CN116445481A - 一种植物花药和雌蕊特异表达启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物花药和雌蕊特异表达的启动子及其应用，属于植物基因工程技术领域。所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为花药和雌蕊特异表达启动子。该启动子对植物基因工程研究和应用具有重要作用，本发明利用该启动子构建无筛选标记和基因编辑元件的生物自发光系统模块，使用FBP生物发光系统对转基因植株进行高效鉴定，并在在转基因T0代有性生殖过程中切除筛选标记基因和基因编辑Cas9元件，获得生物安全性更好的转基因植株。此外，切除了筛选标记基因后的植株还可以继续在下一轮用携带筛选标记的载体转化，达到多轮转入大量目的基因的目的，做到对作物基因组做多轮的改造。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种植物花药和雌蕊特异表达的启动子APSP(Anther and Pistil Specific Promotor)及其应用。
背景技术
基因编辑，是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats-CRISPR associated)系统的出现，加速了基因编辑技术的发展，广泛应用于生命科学领域。为了提高这些系统的性能，研究人员设计和开发了各种各样的CRISPR-Cas工具，具有更广泛的目标范围、更高的效率和特异性以及更高的精度(Liu et al.2022)。如何通过基因编辑技术对动植物自身的基因进行精准改造，之后再把外源CRISPR-Cas系统切除，最后得到无任何外源基因的基因编辑动植物，这个问题是生物安全，临床安全和食品安全中普遍关心的问题。
潮霉素B是一种常用的抗性筛选药物，它通过干扰70S核糖体移位，导致翻译错误，从而抑制蛋白合成，最终杀死细胞。其抗性基因编码潮霉素磷酸转移酶(hygromycinphosphotransferase，Hpt)，通过磷酸化潮霉素B使其丧失活性，从而实现用潮霉素筛选获得转基因阳性植物的目的。但获得转基因阳性植株后如何去除Hpt基因，也是涉及生物安全性的问题。
Cre-loxP重组系统是一种特定位点的重组酶技术，可在DNA的特定位点上执行删除、插入、易位及倒位。Cre/LoxP系统，主要由两大组分组成：Cre重组酶(Cre recombinase)和一段叫做LoxP位点的DNA序列。Cre重组酶是噬菌体P1编码的38kD的蛋白，可以识别loxP上的两段13bp长的重组结合元件(recombinase binding elements,RBE)发挥剪切作用(McLellan et al.2017)。该技术具有高效性，特异性强，应用范围广等特点，在动植物基因工程操作中发挥重要作用，但是如何调控Cre重组酶特异性的表达，从而更好的发挥效果是本领域技术人员需要解决的问题。
植物基因启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。这些启动子通过调控下游基因的表达，决定了基因在时间和空间上有序的表达，这是植物的形态建成和维持正常生长周期的关键。植物组织特异型或条件诱导型启动子也是合理分配能量流向和环境适应性的主要因素。
目前基因工程技术中采用的启动子包括组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子。组成型启动子能够驱动目的基因在植物各组织中持续表达，但是会过度消耗受体细胞内的物质和能量，因此在应用中存在一定的缺陷。诱导型启动子在受外源物理、化学因素等的诱导下，能快速诱导基因转录的“开”与“关”，因此可根据实验需要调控转基因在植物中的表达。组织特异性启动子只在特定的器官或组织中才能启动下游基因的表达，从而克服了组成型启动子启动的外源基因在受体中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加转基因的效果，因此在植物遗传改造过程中受到越来越多的重视，但是已经鉴定的好用的组织特异性启动子非常少。
