CN107177616A

CN107177616A - 一种多基因组装载体系统及其多基因组装方法

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Publication number: CN107177616A
Application number: CN201710384197.7A
Authority: CN
Inventors: 刘耀光; 祝钦泷
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2017-05-26
Filing date: 2017-05-26
Publication date: 2017-09-19
Anticipated expiration: 2037-05-26
Also published as: CN107177616B

Abstract

本发明公开了一种多基因组装载体系统及其多基因组装方法。该系统包括1类接受载体、2类供给载体、以及可选择使用的能发生筛选标记自删除的供给质粒。该系统利用Cre/loxP重组系统和两组突变型loxP的不可逆重组位点，在Cre酶作用下，以野生型loxP位点的重组来实现供给载体整合到接受载体中，然后其一组突变型loxP的不可逆重组自动删除供给载体的骨架，只留下目的基因在接受载体上；重复2类供给载体交替与接受载体的组装，就能实现多基因的快速组装。本发明是目前最简单高效的多基因载体系统。因此本发明对重要的、复杂生物合成途径和重要农艺性状的多基因遗传工程操作提供了可操作的技术平台，具有重要的应用价值。

Description

一种多基因组装载体系统及其多基因组装方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种多基因组装载体系统及其多基因组装方法。

背景技术

植物(作物)中重要的性状如很多农艺性状、复杂代谢合成途径、重要信号传导途径、重要功能的蛋白复合体等都涉及到了多个基因的共同作用，受多基因控制，其基因工程操作常常需要用到多基因转化叠加技术(TransGeneStacking,TGS)。而常规的转基因技术手段只能完成少数(通常1-3个)基因的操作。“黄金大米”和“紫番茄”是目前成功报道的多基因转化作物的两个成功案例，但它们也仅仅是用了2个基因。因此，多基因组装与转化技术是目前基因工程研究的热点与难点，具有重要的应用前景。

与多质粒混合后基因枪共转或单基因分别转化后再杂交聚合的方法相比，在同一植物表达载体上组装多个基因再转化植物的方法是更直接、简单和高效的。但多基因表达载体的构建是其限制因素。传统的酶切连接方法，受到酶切位点的限制，很难完成多个基因在一个表达载体上的构建。为此，目前已有几种多基因组装的方法，包括基于稀有内切酶和归巢内切酶建立pRCS/pAUX和pSAT载体系统(Goderis et al.,2000；Tzfira et al.,2005；Dafny-Yelin et al.,2007)，基于Cre/loxP和归巢内切酶建立的多基因载体系统(Lin etal.,2003；ZL02134869.3)，基于Gateway技术建立的多位点或多轮载体系统(Chen et al.,2006)，以及采用Cre/loxP、Gateway和细菌交配辅助转移的复杂方法的MISSA系统(Chen etal.,2010)。但是，上述方法在进行多基因组装中使用仍然比较困难、费时费力、效率不高。如MISSA多基因系统，需要使用两种Cre/loxP和Gateway两个重组系统，和细菌交配辅助转移的复杂方法实现带供给载体和接受载体的两种菌株间的基因转移与融合，比较繁琐复杂；而Cre/loxP和归巢内切酶建立的多基因载体系统(Lin et al.,2003；ZL02134869.3)则简单得多，该系统用Cre/loxP重组整合供给载体质粒到接受载体上，再用切割效率较低的归巢酶切去供给载体骨架，用双链DNA接头连接入载体，但这也使得整个操作在连接多个基因是比较困难，效率较低。因此，简单高效的多基因载体系统的开发，对多基因工程和合成生物学的应用十分必要。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高效的多基因组装载体系统。

本发明的另一目的在于提供所述的多基因组装载体系统的应用。

本发明的再一目的在于提供一种多基因组装方法，是对上述多基因组装载体系统的具体应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种多基因组装载体系统，命名为TGSII，包括1类接受载体、2类供给载体、以及可选择使用的能发生筛选标记自删除的供给质粒；2类供给载体分别命名为供给载体I和供给载体II；接受载体具有loxP/I-Sce I/loxP1R核心元件DNA序列；供给载体I具有loxP/PI-Sce I/loxP2R/MCS/loxP1L/I-Sce I核心元件DNA序列；供给载体II具有loxP/I-Sce I/loxP1R/MCS/loxP2L/PI-Sce I核心元件DNA序列。供给载体I的MCS序列与供给载体II的MCS序列相同或不相同。

该载体系统利用Cre/loxP特异重组使含有目的基因的供给载体I和供给载体II交替地和接受载体进行多轮的质粒整合，并交替使用两组不可逆重组的突变型loxP位点loxP1L/loxP1R或loxP2L/loxP2R自动删除整合质粒中的供给载体骨架片段，使多轮的基因整合能有效进行，直到完成多基因载体的构建。

所述的loxP/I-Sce I/loxP1R核心元件DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的loxP/PI-Sce I/loxP2R/MCS/loxP1L/I-Sce I核心元件DNA序列如SEQ IDNO.2所示。

所述的loxP/I-Sce I/loxP1R/MCS/loxP2L/PI-Sce I核心元件DNA序列如SEQ IDNO.3所示。

所述的接受载体是多基因组装过程中装载外源目的基或基因片段的载体，在植物转化中使用时是转化表达载体，包括以农杆菌介导转化的双元载体以及适合其它转化方法(基因枪轰击法等)的表达载体；在其它生物中使用时是具有相应载体骨架和元件的载体；所述的载体具有如下特点：

(1)具有1个野生型的loxP特异重组位点，1个归巢酶I-Sce I位点和1个突变loxP位点loxP1R，并按loxP/I-Sce I/loxP1R的位置排列；

(2)具有1个不同于供给载体的细菌抗生素选择标记基因，优选为卡拉霉素抗性基因(Kan^r)；

(3)具有1个负载大的DNA质粒的复制子元件，优选为P1噬菌体的复制子。

所述的接受载体优选为pYL0380、pYL1300H、pYLTAC380、pYLTAC380H、pYLTAC380N、pYLTAC380B、pYLTAC380GW；

接受载体pYL0380通过如下步骤制备得到：将如SEQ ID NO.4所示的序列(含有如SEQ ID NO.1所示接受载体核心元件loxP/I-Sce I/loxP1R)，通过EcoR I和Hind III双酶切后，克隆到EcoR I和Hind III双酶切后的pCAMBIA0380得到；

接受载体pYL1300H通过如下步骤制备得到：将如SEQ ID NO.4所示的序列(含有如SEQ ID NO.1所示接受载体核心元件loxP/I-Sce I/loxP1R)，通过EcoR I和Hind III双酶切后，克隆到EcoR I和Hind III双酶切后的pCAMBIA1300得到；

接受载体pYLTAC380通过如下步骤制备得到：以pYLTAC747质粒(Lin et al.,2003；ZL02134869.3)为模板，用引物P1/P2进行PCR扩增，获得骨架片段；以pYL0380质粒为模板，用引物P3/P4进行PCR扩增，获得插入片段；用Xba I分别酶切骨架片段和插入片段，将酶切后的骨架片段和插入片段连接，得到接受载体pYLTAC380；

接受载体pYLTAC380H通过如下步骤制备得到：以pCAMBIA1300为模板，用引物P5/P6进行扩增，得到两侧带有Kpn I位点的抗潮霉素基因；用Kpn I分别单酶切两侧带有Kpn I位点的抗潮霉素基因和接受载体pYLTAC380；再将酶切后的抗潮霉素基因和接受载体pYLTAC380连接，得到pYLTAC380H载体；

接受载体pYLTAC380N通过如下步骤制备得到：以pCAMBIA2300为模板，用引物P5/P6进行扩增，得到两侧带有Kpn I位点的抗卡拉霉素基因HPT；用Kpn I分别单酶切两侧带有Kpn I位点的抗卡拉霉素基因NPTII和接受载体pYLTAC380；再将酶切后的抗卡拉霉素基因和接受载体pYLTAC380连接，得到pYLTAC380N载体；

pYLTAC380B载体通过如下步骤制备得到：以pCAMBIA3301为模板，用引物P5/P6进行扩增，得到两侧带有Kpn I位点的抗草甘膦基因基因；用Kpn I分别单酶切两侧带有Kpn I位点的抗草甘膦基因和接受载体pYLTAC380；再将酶切后的抗草甘膦基因基因和接受载体pYLTAC380连接，得到pYLTAC380B载体；

