CN114591974B - 一种提高植物的咖啡酸含量和/或生物自发光强度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高植物的咖啡酸含量和/或生物自发光强度的方法，属于生物技术领域。所述方法包括：(1)利用多基因组装技术依次将NtCM1基因、NtPAT基因、NtADT2基因、NtPAL1基因、NtC4H基因整合到受体载体中，构建获得多基因载体；(2)利用转基因技术将目标基因片段导入受体植株中，获得咖啡酸含量和/或生物自发光强度增强的转基因植株。本发明首次公开上述基因参与植物中咖啡酸的合成，与自发光的Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因共同表达，可以显著提升植物的生物自发光强度。本发明为高咖啡酸植物及可持续发光植物的育种和生产提供了一个可行的技术方案。

Description

一种提高植物的咖啡酸含量和/或生物自发光强度的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用烟草NtCM1、NtPAT、NtADT2、NtPAL1、NtC4H基因的共表达以提高植物咖啡酸含量和生物自发光强度的方法。
背景技术
咖啡酸(caffeic acid)，又称为“3,4-二羟基肉桂酸”，分子式C9H8O4，分子量180.15。咖啡酸一般存在于植物体内。咖啡酸作为一种多酚类物质具有非常高的生物活性，可以有效去除自由基，具有良好的抗氧化活性，和预防心脑血管疾病，可以作为饮品添加剂，也可以用作原料药(Ekeuku et al.,2021)，最新研究发现咖啡酸还作为生物自发光代谢途径中最重要的前体物(Reuter et al.,2020)，因此咖啡酸的合成及应用有着广阔的应用前景。
很早以前已经发现在森林中存在发光的真菌，长期以来，人们推测真菌生物发光系统(Elucidation of the Fungal Bioluminescent Pathway，FBP)至少由四种成分组成：分子氧、荧光素、依赖于NAD(P)H的羟化酶和荧光素酶。2018年，Kotlobay等鉴定了FBP中的真菌荧光素酶及其他三种关键酶，阐明了真菌荧光素的生物合成循环以及发光机制(Kotlobay et al.,2018)。随后这参与真菌发光的基因被转入烟草基因组中创造出生物自发光的烟草(Mitiouchkina et al.,2020)。将FBP应用于植物的关键是原料咖啡酸，咖啡酸是生产木质素和其他关键植物代谢物的关键中间体，广泛存在于植物中。
Khakhar A等将构巢曲霉(Aspergillus nidulans)基因组中的NPGA(4’-phosphopantetheinyl transferase)基因、光茸菌(Neonothopanus nambi)基因组中的H3H(hispidin-3-hydroxylase)基因和Hisps(Hispidin synthase)基因，以及真菌荧光素酶(Luz)基因整合到Moclo质粒中，再将质粒导入根瘤农杆菌(A.tumefaciens)中，并与经过预处理的茎外植体进行混合培养，将生物自发光元件整合入植株基因组中。使得植株体内来自苯丙氨酸生物合成途径的咖啡酸(caffeic acid)经Hisps蛋白酶(Hispidin synthase)激活后转化为牛奶树碱(Hispidin)，牛奶树碱经牛奶树碱3-羟基化酶(hispidin-3-hydroxylase，H3H)催化产生3-羟基牛奶树碱(3-hydroxyhispidin)，荧光素酶(Luz)会将3-羟基牛奶树碱氧化成荧光素3-羟基牛奶树碱，荧光素3-羟基牛奶树碱在释放能量变成咖啡酰丙酮酸(caffeylpyruvic acid)的过程中会释放出波长在520nm的可见光。随后，CPH(Caffey pyruvate hydrolase)编码的蛋白酶将咖啡酰丙酮酸转化成咖啡酸，从而实现植物自发光循环，使植物持续产生光(Mitiouchkina et al.,2020)。
但是已发表文章中生物自发光烟草发光较弱，一个重要的限制因素是植物内源的咖啡酸含量较低，因此，通过遗传操作增强植物内源的咖啡酸合成途径，并使该咖啡酸合成途径和植物自发光途径耦合，创造出生物自发光亮度更强的植物，在自发光植物的应用方面有重要作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够提升植物内源咖啡酸含量和生物自发光强度的基因组合，将其应用与高咖啡酸含量植物及可持续发光植物的选育当中。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了NtCM1、NtPAT、NtADT2、NtPAL1和NtC4H基因共表达在提高植物咖啡酸含量和/或提高植物生物自发光强度中的应用，所述NtCM1基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，所述NtPAT基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示，所述NtADT2基因的CDS序列如SEQ IDNO.3所示，所述NtPAL1基因的CDS序列如SEQ ID NO.4所示，所述NtC4H基因的CDS序列如SEQID NO.5所示。
本发明研究发现，烟草基因组中NtCM1，NtPAT，NtADT2，NtPAL1，NtC4H基因编码的蛋白酶参与咖啡酸合成途径，通过基因工程手段整合上述基因使其在植物体内共表达，可显著提高植物中咖啡酸含量。
此外，咖啡酸作为生物自发光代谢途径中的前体物，其含量增加有助于增强自发光植株的生物自发光强度，研究表明，相较于由Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因整合入植株基因组中获得的自发光植株，进一步整合烟草NtCM1，NtPAT，NtADT2，NtPAL1，NtC4H基因可以显著提高植物自发光强度。
具体的，NtCM1基因来源于烟草基因组，编码分支酸变位酶(chorismate mutase)。该基因的CDS序列全长957bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质酶由318个氨基酸残基组成。
NtPAT基因来源于烟草基因组，编码预苯酸转氨酶(prephenateaminotransferase)。该基因的CDS序列全长1443bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码的蛋白质酶由480个氨基酸残基组成。
NtADT2基因来源于烟草基因组，编码阿罗酸脱水酶(Arogenate dehydratase 2)。该基因的CDS序列全长1191bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码的蛋白质酶由396个氨基酸残基组成。
NtPAL1基因来源于烟草基因组，编码苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase)。该基因的CDS序列全长2148bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码的蛋白质酶由715个氨基酸残基组成。
NtC4H基因来源于烟草基因组，编码肉桂酸4-羟化酶(Cinnamate4-hydroxylase)。该基因的CDS序列全长1518bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码的蛋白质酶由505个氨基酸残基组成。
进一步的，所述应用包括以下步骤：
(1)利用多基因组装技术将NtCM1、NtPAT、NtADT2、NtPAL1和NtC4H基因整合到受体载体中，构建获得多基因载体；
(2)利用转基因技术将多基因载体中的目标基因片段导入受体植株或生物自发光受体植株中，培育，获得促进咖啡酸合成或生物自发光强度增强的转基因植株。
步骤(1)中，利用基因工程手段将NtCM1、NtPAT、NtADT2、NtPAL1和NtC4H基因整合到受体载体中构建多基因载体。
作为优选，所述多基因载体中各目的基因的上游均含有35S启动子序列。具体的，所述35S启动子为CaMV 35S启动子。
作为优选，采用TransGene Stacking II系统进行多基因组装。所述TransGeneStacking II系统为多基因组装载体系统，参见申请号为2017103841977的中国专利。
作为优选，以pYL322d1作为供体载体Ⅰ，pYL322d2作为供体载体Ⅱ，pYLTAC380GW作为受体载体。
具体的，所述多基因载体的构建方法包括以下步骤：
1)将NtCM1基因片段、NtADT2基因片段和NtC4H基因片段分别插入供体载体pYL322d1的多克隆位点中获得供体载体pYL322d1-NtCM1，pYL322d1-NtADT2，pYL322d1-NtC4H；
将NtPAT基因片段、NtPAL1基因片段分别插入供体载体pYL322d2的多克隆位点中获得供体载体pYL322d2-NtPAT，pYL322d2-NtPAL1；
