理解，本文的实施方案只是举例说明，本领域的技术人员对试剂或参数的修改涵盖于所附权利要求书的范围内。

菌株和质粒：大肠杆菌菌株DB3.1和DH5α；质粒pHSG396(TAKARA)、pMA–RQ–Seqone(Invitrogen合成)、pMD19-GW-T、T-DsRed、T-DraDsRed、T-NOS、T-CAMV 3’UTR、T-PINII、T-OCS、T-NOS、T-35S、T-Ubiqutin、T-KT630、T-LTPII、T-Actin、T-KT250。后面的14个质粒为本实验室保存。

工具酶：限制性内切酶、归位内切酶、切刻内切酶和T4DNA连接酶均为NEB的产品。

要组装的基因表达单元：(1)Actin promoter-DsRed-OCS terminator；(2)Ubiquitin promoter-DsRed-CaMV3’UTR terminator；(3)KT250promoter-DsRed-NOSterminator；(4)KT630promoter-DsRed-NOS terminator；(5)35SMini promoter-DsRed-NOS terminator；(6)P-LTPII promoter-DsRed-T-PINII terminator；(7)CaMV35Spromoter-DsRed-NOS terminator。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除详细说明外，下列实施例中均使用如下的单酶切反应体系、双酶切反应体系和连接反应体系。

单酶切反应体系：

双酶切反应体系：

连接反应体系：

实施例1、初始载体的改良

pHSG96(TAKARA，图4)和pMD19载体均可以作为本发明的初始载体。为了便于后续的操作，首先将gateway重组位点添加在含有氯霉素抗性基因(CmR)的初始载体pHSG96中。用EcoRI和HindIII限制性内切酶分别酶切质粒pHSG396和本室所存质粒pMD19-GW-T(图3)；经1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收酶切产物pHSG396的高分子量载体部分和pMD19-GW-T的低分子量片段部分(即带有gateway位点的片段)；将上述两个片段按照连接体系在16℃连接3小时后，将连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞，涂布在含CmR的LB平板培养基上，37℃过夜培养，第二天，随机挑取3个克隆，逐一测序，确认质粒为带有gateway重组位点的改良初始载体，命名为pHSG396-GW-T。

实施例2、基于切刻内切酶的组装载体的制备

本发明中基于切刻内切酶识别位点的组装载体即可以作为接受载体也可以作为供给载体，并组成多DNA片段或者多基因表达单元载体组装系统。通过循环添加DNA片段或者目标基因表达单元，即可获得含有多DNA片段或者多个基因表达单元的载体。

为实现上述目的，组装载体除含有复制起始位点和抗性筛选标记基因外，还含有本发明设计的序列，nicking box循环组装单元(SEQ ID NO：1的序列)。所述Nicking Box循环组装单元(seqONE)由沿DNA 5’→3’方向设置的A、B、C、D四个nicking box，一个高效的DNA克隆位点MCS，和三个间隔序列组成。(1)A和D nicking box各含有切刻内切酶Nb.BtsⅠ酶切位点，B和C nicking box各含有切刻内切酶Nb.BsrD Ⅰ的酶切位点；(2)A和B nickingbox之间有高效的DNA克隆位点MCS(Xcm Ⅰ、Asc Ⅰ、Spe Ⅰ、AsiS Ⅰ和Not Ⅰ)；(3)C和Dnicking box之间为一个40bp的短间隔序列；(4)B和C nicking box之间与D nicking box之后为带有归位内切酶I-Sce Ⅰ识别位点的DNA片段；(5)A和B nicking box中两个切刻内切酶M和N识别位点之间的碱基的个数和排布相同，C和D nicking box中两个切刻内切酶N和M识别位点之间的碱基的个数和排布相同，且A和B nicking box中的间隔碱基不同于C和D nicking box中的间隔碱基。nicking box循环组装单元由Invitrogen合成，质粒为pMA–RQ–Seqone(图5)。nicking box循环组装单元中的酶切位点和作用展示如下：XcmI限制性内切酶位点可将该位点之间的序列通过酶切连接的方式转移到pHSG396–GW–T-XcmI中；AscI与SpeI位点之间可以引入启动子，AsiSI与NotI位点之间可以引入终止子，SpeI与AsiSI位点之间可以引入目的基因或者DNA片段，以上所选的4个限制性内切酶均为酶频(DNA序列中酶切位点出现的频率)较低的种类，其中AscI、AsiSI与NotI为8碱基识别系列，酶频为1/4⁸。上述4个限制性内切酶位点区域还可以方便其他形式DNA元件的引入。Nb.BtsI(404、407)对应第一个Nb.BtsI nicking box，Nb.BsrDI(458、461)对应第一个Nb.BsrDI nicking box，Nb.BsrDI(493、495)对应第二个Nb.BsrDI nicking box，Nb.BtsI(549、551)对应第二个Nb.BtsI nicking box。

