CN114990144A - 一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的dna组装载体及其应用 - Google Patents
一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的dna组装载体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的DNA组装载体及其应用。本发明所述DNA组装载体包含一个由特异核苷酸序列、具有筛选标记功能的基因表达盒和缺刻酶位点组成的一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶组装元件(UNiE)，可用于长片段DNA克隆和多基因片段的高效组装。本发明同时将UNiE元件与多基因叠加系统(TGSII)相结合，构建了一个组装效率更高的新型多基因叠加系统(TGSII‑UNiE)，实现了对多基因的高效组装，具有效率高、操作简便和成本低的特点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域。具体地，涉及一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的DNA组装载体及其应用。
背景技术
在植物功能基因组的研究中，克隆载体的构建成为了应用合成生物学和基因工程的重要工具。如何开发高效、操作简便和成本低的载体组装系统，成为了生物技术发展的一个趋势，其将大大加快功能基因组学和合成代谢通路研究的进程。
传统的酶切-连接方法主要是由II类限制性内切酶在载体的特定位置和片段的两端产生切割从而形成相同黏性末端或平末端，然后在DNA连接酶的作用下将两者连接成完整的重组载体(He,et al.2016.Property and blunt end ligation function of T4 DNAligase.Henan Science.034(007):1058-1062.)。但是这种方法对于平末端的连接效率较低，并且不适用于长片段或者多基因的组装。TGS(Trans Gene Stacking)是一种适用于多基因组装和转化的载体系统，包括一个基于可转化的人工染色体(Transformation-competent artificial chromosome，TAC)背景的受体载体和两个供体载体，该系统依赖于Cre/loxP重组元件和归巢酶，通过多轮循环组装可以将多个基因按照一定的顺序组装到TAC载体上(Lin,et al.2003. Efficient linking and transfer of multiple genes bya multigene assembly and transformation vector system.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America.100:5962-5967.)。在此基础上，Zhu等利用突变不可逆loxP位点开发了一种更高效的多基因叠加系统TGSII(专利号： ZL201710384197.7；Zhu,et al.2017.Development of purple endosperm riceby engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system.Molecular Plant.10(7):918-929.)。虽然TGSII可实现多基因的组装，但TGSII载体构建系统对于长片段和多个DNA片段的组装操作仍然费时、比较复杂。Gibson组装(Gibson assembly，GA)是一种高效和操作简便的克隆方法，它可以在体外同时实现多个片段的无缝连接(Gibson,et al.2009. Enzymaticassembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.Nature Methods.6(5):343-345；Gibson.2011.Enzymatic assembly of overlapping DNAfragments.Methods in Enzymology.498:349-361.)。但Gibson组装连接体系需要使用三种酶，即T5核酸外切酶，DNA聚合酶和Taq DNA连接酶，导致其使用成本较高，并且对于具有一定相似性的序列会产生错误连接。