接受载体pYLTAC380GW通过如下步骤制备得到：通过Kpn I和BamH I双酶切分别酶切如SEQ ID NO.5所示的带有Gateway重组反应位点的Kpn I/attP1/SacB/attP1/BamH I片段和接受载体pYLTAC380，再将酶切后的带有Gateway重组反应位点的Kpn I/attP1/SacB/attP1/BamH I片段和接受载体pYLTAC380连接，得到接受载体pYLTAC380GW；

其中，pYLTAC380GW、pYLTAC380、pYLTAC380H、pYLTAC380N和pYLTAC380B具有1个能负载大于100kb的来源于P1噬菌体的复制子；pYL0380和pYL1300H具有负载能力约为30kb的pBR322复制子；pYLTAC380GW、pYLTAC380和pYL0380不含有植物筛选标记基因，它们可以在使用时连接加入任1种植物筛选标记基因；pYLTAC380H和pYL1300H含有抗潮霉素标记基因HPT，pYLTAC380N含有抗卡拉霉素标记基因NPTII，pYLTAC380B含有抗草甘膦标记基因Bar；接受载体pYLTAC380GW是可删除筛选标记基因(Marker-free)接受载体，具有能进行Gateway反应的元件attP1-SacB-attP2，可以用于Marker-free多基因载体的构建。

所述的供给载体I具有如下特点：

1)具有1个野生型loxP位点和2个归巢酶位点PI-Sce I和I-Sce I；

2)具有2个突变型loxP位点loxP2R和loxP1L；

3)具有一个多克隆位点MCS；

4)特征1)～3)中的位点按loxP/PI-Sce I/loxP2R/MCS/loxP1L/I-Sce I的顺序排列；

5)具有1个不同于接受载体与供给载体II的细菌选择标记基因，优选为氯霉素抗性基因(Cm^r)。

所述的供给载体I用于与接受载体进行奇数轮的基因组装。

所述的供给载体I优选为pYL322d1，其通过如下步骤制备得到：以pYL1300H为模板，通过引物P7/P8扩增，得到骨架片段；以pYLSV质粒(Lin et al.,2003；ZL02134869.3)为模板，通过引物P9/P10扩增，得到插入片段I；再通过BssHII和Mlu I双酶切分别酶切骨架片段和插入片段I，得到中间载体d1-I；通过BssHII分别单酶切中间载体d1-I和如SEQ IDNO.6所示的插入片段II(含有如SEQ ID NO.2所示供给载体I核心元件loxP/PI-Sce I/loxP2R/MCS/loxP1L/I-Sce I)，将单酶切后的中间载体d1-I和插入片段II连接，得到中间载体d1-II；通过EcoR V分别单酶切中间载体d1-II和如SEQ ID NO.7所示的插入片段III，将单酶切后的中间载体d1-I和插入片段III连接，得到质粒pYL322d1。

所述的供给载体II具有如下特征：

①具有1个野生型特异重组位点loxP和2个归巢酶位点I-Sce I和PI-Sce I；

②具有2个突变的loxP位点loxP1R和loxP2L；

③具有一个多克隆位点MCS；

④特征①～③中的位点按loxP/I-Sce I/loxP1R/MCS/loxP2L/PI-Sce I的顺序排列；

⑤具有1个不同于接受载体与供给载体I的细菌选择标记基因，优选为氨苄抗性选择基因(Amp^r)。

所述的供给载体II用于与接受载体进行偶数轮的基因组装。

所述的供给载体II优选为pYL322d2，其通过如下步骤制备得到：以pYL322d1为模板，通过引物P11/P12扩增，得到骨架片段；以pUC18质粒为模板，通过引物P13/P14扩增，得到插入片段A；通过Mlu I分别单酶切骨架片段和插入片段A，将单酶切后的骨架片段和插入片段A连接，得到中间载体d2-I；通过Mlu I分别单酶切中间载体d2-I和如SEQ ID NO.8所示的插入片段B(含有如SEQ ID NO.3所示供给载体II核心元件loxP/I-Sce I/loxP1R/MCS/loxP2L/PI-Sce I)，将单酶切后的中间载体d1-I和插入片段B连接，得到质粒pYL322d2。

所述的pYL322d2的MCS序列与所述的pYL322d1的MCS序列相同，但方向相反。

所述的可选择使用的能发生筛选标记自删除的供给质粒指的是可以使用，也可以不使用，要视接受载体是否具为不含植物抗生素标记基因，并且具有Gateway重组反应位点的接受载体而定，其具有如下特点：

(A)具有Gateway特异重组反应的两个位点attP1和attP2；

(B)具有2个或1个野生型loxP位点，它们整合到接受载体后与接受载体的野生型loxP位点形成同向排列；

(C)具有任一个植物筛选标记基因，优选为抗潮霉素基因(HPT)、抗卡拉霉素基因(NPTII)、或抗草甘膦基因(Bar)；

(D)具有诱导型启动子或器官特异表达启动子驱动的重组酶基因Cre的表达盒；

(E)特征(A)～(D)中的位点和基因在质粒载体上的排列顺序为：attP1/loxP/植物筛选标记/Cre表达盒/loxP/attP2，构成可删除筛选标记(Marker-free)结构。

特点(D)中所述的启动子优选为花药特异表达启动子PV4，其可以从水稻的基因组DNA为模板，用引物P17/P18直接PCR扩增得到。

所述的可选择使用的能发生筛选标记自删除的供给质粒优选为pYLMF-H、pYLMF-N和pYLMF-B；

供给质粒pYLMF-H、pYLMF-N和pYLMF-B通过如下步骤制备得到：

1)用引物P15/P16，以供给载体II质粒pYL322d2为模板，经PCR扩增，获得骨架片段，Xba I酶切该骨架片段后自连，获得中间载体pYLMF-0；

2)以水稻基因组DNA为模板，用引物P17/P18扩增得到花药启动子，为片段1；用引物P19/P20，以大肠杆菌NS3529基因组为模板，扩增Cre基因编码区，得到片段2；用引物P21/P22从质粒pCAMBIA1305扩增Nos终止子Tnos，作为片段3；将片段1、2和3作为模板，用引物P17/P22做重叠PCR，获得片段4；以Xba I和Hind III双酶切分别酶切片段4和中间载体pYLMF-0，将双酶切后的片段4和中间载体pYLMF-0连接，得到中间载体pYLMF-1；

3)用引物P23/P24分别以质粒pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3301为模板，PCR扩增植物抗性基因表达盒，分别获得Asc I/loxP/HPT/Xba I片段、Asc I/loxP/NPTII/Xba I片段和Asc I/loxP/Bar/Xba I片段，分别用Asc I和Xba I双酶切，再连接入Asc I和Xba I双酶切厚后的pYLMF-1，分别得到质粒pYLMF-H、pYLMF-N和pYLMF-B。

其中，pYLMF-H具有植物抗潮霉素筛选标记基因(HPT)、pYLMF-N具有植物抗卡拉霉素筛选标记基因(NPTII)、和pYLMF-B具有植物抗草甘膦筛选标记基因(Bar)；在pYLMF-H载体上的可删除筛选标记结构的排列顺序为attP1/loxP/HPT/PV4-Cre/loxP/attP2，在pYLMF-N载体上的可删除筛选标记结构的排列顺序为attP1/loxP/NPTII/PV4-Cre/loxP/attP2，在pYLMF-B载体上的可删除筛选标记结构的排列顺序为attP1/loxP/Bar/PV4-Cre/loxP/attP2。

所述的可选择使用的能发生筛选标记自删除的供给质粒可选择用于Marker-free的多基因载体组装的最后一步，通过Gateway重组反应把可删除筛选标记结构组装到含Gateway位点的已组装完多个基因的不含植物抗生素标记基因，并且具有Gateway重组反应位点的接受载体上，如接受载体pYLTAC380GW上。

所述的突变的loxP位点是不可逆的特异重组突变型，其包括loxP1L、loxP1R、loxP2L、和loxP2R，序列如SEQ ID NO:9～12所示；

A)在同一组的2个突变型loxP位点(即loxP1L和loxP1R为同一组，loxP2L和loxP2R为同一组)中，其中1个在左臂(13碱基组成)中有4-6碱基的突变，另1个在右臂(13碱基组成)中有4-6碱基的突变，2个位点的中部间隔区(8碱基组成)有1-4碱基的相同突变；

B)loxP1L/loxP1R和loxP2L/loxP2R的中部间隔区序列(发生DNA链重组交换的位置)在组内相同而在组间不同，不可逆特异重组只在同一组的2个位点之间发生，即loxP1L只与loxP1R发生重组反应，loxP2L只与loxP2R发生重组反应，组间的任2个位点之间以及任一突变型loxP与野生型loxP之间不能发生重组反应；