2)将供体载体pYL322d1-NtCM1和受体载体pYLTAC380GW按1:1至2:1混合，共转入大肠杆菌NS3529感受态细胞中，涂布于含卡那霉素(kanamycin)和氯霉素(chloramphenicol)的双抗培养基中培养，取阳性菌株提取质粒；
3)使用归巢酶I-Sce I对步骤2)提取的质粒进行酶切，再转化大肠杆菌菌株XL10或NEB10-β，培养，筛选，提取质粒，获得含有目的基因NtCM1的阳性克隆pYLTAC380GW-NtCM1；
4)将供体载体pYL322d2-NtPAT和步骤3)制备的受体载体pYLTAC380GW-NtCM1按1:1至2:1混合，共转入大肠杆菌NS3529感受态细胞中，涂布于含卡那霉素(kanamycin)和氨苄霉素(ampicillin)的双抗培养基中培养，取阳性菌株提取质粒；
5)使用归巢酶PI-Sce I对步骤4)提取的质粒进行酶切，再转化大肠杆菌菌株XL10或NEB10-β，培养，筛选，提取质粒，获得含目的基因NtCM1和NtPAT的阳性克隆pYLTAC380GW-NtCM1-NtPAT；
6)重复步骤2)-5)，以上一步骤获得的含有目的基因的新质粒作为受体载体，交叉使用含不同基因的d1、d2供体载体进行重组，直至所有目的基因组装到受体载体上，最后一步BP重组反应连入去除筛选标记基因表达盒元件，构建得到多基因载体pYLTAC380GW-NtCM1-NtPAT-NtADT2-NtPAL1-NtC4H。
步骤(2)中，将构建的多基因片段导入受体植株中，使其在植株体内表达，表达的各蛋白酶参与咖啡酸的合成，合成的咖啡酸参及咖啡酸循环，使植物持续产生咖啡酸和光。
作为优选，采用农杆菌介导技术将多基因片段导入受体植株。所述农杆菌采用EHA105。
所述生物自发光受体植株可以为天然自发光植物，也可以为通过整合生物自发光基因元件获得生物自发光转基因植物。
进一步的，所述受体植株为烟草、油菜、水稻、蝴蝶兰或菊花植物。
进一步的，所述生物自发光受体植株的基因组中整合有生物自发光基因元件。所述生物自发光基因元件包括：编码序列如SEQ ID NO.6所示的Hisps基因，编码序列如SEQID NO.7所示的CPH基因，编码序列如SEQ ID NO.8所示的H3H基因，编码序列如SEQ ID NO.9所示的NPGA基因和编码序列如SEQ ID NO.10所示Luz基因。
本发明具备的有益效果：
本发明首次公开烟草NtCM1基因，NtPAT基因，NtADT2基因，NtPAL1基因，NtC4H基因可以提高植物中咖啡酸的含量，并且与参与植物自发光的Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因共同表达，可以显著提升植物咖啡酸的含量和植物的自发光强度。本发明为高咖啡酸含量植物和可持续发光植物的育种和生产提供了一个可行的技术方案。
附图说明
图1为咖啡酸合成增强模块(ECAM,enhanced caffeic acid synthsis module)pYLTAC380GW-7G载体构建过程中各轮酶切的检测图。
图2为eCAS模块瞬时转化烟草叶片目的基因表达量检测，其中EV-1、EV-2、EV-2代表空载体(empty vector)为阴性对照，ECAM-1、ECAM-2、ECAM-3代表瞬时转化(ECAM,enhanced caffeic acid synthsis module)载体模块的转化体，下同。
图3为eCAS模块瞬时转化烟草叶片咖啡酸含量检测，**表示P≤0.01。
图4为在农杆菌介导烟草转基因阳性植物叶片目的基因表达量检测，其中CT-1、CT-2、CT-2代表转基因阴性对照(control treat)，ECAM-1、ECAM-2、ECAM-3代表(ECAM,enhanced caffeic acid synthsis module)载体转基因烟草超量表达植株，下同。
图5为在农杆菌介导烟草转基因阳性植物叶片中咖啡酸含量的检测，**表示P≤0.01。
图6为烟草转基因植株苗期叶片在发光检测系统下检测荧光表达情况。
图7为烟草转基因植株苗期叶片的荧光强度比较图，**表示P≤0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
pYL322d1、pYL322d2和pYLTAC380GW为华南农业大学刘耀光教授实验室馈赠，其构建方法参见申请号为2017103841977的中国专利。
生物自发光的转基因烟草(基因组中整合有发光相关基因Hisps-CPH-H3H-NPGA-Luz)种子由本实验室前期构建培育，其构建方法参考文献Mitiouchkina et al.,2020。使用TransGene Stacking II系统进行多基因组装，利用pYL322d1、pYL322d2作为供体载体，将编码序列如SEQ ID NO.6所示的Hisps基因，编码序列如SEQ ID NO.7所示的CPH基因，编码序列如SEQ ID NO.8所示的H3H基因，编码序列如SEQ ID NO.9所示的NPGA基因和编码序列如SEQ ID NO.10所示Luz基因整合到pYLTAC380GW质粒中，最后通过一步BP重组反应连入去除筛选标记基因表达盒元件，从而构成载体pYLTAC380GW-Hisps-CPH-H3H-NPGA-Luz，再将质粒导入农杆菌中，并与经过预处理的烟草叶片进行混合培养，将生物自发光元件整合入植株基因组中。
实施例1咖啡酸合成增强(enhanced caffeic acid synthesis，eCAS)模块载体pYLTAC380GW-7G构建过程
本研究使用TransGene Stacking II系统进行多基因组装。将烟草(Nicotianatabacum)基因组中的NtCM1，NtPAT，NtADT2，NtPAL1，NtC4H基因对应CDS扩增出来。用来源于烟草花叶病毒35S启动子驱动的烟草以下基因NtCM1，NtPAT，NtADT2，NtPAL1，NtC4H基因整合到pYLTAC380GW质粒中，最后通过一步BP重组反应连入去除筛选标记基因表达盒元件，从而构成增强咖啡酸合成途径载体pYLTAC380GW-NtCM1-NtPAT-NtADT2-NtPAL1-NtC4H(pYLTAC380GW-7G)。
其中NtCM1的序列信息见基因登录号：XP_009768497；NtPAT的序列信息见基因登录号：XP_016480150；NtADT2的序列信息见基因登录号：XP_009617905；NtPAL1的序列信息见基因登录号：XP_009629066.1；NtC4H的序列信息见基因登录号：NP_001312445。
对上述基因的编码序列进行PCR扩增获得相应的基因片段。具体的，NtCM1基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示；NtPAT基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示；NtADT2基因的CDS序列如SEQ ID NO.3所示；NtPAL1基因的CDS序列如SEQ ID NO.4所示；NtC4H基因的CDS序列如SEQ ID NO.5所示。
咖啡酸合成增强载体pYLTAC380GW-7G的具体构建过程如下：
(1)构建供体载体，pYL322d1-NtCM1，pYL322d2-NtPAT，pYL322d1-NtADT2，pYL322d2-NtPAL1，pYL322d1-NtC4H；
(2)将供体载体pYL322d1-NtCM1和受体载体pYLTAC380GW(按1:1至2:1)混合在NS3529感受态中进行共转，采用热激法，冰浴30min，热激90s，冰浴2-3min，在不含抗生素的LB中，37℃，200rpm，2h复活，涂在含kanamycin(Km,25mg/L)和chloramphenicol(Chl,15mg/L)的LA板上，约18h后长出单克隆，用ddH2O将所有单克隆冲洗至管中，抽提混合质粒。
(3)取约50-100ng混合质粒用0.5uL I-Sce I(NEB)在10uL体系中酶切4-5h，转化大肠杆菌菌株XL10(Vazyme)或NEB10-β(博迈德生物科技有限公司)，涂在含kanamycin(Km,25mg/L)的LA板上，37℃，15h后挑单克隆，在LB(含25mg/L Km和0.5mM IPTG)中培养，并进行菌液PCR鉴定，使用Green Taq Mix，将能扩增出亮带的进一步抽提质粒，各取200ng使用0.2uL Not l在20uL反应体系中酶切验证，出现四条带，含目的基因0.95k bp即为所需阳性克隆pYLTAC380GW-NtCM1(图1，380GW-2G)。
(4)将供体载体pYL322d2-NtPAT和(3)中受体载体pYLTAC380GW-NtCM1(按1:1至2:1)混合在NS3529感受态中进行共转，按照(2)方法转化，涂在含kanamycin(Km,25mg/L)和ampicillin(Amp,70mg/L)的LA板上，约18h后长出单克隆，用ddH2O将所有单克隆冲洗至管中，抽提混合质粒。