缺刻酶(Nicking endonuclease，NiE)作为一种新型的限制性内切酶，可以在DNA双链的其中一条链上的特定位置产生切口(Too,et al.2010.Engineering Nt.BtsC I andNb.BtsC I nicking enzymes and applications in generating longoverhangs.Nucleic Acids Research.38(4):1294-1303；Abrosimova,et al.2019.Nicking endonucleases as unique tools for biotechnology and gene engineering.Russian Journal of Bioorganic Chemistry.45(5):303-320.)。缺刻酶介导的不依赖连接酶克隆(Nicking endonucleases-mediated ligation-independent cloning，NiE-LIC)由于操作简单和成本低，已被开发用于突出末端互补配对组装多个DNA片段 (Yang,etal.2010.A ligation-independent cloning method using nicking DNAendonuclease.Biotechniques.49(5):817-821；Wang,et al.2013.DNA fragmentsassembly based on nicking enzyme system.PLoS One.8(3):e57943；Gong,et al.2020.Nicking endonuclease-mediated vector construction strategies for plantgene functional research.Plants.9(9):1090.)。但这种克隆方法是通过扩增在目的片段两端引入与载体末端互补的10～14个碱基左右的序列，需要重组的DNA片段接头处结构难以达到理想的状态，产生的单链DNA(ssDNA)容易形成二级结构，影响DNA分子的互补复性并降低重组效率。因此，有必要提供一种可引导缺刻酶介导的DNA组装的特异核苷酸序列，提高长片段DNA或多基因片段组装的效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的DNA组装载体及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种由所述特异核苷酸序列引导的缺刻酶组装元件。
本发明的第二个目的是提供一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的 DNA组装载体。
本发明的第三个目的是提供一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的多基因(DNA)片段叠加系统。
本发明的第四个目的是提供所述DNA组装载体或所述多基因叠加系统在长片段DNA或多基因组装中的应用。
本发明的第五个目的是提供所述DNA组装载体或所述多基因叠加系统在构建功能互补转化体、稳定转基因植株、瞬时转化植株、组建植物多基因代谢通路或在植物代谢物生物合成中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的长片段DNA的组装方法。
本发明的第七个目的是提供一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的多基因的组装方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
为克服现有长片段DNA和多基因组装载体所存在的效率低、操作复杂、成本高等缺点，本发明设计优化得到了一组15个碱基(nt)的特异核苷酸序列 (Unique nucleotidesequences，UNSs)，并通过连接具有筛选标记功能的基因表达盒和缺刻酶识别位点，构建了一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶组装元件 (Unique nucleotide sequence-guidednicking endonuclease element，UNiE)。利用该组装元件，本发明还构建了一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的DNA 组装(Unique nucleotide sequence-guided nickingendonuclease-mediated DNA assembly，UNiEDA)载体，可用于长片段DNA和多基因的组装。同时，本发明通过将UNiE与多基因叠加系统(Trans Gene Stacking II，TGSII)相结合，构建了一个组装效率更高的新型多基因叠加系统，即由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的多基因叠加系统(TGSII-UNiE)，该系统保留了TGSII的Cre/loxP特异重组位点，大大地提高了克隆效率。利用本发明所述组装载体或TGSII-UNiE 时，可通过使用缺刻酶切割特异性识别位点暴露出15个碱基(nt)的UNSs，通过与带有互补配对的UNSs的目标片段退火并在连接酶作用完成连接，可同时实现长片段DNA或多基因的高效组装。
本发明提供了一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶组装元件(UNiE)，所述元件中包含一个具有筛选标记功能的基因表达盒，基因表达盒两侧连接有不同的特异核苷酸序列，基因表达盒和特异核苷酸序列的正向序列和反向互补序列的 3’端均存在缺刻酶识别位点；所述特异核苷酸序列为12～16个碱基(nt)的核苷酸序列，序列中四种碱基分布均匀，不含起始密码子或常用限制性酶切位点，不含有4碱基或以上的回文序列，不形成发夹结构，不同的特异核苷酸序列之间不发生6个碱基连续配对。