C)loxP1L和loxP1R之间(或loxP2L和loxP2R之间)的重组产生的新位点loxP1LR(或loxP2LR)在左臂和右臂都含有突变碱基，不被重组酶Cre有效识别结合，因而不再发生可逆的回复重组。

所述的loxP1L的序列如SEQ ID NO:9所示。

所述的loxP1R的序列如SEQ ID NO:10所示。

所述的loxP2L的序列如SEQ ID NO:11所示。

所述的loxP2R的序列如SEQ ID NO:12所示。

所述的多基因组装载体系统在培育转基因生物中的应用。

所述的生物包括植物、动物和微生物。

所述的多基因组装载体系统在多基因转化表达中的应用。

一种多基因组装方法，是对上述多基因组装载体系统的具体应用，是利用位点特异重组及不可逆重组位点，使供给载体I和供给载体II轮流交替地和接受载体进行多轮基因组装，其具体步骤如下：

S1.把需要组装的目的基因或DNA片段按组装先后次序排号，用任一种常规的连接克隆的方法，把奇数轮和偶数轮组装的基因或DNA片段分别连入供给载体I和供给载体II的多克隆位点中；每个供给载体可以克隆入1个或几个目的基因或DNA片段；

S2.第1(奇数)轮基因组装：把含有目的基因(如基因A)的供给载体I质粒和接受载体质粒共转化到含有Cre基因的大肠杆菌，或用分离纯化的Cre酶进行试管反应，使2种质粒通过野生型loxP位点发生重组，整合为一个重组型中间质粒；随后，在同一反应系中，其中的来源于供给载体I的loxP1L与来源于接受载体的loxP1R发生不可逆重组反应，自动删除此2个位点之间的供给载体I的载体骨架片段，只保留目的基因A在接受载体上；提取纯化此反应产生的混合菌落的质粒或用特异重组酶进行体外反应的产物，用归巢酶I-Sce I酶切切断未发生重组的质粒和未删除供给载体骨架的重组中间质粒，再转化一种不含Cre基因的大肠杆菌，获得含目的基因A的新接受载体；

S3.第2(偶数)轮基因组装：把含有目的基因(如基因B)的供给载体II质粒和上述含目的基因A的新接受载体质粒共转化含有Cre基因的大肠杆菌，或用分离纯化的Cre酶进行试管反应，通过野生型loxP位点重组产生重组型中间质粒；随后，在同一反应系中，其中的来源于供给载体II的loxP2L与来源于新接受载体的loxP2R发生不可逆重组，自动删除供给载体II的载体骨架，接受载体上保留目的基因B和基因A；提取纯化此反应产生的混合菌落的质粒或用特异重组酶进行体外反应的产物，用归巢酶PI-Sce I酶切切断未发生重组的质粒和未删除供给载体骨架的重组中间质粒，再转化一种不含Cre基因的大肠杆菌，获得含目的基因B/A的新接受载体；

S4.第3(奇数)轮基因组装：把含有目的基因(如基因C)的供给载体I质粒和含目的基因B/A的新接受载体质粒共转化到含有Cre基因的大肠杆菌，或用分离纯化的Cre酶进行试管反应，其余反应与步骤S2相同，获得含3个目的基因C/B/A的新接受载体；

S5.第4(偶数)轮基因组装：把含有目的基因(如基因D)的供给载体II质粒和含目的基因C/B/A的新接受载体质粒共转化到含有Cre基因的大肠杆菌，或用分离纯化的Cre酶进行试管反应，其余反应与步骤S3相同，获得含4个目的基因D/C/B/A的新接受载体；

S6.用含有目的基因的新接受载体质粒，不断与含新目的基因或DNA片段的供给载体I和II，交替重复奇数和偶数组装步骤，直到所有目的基因或DNA片段的组装到接受载体上，构建成多基因载体；

S7.标记删除元件组装：当需要构建可达到Marker-free的多基因载体时，用于起始组装的接受载体为不含植物抗生素标记基因，并且具有Gateway重组反应位点的接受载体；当以该接受载体完成多个目的基因的组装后，与可选择使用的Marker-free的供给质粒，在Gateway BP重组酶作用下，以体外重组反应把含植物筛选标记/重组酶基因的Marker-free标记删除元件序列组装到含有多个目的基因的接受载体上，完成最后一步反应，构建成可达到Marker-free的多基因载体。

所述的供给载体I为pYL322d1，所述的供给载体II为pYL322d2，所述的接受载体为pYLTAC380GW时，多基因组装方法的具体步骤如下：

(1)把需要组装的目的基因(或DNA片段)A、B、C、D、E、F等按组装先后次序排号；用任一种常规克隆方法把奇数次和偶数次组装的基因片段分别克隆到供给载体I和供给载体II的多克隆位点MCS中，如奇数次组装为pYL322d1-A、pYL322d1-C、pYL322d1-E等，偶数次组装为pYL322d2-B、pYL322d1-D、pYL322d1-F等；

(2)第1轮基因组装：把含有目的基因A的供给载体I质粒pYL322d1-A和1个起始接受载体质粒pYLTAC380GW混合，共转化含有Cre基因的大肠杆菌宿主NS3529，或用分离纯化的Cre重组酶进行试管内反应，使2种质粒通过野生型loxP位点发生重组整合为一个中间质粒，随后来源于接受载体的loxP1R与来源于pYL322d1-A的loxP1L发生不可逆重组反应，自动删除供给载体I的整个载体骨架，只保留目的基因A在新的接受载体上；提取纯化此共转化产生的混合菌落的质粒或用Cre进行试管反应的产物，用归巢酶I-Sce I酶切断未发生重组的接受载体和供给载体I(各含1个I-Sce I位点)和未删除供给载体骨架的质粒(含有2个I-Sce I位点)，而删除了供给载体骨架的目的质粒不含有I-Sce I位点(只含有1个PI-SceI位点)；将I-Sce I酶切产物转化不含Cre基因的大肠杆菌菌株如DH10B，在含抗生素(卡那霉素)的平板培养基上鉴定获得含目的基因A的新接受载体pYLTAC380GW-A；

(3)第2轮基因组装：把含有目的基因B的供给载体II质粒pYL322d2-B和含目的基因A的新接受载体质粒pYLTAC380GW-A共转化大肠杆菌NS3529，或用分离纯化的Cre酶进行试管内反应，使2种质粒通过野生型loxP发生重组整合为一个中间质粒，随后来源于接受载体的loxP2R与来源于pYL322d2-B的loxP2L发生不可逆重组反应，自动删除供给载体II的载体骨架，只保留目的基因B在新的接受载体上；提取纯化此共转化产生的混合菌落的质粒或用Cre进行试管反应的产物，用归巢酶PI-Sce I酶切切断未发生重组的接受载体和供给载体I(各含1个PI-Sce I位点)和未删除供给载体骨架的质粒(含有2个PI-Sce I位点)，而删除了供给载体骨架的目的质粒不含有PI-Sce I位点(只含有1个I-Sce I位点)；将PI-Sce I酶切产物转化大肠杆菌菌株如DH10B，在含抗生素(卡那霉素)的平板培养基上鉴定获得含目的基因B/A的新接受载体pYLTAC380GW-B/A；

(4)以装载有目的基因的新质粒为接受载体，不断交替重复所述步骤(2)和步骤(3)，直到完成所有目的基因组装完成，构建成多基因载体pYLTAC380GW···D/C/B/A；