(5)取约40-90ng混合质粒用0.5uL PI-Sce I(NEB)，加0.5uL BSA在10uL体系中酶切4-5h，随后按照(3)中方法进行转化及验证，出现五条带，含目的基因1.4k bp NtPAT与0.95k bp NtCM1即为阳性克隆pYLTAC380GW-NtCM1-NtPAT(图1，380GW-3G)。
(6)更多回合的重组，交叉使用含不同基因的d1、d2供体载体与上一轮构建完成的受体载体进行共转，构建完成pYLTAC380GW-7G；
最后通过BP反应，25℃，将pYLTAC380GW-7G(200ng)与PYLMFH-Bnmlpro(100ng)在5μl反应中用1μL的5×BP酶混合物混合5小时。然后加入1μL proteinase K溶液以在37℃下终止反应10分钟。转入NEB10-β(博迈德生物科技有限公司)感受态，挑单克隆鉴定。用Not1酶切检测，正确的阳性终载体pYLTAC380GW-7G有目的DNA条带(图1)，挑取阳性克隆做全质粒测序分析，选取正确pYLTAC380GW-7G载体用于后续实验。
实施例2咖啡酸合成增强(eCAS)模块载体瞬时转化烟草叶片分析
1、将含有已验证正确的载体质粒pYLTAC380GW-7G的EHA105菌液在LA+Kana+Rif板上划线活化，28℃，36h，从板上挑取菌落，转入LB+Kana+Rif+15μM As培养基中，28℃，200rpm培养至OD600＝0.8-1.0，4000rpm，10min收集菌体，用侵染液(含10mM MgCl，10MmMES，150μMAs)悬浮农杆菌菌体，室温静置2～3h。
2、烟草叶片中瞬时表达验证，用1mL的针头在烟草叶片表面轻轻点开一个小口，再用去掉针头的针管吸取菌液，从烟草叶片伤口处注射进入叶片。室内正常培养48h，之后取样部分叶片用qPCR做相对表达量检测，确定目标基因的超量表达，结果如图2所示，3个独立的转基因家系中目的基因均有超量表达。其余叶片用高效液相色谱质谱联用仪器检测，结果如图3所示，烟草叶片瞬时转化pYLTAC380GW-7G载体内源咖啡酸含量显著高于空载体转化的阴性对照。
实施例3农杆菌介导的eCAS模块转基因植株咖啡酸含量和发光强度分析
1、将含有已验证正确的载体质粒pYLTAC380GW-7G的EHA105菌液在LA+Rif+Kana平板上划线，28℃、36h，挑单克隆至3-5ml LB培养基中200rpm，28℃，36h，按照1:100-1:50的比例扩大培养50ml 3-5h至OD＝0.6，然后将菌液离心，用MS0液体培养基(MS+3％Sucrose+PH5.8，50ml)悬浮菌体至OD＝0.6用于侵染；
2、选取已经成功获得的生物自发光的转基因烟草(基因组中已经有发光相关基因Hisps-CPH-H3H-NPGA-Luz)种子，在无菌MS培养基上种植4-5周至完全展开的烟草健康叶片，用手术刀切成0.5cm见方大小(切掉叶缘避开主脉)，叶片上表面朝下在MS1固体培养基(MS+0.5mg/L IAA+2.0mg/L BA+3％sucrose+0.6-0.8％Phytagel，PH＝5.8)上，25℃暗培养2-3天；
3、将预培养过的烟草叶片加入到菌液中，涡旋振荡确保叶片切口被菌液浸没，静止5-30min，用无菌滤纸吸去附着的菌液；将侵染过的叶片上表面朝下置于MS1固体培养基上28℃、暗培养2d；将叶片上表面朝上放入含有Timentin和草甘膦的MS1筛选培养基上，25℃光培养；当叶缘长出芽并可以分离时(1cm以上)，将芽切下转移至含有抗生素(TM+basta)的MS2(MS+0.5mg/L IAA+3％sucrose+0.6-0.8％Phytagel，PH＝5.8)固体培养基中，两周后长出根，打开育苗盒的盖子练苗一周后转入种植土中培养，取3个转基因阳性家系叶片做qPCR分析和咖啡酸含量检测，确定转基因烟草eCAS模块中5个目的基因超量表达(图4)，用高效液相色谱质谱联用仪器检测3个转基因阳性家系叶片中咖啡酸含量有显著增加(图5)。
同时切取小块叶片在全自动发光检测系统下拍照分析，发现转基因烟草稳定超量表达pYLTAC380GW7G载体模块发光强度显著高于对照(图6，图7)。
序列表
<110> 浙江大学杭州国际科创中心
<120> 一种提高植物的咖啡酸含量和/或生物自发光强度的方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 957
<212> DNA
<213> 烟草(Nicotiana tabacum)
<400> 1
atggaagccc aattgttaaa actcccttct ccttccttaa caagtaccaa ttcttcaaaa 60
cacagtaccc ttttaccccg tcaaaaatgg tcaaattttt gtaagtttca attacccaat 120
tcaactagta ccattactat tcgtcccctt caagcttctg ctacttctct tggacttggg 180
ccaaagaaga gaatagatga gacggagagt tacactcttg atggtataag gaactcttta 240
attcgacaag aagatagcat aatattcagc cttgtggaga gagctcagta ctgttacaat 300
gcggagacat atgatcctga tgtttttttg atggatgggt ttcatggctc tttggttgaa 360
tatattgtca aagaaactga aaagcttcat gctaaggttg gaagatataa aagccctgat 420
gagcacccat tcttcccaaa agaattaccc gagccaatgt tgccacccat gcagttccca 480
aaggttctgc attcagttgc tgattcaata aatatcaatg tcaaaatatg ggaaatgtat 540
ttcaagaatc tcctcccaag attagtaaag gaaggcgacg atggtaattt tggatctaca 600
gcagtttgtg acactatttg cttgcaggcc ctgtcgaaga gaattcatta tgggaaattt 660
gtcgctgaag caaaatttcg agcctcacca gatgtctata aggctgccat aagagcacaa 720
gacagaaacg gactgatgga tttgttaacc taccctactg ttgaagaggc tatcacgagg 780
agggtagaaa tgaaaaccag aacttacgga caagaattta acatcaatgg accggaaaat 840
ggaggtgacc cagtgtacaa aataaaacca agcctagttg ctgaattgta cggcgactgg 900
atcatgccat tgacaaagga agttcaagtt gagtatctcc tgagaagact ggattag 957
<210> 2
<211> 1443
<212> DNA
<213> 烟草(Nicotiana tabacum)
<400> 2
atggctgctg ctactactac taccgcatct tcctcaagaa ttggttcaag acccaccatt 60
cctcctggac ttcattctga ttcattcaac cccacttcta tctctttctc ttctaacatt 120
cacggtctct ctctcaaatc ttcagtgtca aagaaacagc tatactcacg tagagcaggt 180
gcagttgtca taacacagac catggacaga gttgaggttg atatctcgct cagtcctagg 240
gtaaattcag taaaaccctc aaaaacggtt gctataactg atcaggcaac tgctcttgcg 300
caagctggtg tacctgttat ccgattagca gctggtgaac ctgattttga cactccagct 360
cctatagcag aggctgggat aaatgcaatt cgggaaggtc ataccaggta tacaccaaat 420
gcaggtacta tggaacttcg gtcagctatt tgtcataagc taaaagagga gaatgagcta 480
tcatacactc ctgatcagat tttggtaagc aatggggcaa aacaaagtat tgttcaggca 540
gtgcttgcag tttgttcccc aggggatgag gttcttattc cagctccctt ttgggtgagt 600
taccctgaaa tggcaaggat ggcagatgca acgcctgtga ttcttccgac cagcatatct 660
gaagattttc tcttagatcc aaagcttctt gaatctaaac ttagtgagaa gtcaagactt 720
ctgattcttt gttctccatc caacccaaca gggtctgttt accctcggaa attgcttgaa 780