为了将nicking box循环组装单元添加到改良的初始载体pHSG396-GW-T上，用XcmI限制性内切酶分别酶切质粒pHSG396-GW-T和质粒pMA-RQ-Seqone；经1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收酶切产物pHSG396-GW-T的高分子量载体部分和pMA-RQ-Seqone的低分子量片段部分；将上述两个片段按照连接体系连接，并将连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含CmR的LB平板培养基上，37℃过夜培养后，随机挑取3个克隆，逐一测序，确认质粒为含有nicking box循环组装单元的组装载体，命名为pHSG396-URS-GW。此组装载体即可以作为接受载体也可以作为供给载体使用。

实施例3、单个基因表达单元载体的构建

(1)将目标基因DsRed添加到组装载体pHSG396-URS-GW

DsRed基因(SEQ ID NO：2)将作为目的基因添加到实施例2构建的组装载体中，同时为了便于后续操作，避开限制性内切酶的酶切位点，将DraIII限制性内切酶位点置于DsRed基因的两端，命名为DraDsRed，并添加到实施例2的组装载体中。

用AsiSI和SpeI限制性内切酶分别双酶切实施例2获得的质粒pHSG396-URS-GW和本实验保存的质粒T-DsRed和T-DraDsRed；经1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收酶切产物pHSG396-URS-GW的高分子量载体部分、T-DsRed和T-DraDsRed的低分子量片段部分；16℃连接3小时后，将连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含CmR的LB平板培养基上，37℃过夜培养后，分别从每个平板培养基上随机挑取3个克隆，逐一测序，确认质粒为添加了DsRed基因的pHSG396-URS-GW-DsRed和pHSG396-URS-GW-DraDsRed。

(2)向(1)中构建的载体导入不同终止子序列

四个终止子序列OCS(SEQ ID NO：10)、CAMV 3’UTR(SEQ ID NO：11)、NOS(SEQ IDNO：12)、和T-PINII(SEQ ID NO：13)将用于本实施例中。

使用限制性内切酶AsiSI和NotI对表1中的质粒1和质粒2分别进行双酶切。经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收质粒1酶切产物的高分子量载体部分和质粒2的低分子量片段部分；16℃连接3小时，将连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含CmR的LB平板培养基上，37℃过夜培养后，每个平板培养上分别随机挑取3个克隆，逐一测序，确认质粒为四种新构建成的含不同终止子的质粒。

表1.含有不同终止子的载体

(3)向(2)中构建的载体导入不同启动子序列

七个启动子序列：Actin promoter(SEQ ID NO：3)，Ubiquitin promoter(SEQ IDNO：4)，KT250promoter(SEQ ID NO：5)，KT630promoter(SEQ ID NO：6)，CaMV 35S Mini(SEQID NO：7)，P-LTPII promoter(SEQ ID NO：8)，CaMV35S promoter(SEQ ID NO：9)将用于本实施例中。