(5)Marker-free结构的组装：如果要构建Marker-free的多基因载体，将含有所有目的基因的接受载体(pYLTAC380GW···D/C/B/A)与Marker-free供给质粒，如pYLMF-H，在BP重组酶作用下进行试管内反应，使pYLMF-H上的attP1/loxP/HPT/PV4-Cre/loxP/attP2结构替换掉pYLTAC380GW…D/C/B/A上的蔗糖致死基因SacB，最终完成Marker-free的多基因载体pYLTAC380MF···D/C/B/A的构建。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明包括1类接受载体、2类供给载体、以及可选择使用的能发生筛选标记自删除的供给质粒，利用Cre/loxP重组系统和两组突变型loxP的不可逆重组位点loxP1L/loxP1R或loxP2L/loxP2R，在Cre酶作用下，野生型loxP位点的重组实现供给载体整合到接受载体中，然后在同一反应系中其loxP1L/loxP1R或loxP2L/loxP2R的不可逆重组自动删除供给载体的骨架，只留下目的基因在接受载体上；重复供给载体交替与接受载体的组装，就能实现多基因的快速组装。与已报道的两个利用Cre/loxP重组系统的多基因载体系统相比，本发明只需要一个重组系统(Cre/loxP)，利用一种重组酶(Cre)和两组突变的不可逆重组位点(loxP1L/loxP1R或loxP2L/loxP2R)，可以将多个目的基因转移到一个接受载体，并自动去除供给载体骨架，对于多基因载体的构建更加简单有效。本发明是目前最简单高效的多基因载体系统。因此本发明对重要的、复杂生物合成途径和重要农艺性状的多基因遗传工程操作提供了可操作的技术平台，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明提供的多基因组装载体系统结构示意图；其中，图A为一个可用于构建Marker-free多基因载体的(双元)接受载体pYLTAC380GW，其以可转化人工染色体TAC为骨架，具有大的DNA负载能力(超过100kb)，在其T-DNA区(右边界RB与左边界LB之间的序列)具有loxP/I-SceI/loxP1R的多基因组装的功能区，以及一个接受Marker-free元件的Gateway重组位点attB1和attB2(它们之间有1个蔗糖致死基因SacB，用于负筛选整合的Marker-free元件)；图B为供给载体，包括供给载体I质粒pYL322d1，其具有多基因组装的功能元件loxP/PI-Sce I/loxP2R/MCS/loxP1L/I-Sce I，和供给载体II质粒pYL322d2，其具有多基因组装的功能元件loxP/I-Sce I/loxP1R/MCS/loxP2L/PI-Sce I；图C为3个包含不同植物抗性筛选标记基因(HPT，NPTII，Bar)的质粒，其Marker-free元件包括1个植物抗性筛选标记基因和花药特异表达启动子(Pv4)驱动的Cre基因表达盒。

图2为本发明创建的不可逆重组位点组loxP1L/loxP1R和loxP2L/loxP2R及其不可逆反应的示意图；其中，图A为野生型的loxP位点，由左臂序列(含13碱基)、决定重组位点方向和发生DNA链交换的间隔区序列(含8碱基)、以及右臂序列(含13碱基)组成，在Cre酶的作用下，2个野生型loxP位点之间可以发生可逆重组反应；图B和C分别是突变的loxP位点组loxP1L/loxP1R和loxP2L/loxP2R，其中L表示左臂和间隔区序列有人为突变(小写字母为突变碱基)，R表示右臂和间隔区序列有人为突变(小写字母为突变位点)；Cre酶可以识别催化组内位点之间重组，生成的LR位点为左臂、右臂和间隔序列都存在突变碱基的位点，它完全不能被Cre酶识别，所以此重组反应是单方向不可逆的；由于不同组loxP1L/loxP1R和loxP2L/loxP2R之间(以及它们与野生型loxP之间)的间隔区序列有差异，不能产生配对和链交换，这些突变loxP组之间(以及它们与野生型loxP之间)是不亲和的，不能发生重组反应。

图3为其它的多基因接受载体的结构示意图；其中，图A为以TAC载体骨架构建的多基因接受载体，具有多基因组装的功能区loxP/I-Sce I/loxP1R；图B为基于pBR322载体骨架的多基因接受载体，具有多基因组装的功能区loxP/I-Sce I/loxP1R，具有中等DNA负载能力(包括载体骨架约30kb)。

图4为多基因载体的组装流程图；其中，图A为多基因组装循环；图B为筛选标记基因删除(Marker-free)结构的组装过程。在任一个供给载体中可以用常规克隆方法连接进1个或若干个目的基因。

图5为构建接受载体的示意图；其中，图A是基于pBR322载体骨架的多基因接受载体pYL0380和pYL1300H的构建过程，图B、C、D是基于TAC载体骨架构建的多基因接受载体pYLTAC380(图B)、pYLTAC380H、pYLTAC380N和pYLTAC380B(图C)、和pYLTAC380GW(图D)。

图6为构建供给载体的示意图；其中，图A是pYL322d1，图B是pYL322d2。

图7为构建Marker-free供给质粒pYLMF-H/N/B的示意图。

图8为构建的多基因载体结构示意图与酶切检测图；其中，图A是通过5轮组装的含有6个基因的多基因载体pYLTAC380H-Hsp20.1-Hsp18.1-Hsp82.3-Hsp82.1-Hsp82.2-SNF2的结构示意图，其中箭头代表基因的转录方向，括号中的数字代表组装的基因顺序，N代表来源于供给载体MCS两侧的Not I酶切位点；图B组装完成的多基因载体用Not I酶切检测，其中Hsp20.1内部含有一个Not I位点，Hsp82.1和Hsp82.3基因重叠，Hsp20.1基因部分片段与载体骨架的1.5kb小片段重叠。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下述实施例中所使用的试验技术方法如无特殊说明，均为常规分子生物学技术方法，本领域的科研人员能够按常规分子生物学技术方法操作实现其结果；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。本发明的PCR扩增均使用耐热高保真DNA聚合酶，最终都通过测序证实PCR过程没有产生错误。

表1实施例中各个名称引物对应的核苷酸序列

实施例1

接受载体的构建

S1.接受载体pYL0380和pYL1300H的构建

如图5A所示，由商业公司合成215bp的含有核心元件loxP/I-Sce I/loxP1R和其它多个内切酶位点(MCS)的序列(EcoR I/Sac I/Kpn I/I-Ceu I/BamH I/PI-Psp I/Sal I/Pst I/loxP/I-Sce I/loxP1R/I-Ppo I/Hind III，图3B，该序列如SEQ ID NO.4所示)，以EcoR I和Hind III双酶切后，连接入经EcoR I和Hind III双酶切的pCAMBIA0380和pCAMBIA1300质粒(澳大利亚CAMBIA公司)，获得接受载体pYL0380和接受载体pYL1300H。

S2.接受载体pYLTAC380的构建

如图5B所示，以TAC载体pYLTAC747质粒(已在文献“Lin et al.,2003.Efficientlinking and transfer of multiple genes by a multigene assembly andtransformation vector system.Proc Natl Acad Sci.,100:5962-5967”公开)为模板，用引物P1/P2(引物5’末端含XbaI位点)进行PCR扩增，获得Xba I/P1裂解复制子-P1质粒复制子-卡拉霉素抗性基因(Kan^r)/Xba I的11.2kb的骨架片段；以pYL0380质粒为模板，用引物P3/P4进行PCR扩增，获得含Xba I/T-DNA区和农杆菌复制子pVS1/Xba I/的4.6kb的片段；Xba I酶切两个片段后连接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，直接挑选5个转化的单菌落提取质粒后测序，保留P1裂解复制子-LB(T-DNA左边界)连接方向的质粒，作为获得接受载体pYLTAC380。

S3.接受载体pYLTAC380H、pYLTAC380N和pYLTAC380B的构建

如图5C所示，用引物P5/P6(引物5’末端含Kpn I位点)分别从CAMBIA公司的质粒pCAMBIA1300、pCAMBIA2300和pCAMBIA3301扩增，获得两侧加上Kpn I位点的2.1kb的抗潮霉素基因(HPT)、1.9kb的抗卡拉霉素基因(NPTII)和1.5kb的抗草甘膦基因(Bar)，分别酶切连入S2的接受载体pYLTAC380的Kpn I位点，连接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，分别挑选5个转化的单菌落提取质粒后测序，保留LB-T35S连接方向的质粒，分别获得pYLTAC380H、pYLTAC380N和pYLTAC380B。

S4.接受载体pYLTAC380GW的构建

如图5D所示，根据pYLTAC27质粒的SacB基因序列(Liu Y.G.,Liu H,Chen L,QiuW,Zhang Q,Wu H,Yang C,Su J,Wang Z,Tian D,Mei M,2002.Development of newtransformation-competent artificial chromosome vectors and rice genomiclibraries for efficient gene cloning.Gene 282,247-255.)，商业合成2.2kb带有Gateway重组反应位点的Kpn I/attP1/SacB/attP1/BamH I片段(如SEQ ID NO.5所示)，用Kpn I和BamH I双酶切后，连入S2的接受载体pYLTAC380的相同位点，获得接受载体pYLTAC380GW。