gagattgctg agattgttgc taggcatccg aggcttcttg tgatatcaga tgaaatttac 840
aaacacatta tttatgcacc agcaacccat actagctttg catctttgcc tggtatgtgg 900
gataggactc tcactataaa tggtttctct aaggcatttg cgatgactgg atggagactt 960
ggctatattg ctggtcctaa acattttgtt tctgcatgta ataagatcca gagccagttc 1020
acatcaggtg caagtagcat ctcccaaaaa gcagctgtcg ctgctttggg acttggatat 1080
gctggtggag aagcagttgc aactatggta aaagcatttc gtgagcgacg tgattacctt 1140
gtcaagagct ttggggaaat agatggtgtc aaaatttcag agcctcgggg agctttctat 1200
ctatttattg atttaagctc ttattatgga gtagaggttg atggatttgg ctccatcaac 1260
gactcagaat ctctttgccg atatttgctg gataaagctc aagtagcgct tgtcccagga 1320
gatgcatttg gggatgacac atgcatccgt atctcctatg cagcatccct ctcgaccttg 1380
caggcagcag tggagagaat caagaaagca ttggttactc ttagatctca tgtcccagtt 1440
taa 1443
<210> 3
<211> 1191
<212> DNA
<213> 烟草(Nicotiana tabacum)
<400> 3
atggctgcca ccatcattag gtcaccaaaa atctccctcc cccctcccga aacaaccacc 60
tcaaatctct catccctcat tcacacctcc ttcactccgt tacctaaacg acgtcgttgt 120
ctctcgatct acgcctgcgc cgacggtgcc ggcgaccaaa gcaacagccc attcggagga 180
gaaattaaga aaggtcaagc aattgagctt aataaagtca atgatgaaca tccttatgaa 240
tacaatgcta aggattcacc taatcccctt ccaaggccat taacatcggc tgatttgagc 300
aatatggcat ctgaagggtc tcgtcttcgg gttgcttatc agggagtgcg tggtgcttac 360
agtgaatcag cagcagagaa agcatatcca aactgtgaag cagttccctg cgaacaattt 420
gatactgctt ttgaagctgt tgaaaggtgg cttgttgata gagcagtttt accaatagaa 480
aactctttag gagggagtat tcacaggaat tatgaccttt tactgagaca ccgtctccat 540
atagttggag aagtcaaact tgcaattcgg cactgtttaa tggctaacaa tggcgtcaaa 600
attgaagacc tgaaaagagt tcttagccat cctcaggctc ttgcacagtg tgagaacaca 660
ttaacaaagt tggggttggt cagagaagct gtggatgata ctgctggtgc agccaagtat 720
attgctttcc aaaaactaaa agatgcaggg gcagttgcaa gtttggctgc agctaggatc 780
tatggtttga acgtgcttgc acaagatatt caggatgact ctgataatgt cacacgcttc 840
cttatgctgg ctagggaacc cattattcct ggtactgata aaccattcaa gacaagtgtg 900
gtcttttcgc tcgatgaagg ccctggggtg cttttcaagg cacttgctgt ttttgctatg 960
cgaaatatca atcttactaa gattgagagt cgtccgctgc aaaagcaggc tttgcgggtg 1020
cttgatgata gtacagatgg gtttccaaaa tacttccctt accttttcta tgtggatttc 1080
gaagcatcta tggctgacca aagggctcaa aatgctttgg gacatctcaa ggaatttgca 1140
acctttttgc gagtattagg gagttaccct tcagatagtg gtgtagcttg a 1191
<210> 4
<211> 2148
<212> DNA
<213> 烟草(Nicotiana tabacum)
<400> 4
atggcatcaa atggtcatgt taatggagga gaaaactttg agttgtgcaa aaaatcagct 60
gatccattga attgggaaat ggcagctgaa tccttaagag ggagtcattt ggatgaagtg 120
aaaaaaatgg tgagtgaatt tagaaaacca atggtaaaac ttggtggtga aagtttaaca 180
gtggcacaag tggctgctat tgctgttagg gacaaaagtg caaatggtgt taaagttgaa 240
ctttctgaag aggcaagagc tggtgttaaa gctagtagtg attgggttat ggacagtatg 300
aataaaggaa ctgatagtta tggtgttact actggttttg gtgctacatc tcataggaga 360
accaagaatg gtggtgctct tcaaaaagaa cttattaggt tcttgaatgc tggtgttttt 420
ggcaatggaa cagaaacaag ccacacattg ccacattcag caacaagggc agctatgctt 480
gttaggatca acacactcct acaaggctac tctggcatca gatttgaaat cttggaagct 540
attacaaaat tgattaacag caacatcact ccatgtttac ctctccgtgg aacgatcact 600
gcctcgggtg atcttgtccc tttatcctac attgctggtt tgctcactgg taggcctaat 660
tccaaggctg ttggtcccaa tggtgagaca cttaatgctg aagaagcgtt ccgcgttgct 720
ggtgttaacg gtggattttt cgagttgcag cctaaggaag gacttgcact tgtgaatggt 780
acagctgttg gttctggtat ggcatcaatg gtcctctttg attccaacat tcttgctgta 840
atgtctgaag ttttatcagc aattttcgct gaagtaatga acggaaagcc cgaattcact 900
gaccatttga cacacaagtt gaagcaccac cctggtcaaa ttgaggctgc tgctattatg 960
gaacatattt tggatggaag ctcttatgtg aaggcggctc aaaagctaca tgaaatggat 1020
cctctacaaa aaccaaagca agatcgttat gctctccgaa catctccaca atggcttggc 1080
cctcaaattg aagtcattcg cgctgcaact aagatgattg agagggagat taactcagtg 1140
aacgataacc ctttgatcga tgtttcaaga aacaaggcgt tacatggtgg caacttccaa 1200
ggcactccta tcggtgtttc catggataat gcaagattgg ctcttgcatc aattgggaaa 1260
ttgatgtttg ctcaattctc ggaacttgtc aacgactatt acaacaacgg tttgccctct 1320
aatctcactg catcaaggaa tccaagcttg gactatggtt tcaagggagc tgaaatcgcc 1380