因此，在动植物中寻找组织特异性启动子非常重要，通过组织特异性启动子驱动Cre重组酶特异性的表达，在转基因过程中切除不再必要的基因或编辑元件是涉及生物安全和生命安全的重要研究内容。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种在花药和雌蕊中特异表达的启动子，将其应用到转基因工程中。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明通过对烟草转录组数据进行分析，筛选出一个候选的花药和雌蕊特异表达启动子APSP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。研究表明，相较于烟草转基因过程中的生长情况，该启动子在花药和雌蕊中启动下游基因的表达量是其他检测组织中的10倍以上。
本发明提供了SEQ ID NO.1所示的DNA分子的获取方法，包括：首先提取烟草(N.tabacum栽培品种ZY100)基因组DNA，然后利用PCR技术克隆所述的DNA分子片段；PCR扩增采用的引物为：F引物：5’-gagaaaaactagaaatttacgacatAATTTCTCCTAACTTTCACTTTGATTTTC-3’，R引物：5’-cagtaggatagaggtggctcCCATTAATCAACATACAATG-3’。
本发明提供了所述植物花药和雌蕊特异表达启动子APSP在构建于花药和雌蕊中特异性表达的基因表达盒或是于花药和雌蕊中特异性表达的基因表达载体中的应用。
通过在目的基因上游整合所述的启动子，该启动子在植物体生长期不能诱导或者较低水平诱导下游靶基因的表达，于花期的花药和雌蕊中特异性启动目的基因高表达。
进一步的，本发明提供了一种于花药和雌蕊中特异性表达的基因表达盒，包含所述的植物花药和雌蕊特异表达启动子。
进一步的，本发明提供了一种于花药和雌蕊中特异性表达的基因表达载体，包含所述的基因表达盒。
优选的，所述基因表达载体为无筛选标记转化载体。
优选的，所述无筛选标记转化载体为植物Cre/loxP重组表达载体，所述植物Cre/loxP重组表达载体的T-DNA区内含有两个或两个以上同向loxP序列，两个同向1oxP序列之间含有Cre重组酶表达盒和标记基因表达盒；所述Cre重组酶表达盒的启动子为上述花药和雌蕊特异表达启动子。
所述的植物Cre/loxP重组表达载体被转入植物后，在花药和雌蕊发育过程中，上述启动子驱动Cre重组酶表达，将两个同向loxP序列之间的基因表达盒删除，从而去除标记基因和Cre基因本身。
本发明研究表明，上述雌蕊和花药特异表达启动子APSP驱动Cre重组酶表达可以切除多个靶位点，为植物基因工程中的多基因，多次系统改造提供技术支持。进一步的，在植物Cre/loxP重组表达载体的T-DNA区引入多个loxP序列，同向1oxP序列之间插入Cre重组酶表达盒、标记基因表达盒或基因编辑元件表达盒。所述标记基因表达盒或基因编辑元件表达盒采用不同于Cre重组酶表达盒的启动子，例如CaMV 35S启动子。
进一步的，本发明提供了一种重组工程菌，所述工程菌包含所述的基因表达载体。
本发明提供了一种在植物花药和雌蕊中表达目的核苷酸序列的方法，包括：构建含有所述启动子APSP和连接于所述启动子的目的核苷酸序列的表达载体，再向植物体导入所述表达载体，筛选培育获得转基因植株。
进一步的，所述的目的核苷酸序列可以是结构基因、调节基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA，其在花粉发育阶段特异性表达可以调节花粉的育性及花粉萌发。
所述植物为双子叶植物，进一步的，所述植物为烟草。
本发明还提供了一种培育无筛选标记的转基因植物的方法，包括：