实施例2

供给载体I和供给载体II的构建

S1.供给载体I质粒pYL322d1的构建

如图6A所示，用引物P7/P8(引物5’末端分别含BssH II/EcoR V位点和Mlu I位点)和P9/P10(引物5’末端分别含BssHII和Mlu I位点)，分别以图5A构建的pYL1300H和pYLSV质粒(已在文献“Lin et al.,2003.Efficient linking and transfer of multiple genesby a multigene assembly and transformation vector system.Proc Natl Acad Sci.,100:5962-5967”公开)为模板进行PCR扩增，获得BssHII/EcoR V/pBR322复制子/Mlu I片段和BssHII/Cm^r/Mlu I片段(插入片段I)。以BssH II和Mlu I双酶切后连接，获得中间载体d1-I；以商业合成的含BssH II位点的片段BssH II/loxP/PI-Sce I/loxP2R/MCS/loxP1L/I-Sce I/BssH II(插入片段II，如SEQ ID NO.6所示)，BssH II酶切连接入d1-I的相同位点，挑选5个转化的单菌落提取质粒后测序，保留EcoR V-BssH II/loxP连接方向的质粒，作为中间载体d1-II。以商业合成的LacZ基因片段(插入片段III，如SEQ ID NO.7所示)插入到d1-II的EcoR V位点，挑选5个转化的单菌落提取质粒后测序，保留正向插入的质粒，作为供给载体I质粒pYL322d1。

S2.供给载体II的pYL322d2质粒的构建

如图6B所示，用引物P11/P12(引物5’末端分别含Mlu I/BssH II位点和Mlu I位点)和P13/P14(引物5’末端分别含Mlu I位点)，分别以pYL322d1质粒和pUC18质粒为模板PCR扩增，获得Mlu I/BssH II/LacZ基因/pBR322复制子/Mlu I的骨架片段和Mlu I/氨苄抗性基因(Amp^r)/Mlu I片段(插入片段A)，Mlu I酶切后连接两个片段，挑选5个转化的单菌落提取质粒后测序，保留正向插入氨苄抗性基因(Amp^r)的质粒，作为中间载体d2-I；由商业公司合成含BssH II位点的片段BssH II/loxP/I-Sce I/loxP1R/MCS/loxP2L/PI-Sce I/BssHII(插入片段B，如SEQ ID NO.8所示)，BssH II酶切连接入中间载体d2-I的BssHII位点，挑选5个转化的单菌落提取质粒后测序，保留LacZ-BssHII/loxP/I-Sce I连接方向的质粒，作为供给载体II的质粒pYL322d2。

实施例3

Marker-free供给质粒的构建

如图7所示，用长引物P15/P16(引物5’末端分别含Xba I/Asc I/attB1位点和HindIII/Xba I/attB2位点)，以供给载体II质粒pYL322d2为模板PCR扩增，获得Xba I/Asc I/attB1/pBR322复制子/Amp^r/attB2/HindIII/Xba I的骨架片段，以Xba I酶切自连，获得中间载体pYLMF-0。

以水稻品种中花11的DNA为模板，用引物P17/P18PCR扩增花药特异表达基因Villin 4(基因号Os04g0604000)的启动子PV4作为片段1，用引物P19/P20以大肠杆菌NS3529基因组DNA为模板扩增Cre基因编码区(序列同GenBank No.DQ340306)获得片段2，用引物P21/P22从质粒pCAMBIA1305(CAMBIA公司)扩增Nos终止子Tnos作为片段3，用上述片段具有20～25bp同源序列，混合上述片段作为模板，用引物P17/P22(引物5’末端分别含Xba I位点和loxP/Hind III位点)做重叠PCR直接拼接获得Xba I/Cre基因表达盒(Pv4-Cre-Tnos)/loxP/Hind III片段，以Xba I和Hind III双酶切连接入pYLMF-0的相同位点，获得中间载体pYLMF-1。

用引物P23/P24(引物5’末端分别含Asc I/loxP位点和Xba I位点)分别以质粒pCAMBIA1300/2300/3301为模板PCR扩增植物抗性基因表达盒，分别获得2.1kb的Asc I/loxP/HPT/Xba I片段、1.9kb的Asc I/loxP/NPTII/Xba I片段和1.6kb的Asc I/loxP/Bar/Xba I片段，分别用Asc I和Xba I双酶切连接入pYLMF-1的相同位点，最终分别获得可剔除筛选标记(Marker-free)供给质粒pYLMF-H、pYLMF-N和pYLMF-B。

实施例4

多基因载体组装示例

S1.目的基因亚克隆到供给载体上

把要组装的目的基因，按组装的先后排序；奇数次组装(第1轮组装、第3轮组装、第5轮组装等以此类推)的目的基因亚克隆到供给载体I质粒pYL322d1的多克隆位点MCS上；偶数次组装(第2轮组装、第4轮组装、第6轮组装等以此类推)的目的基因亚克隆到供给载体II质粒pYL322d2的MCS上；在技术难度允许的情况下，也可以将2个及以上的目的基因亚克隆到同一个供给载体上。

奇数次组装的目的基因亚克隆到多基因供给载体I质粒pYL322d1：以水稻品种中花11的基因组DNA为模板，用引物P25/P26(引物5’末端分别含Asc I位点)扩增SNF2基因(基因号Os02g0161400，4.3kb)，用Asc I位点亚克隆到pYL322d1，产生质粒pYL322d1-SNF2；以水稻黄华占DNA为模板，用引物P27/P28(引物5’末端分别含Asc I位点)扩增Hsp82.1基因(基因号Os08g0500700，6.8kb)，用Asc I位点亚克隆到pYL322d1，产生质粒pYL322d1-Hsp82.1；以水稻品种黄华占DNA为模板，先用引物P29/P30(引物5’末端分别含Hind III位点)扩增Hsp18.1基因(Os03g0266300，2.1kb)，把Hsp18.1再亚克隆到pYL322d1的MCS中的Hind III位点，获得pYL322d1-Hsp18.1载体，再用引物P31/P32(引物5’末端分别含Asc I位点)扩增Hsp20.1基因(Os02g0758000，2.5kb)，再亚克隆到pYL322d1的MCS中的Asc I位点，产生含双基因的质粒pYL322d1-Hsp18.1-Hsp20.1。

偶数次组装的目的基因亚克隆到多基因供给载体II质粒pYL322d2：以水稻黄华占DNA为模板，用引物P33/P34(引物5’末端分别含Asc I位点)扩增Hsp82.2基因(Os04g0107900，6.2kb)，在用相同的Asc I位点亚克隆到pYL322d2，产生质粒pYL322d2-Hsp82.2；以黄华占DNA为模板，用引物P35/P36(引物5’末端分别含Asc I位点)扩增Hsp82.3基因(Os09g0482400,6.4kb)，在用相同的Asc I位点亚克隆到pYL322d2，产生质粒pYL322d2-Hsp82.3。

S2.目的基因组装到多基因接受载体pYLTAC380H上，获得含6个基因的多基因载体pYLTAC380H-Hsp20.1-Hsp18.1-Hsp82.3-Hsp82.1-Hsp82.2-SNF2：

S2.1.SNF2基因的组装(第1轮)：将含SNF2基因的供给载体pYL322d1-SNF2质粒与多基因接受载体pYLTAC380H质粒混合，电激转化能表达Cre酶的大肠杆菌菌株NS3529感受态细胞，在含卡拉霉素(25μg/ml)和氯霉素(15μg/ml)双抗LB平板培养基(下同)上筛选转化子，利用NS3529内源表达的Cre酶，实现接受载体和供给载体质粒的整合和供给载体骨架的删除。洗下双抗平板上的混合菌落抽提质粒，再用I-SceI酶切切断未重组的质粒和未删除供给载体骨架的重组中间质粒后，转化不含Cre基因的大肠杆菌菌株DH10B，在含卡拉霉素(25μg/ml)的LB平板培养基上鉴定，获得含1个基因的载体pYLTAC380H-SNF2。

S2.2.Hsp82.2基因的组装(第2轮)：将含Hsp82.2基因的供给载体pYL322d2-Hsp82.2质粒与步骤S2.1构建的新接受载体pYLTAC380H-SNF2质粒混合，电激转化NS3529感受态细胞，在含卡拉霉素(25μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)双抗LB平板培养基上筛选转化子，利用NS3529内源表达的Cre酶，实现接受载体和供给载体质粒的整合和供给载体骨架的删除。洗下双抗平板上的混合菌落抽提质粒，再用PI-SceI酶切切断未重组的质粒和未删除供给载体骨架的重组中间质粒后，转化大肠杆菌DH10B，在含卡拉霉素(25μg/ml)平板培养基上鉴定，获得含1个基因的载体pYLTAC380H-Hsp82.2-SNF2。

S2.3.Hsp82.1基因的组装(第3轮)：将含Hsp82.1基因的供给载体pYL322d1-Hsp82.1质粒与步骤S2.2获得新接受载体pYLTAC380H-Hsp82.2-SNF2质粒混合，电激转化NS3529感受态细胞，在含卡拉霉素和氯霉素平板培养基上筛选转化子。洗下双抗平板培养基上的混合菌落抽提质粒，用I-SceI酶切后转化DH10B，在卡拉霉素平板培养基上鉴定获得含3个基因的载体pYLTAC380H-Hsp82.1-Hsp82.2-SNF2。