atggcttctt actgctcaga acttcaattc ttggcaaatc cagtgacaaa ccatgtccaa 1440
agtgctgaac aacacaacca agatgtcaac tccttaggct taatctcagc aaggaaaaca 1500
gctgaagctg ttgatatctt aaagctcatg tcatcaactt atctcgtggc actttgccaa 1560
gctatagact tgaggcattt ggaagaaaac ttaaagaatg cagtcaagaa cacagttagc 1620
caagtagcta agagaactct tacaatgggt gctaatggtg aacttcatcc agcaagattc 1680
tgtgaaaagg aattgcttcg aatcgtggat agggaatact tgttcgccta cgctgatgat 1740
ccttgcagtt gcaactaccc tttaatgcag aaactgagac aagtacttgt tgatcatgca 1800
atgaataatg gtgaaagtga gaagaatgtg aacagctcaa tctttcaaaa gattggagct 1860
ttcgaagatg aattgaaggc tgttttacca aaggaagttg agagtgcaag agctgcatta 1920
gaaagtggaa accctgctat tcctaacagg attacagaat gcagatctta tccattgtac 1980
aggtttgtga gaaaggagct tggaacagaa ttattgacag gagaaaaagt ccgatcaccg 2040
ggcgaggagt gtgacaaagt gttcacagca atgtgcaatg gacaaatcat tgatccaatg 2100
ttggagtgtc tcaagagctg gaatggtgct cctcttccta tctgttag 2148
<210> 5
<211> 1518
<212> DNA
<213> 烟草(Nicotiana tabacum)
<400> 5
atggatcttc tcttactaga gaagacctta attggtctct tctttgccat tttaatcgct 60
ataattgtct ctagacttcg ttcaaagcgt tttaagcttc ccccaggacc aatcccagta 120
ccagtttttg gtaattggct tcaagttggt gatgatttaa accacagaaa tcttactgat 180
tttgccaaaa aatttggtga tcttttcttg ttaagaatgg gccagcgtaa tttagttgtt 240
gtgtcatctc ctgaattagc taaagaagtt ttacacacac aaggtgttga atttggttca 300
agaacaagaa atgttgtatt tgatattttt actggaaaag gtcaagatat ggtttttact 360
gtatatggtg aacactggag aaaaatgagg agaattatga ctgtaccatt ttttactaat 420
aaagttgtgc agcaatatag aggggggtgg gagtttgaag tggcaagtgt aattgaggat 480
gtgaagaaaa atcctgaatc tgctactaat gggattgtat taaggaggag attacaattg 540
atgatgtata ataatatgtt taggattatg tttgatagga gatttgagag tgaagatgat 600
cctttgtttg ttaagcttaa ggctttgaat ggtgaaagga gtagattggc tcagagtttt 660
gagtataatt atggtgattt tattcccatt ttgaggcctt ttttgagagg ttatttgaag 720
atctgtaaag aagttaagga gaagaggctg cagcttttca aagattactt tgttgatgaa 780
agaaagaagc tttcaaatac caagagcttg gacagcaatg ctctgaaatg tgcgattgat 840
cacattcttg aggctcaaca gaagggggag atcaatgagg acaacgttct ttacattgtt 900
gaaaacatca atgttgctgc tatagaaacc acattatggt caattgagtg gggtatcgcc 960
gagttagtca accaccctca catccaaaag aaactccgcg acgagattga cacagttctt 1020
ggcccaggag tgcaagtgac tgaaccagac acccacaagc ttccatacct tcaggctgtg 1080
atcaaggaga cgcttcgtct ccgtatggca attcctctat tagtcccaca catgaacctt 1140
cacgatgcaa agcttggcgg gtttgatatt ccagcagaga gcaaaatctt ggttaacgct 1200
tggtggctag ctaacaaccc ggctcattgg aagaaacccg aagagttcag acccgagagg 1260
ttcttcgaag aggagaagca cgttgaggcc aatggcaatg acttcagata tcttccgttt 1320
ggcgttggta ggaggagttg ccctggaatt atacttgcat tgccaattct tggcattact 1380
ttgggacgtt tggttcagaa ctttgagctg ttgcctcctc caggccagtc gaagctcgac 1440
accacagaga aaggtggaca gttcagtctc catattttga agcattccac cattgtgttg 1500
aaaccaaggt cttgctga 1518
<210> 6
<211> 5097
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgaactcat ctaagaaccc accatctact ctcctcgatg ttttcctcga tactgctaga 60
aacctcgata ctgcttcaag aaacgttttg gagtgtggtg agcatagatg gtcatacagg 120
gagctggata ctgtgtcatc agctctcgct caacatctta ggtacactgt gggattgtca 180
cctactgtgg ctgttatctc agagaaccat ccatacatcc tcgctcttat gctcgctgtt 240
tggaagttgg gtggaacttt cgctccaatc gatgtgcatt caccagctga gctggtggct 300
ggaatgctta acatcgtgtc accatcatgt ctcgttatcc catcttctga tgtgactaac 360
caaactttgg cttgtgattt gaacatccca gtggtggctt tccatccaca tcaatcaact 420
atccctgagt tgaacaagaa gtaccttact gattcacaaa tctcaccaga tttgccattc 480
cctgatccaa acaggccagc tttgtacctt ttcacttctt cagctacttc taggtcaaac 540
cttaagtgtg tgccattgac tcatactttc atcctcagaa actctttgtc taagagggct 600
tggtgtaaga gaatgagacc agagactgat ttcgatggaa tcagggtttt gggatgggct 660
ccctggtcac atgttttggc tcacatgcaa gatattggtc cacttactct tttgaacgct 720
ggatgttacg ttttcgctac tactccatct acttacccta ctgagttgaa ggatgatagg 780
gatgttatct catgtgctgc taacgctgtt atgtacaagg gagtgaagtc attcgcttgt 840
ttgccattcg ttttgggagg acttaaggct ctctgtgagt ctgagccatc agtgaaggct 900
caattgcaag ttgaggagag ggctcaactc cttaagtcat tgcaacacat gaaaatatta 960