(1)构建植物Cre/loxP重组表达载体，所述植物Cre/loxP重组表达载体的T-DNA区内含有两个或两个以上loxP序列，两个同向1oxP序列之间含有Cre重组酶表达盒和标记基因表达盒；Cre重组酶表达盒中启动Cre重组酶表达的启动子是上述的植物花药和雌蕊特异表达启动子APSP；
(2)利用转基因技术将植物Cre/loxP重组表达载体的T-DNA区导入受体植株，培育，获得无筛选标记的转基因植物。
上述方法中，所述启动子APSP驱动Cre酶的表达，该启动子在转基因筛选阶段及分化阶段的愈伤组织，叶片，茎秆，根中不能诱导或者较低水平诱导下游靶基因Cre的表达，在开花期的花药和雌蕊中诱导下游Cre酶基因高表达，Cre酶识别loxP上的重组结合元件发挥剪切作用。在不影响转基因T0代获得目标性状植物的前提下，在转基因T0代有性生殖过程中切除筛选标记基因。
进一步的，所述的植物Cre/loxP重组表达载体还含有多克隆位点或外源目的基因的表达盒；多克隆位点或外源目的基因表达盒位于T-DNA区内，在所述两个同向loxP序列区间之外。
本发明提供了一种无筛选标记及基因编辑元件的自发光转基因植物的培育方法，包括：
1)利用多基因组装技术将Hpt基因、Cas9基因、Cre基因、Hisps基因、CPH基因、H3H基因和Luz基因整合到受体载体中，构建获得多基因载体，所述多基因载体中含有两个或两个以上lox-P元件，所述Hpt基因、Cas9基因、Cre基因表达模块在两个同向lox-P元件中间，Cre基因的上游整合有启动子APSP；Hisps基因、CPH基因、H3H基因和Luz基因表达模块在两个同向loxP序列区间之外；
2)利用转基因技术将多基因载体中的T-DNA区片段导入受体植株中，培育，获得T0代转基因植株，在T1代幼苗期对转基因植株进行筛选，获得Hpt和Cas9剪切掉的转基因植株。
上述方法中，将构建的多基因片段导入受体植株中，使其在植株体内表达，表达的各蛋白酶参与咖啡酸循环，使植物发光，作为报告系统方便筛选转基因阳性植株。其中Cre基因只在T0代转基因植株开花期，在生殖器官中表达，切除loxP位点中间的目标基因Hpt和Cas9。最终在T1代植株中获得筛选标记Hpt基因及基因编辑中Cas9基因切除的转基因植株。
其中Hisps的序列信息见基因登录号：QJQ48095.1；CPH的序列信息见基因登录号：QJQ48093.1；H3H的序列信息见基因登录号：QJQ48094.1；Luz的序列信息见基因登录号：QJQ48096.1。Hpt基因的序列信息见载体pEASY-tub/hptII登录号MH752994.1中的Hpt序列信息、Cas9基因的序列信息见载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-N登录号MG719602.1中的Cas9序列信息、Cre基因的序列信息见基因登录号：MK854762.1。
优选的，步骤1)中，采用TransGene Stacking II系统进行多基因组装。以pYL322d1作为供体载体Ⅰ，pYL322d2作为供体载体Ⅱ，pYLTAC380GW作为受体载体，pYLMF-H作为筛选标记Hpt自删除供给载体，其中驱动Cre重组酶表达的启动子替换成启动子APSP。
具体的，所述多基因载体的构建方法包括以下步骤：
a、将Hisps、H3H基因片段分别插入pYL322d1的多克隆位点获得pYL322d1-35S-Hisps，pYL322d1-35S-H3H；
CPH、Luz基因片段分别插入pYL322d2的多克隆位点获得pYL322d2-35S-CPH，pYL322d2-35S-Luz；
利用同源重组技术将pYLMF-H基础载体中的PV4启动子替换成APSP启动子，在pYLMF-H载体的XbaⅠ酶切位点添加P35S-Cas9-T35S模块，构建得到pYLMF-H-APSP-Cre-35S-Cas9-35S-HPT。
b、将供体载体pYL322d1-35S-Hisps和受体载体pYLTAC380GW按1:1至2:1混合，共转入大肠杆菌NS3529感受态细胞中，涂布于含卡那霉素和氯霉素的双抗培养基中培养，取阳性菌株提取质粒；