S2.4.Hsp82.3基因的组装(第4轮)：将含Hsp82.3基因的供给载体pYL322d2-Hsp82.3质粒与步骤S2.3获得的新接受载体pYLTAC380H-Hsp82.1-Hsp82.2-SNF2质粒混合，电激转化NS3529感受态细胞，在卡拉霉素和氨苄霉素双抗平板培养基上筛选转化子。洗下混合菌落抽提质粒，用PI-SceI酶切质粒后转化DH10B，在卡拉霉素平板培养基上鉴定获得含4个基因的多基因载体pYLTAC380H-Hsp82.3-Hsp82.1-Hsp82.2-SNF2。

S2.5.Hsp20.1和Hsp18.1基因表达盒的组装(第5轮)：将含Hsp20.1和Hsp18.1基因的供给载体pYL322d1-Hsp20.1-Hsp18.1质粒与步骤S2.4获得的新接受载体pYLTAC380H-Hsp82.3-Hsp82.1-Hsp82.2-SNF2质粒混合，电激转化NS3529感受态细胞，在含卡拉霉素和氯霉素平板上筛选转化子。洗下双抗平板培养基上的混合菌落抽提质粒，用I-SceI酶切后转化DH10B，在卡拉霉素平板培养基上鉴定获得含6个基因的多基因载体pYLTAC380H-Hsp20.1-Hsp18.1Hsp82.3-Hsp82.1-Hsp82.2-SNF2(图8A)。用Not I酶切电泳鉴定此多基因载体质粒(图8B)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种多基因组装载体系统及其多基因组装方法

<130> 1

<160> 48

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 99

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> loxP/I-Sce I/loxP1R核心元件

<400> 1

ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatgggccg cattaccctg ttatccctag 60

gccgcataac ttcgtatagc ctacattata ggatggagg 99

<210> 2

<211> 313

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> loxP/PI-Sce I/loxP2R-MCSI-loxP1L/I-Sce I核心元件

<400> 2

ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatcagatc taatactgcc atttcattac 60

ctctttctcc gcacccgaca tagatgcaat aacttcgtat aggctaattt atacgatgta 120

ggagatcgat gcatgcggcc gctagctcga gaggcgcgcc taccggtgag ctctagaatt 180

ctgcaggtac cgcggatcca tgggcccggg actagtcgac atgtacaagc ttagcggccg 240

cataaggccg gccttgccct agttcctata gcctacatta tacgaagtta tactagggat 300

aacagggtaa ttc 313

<210> 3

<211> 304

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> loxP/I-Sce I/loxP1R/MCS/loxP2L/PI-Sce I核心元件

<400> 3

ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatcagatc tgaattaccc tgttatccct 60

agtataactt cgtatagcct acattatagg atggagggca tggccggcca tgcggccgca 120

agcttgtaca tgtcgactag tcccgggccc atggatccgc ggtacctgca gaattctaga 180

gcaccggtaa ggcgcgcctc tcgagctagc ggccgcatgc atcgatctag tagaacgtat 240

aggctaattt atacgaagtt attacatcta tgtcgggtgc ggagaaagag gtaatgaaat 300

ggca 304

<210> 4

<211> 215

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MCS/loxP/I-SceI/loxP1R片段序列

<400> 4

gaattcgagc tcggtaccaa ctataacggt cctaaggtag cgaaggatcc tggcaaacag 60

ctattatggg tgtcgacctg cagtcataac ttcgtatagc atacattata cgaagttatg 120

ggccgcatta ccctgttatc cctaggccgc ataacttcgt atagcctaca ttataggatg 180

gagggatatc ctctcttaag gtagcgagca agctt 215

<210> 5

<211> 2262

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 带有Gateway重组反应位点的Kpn I/attP1/SacB/attP1/BamH I片段

<400> 5

gagctcataa ggtaccgtaa aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt 60

ttattttgac tgatagtgac ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata 120

atgccaactt tgtacaaaaa agctgaacga gaaacgtaaa atgatataaa tatcaatata 180

ttaaattaga ttttgcataa aaaacagact acataatact gtaaaacaca acatatccag 240

tcactatgaa tcaactactt agatggtatt agtgacctgt aggcgactta ataacacatt 300

gcggacgttt ttaatgtact gaattcttaa ttaacccacg tgttgagaaa taaaagaaaa 360

tgccaatgaa gtatcggcat tttctttttg ctgttattag ttgactgtca gctgtccttg 420

ctccaggatg ctgtttttga caacggatgt tttattgcct ttgatgttca ttaagaagct 480

cggggcaaat gttgcctttt tatcctcgaa gaagcctctg tttgtcatgt agcttgtgat 540

aaccacattg ttgcctttgg cttgcggcac tgcgaagtga gagtaagtga atgtcacatc 600

gtttggatca agacccattt gcagcacaag ccctgttttg ttcagcggct tgtaagggcc 660

ggttaaagag tttgatacat aaccaagcat gtaaatatcg tttgagttaa taccatcgat 720

cgtcattttt gaaccgcgtg aatcagtgaa caagtaccat ttgccgttca ttttgaaaac 780

attcgcgcgc tcgatttcat cagttaccgt gtttgaagtg atcagcggct tcattacttt 840

tttcaatgtg taatcattat ttaactctat gataccgagg gcgccgttcg ctaactcagc 900

atcgcgtttt ttagcgctct gctggagctt ctggctttct ttacggaaga agttcgtgcc 960

gccgccgtag tacgctttgt taaataaaga ttcttcgcct tggtatccgt tttctgttcc 1020

cgtgttggct tcgaatacaa gatatttatg gcctttgtct tcaacgtagt gagggtctct 1080

cagcgtatgg ttgtcgccgg atgtataatt gccttcatcg ataaactgct gaacgttctg 1140

atatgttttt ccgtctccgt caaaaatcgt tttgtgatct tccactccgt tgattttgag 1200

tgtgtcatca gattttgaca catttacctg cgctgttgtc aggctttgtt tgccgtaatg 1260

tttaccggaa tagtcagtgt agaataaacg gatttttccg tcagatgtaa aggttgcaga 1320

accggaccat tcttgcgtct gatctttcag gatcggatcg ttggcgtcga acttatcgct 1380

gtctttaaag acacggcccg cgtttttcca gctgtcgatt gagttgtcgc cgaccttttg 1440

ataaaacatg tagattgatg tgtcatcagc gtctttcggg cttcccgcaa gagcaaacac 1500

aacgtgatag ccgttgtatt cagctactgt tccgtcagcg ttttgcagcg gccagctgtc 1560

ccacacatca agtccttttg cagactcaat atttttaatc gttgattgat cgaattgagg 1620

cacttggtat ttttcgtttt gctgctgttt agggatctgc agcatatcat ggcgtgtaat 1680

atgagagacg ccgtacgttt ctttgtatgc tttttggtta ttttctttcg cgaaggcttg 1740

agtcgctcct cctgccagaa gtgcagtcgt aaaagtcaga actgtggctt gttttacaat 1800

ttttttgatg ttcatgttca tgtctccttc tgtatgtact gttttttgcg atctgccgtt 1860

tcgatcctcc cgaattgact agtgggtagg cctaattgcg gcctagggat aacagaaaaa 1920

tttattagag caatatagtc ctacaatgtc aaagtcgact acaggtcact aataccatct 1980

aagtagttga ttcatagtga ctggatatgt tgtgttttac agtattatgt agtctgtttt 2040

ttatgcaaaa tctaatttaa tatattgata tttatatcat tttacgtttc tcgttcagct 2100

ttcttgtaca aagttggcat tataagaaag cattgcttat caatttgttg caacgaacag 2160

gtcactatca gtcaaaataa aatcattatt tgccatccag ctgatatccc ctatagtgag 2220

tcgtattaca tggtcatagc tgtttcctgg cagctcggat cc 2262

<210> 6

<211> 335

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BssHII/loxP/PI-Sce I/loxP2R/MCS/loxP1L/I-Sce I/BssHII片段

<400> 6

gcgcgctcat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atcagatcta atactgccat 60

ttcattacct ctttctccgc acccgacata gatgcaataa cttcgtatag gctaatttat 120

acgatgtagg agatcgatgc atgcggccgc tagctcgaga ggcgcgccta ccggtgagct 180

ctagaattct gcaggtaccg cggatccatg ggcccgggac tagtcgacat gtacaagctt 240

agcggccgca taaggccggc cttgccctag ttcctatagc ctacattata cgaagttata 300

ctagggataa cagggtaatt cagatctcag cgcgc 335

<210> 7

<211> 365

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LacZ基因片段

<400> 7

gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 60

gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 120

ctatgaccat gattacgcca gatatcatgt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 180

gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 240

ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 300

gcgaatggga cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca 360

gctaa 365

<210> 8

<211> 331

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BssHII/loxP/I-Sce I/loxP1R/MCS/loxP2L/PI-Sce I/BssHII片段序列