gaatgtggtg gagctatgtt ggaggtgtca gtggcttcat gggctatcga gaacagaatc 1020
ccaatctcaa tcggaatcgg tatgactgag actggtggtg cgcttttcgc tggtccagtg 1080
caagctatcc aaactggttt ctcttctgag gataagttca tcgaggatgc tacttacctc 1140
ctcgtgaagg atgattacga gtcacatgct gaggaggata ttaacgaggg tgaattagtt 1200
gttaagtcca gaatgttgcc taggggttac ctcggataca acgatccatc attctcagtg 1260
gatgatgctg gttgggtgac tttcaagact ggtgataggt actcagtgac tccagatgga 1320
aagttctcat ggctcggtag aaacactgat ttcatccaaa tgacttctgg tgagactctt 1380
gatcctagac caatcgagtc actcctctgt gagtcttcac ttatctctag ggcttgtgtt 1440
atcggtgata agttccttaa cggaccagct actgctgtgt gtgctatcat cgagttggag 1500
ccaactactg ttgagaaggg acaagctcat tctagggaca tagctagaat cttcgctcca 1560
atcaacaggg atttgccacc accacttaga atcgcttggt cacatgtttt ggttttgcaa 1620
ccttctgaga agatccctat gactaagaag ggaactatct tcagaaagaa gatcgagcaa 1680
gttttcggtt cagctctcgg tggatcttct ggtgataact cacaagctac tactgatgct 1740
tcagtggtta gaagggatga gttgtctaac actgtgaagc atatcatcag cagagttctc 1800
ggagtgtctg atgatgagtt gctctggact ttgtcattcg ctgagttggg tatgacttct 1860
gctctcgcta ctagaatcgc taacgagttg aacgaggttt tggtgggagt gaacctccct 1920
atcaacgctt gttacatcca tgttgatttg ccttcattgt caaacgctgt gtacgctaag 1980
ttggctcatt tgaagttgcc agatagaact ccagagccta gaaaggctcc agtggagaac 2040
cctggtggaa aggagatcgt tatcgtggga caggcattca gattgccagg ttctatcaac 2100
gatgtggctt cacttaggga tgctttcctt gctaggcagg cctcttctat catcactgag 2160
atcccaccag atagatggga tcatgcttct ttctacccta aggacatcag gttcaacaag 2220
gctggacttg ttgatatagc taactacgat cattctttct tcggtttgac tgctactgag 2280
gctctttacc tttcaccaac tatgagactc gctcttgagg tgtctttcga ggctctggaa 2340
aacgctaaca tcccagtgtc acaattgaag ggttcacaaa ctgctgttta cgtggctact 2400
actgatgatg gtttcgagac tctccttaac gctgaggctg gttacgatgc ttacactagg 2460
ttctacggaa ctggtagggc tgcttcaact gcttctggta gaatctcata ccttttggat 2520
gtgcatggtc catcaatcac tgtggatact gcttgttcag gaggagctgt gtgtatcgat 2580
caagctatcg attacctcca atcttcatca gctgctgata ctgctatcat ctgtgcttct 2640
aacactcatt gttggcctgg ttcattcatg ttcctctcag ctcaaggtat ggtgtcttct 2700
ggaggtaggt gtgctacttt cactactgat gctgatggat acgtgccatc tgagggtgct 2760
gtggctttca tccttaagac tagagaggct gctatgaggg ataaggatac tatcctcgct 2820
actatcaagg ctactcaaat ctcacataac ggtaggtcac aaggtcttgt ggctccaaac 2880
gttaactcac aagctgattt gcataggtca ctcctccaaa aggctggttt gtcaccagct 2940
gatatacatt tcatcgaggc tcatggtact ggaacttcac tcggtgattt gtcagagatc 3000
caagctatca acgatgctta cacttcatca caacctagga ctgctggacc acttatcgtg 3060
tcagcttcta agactgttat cggacatact gagcctgctg gaccactcgt gggtatgttg 3120
tcagttttga actcattcaa ggagggagct gtgccaggtc ttgctcattt gactgctgat 3180
aaccttaacc cagctctcga ttgttcttca gtgccattgc ttatcccata ccaaccagtg 3240
catttggctg ctccaaagcc acatagggct gctgttatgt catacggatt ctcaggaact 3300
ctcggtggaa tcgttttgga ggctccagat gaggagagac ttgaggagga gccaccaaac 3360
gataagccta tgttgttcgt ggtgtcagct aagactcata ctgctcttat cgagtacctt 3420
ggtcggtatc ttgagttcct tttgcaagct aacccacaag atttctgtga tatatgttac 3480
acttcttgtg tgggtagaga gcattacagg tacaggttcg cttgtgtggc taacgatatg 3540
gaggatttga tcggacaatt gcaaaagaga ttgggttcta aggtgccacc aaagccatct 3600
tacaagaggg gcgcactcgc tttcgctttc tctggacaag gaactcaatt caggggaatg 3660
gctactgagc tggctaaggc ttactcaggt ttcagaaaga tcgtgtcaga tttggctaag 3720
agagcttctg agttgtctgg acatgctatc gataggttcc tcctcgctta cgatattggt 3780
gctgagaacg tggctccaga ttcagaggct gatcaaatct gtatcttcgt ttaccaatgt 3840
tctgttctta gatggttgca aactatggga atcaggccat cagctgttat cggacattca 3900
ctcggagaaa tatctgcttc agttgctgct ggagctttgt cacttgattc agctctcgat 3960
ctcgttatct ctagggctag actccttagg tcttctacta acgctcctgc tggaatggct 4020
gctatgtctg cttcacaaga tgaggtggtt gagttgatcg gaaagttgga tctcgataag 4080
gctaactcat tgtctgtgtc agttatcaac ggaccacaaa acactgttgt gtctggatct 4140
tcagctgcta tcgagtcaat cgtggctctt gctaagggta gaaagatcaa ggcttctgct 4200
cttaacatca accaggcctt ccattcacca tacgttgatt cagctgtgcc tggacttagg 4260
gcttggtcag agaagcatat ctcttcagct aggccactcc aaatcccatt gtactctact 4320