六个不同启动子添加到(2)中构建的载体

表2中，质粒1栏为本实施例(2)中构建的质粒，质粒2栏为含有不同启动子的质粒，通过酶切反应将不同的启动子添加到酶切后的质粒1载体片段中。用AscI和SpeI限制性内切酶分别酶切表2中质粒1，AscI和SpeI或者AscI和AvrII分别酶切表2中质粒2。SpeI和AvrII为同尾酶，经酶切后能够产生相同的粘性末端。经过双酶切的质粒1和质粒2能够通过粘性末端连接。将酶切产物经过1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收质粒1酶切产物的高分子量载体部分和质粒2的低分子量片段部分；16℃连接3小时后，将连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含CmR的LB平板培养基上，37℃过夜培养后，随机挑取3个克隆，逐一测序，确认质粒为含有目的启动子的新质粒。

表2.含有不同启动子载体

pHSG396-URS-GW-DsRed-SmN的构建

pHSG396-URS-GW-DsRed-SmN为含有CaMV 35SMini(SEQ ID NO：4)启动子的质粒，可通过酶切含有35S启动子的pHSG396-URS-GW-DsRed-SN获得。本实施例中，采用AscI和EcoRV限制性内切酶酶切质粒pHSG396-URS-GW-DsRed-SN可以获得质粒pHSG396-URS-GW-DsRed-SmN。

经过上述的反应，构建了7个含有不同启动子、目的基因和终止子的基因表达单元的质粒载体(如表3所示)。

表3.构建的含不同基因表达单元的载体

实施例4、多基因表达单元载体的构建

在多基因表达单元载体构建的过程中，采用的酶切体系为：50μL酶切体系中含1μLNb.BsrDI(65℃)或者Nb.BtsI(37℃)，5μL 10x NEB Buffer 4，0.5μL 100x BSA，1.5μg质粒，灭菌蒸馏水补足至50μL，按照各自的适宜温度酶切3小时；10μL连接体系为：0.5μLT₄DNA连接酶，1×T₄DNA连接酶反应缓冲液，8μL供体酶切后的高分子量片段部分，0.5μL回收的受体酶切后的高分子量载体部分，16℃连接3小时。

(1)两个基因表达单元载体的构建

使用Nb.BsrDI酶切处理接受载体pHSG396-URS-GW-DraDsRed-AO，Nb.BtsI酶切处理供给载体pHSG396-URS-GW-DsRed-UC，经1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收酶切产物pHSG396-URS-GW-DraDsRed-AO的高分子量载体部分和pHSG396-URS-GW-DsRed-UC的目的片段部分；16℃连接3小时，将连接产物AU采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含CmR的LB平板培养基上，37℃过夜培养后，选择培养基平板上长出数百个细菌菌落。

挑取多个单克隆菌落进行摇菌培养，提取质粒进行EcoRI酶切检测，产生大小为208bp、396bp、3422bp、4554bp的片段，鉴定得到含有两个目的基因表达单元的载体pHSG396-AU。

(2)三个基因表达单元载体的构建

使用Nb.BsrDI酶切处理本实例(1)中得到的接受载体pHSG396-AU，Nb.BtsI酶切处理供给载体pHSG396-URS-GW-DraDsRed-KT250N，经0.7％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收酶切产物pHSG396-AU的高分子量载体部分和pHSG396-URS-GW-DraDsRed-KT250N的高分子量片段部分；连接3小时后，将连接产物AUM采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后涂布在含CmR的LB平板培养基上，37℃过夜培养后，选择培养基平板上长出数百个细菌菌落。

挑取几个单克隆菌落进行摇菌培养，提取质粒进行EcoRI酶切检测，产生大小为208bp、396bp、3019bp、3422bp、4314bp的片段，鉴定得到含有三个目的基因表达单元的载体pHSG396-AUM。

(3)四个基因表达单元载体的构建

使用Nb.BsrDI酶切处理本实例(2)得到接受载体pHSG396-AUM，Nb.BtsI酶切处理供给载体pHSG396-URS-GW-DraDsRed-KT630N，经0.7％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收酶切产物pHSG396-AUM的高分子量载体部分和pHSG396-URS-GW-DraDsRed-KT630N的低分子量片段部分；连接3小时后，将连接产物AUMK采用电击转化法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含CmR的LB平板培养基上，37℃过夜培养后，选择培养基平板上长出数百个细菌菌落。挑取24个单克隆进行菌落PCR检测，PCR反应体系、引物序列和引物组合如表4：