<400> 8

gcgcgctcat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atcagatctg aattaccctg 60

ttatccctag tataacttcg tatagcctac attataggat ggagggcatg gccggccatg 120

cggccgcaag cttgtacatg tcgactagtc ccgggcccat ggatccgcgg tacctgcaga 180

attctagagc accggtaagg cgcgcctctc gagctagcgg ccgcatgcat cgatctagta 240

gaacgtatag gctaatttat acgaagttat tacatctatg tcgggtgcgg agaaagaggt 300

aatgaaatgg cagtattaga tctcagcgcg c 331

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> loxP1L

<400> 9

cctagttcct atagcctaca ttatacgaag ttat 34

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> loxP1R

<400> 10

ataacttcgt atagcctaca ttataggatg gagg 34

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> loxP2L

<400> 11

agtagaacgt ataggctaat ttatacgaag ttat 34

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> loxP2R

<400> 12

ataacttcgt ataggctaat ttatacgatg tagg 34

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1

<400> 13

aatatttcta gaaataggcg ttgcgcttat ccagcctcgt c 41

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P2

<400> 14

aatatttcta gatacaggca gcccatcagt cc 32

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P3

<400> 15

aatatttcta gagtggtgat tttgtgccga gctgccg 37

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P4

<400> 16

aatatttcta gaagcggcca gcggccgcga taggccgacg cg 42

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P5

<400> 17

aattaaggta ccgcggccgc taattcgggg gatctgg 37

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P6

<400> 18

aattaaggta ccgcggccgc gcggtttgcg tattggctag agcagcttgc 50

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P7

<400> 19

aattaagcgc gcaagatatc gcatgaccaa aatcccttaa cgtg 44

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P8

<400> 20

aattaaacgc gtcgcgcgtt tcggtgatga cggtg 35

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P9

<400> 21

aattaagcgc gcccctatag tgagtcgtat ta 32

<210> 22

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P10

<400> 22

aattaaacgc gtagattatc aaaaaggatc ttcacctag 39

<210> 23

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P11

<400> 23

aattaaacgc gtaagcgcgc atcaaaggat cttcttgaga tcc 43

<210> 24

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P12

<400> 24

aattaaacgc gtcacctaaa tgatatctta gctg 34

<210> 25

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P13

<400> 25

aattaaacgc gtgattttgc cgatttcggc ctattgg 37

<210> 26

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P14

<400> 26

aattaaacgc gtagattatc aaaaaggatc ttcacctag 39

<210> 27

<211> 71

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P15

<400> 27

aattaatcta gaaaggcgcg ccataacaag tttgtacaaa aaagcaggct taagggattt 60

tgccgatttc g 71

<210> 28

<211> 71

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P16

<400> 28

aattaatcta gaataagctt aataccactt tgtacaagaa agctgggtcg cgcgtttcgg 60

tgatgacggt g 71

<210> 29

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P17

<400> 29

taatctaagc tttataactt cgtatagcat acattatacg aagttatagt tgcagtagga 60

tagaggtggc 70

<210> 30

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P18

<400> 30

aattaatcta gaagtacggt cagtaaattg gacatgcttg atgttgtgaa agagcctttc 60

c 61

<210> 31

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P19

<400> 31

ggaaaggctc tttcacaaca tcaagcatgt ccaatttact gaccgtac 48

<210> 32

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P20

<400> 32

ccaaatgttt gaacgatcgg gactaatcgc catcttccag cagg 44

<210> 33

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P21

<400> 33

cctgctggaa gatggcgatt agtcccgatc gttcaaacat ttgg 44

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P22

<400> 34

cccgatctag taacatagat 20

<210> 35

<211> 68

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P23

<400> 35

ataattgcgc gcaaataact tcgtatagca tacattatac gaagttatcg ctaattcggg 60

ggatctgg 68

<210> 36

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P24

<400> 36

aattaatcta gagcgcggtt tgcgtattgg ctagagcagc ttgc 44

<210> 37

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P25

<400> 37

aattaaggcg cgccgacgac gttattctac ttagtttgag 40

<210> 38

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P26

<400> 38

ataataggcg cgccgcagat agtatataca actcctctc 39

<210> 39

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P27

<400> 39

aattaaggcg cgccggagtg agctgctctg aagaaac 37

<210> 40

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P28

<400> 40

aattaaggcg cgccactccc tccttcacca cacattgg 38

<210> 41

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P29

<400> 41

aattaaaagc ttagttttgc tcctcctctc gccacgctt 39

<210> 42

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P30

<400> 42

aattaaaagc tttgctagcg tgctttgctc gcc 33

<210> 43

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P31

<400> 43

aattaaggcg cgcctcagat agtcatctaa cctagg 36

<210> 44

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P32

<400> 44

aattaaggcg cgccaatata tggaaagtta at 32

<210> 45

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P33

<400> 45

aattaaggcg cgccgccgga gatgtaatcc atttcc 36

<210> 46

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P34

<400> 46

aattaaggcg cgccctctcc tcttaggtga ttttcttaaa agc 43

<210> 47

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P35

<400> 47

aattaaggcg cgccgcatcc atttagtttc ttgtcaaact ttgg 44

<210> 48

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P36

<400> 48

aattaaggcg cgccgttacg gtggtttatg gtacgagtg 39

Claims

1.一种多基因组装载体系统，其特征在于：命名为TGSII，包括1类接受载体、2类供给载体、以及可选择使用的能发生筛选标记自删除的供给质粒；2类供给载体分别命名为供给载体I和供给载体II；接受载体具有如SEQ ID NO.1所示的loxP/I-Sce I/loxP1R核心元件DNA序列；供给载体I具有如SEQ ID NO.2所示的loxP/PI-Sce I/loxP2R/MCS/loxP1L/I-Sce I核心元件DNA序列：供给载体II具有如SEQ ID NO.3所示的loxP/I-Sce I/loxP1R/MCS/loxP2L/PI-Sce I核心元件DNA序列。

2.根据权利要求1所述的多基因组装载体系统，其特征在于：

所述的接受载体具有如下特点：

(2)具有1个不同于供给载体的细菌抗生素选择标记基因；

(3)具有1个DNA质粒的复制子元件；

所述的供给载体I具有如下特点：

1)具有1个野生型loxP位点和2个归巢酶位点PI-Sce I和I-Sce I；

2)具有2个突变型loxP位点loxP2R和loxP1L；

3)具有一个多克隆位点MCS；

4)特征1)～3)中的位点按loxP/PI-Sce I/loxP2R/MCSloxP1L/I-Sce I的顺序排列；

5)具有1个不同于接受载体与供给载体II的细菌选择标记基因；

所述的供给载体II具有如下特征：

②具有2个突变的loxP位点loxP1R和loxP2L；

③具有一个多克隆位点MCS；

⑤具有1个不同于接受载体与供给载体I的的细菌选择标记基因；

所述的可选择使用的能发生筛选标记自删除的供给质粒具有如下特点：

(A)具有Gateway特异重组反应的两个位点attP1和attP2；

(B)具有2个同向的或1个野生型loxP位点；

(C)具有任一个植物筛选标记基因；

(E)特征(A)～(D)中的位点和基因在质粒载体上的排列顺序为：attP1/loxP/植物筛选标记/Cre表达盒/loxP/attP2，构成可删除筛选标记结构。

3.根据权利要求2所述的多基因组装载体系统，其特征在于：

接受载体的特点(2)中所述的细菌抗生素选择标记基因为卡拉霉素抗性基因；

接受载体的特点(3)中所述的DNA质粒的复制子元件为P1噬菌体的复制子；

供给载体I的特点5)中所述的细菌选择标记基因为氯霉素抗性基因；

供给载体II的特点⑤具中所述的细菌选择标记基因为氨苄抗性选择基因；

能发生筛选标记自删除的供给质粒的特点(C)中所述的植物筛选标记基因为抗潮霉素基因、抗卡拉霉素或抗草甘膦基因。

4.根据权利要求2所述的多基因组装载体系统，其特征在于：

所述的接受载体为pYLTAC380GW、pYLTAC380、pYLTAC380H、pYLTAC380N、pYLTAC380B、pYL0380、pYL1300H；

接受载体pYL0380通过如下步骤制备得到：将如SEQ ID NO.4所示的序列，通过EcoR I和Hind III双酶切后，克隆到EcoR I和Hind III双酶切后的pCAMBIA0380得到；