c、使用归巢酶I-Sce I对步骤b提取的质粒进行酶切，再转化大肠杆菌菌株NEB10-β，培养，筛选，提取质粒，获得含有目的基因Hisps的阳性克隆pYLTAC380GW-Hisps；
d、将供体载体pYL322d2-35S-CPH和步骤c制备的受体载体pYLTAC380GW-Hisps按1:1至2:1混合，共转入大肠杆菌NS3529感受态细胞中，涂布于含卡那霉素和氨苄霉素的双抗培养基中培养，取阳性菌株提取质粒；
e、使用归巢酶PI-Sce I对步骤d提取的质粒进行酶切，再转化大肠杆菌菌株NEB10-β，培养，筛选，提取质粒，获得含目的基因Hisps和CPH的阳性克隆pYLTAC380GW-Hisps-CPH；
f、重复步骤b-e，以上一步骤获得的含有目的基因的新质粒作为受体载体，交叉使用含不同基因的d1、d2供体载体进行重组，至Hisps、CPH、H3H、Luz基因组装到受体载体上，最后一步与pYLMF-H-APSP-Cre-35S-Cas9-35S-HPT进行BP重组反应连入可去除筛选标记基因Hpt和Cas9基因表达盒元件，构建得到多基因载体。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明首次从烟草基因组中鉴定出如SEQ ID NO.1所示的启动子序列，为花药和雌蕊特异表达启动子。该启动子对植物基因工程研究和应用具有重要作用，其应用前景十分广阔。
(2)本发明利用该启动子构建无筛选标记和基因编辑元件的生物自发光系统模块，使用FBP生物发光系统对转基因植株进行高效鉴定，并在转基因T0代有性生殖过程中切除筛选标记基因和基因编辑Cas9元件，获得生物安全性更好的转基因植株。此外，切除了筛选标记基因后的植株还可以继续在下一轮用携带筛选标记的载体转化，达到多轮转入大量目的基因的目的，做到对作物基因组做多轮的改造。
附图说明
图1为qPCR技术对烟草花药和雌蕊特异表达启动子驱动的下游靶基因组织特异性分析。
图2为用于验证启动子效果的转基因载体设计示意图。
图3为转基因烟草愈伤筛选阶段图(A)和转基因烟草分化阶段图(B)。
图4为化学发光检测仪器对转基因烟草T0阳性筛选，其中(A)为明场条件下，(B)为化学发光条件下。
图5为转基因烟草T1植株靶基因检测，其中1-3为获得Clean-FBP 3个不同植株，4-6为阴性对照(目的基因没有被切除)。
图6为Hpt基因和Cas9基因被剪切的转基因阳性植株，其中(A)为光照条件下，(B)为黑暗条件下。
图7为Hpt基因和Cas9基因被剪切的转基因阳性植株比例。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1花药和雌蕊特异表达启动子的鉴定
为了寻找在生殖器官中特异表达的启动子，驱动转基因载体中在获得阳性植株后不必需要的外源基因切除，创造出符合生物安全的转基因植物，及以烟草为底盘的合成生物学研究。我们对烟草基因组织特异性转录组数据进行分析，筛选出一个花药和雌蕊特异表达的启动子APSP(Anther and Pistil Specific Promotor)，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
我们针对其下游基因SLP8基因设计qPCR引物，F引物：5’-GGGTTGAATTTGGGCGGAAG-3’；R引物：5’-TCGGTGGTAGTGCTTTGCAT-3’。
针对转基因工程组织培养过程中使用的烟草离体叶片组织，我们挑选转基因筛选过程中的烟草叶片、分化过程中的烟草叶片、根、茎秆等组织取样，抽提RNA，用qPCR方法验证启动子APSP驱动下游基因的组织特异性情况。
结果如图1所示，实验数据显示启动子APSP驱动的下游基因主要在花药和雌蕊中表达。
实施例2植物转基因载体Clean-FBP构建