cttttgggtg ctcaagtgtc tgagggacaa atgttgaacc cagatcattg ggttgatcat 4380
gctagaaagc ctgtgcaatt cgctcaagct gctactatca tgaaggagtc attcactgga 4440
gttatcatcg acataggacc acaagtggtg gcttggtcac ttttgttgtc taacggattg 4500
acttcagtga ctgctttggc tgctaagagg ggtaggtcac aacaagtggc tttcctctca 4560
gctctcgctg atttgtacca agattacgga gtggtgccag atttcgttgg attgtacgct 4620
caacaagagg atgcatcacg gcttaagaaa actgacattc ttacttaccc attccaaagg 4680
gttagacggt atccatcatt catcccatca agaagggctc caactcatgc tcatgtgcaa 4740
gatgaggaga ctttgtcttc aggttcttca actccaactc ttgagaacac tgatttggat 4800
tcaggtaagg agtcacttat gggacctact aggggtctgc ttagagttga tgatcttaga 4860
gattcaatcg tgtcttcagt taaggatgtt ttggagttga agtctaacga ggatcttgat 4920
ttgtcagagt cacttaacgc tttgggtatg gattctatca tgttcgctca attgagaaag 4980
agaatcggtg agggtcttgg attgtcagtg cctatggttt tcctttctga tgctttctca 5040
atcggagaga tggtgtctaa cctcgttgag caagctgagg cttcagagga taactaa 5097
<210> 7
<211> 921
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggctccta tctcatctac ttggtctagg cttatcagat tcgtggctgt tgagacttca 60
ctcgtgcata tcggtgagcc aatcgatgct actatggatg tgggactcgc tagaagagag 120
ggtaagacta tccaggccta cgagatcatc ggttcaggtt cagctcttga tttgtctgct 180
caagtgtcta agaacgtttt gactgttagg gaacttctta tgccattgtc tagggaggag 240
atcaagactg ttaggtgttt gggtcttaac tacccagtac acgctactga ggctaacgtt 300
gctgtgccta agttcccaaa ccttttctac aagccagtga cttcactcat cggaccaggt 360
ggattgatca ctatcccttc agttgtgcaa ccaccaaagg agcatcaatc tgattacgag 420
gctgaattgg tgatcgttat cggaaaggct gctaagaacg tgtcagagga tgaggctctc 480
gattacgttt tgggatacac tgctgctaac gacatatctt tcaggaagca tcaactcgct 540
gtgtcacaat ggtcattctc aaagggtttc gatggtacta acccattggg tccatgtctt 600
gtgtcagctt cttctatccc tgatccacaa gatattccta tccaatgtaa gttgaacggt 660
ggagttgtgc aaaacggaaa cactagagat caaatcttca acgtgaagaa aactatctca 720
ttcctctcac aaggtactac gctcgaacct ggttcaatca tcctcactgg tactccagat 780
ggagtgggat tcgttagaaa cccacctctt taccttaagg atggtgatga ggttatgact 840
tggatcggtt ctggaatcgg aactttggct aacactgtta gagaggagca aacttgtttc 900
gcttctggtg gacatgagta a 921
<210> 8
<211> 1269
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggcttcat tcgagaactc attgtcagtt cttatcgttg gtgctggact aggtggactc 60
gctgctgcta tcgctcttag aaggcaagga catgttgtta agatttacga ttcatcttca 120
ttcaaggctg agttgggagc tggacttgct gtgccaccaa acactcttag gtcactccaa 180
caattgggat gtaacactga gaaccttaac ggtgttgata acctttgttt cactgctatg 240
ggttacgatg gttctgtggg tatgatgaac aacatgactg attacaggga ggcttacggt 300
acttcttgga tcatggtgca tagagtggat ttgcataacg agcttatgag agtggctctc 360
gatcctggag gcttgggacc accagctact ttgcatttga accatagggt gactttctgt 420
gatgttgatg cttgtactgt gactttcact aacggtacta ctcaatctgc tgatcttatc 480
gtgggagctg atggaatcag gtctactatc agaagattcg tactggagga ggatgtgact 540
gttccagctt ctggaatcgt gggtttcagg tggctcgtgc aagctgatgc tctcgatcca 600
tacccagagt tggattggat cgttaagaag cctccactcg gagctagact tatctcaact 660
ccacaaaacc cacaatctgg tgttggactt gctgatagaa gaactatcat catctacgct 720
tgtaggggag gtactatggt taacgttttg gctgtgcatg atgatgagag ggatcaaaac 780
actgctgatt ggtcagtgcc agcttctaag gatgatttgt tcagagtttt ccatgattac 840
catcctagat tccgcaggct ccttgaatta gctcaagaca ttaacctctg gcaaatgaga 900
gttgtgccag tgttgaagaa gtgggtgaac aagagggtgt gtcttttggg agatgctgct 960
catgcttcat tgcctacttt gggacaaggt ttcggaatgg gtcttgaaga tgctgtggct 1020
ctcggaactc tcctcccaaa gggaactact gcttcacaaa tcgagactag gctcgctgtt 1080
tacgagcaac ttagaaagga tagggctgag ttcgtggctg ctgagtcata cgaggagcaa 1140
tacgtgccag agatgagggg tttgtacctc aggtctaagg agcttagaga tagagttatg 1200
ggttacgaca taaaggttga gtcagagaag gttcttgaga ctctccttag gtcatctaac 1260
tcagcttga 1269
<210> 9
<211> 1041
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggtgcaag atacttcatc tgcttcaact tcaccaatct tgactagatg gtacatcgat 60
actaggccat tgactgcttc tactgctgct ttgcctctcc ttgagacttt gcaaccagct 120
gatcaaatct ctgtgcaaaa gtactaccat ttgaaggata agcacatgtc actcgcttct 180
aacctcctta agtacctttt cgtgcataga aactgtagaa tcccttggtc atctatcgtt 240