接受载体pYL1300H通过如下步骤制备得到：将如SEQ ID NO.4所示的序列，通过EcoR I和Hind III双酶切后，克隆到EcoR I和Hind III双酶切后的pCAMBIA1300得到；

接受载体pYLTAC380通过如下步骤制备得到：以pYLTAC747质粒为模板，用引物P1/P2进行PCR扩增，获得骨架片段；以pYL0380质粒为模板，用引物P3/P4进行PCR扩增，获得插入片段；用Xba I分别酶切骨架片段和插入片段，将酶切后的骨架片段和插入片段连接，得到接受载体pYLTAC380；

接受载体pYLTAC380N通过如下步骤制备得到：以pCAMBIA2300为模板，用引物P5/P6进行扩增，得到两侧带有Kpn I位点的抗卡拉霉素基因；用Kpn I分别单酶切两侧带有Kpn I位点的抗卡拉霉素基因和接受载体pYLTAC380；再将酶切后的抗卡拉霉素基因和接受载体pYLTAC380连接，得到pYLTAC380N载体；

接受载体pYLTAC380GW通过如下步骤制备得到：通过Kpn I和BamH I双酶切分别酶切如SEQ ID NO.5所示的带有Gateway重组反应位点的Kpn I/attP1/SacB/attP1/BamH I片段和接受载体pYLTAC380，再将酶切后的带有Gateway重组反应位点的Kpn I/attP1/SacB/attP1/BamH I片段和接受载体pYLTAC380连接，得到接受载体pYLTAC380GW。

5.根据权利要求2所述的多基因组装载体系统，其特征在于：

所述的供给载体I为pYL322d1，其通过如下步骤制备得到：以pYL1300H为模板，通过引物P7/P8扩增，得到骨架片段；以pYLSV质粒为模板，通过引物P9/P10扩增，得到插入片段I；再通过BssHII和Mlu I双酶切分别酶切骨架片段和插入片段I，得到中间载体d1-I；通过BssH II分别单酶切中间载体d1-I和如SEQ ID NO.6所示的插入片段II，将单酶切后的中间载体d1-I和插入片段II连接，得到中间载体d1-II；通过EcoR V分别单酶切中间载体d1-II和如SEQ ID NO.7所示的插入片段III，将单酶切后的中间载体d1-I和插入片段III连接，得到质粒pYL322d1；

所述的供给载体II为pYL322d2，其通过如下步骤制备得到：以pYL322d1为模板，通过引物P11/P12扩增，得到骨架片段；以pUC18质粒为模板，通过引物P13/P14扩增，得到插入片段A；通过Mlu I分别单酶切骨架片段和插入片段A，将单酶切后的骨架片段和插入片段A连接，得到中间载体d2-I；通过Mlu I分别单酶切中间载体d2-I和如SEQ ID NO.8所示的插入片段B，将单酶切后的中间载体d1-I和插入片段B连接，得到质粒pYL322d2。

6.根据权利要求2所述的多基因组装载体系统，其特征在于：所述的可选择使用的能发生筛选标记自删除的供给质粒为pYLMF-H、pYLMF-N和pYLMF-B；

供给质粒pYLMF-H、pYLMF-N和pYLMF-B通过如下步骤制备得到：

1)用引物P15/P16，以供给载体II质粒pYL322d2为模板，PCR扩增，获得骨架片段，Xba I酶切该骨架片段后自连，获得中间载体pYLMF-0；

3)用引物P23/P24分别以质粒pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3301为模板，PCR扩增植物抗性基因表达盒，分别获得Asc I/loxP/HPT/Xba I片段、Asc I/loxP/NPTII/Xba I片段和Asc I/loxP/Bar/Xba I片段，分别用Asc I和Xba I双酶切，再连接入Asc I和Xba I双酶切后的pYLMF-1，分别得到质粒pYLMF-H、pYLMF-N和pYLMF-B。

7.根据权利要求2所述的多基因组装载体系统，其特征在于：所述的突变的loxP位点是不可逆的特异重组突变型，其包括loxP1L、loxP1R、loxP2L、和loxP2R；

A)在同一组的2个突变型loxP位点，loxP1R和loxP1L为同一组，loxP2R和loxP2L为同一组；其中1个在左臂中有4-6碱基的突变，另1个在右臂中有4-6碱基的突变，2个位点的中部间隔区有1-4碱基的相同突变；

B)loxP1L/loxP1R和loxP2L/loxP2R的中部间隔区序列在组内相同而在组间不同，不可逆特异重组只在同一组的2个位点之间发生，即loxP1L只与loxP1R发生重组反应，loxP2L只与loxP2R发生重组反应，组间的任2个位点不能发生重组反应；

C)loxP1L和loxP1R之间，或loxP2L和loxP2R之间，的重组产生的新位点loxP1LR或loxP2LR在左臂和右臂都含有突变碱基，不被重组酶Cre有效识别结合，因而不再发生可逆的回复重组。

8.根据权利要求7所述的多基因组装载体系统，其特征在于：

所述的loxP1L的序列如SEQ ID NO:6所示；

所述的loxP1R的序列如SEQ ID NO:7所示；

所述的loxP2L的序列如SEQ ID NO:8所示；

所述的loxP2R的序列如SEQ ID NO:9所示。

9.权利要求1～8任一项所述的多基因组装载体系统的应用，其特征在于：所述的多基因组装载体系统用于培育转基因转化生物，或是进行多基因转化表达。

10.一种多基因组装方法，其特征在于：是对权利要求1～8任一项所述的多基因组装载体系统的具体应用，是利用位点特异重组及不可逆重组位点，使供给载体I和供给载体II轮流交替地和接受载体进行多轮基因组装，其具体步骤如下：

S2.第1轮基因组装：把含有目的基因A的供给载体I质粒和接受载体质粒共转化到含有Cre基因的大肠杆菌，或用分离纯化的Cre酶进行试管反应，使2种质粒通过野生型loxP位点发生重组，整合为一个重组型中间质粒；随后，其中的来源于供给载体I的loxP1L与来源于接受载体的loxP1R发生不可逆重组反应，自动删除此2个位点之间的供给载体I的载体骨架片段，只保留目的基因A在接受载体上；提取纯化此反应产生的混合菌落的质粒或用特异重组酶进行体外反应的产物，用归巢酶I-Sce I酶切切断未发生重组的质粒和未删除供给载体骨架的重组中间质粒，再转化一种不含Cre基因的大肠杆菌，获得含目的基因A的新接受载体；

S3.第2轮基因组装：把含有目的基因B的供给载体II质粒和上述含目的基因A的新接受载体质粒共转化含有Cre基因的大肠杆菌，或用分离纯化的Cre酶进行试管反应，通过野生型loxP位点重组产生重组型中间质粒；随后，其中的来源于供给载体II的loxP2L与来源于新接受载体的loxP2R发生不可逆重组，自动删除供给载体II的载体骨架，接受载体上保留目的基因B和基因A；提取纯化此反应产生的混合菌落的质粒或用特异重组酶进行体外反应的产物，用归巢酶PI-Sce I酶切切断未发生重组的质粒和未删除供给载体骨架的重组中间质粒，再转化一种不含Cre基因的大肠杆菌，获得含目的基因B/A的新接受载体；

S4.第3轮基因组装：把含有目的基因C的供给载体I质粒和含目的基因B/A的新接受载体质粒共转化到含有Cre基因的大肠杆菌，或用分离纯化的Cre酶进行试管反应，其余反应与步骤S2相同，获得含3个目的基因C/B/A的新接受载体；

S5.第4轮基因组装：把含有目的基因D的供给载体II质粒和含目的基因C/B/A的新接受载体质粒共转化到含有Cre基因的大肠杆菌，或用分离纯化的Cre酶进行试管反应，其余反应与步骤S3相同，获得含4个目的基因D/C/B/A的新接受载体；

S7.可删除筛选标记元件的组装：当需要构建Marker-free的多基因载体时，使用起始组装的接受载体为不含植物抗生素标记基因，并且具有Gateway重组反应位点的接受载体；当以该接受载体完成多个目的基因的组装后，与可选择使用的Marker-free的供给质粒，在Gateway BP重组酶作用下，以把含植物筛选标记/重组酶基因的Marker-free标记删除元件序列组装到含有多个目的基因的接受载体上，完成最后一步反应，构建成Marker-free的多基因载体。