根据实施例1的结果，利用PCR技术扩增出启动子序列，F引物：5’-gagaaaaactagaaatttacgacatAATTTCTCCTAACTTTCACTTTGATTTTC-3’，R引物：5’-cagtaggatagaggtggctcCCATTAATCAACATACAATG-3’。提取烟草(N.tabacum栽培品种ZY100)基因组DNA作为模板。
将扩增出的启动子元件连入Cre基因上游，该操作中使用华南农业大学刘耀光院士课题组开发的TransGene Stacking II系统进行多基因组装，参见申请号为2017103841977的中国专利，pYL322d1、pYL322d2、pYLMF-H和pYLTAC380GW为华南农业大学刘耀光教授实验室馈赠。
为验证实验设计的有效性，我们选择在转基因载体中引入FBP(fungalbioluminescent pathway)，该真菌发光系统融合真菌荧光素酶(Luz)，hispidin合酶(HispS)，hispidin3-羟化酶(H3H)和咖啡酰丙酮酸水解酶(CPH)(Mitiouchkina etal.2020)，可以发出波长约为520nm的绿光，发光底物为咖啡酸，通过耦合植物内源的咖啡酸代谢，植物可以持续发出肉眼可见的绿光。以FBP发光系统作为转基因阳性筛选的标记，可以活体高效，无损情况下筛选转基因阳性植株。
构建方法为：将光茸菌(Neonothopanus nambi)基因组中的H3H(hispidin-3-hydroxylase)基因和牛奶树碱合成酶基因Hisps(Hispidin synthase)，咖啡酰丙酮酸水解酶基因CPH(caffeoyl pyruvate hydrolase)，真菌荧光素酶(Luz)基因整合到pYLTAC380GW质粒中，其中H3H、Hisps、CPH、Luz均由35S启动子驱动。进一步的，将连入APSP启动子的Cre基因、Cas9基因、Hpt基因表达盒元件整合到上述质粒中，Cas9、Hpt由35S启动子驱动，从而构成Clean-FBP载体(图2)。
所述Hisps基因的编码序列如SEQ ID NO.2所示，所述CPH基因的编码序列如SEQID NO.3所示，所述H3H基因的编码序列如SEQ ID NO.4所示，所述Luz基因的编码序列如SEQID NO.5所示。所述Cre基因的编码序列如SEQ ID NO.6所示，所述Cas9基因的编码序列如SEQ ID NO.7所示，Hpt基因的编码序列如SEQ ID NO.8所示，所述loxP序列如SEQ ID NO.9所示。
具体过程如下：
(1)构建供体载体：pYL322d1-35S-Hisps，pYL322d2-35S-CPH，pYL322d1-35S-H3H，pYL322d2-35S-Luz；
筛选标记和基因编辑元件自删除供给质粒：pYLMF-H-APSP-Cre-35S-Cas9-35S-HPT。
各目标基因片段委托生物公司合成，Hisps、H3H基因片段分别插入pYL322d1的多克隆位点获得pYL322d1-35S-Hisps，pYL322d1-35S-H3H；CPH、Luz基因片段分别插入pYL322d2的多克隆位点获得pYL322d2-35S-CPH，pYL322d2-35S-Luz；
利用同源重组技术将pYLMF-H基础载体中的PV4启动子替换成P：：APSP启动子，再在pYLMF-H载体的XbaⅠ酶切位点添加P35S-Cas9-T35S模块，其中Cas9基因片段上游引入一个loxp位点，从而构建得到pYLMF-H-APSP-Cre-35S-Cas9-35S-HPT。
(2)将供体载体pYL322d1-35S-Hisps和受体载体pYLTAC380GW(按1:1至2:1)混合在NS3529感受态中进行共转，采用热激法，冰浴30min，热激90s，冰浴2-3min，在不含抗生素的LB中，37℃，200rpm，2h复活，涂在含kanamycin(Km,25mg/L)和chloramphenicol(Chl,15mg/L)的LA板上，约18h后长出单克隆，用ddH2O将所有单克隆冲洗至管中，抽提混合质粒。