表4. PCR验证引物序列

表5. PCR反应混合液和程序

PCR扩增循环程序为：

表6.菌落PCR的验证引物组合与扩增结果

质粒名称	引物对组合	扩增片段的长度(bp)
			AUMK	UCSeq&Check-R-DsRed	247
AUMK	KT250Seq&Check-R-DsRed	237
			AUMK	KT630Seq&Check-R-DsRed	272

电泳检测结果表明，以挑取的克隆为模板，有16/24的菌落能扩增出表6中引物对组合的目的条带。提取这16个单克隆的质粒进行EcoRI酶切检测，产生大小为208bp、396bp、506bp、1517bp、3075bp、3422bp、和4314bp的片段，PCR验证和酶切验证结果表明，已得到含有四个目的基因表达单元的载体pHSG396-AUMK。

(4)五个目的基因表达单元载体的构建

使用Nb.BsrDI酶切处理本实施例(3)得到的接受载体pHSG396-AUMK，Nb.BtsI酶切处理供给载体pHSG396-URS-GW-DsRed-SmN。经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收酶切产物pHSG396-AUMK的高分子量载体部分和pHSG396-URS-GW-DsRed-SmN的低分子量片段部分；16℃连接3小时。将连接产物AUMKSm采用电击转化法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含CmR的LB平板培养基上，37℃过夜培养后，选择培养基平板上长出数百个细菌菌落。挑取其中24个单克隆进行菌落PCR检测，引物序列和引物组合如下：

35SSeq:ATTTGGAGAGGACACGCTGA AATCACC(SEQ ID NO：18)

表7.菌落PCR的验证引物组合与扩增结果

质粒名称	验证引物对组合	扩增片段的长度(bp)
			AUMKSm	KT630Seq&Check-R-DsRed	272
AUMKSm	35SSeq&Check-R-DsRed	225

电泳检测结果表明，7/24能扩增出表7中引物对组合的目的条带。提取这7个单克隆菌落的质粒进行EcoRI酶切检测，产生大小为208bp、396bp、506bp、1151bp、1517bp、3131bp、3422bp、4314bp的片段，因此PCR验证为阳性的质粒，酶切验证也均得到阳性结果，表明已将五个目的基因表达单元组装在一个载体中，将该载体命名为pHSG396-AUMKSm。

(5)六个目的基因表达单元载体的构建

使用Nb.BsrDI酶切处理接受载体pHSG396-AUMKSm，Nb.BtsI酶切处理供给载体pHSG396-URS-GW-DsRed-LP，经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收酶切产物pHSG396-AUMKSm的高分子量载体部分和pHSG396-URS-GW-DsRed-LP的低分子量片段部分；16℃连接3小时后，将连接产物AUMKSmL采用电击转化法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含CmR的LB平板培养基上，37℃过夜培养后。挑取其中24个单克隆进行菌落PCR检测，引物序列和引物组合如下：

LTPIISeq：CTTGAATGCGCTACCTTCGT(SEQ ID NO：19)

表8.菌落PCR的验证引物组合与扩增结果

质粒名称	验证引物对组合	扩增片段的长度(bp)
			AUMKSmL	LTPIISeq&Check-R-DsRed	362
AUMKSmL	KT630Seq&Check-R-DsRed	272

电泳检测结果表明，7/24能扩增出表8中引物对组合的目的条带。提取这7个单克隆菌落的质粒进行EcoRI酶切检测，产生大小为208bp、396bp、506bp、1151bp、1517bp、3422bp、4314bp、5147bp的片段，因此PCR验证为阳性的质粒，酶切验证也均得到阳性结果，表明已将六个目的基因表达单元组装在一个载体中，将该载体命名为pHSG396-AUMKSmL。