atctctagga ctcctgatcc acatagaagg ccatgttaca tcccaccttc tggatcacaa 300
gaggattcat tcaaggatgg ttacactgga atcaacgttg agttcaacgt gtcacatcaa 360
gcctctatgg ttgctatcgc tggaactgct ttcactccaa actcaggagg tgattctaag 420
ttgaagcctg aggtgggtat cgatataact tgtgtgaacg agagacaagg tagaaacgga 480
gaggagaggt cattggagtc tcttaggcaa tacatcgaca ttttctcaga ggttttctca 540
actgctgaga tggctaacat ccgtagactc gatggagtgt cttcttcatc attgtcagct 600
gatagactcg ttgattacgg ttacagattg ttctacactt actgggctct taaggaggct 660
tacatcaaga tgactggaga ggctctcctc gctccgtggc tcagggagct ggagttctca 720
aacgttgtgg ctccagctgc tgtggctgag tctggtgatt cagctggtga tttcggtgag 780
ccatacactg gagttaggac tactttgtac aagaacctcg ttgaggatgt tagaatcgag 840
gttgctgctt tgggtggtga ttaccttttc gctactgctg ctaggggtgg tggaatcgga 900
gcttcatcta ggccaggtgg tggaccagat ggatcaggta tcaggtcaca agatccttgg 960
agaccattca agaagctcga tattgagagg gatatacaac catgtgctac tggtgtttgt 1020
aactgtttgt ctaggggatg a 1041
<210> 10
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgagaatca acatctcact ctcttctctt ttcgagagat tgtcaaagtt gtcatctagg 60
tcaatcgcta tcacttgtgg tgtggttttg gcttctgcta tcgctttccc aatcatcaga 120
agggattacc agactttctt agaagttgga ccttcttacg ctccacagaa cttcaggggt 180
tacatcatcg tgtgtgtttt gtcattgttc agacaggagc agaagggttt agctatctac 240
gatagattgc ctgagaagag aagatggctt gctgatttgc cattcaggga gggtactagg 300
ccttcaatca cttcacatat catccagaga cagagaactc agctcgtgga tcaggagttc 360
gctactaggg agcttatcga taaggttatc cctagagtgc aggctaggca tactgataag 420
actttcttgt ctacttcaaa gttcgagttc catgctaagg ctatcttcct cctcccttca 480
atcccaatca acgatcctct taacatccca tctcatgata ctgttagaag gactaagagg 540
gagatcgctc acatgcatga ttaccatgat tgtactctcc atttggctct tgctgctcag 600
gatggtaagg aggtgcttaa gaagggatgg ggacagaggc atccactcgc tggacctggt 660
gtgcctggac caccaactga gtggactttc ctttacgctc ctaggaacga ggaggaggct 720
agagtggttg agatgatcgt tgaggcttct atcggataca tgactaacga tccagctgga 780
aagatcgttg agaacgctaa gtaa 804

Claims (9)

1.NtCM1、NtPAT、NtADT2、NtPAL1和NtC4H基因共表达在提高植物咖啡酸含量和/或提高植物生物自发光强度中的应用，其特征在于，所述NtCM1基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，所述NtPAT基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示，所述NtADT2基因的CDS序列如SEQ IDNO.3所示，所述NtPAL1基因的CDS序列如SEQ ID NO.4所示，所述NtC4H基因的CDS序列如SEQID NO.5所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
(1)利用多基因组装技术将NtCM1、NtPAT、NtADT2、NtPAL1和NtC4H基因整合到受体载体中，构建获得多基因载体；
(2)利用转基因技术将多基因载体中的目标基因片段导入受体植株或生物自发光受体植株中，培育，获得促进咖啡酸合成或生物自发光强度增强的转基因植株。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述多基因载体中各目的基因的上游均含有35S启动子序列。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，采用TransGene Stacking II系统进行多基因组装。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述多基因载体的构建方法包括以下步骤：
1)将NtCM1基因片段、NtADT2基因片段和NtC4H基因片段分别插入供体载体pYL322d1的多克隆位点中获得供体载体pYL322d1-NtCM1，pYL322d1-NtADT2，pYL322d1-NtC4H；
将NtPAT基因片段、NtPAL1基因片段分别插入供体载体pYL322d2的多克隆位点中获得供体载体pYL322d2-NtPAT，pYL322d2-NtPAL1；
2)将供体载体pYL322d1-NtCM1和受体载体pYLTAC380GW按1:1至2:1混合，共转入大肠杆菌NS3529感受态细胞中，涂布于含卡那霉素和氯霉素的双抗培养基中培养，取阳性菌株提取质粒；
3)使用归巢酶I-SceI对步骤2)提取的质粒进行酶切，再转化大肠杆菌菌株XL10或NEB10-β，培养，筛选，提取质粒，获得含有目的基因NtCM1的阳性克隆pYLTAC380GW-NtCM1；
4)将供体载体pYL322d2-NtPAT和步骤3)制备的受体载体pYLTAC380GW-NtCM1按1:1至2:1混合，共转入大肠杆菌NS3529感受态细胞中，涂布于含卡那霉素和氨苄霉素的双抗培养基中培养，取阳性菌株提取质粒；
5)使用归巢酶PI-SceI对步骤4)提取的质粒进行酶切，再转化大肠杆菌菌株XL10或NEB10-β，培养，筛选，提取质粒，获得含目的基因NtCM1和NtPAT的阳性克隆pYLTAC380GW-NtCM1-NtPAT；
6)重复步骤2)-5)，以上一步骤获得的含有目的基因的新质粒作为受体载体，交叉使用含不同基因的d1、d2供体载体进行重组，直至所有目的基因组装到受体载体上，最后一步BP重组反应连入去除筛选标记基因表达盒元件，构建得到多基因载体pYLTAC380GW-NtCM1-NtPAT-NtADT2-NtPAL1-NtC4H。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，采用农杆菌介导技术将多基因片段导入受体植株。
7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述受体植株为烟草、油菜、水稻、蝴蝶兰或菊花植物。
8.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述生物自发光受体植株的基因组中整合有生物自发光基因元件。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述生物自发光基因元件包括：编码序列如SEQ ID NO.6所示的Hisps基因，编码序列如SEQ ID NO.7所示的CPH基因，编码序列如SEQ ID NO.8所示的H3H基因，编码序列如SEQ ID NO.9所示的NPGA基因和编码序列如SEQ ID NO.10所示Luz基因。
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