(3)取100-200ng混合质粒用0.5uL I-Sce I(NEB)在10uL体系中酶切4-5h，转化大肠杆菌菌株NEB10-β(博迈德)，涂在含kanamycin(Km,25mg/L)的LA板上，37℃，15h后挑单克隆，在LB(含25mg/L Km和0.5mM IPTG)中培养，并进行菌液PCR鉴定，使用Green Taq Mix，将能扩增出亮带的进一步抽提质粒，测序验证。
(4)将供体载体pYL322d2-35S-CPH和(3)中受体载体pYLTAC380GW-Hisps(按1:1至2:1)混合在NS3529感受态中进行共转，按照(2)方法转化，涂在含kanamycin(Km,25mg/L)和ampicillin(Amp,70mg/L)的LA板上，约18h后长出单克隆，用ddH2O将所有单克隆冲洗至管中，抽提混合质粒。
(5)取100-200ng混合质粒用0.5uL PI-Sce I(NEB)，加0.5uL BSA在10uL体系中酶切4-5h，随后按照(3)中方法进行转化及验证，出现六条带，含目的基因1.7k bp CPH与6.2kbp Hisps大小条带即为阳性克隆pYLTAC380GW-Hisps-CPH。
(6)更多回合的重组，交叉使用含不同基因的d1、d2供体载体与上一轮构建完成的受体载体进行共转，构建完成pYLTAC380GW-G4载体(含有4个基因片段Hisps、CPH、H3H、Luz)，最后通过BP重组反应把pYLMF-H-APSP-Cre-35S-Cas9-35S-HPT中的APSP-Cre基因表达盒、Cas9基因表达盒、Hpt基因表达盒元件连入pYLTAC380GW-G4载体，构建完成Clean-FBP(图2)，转入NEB10-β(博迈德)感受态，挑单克隆鉴定即可。确认正确菌株用于后续转基因实验。
实施例3靶基因切除的转基因植株的获得
1、将含有已验证正确的载体质粒Clean-FBP的EHA105菌液在LA+Rif+Kana平板上划线，28℃、36h，挑单克隆至3-5ml LB培养基中200rpm，28℃，36h，按照1:100-1:50的比例扩大培养50ml 3-5h至OD＝0.6，然后将菌液离心，用MS0液体培养基(MS+3％Sucrose+PH5.8，50ml)悬浮菌体至OD＝0.6用于侵染；
2、选取野生型烟草ZY100种子，在无菌MS培养基上种植4-5周至完全展开的烟草健康叶片，用手术刀切成0.5cm见方大小(切掉叶缘避开主脉)，叶片上表面朝下在MS1固体培养基(MS+0.5mg/L IAA+2.0mg/L BA+3％sucrose+0.6-0.8％Phytagel，PH＝5.8)上，25℃暗培养2-3天；
3、将预培养过的烟草叶片加入到菌液中，涡旋振荡确保叶片切口被菌液浸没，静止5-30min，用无菌滤纸吸去附着的菌液；将侵染过的叶片上表面朝下置于MS1固体培养基上28℃、暗培养2d；将叶片上表面朝上放入含有Timentin和潮霉素(Hygromycin B)的MS1筛选培养基上，25℃光培养(图3A)；当叶缘长出芽并可以分离时(1cm以上)，将芽切下转移至含有抗生素(TM+Hygromycin B)的MS2(MS+0.5mg/L IAA+3％sucrose+0.6-0.8％Phytagel，PH＝5.8)固体培养基中，两周后长出根(图3B)，打开育苗盒的盖子练苗一周后转入种植土中培养为T0代，取T0代转基因植株叶片通过天能4600成像仪拍照鉴定阳性植株(图4)，共获得转基因烟草幼苗47棵，阳性发光烟草苗45棵，阳性率达到95.7％，表明APSP启动子在转基因操作过程中并没有启动Cre基因的表达，切割Hpt基因，使得转基因过程中阳性植株保持对潮霉素筛选试剂的抗性。