(6)七个目的基因表达单元载体的构建

使用Nb.BsrDI酶切处理接受载体pHSG396-AUMKSmL，Nb.BtsI酶切处理供给载体pHSG396-URS-GW-DsRed-SN，经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收酶切产物pHSG396-AUMKSmL的高分子量载体部分和pHSG396-URS-GW-DsRed-SN的低分子量片段部分；16℃连接3小时后，将连接产物AUMKSmLS采用电击转化法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后涂布在含CmR的LB平板培养基上，37℃过夜培养后。挑取48个单克隆进行菌落PCR检测，引物序列和引物组合如下：

Check-PinII：TGGGCATCAAAGTTGTGTGT(SEQ ID NO：20)

表9.菌落PCR的验证引物组合与扩增结果

质粒名称	验证引物对组合	扩增片段的长度(bp)
			AUMKSmLS	Check-PinII&Check-R-DsRed	1265

电泳检测结果表明，6/48能扩增出表9中引物对组合的目的条带。提取PCR验证为阳性的6个单克隆菌落的质粒进行EcoRI酶切检测，产生大小为208bp、396bp、506bp、1151bp、1517bp、3243bp、3422bp、3816bp、4314bp的片段，该6个单克隆菌落的质粒均得到阳性结果。因此通过切刻内切酶酶切连接得到含有七个目的基因表达单元的载体，将该载体命名为pHSG396-AUMKSmLS。

本实施例说明本发明所述的方法可以有效的把多个基因表达单元定向组装到一个载体中并获得多基因载体的质粒。

另外，也可以将多个基因表达单元构建在一个组装载体后，与其他的多基因表达单元载体通过上述的切刻内切酶酶切和连接反应将构建含有多个基因表达单元的载体，此过程可以节约时间。

Claims

1.一种组装载体，包含复制起始位点、抗性筛选标记基因，还包含一个nicking box循环组装单元，所述nicking box循环组装单元包含沿DNA 5’→3’方向排列的A、B、C、D四个nicking box，一个高效的DNA克隆位点MCS和三个间隔序列，其中，所述A、B、C和D四个nicking box，均由一对同种切刻内切酶的识别位点和位于所述同种切刻内切酶识别位点之间的间隔碱基组成，且所述同种切刻内切酶的两个切刻位点分别位于双链DNA的上下两条链上；所述A和D nicking box各含有切刻内切酶M酶切位点，所述B和C nicking box各含有切刻内切酶N的酶切位点，所述切刻内切酶M和N不同，但为同类切刻内切酶；所述Anicking box产生的粘性末端与所述B nicking box产生的粘性末端序列完全相同，所述Cnicking box产生的粘性末端与所述D nicking box产生的粘性末端序列完全相同，且所述A和B nicking box中的粘性末端与所述C和D nicking box中粘性末端不互补；所述高效DNA克隆位点MCS包含限制性内切酶识别位点,位于A和B nicking box之间；所述三个间隔序列分别位于C和D nicking box之间，B和C nicking box之间，与D nicking box之后。

2.根据权利要求1所述的组装载体，所述A、B、C和D nicking box中同种切刻内切酶识别位点之间的间隔碱基为1～10个任意排列的A、C、G或T。

3.根据权利要求1所述的组装载体，所述切刻内切酶M和N选自Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI和Nb.BtsI。

4.根据权利要求3所述的组装载体，所述切刻内切酶M和N为Nb.BsrDI和Nb.BtsI。

5.根据权利要求1所述的组装载体，所述切刻内切酶M和N选自Nt.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI和Nt.CviPII。

6.根据权利要求1所述的组装载体，所述间隔序列长度至少为30bp。

7.根据权利要求6所述的组装载体，所述C和D nicking box之间的间隔序列的长度为40bp。

8.根据权利要求1所述的组装载体，所述B和C nicking box之间和D nicking box之后的间隔序列为含有归位内切酶识别位点的DNA序列。

9.根据权利要求8所述的组装载体，所述归位内切酶选自I-CeuI、I-SceI、PI-PspI和PI-SceI。

10.根据权利要求9所述的组装载体，所述归位内切酶是I-SceI。

11.根据1-10任一权利要求所述的组装载体，所述组装载体通过向初始载体中添加nicking box循环组装单元得到的。

12.根据权利要求11所述的组装载体，所述初始载体选自PBR322、PUC系列、PGEM系列、pBluescript、pMD19-T载体、pMD18-T载体、pMD19-T Simple载体、pMD18-T Simple载体。