4、用以上阳性植株T0代转基因植株种子为T1代。取3个独立家系(Clean-FBP-3，Clean-FBP-8，Clean-FBP-26)T1代种子发芽，在使用含有3μg/mL Hygromycin B的植物MS培养基中生长，挑选出长势较弱的幼苗到无潮霉素的MS培养基中生长，至4-5叶期，抽提叶片DNA对3个目的基因做PCR检测，发现在所检测叶片中有植株Hpt和Cas9基因被成功切除，而FBP模块中Luz基因仍然存在(图5)。
将获得的Clean-FBP植株(Hpt和Cas9基因已被切除)移植到营养土中在温室生长(25℃，12h光照\12h黑暗，6000lux)50天后，光照条件下用Nikon700相机拍照光照下曝光时间1/60s，暗处曝光时间3min，发现该烟草可以发光(图6)。
对检测的3个转基因家系植株统计发现获得干净的转基因植株比例在6％-10％之间(图7)，达到预期目的。表明我们鉴定的APSP启动子可以用于在转基因T1代中对靶基因的有效切除，创造干净的转基因植株。
以上结果表明APSP启动子在创建干净的转基因植株应用中较好的应用前景。此外，切除了筛选标记Hpt基因后的烟草，还可以继续在下一轮用携带筛选标记Hpt基因的载体转化，达到多轮转入大量目的基因的要求。这样可用于烟草的设计育种和以烟草为底盘的合成生物学研究及应用，有着重大的应用价值。
Claims (10)
1.一种植物花药和雌蕊特异表达启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的植物花药和雌蕊特异表达启动子在构建于花药和雌蕊中特异性表达的基因表达盒或是于花药和雌蕊中特异性表达的基因表达载体中的应用。
3.一种于花药和雌蕊中特异性表达的基因表达盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的植物花药和雌蕊特异表达启动子。
4.一种于花药和雌蕊中特异性表达的基因表达载体，其特征在于，包含如权利要求3所述的基因表达盒。
5.一种重组工程菌，其特征在于，所述工程菌包含如权利要求4所述的基因表达载体。
6.一种在植物花药和雌蕊中表达目的核苷酸序列的方法，其特征在于，包括：构建含有如权利要求1所述启动子和连接于所述启动子的目的核苷酸序列的表达载体，再向植物体导入所述表达载体，筛选培育获得转基因植株。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述植物为烟草。
8.一种培育无筛选标记的转基因植物的方法，其特征在于，包括：
(1)构建植物Cre/loxP重组表达载体，所述植物Cre/loxP重组表达载体的T-DNA区内含有两个或两个以上loxP序列，两个同向1oxP序列之间含有Cre重组酶表达盒和标记基因表达盒；Cre重组酶表达盒中启动Cre重组酶表达的启动子是权利要求1所述的植物花药和雌蕊特异表达启动子；
(2)利用转基因技术将植物Cre/loxP重组表达载体的T-DNA区导入受体植株，培育，获得无筛选标记的转基因植物。
9.如权利要求8所述的培育无筛选标记的转基因植物的方法，其特征在于，所述的植物Cre/loxP重组表达载体还含有多克隆位点或外源目的基因的表达盒；多克隆位点或外源目的基因表达盒位于T-DNA区内，在所述两个同向loxP序列区间之外。
10.一种无筛选标记及基因编辑元件的自发光转基因植物的培育方法，其特征在于：包括：
1)利用多基因组装技术将Hpt基因、Cas9基因、Cre基因、Hisps基因、CPH基因、H3H基因和Luz基因整合到受体载体中，构建获得多基因载体，所述多基因载体中含有两个或两个以上lox-P元件，所述Hpt基因、Cas9基因、Cre基因表达模块在两个同向lox-P元件中间，Cre基因的上游整合有权利要求1所述的启动子；Hisps基因、CPH基因、H3H基因和Luz基因表达模块在两个同向loxP序列区间之外；
2)利用转基因技术将多基因载体中的T-DNA区片段导入受体植株中，培育，获得T0代转基因植株，在T1代幼苗期对转基因植株进行筛选，获得Hpt和Cas9剪切掉的转基因植株。
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