13.一种多DNA片段载体的构建方法，其特征是由一个既可以作为接受载体也可以作为供给载体的组装载体组成多DNA片段组装载体系统，利用切刻内切酶酶切和连接反应将作为供给载体的组装载体中目的DNA片段组装到作为接受载体组装载体中构建成多DNA片段载体；

其中所述的组装载体包含复制起始位点和抗性筛选标记基因，还包含nicking box循环组装单元，所述nicking box循环组装单元包含沿DNA 5’→3’方向设置的A、B、C、D四个nicking box，一个高效的DNA克隆位点MCS和三个间隔序列组成；所述高效DNA克隆位点MCS包含限制性内切酶识别位点,位于A和B nicking box之间；所述的三个间隔序列分别位于C和D nicking box之间，B和C nicking box之间，与D nicking box之后；所述的A、B、C、D四个nicking box，均由一对同种切刻内切酶的识别位点和位于所述同种切刻内切酶识别位点之间的间隔碱基组成，且所述同种切刻内切酶的两个切刻位点分别位于双链DNA的上下两条链上；所述A和D nicking box各含有切刻内切酶M酶切位点，所述B和C nicking box各含有切刻内切酶N的酶切位点，所述切刻内切酶M和N不同，但为同类切刻内切酶；所述Anicking box产生的粘性末端与所述B nicking box产生的粘性末端序列完全相同，所述Cnicking box产生的粘性末端与所述D nicking box产生的粘性末端序列完全相同，且所述A和B nicking box中的粘性末端与所述C和Dnicking box中粘性末端不互补；

所述利用切刻内切酶酶切和连接反应将作为供给载体的组装载体中目的DNA片段组装到作为接受载体的组装载体中构建多DNA片段载体的方法，具体步骤如下：

(2)使用切刻内切酶N酶切接受载体，获得含有DNA片段#1的载体骨架片段，使用切刻内切酶M酶切供给载体，获得含有目的DNA片段#2的片段；所述获得含有DNA片段#1的载体骨架片段和所述含有目的DNA片段#2的片段含有互补的粘性末端，将两者连接，转化大肠杆菌感受态细胞，经过筛选培养，获得含有DNA片段#1和DNA片段#2的新载体；

(3)以步骤(2)构建的所述新载体为接受载体，重复步骤(2)完成多个目的DNA片段的定向组装，构建成含有多个DNA片段的载体。

14.根据权利要求13所述的方法，所述A、B、C和D nicking box中相同切刻内切酶识别位点之间的间隔碱基的个数是1～10。

15.根据权利要求13所述的方法，所述A、B、C和D nicking box中间隔碱基为任意排列顺序碱基A、G、C或者T。

16.根据权利要求13所述的方法，所述切刻内切酶M和N选自Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI和Nb.BtsI。

17.根据权利要求16所述的方法，所述切刻内切酶M和N为Nb.BsrDI和Nb.BtsI。

18.根据权利要求13所述的方法，所述切刻内切酶M和N选自Nt.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI和Nt.CviPII。

19.根据权利要求13所述的方法，所述位于B和C nicking box之间和D nicking box之后的间隔序列，为含有归位内切酶识别位点的DNA序列。

20.根据权利要求19所述的方法,所述的归位内切酶选自I-SceI、PI-SceI、I-CeuI、PI-PspI。

21.根据权利要求20所述的方法，所述归位内切酶是I-SceI。

22.根据19-21任一权利要求所述的方法，所述方法还包括的步骤为：使用归位内切酶切除多DNA片段组装结束时由每轮组装所带进的供体骨架。