优选地，所述特异核苷酸序列长度为15nt。
由于缺刻酶仅能识别其识别位点的正向序列，为避免酶切后的片段被重新连接至载体上，因此，在具有筛选标记功能的基因表达盒的两端均需含有缺刻酶识别位点，即所述基因表达盒的正向序列和反向互补序列的3’端均含有缺刻酶识别位点；特异核苷酸序列两端同理，以便在酶切和加热(70℃)后在特异核苷酸序列的3’端形成突出粘性末端。
具体地，所述特异核苷酸序列为UA1～UA21任一所述，UA1～UA21的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.2～22所示。
本发明所述具有筛选标记功能的基因表达盒可以为ccdB表达盒、LacZ表达盒等。
具体地，本发明所述缺刻酶组装元件中所用的具有筛选标记功能的基因表达盒为LacZ表达盒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明使用LacZ表达盒作为阴性菌落的筛选标记，其在重组克隆后的载体中会丢失，使重组转化菌落呈白色，而非重组载体转化菌落呈蓝色。
本发明所述缺刻酶位点可以为任一种缺刻酶的识别位点，在本发明的具体实施例中，所用缺刻酶位点为缺刻酶Nt.BtsI的识别位点，其序列如SEQ ID NO.23 所示。
本发明还提供了一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的DNA组装载体，所述载体中含有本发明所述的特异核苷酸序列引导的缺刻酶组装元件。
具体地，本发明所述由特异核苷酸序列引导的DNA组装载体的骨架为 pYLTAC380和pYL1300，其中还携带有抗性基因。
具体地，载体中携带的抗性基因分别为HPT抗潮霉素基因、NPT II抗卡那霉素基因或Bar抗除草剂基因。
具体地，本发明利用特异核苷酸序列UA1、UA21，LacZ表达盒和缺刻酶 Nt.BtsI的识别位点构建好了一个缺刻酶组装元件，再通过将该元件分别插入骨架载体(pYLTAC380和pYL1300)的多克隆酶切位点，构建了6个由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的DNA组装载体，分别为pYL1300H-UNiE、 pYL1300N-UNiE、pYL1300B-UNiE、pYLTAC380H-UNiE、pYLTAC380N-UNiE 和pYLTAC380B-UNiE；载体中的H代表该载体中含有HPT抗潮霉素基因，N代表该载体中含有NPT II抗卡那霉素基因，B代表该载体中含有Bar抗除草剂基因。
本发明还提供了一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的多基因叠加系统，所述系统中包含供体载体和受体载体，所有载体中都含有本发明所述特异核苷酸序列引导的缺刻酶组装元件。
具体地，所述受体载体为本发明构建的pYL1300H/N/B-UNiE和 pYLTAC380H/N/B-UNiE。
具体地，所述供体载体的骨架为pYL332d1或pYL332d2。
利用本发明所述载体和多基因叠加系统可以实现对长片段DNA和多基因的组装。因此，本发明申请保护本发明所述DNA组装载体或所述多基因叠加系统在长片段DNA或多基因组装中的应用。
具体地，所述长片段DNA的长度大于5kb或大于10kb。
本发明还申请保护所述DNA组装载体或所述多基因叠加系统在构建功能互补转化体、稳定转基因植株、瞬时转化植株、组建植物多基因代谢通路或在植物代谢物生物合成中的应用。
具体地，所述稳定转基因植株所用的稳定转化方法为农杆菌介导的转基因方法，所述瞬时转化植株所用的瞬时转化方法为农杆菌或基因枪介导的转基因方法。
具体地，所述的植物为单子叶或双子叶植物。
更具体地，所述单子叶植物为水稻、玉米、小麦、高粱、大麦或燕麦。
本发明还提供了一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的长片段DNA的组装方法，包括以下步骤：
S1.构建DNA组装载体：分析待组装的长片段DNA序列，选择在长片段DNA 序列中相邻缺刻酶识别位点间的序列的Tm值大于70℃的缺刻酶识别位点，将选择的缺刻酶识别位点与特异核苷酸序列和具有筛选标记功能的基因表达盒构建得到权利要求1所述缺刻酶组装元件，并构建DNA组装载体；
S2.长片段DNA的扩增：利用与DNA组装载体中相同的特异核苷酸序列设计由特异核苷酸序列引导的嵌合引物，通过PCR扩增在长片段DNA的两端引入缺刻酶识别位点以及与DNA组装载体互补的特异核苷酸序列；
S3.长片段DNA的组装：用可识别缺刻酶识别位点的缺刻酶分别酶切步骤 S1所得DNA组装载体和步骤S2中扩增得到的长片段DNA，将酶切后的长片段DNA与线性载体连接并转化，筛选阳性转化子。
本发明还提供了一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的多基因(DNA) 片段的组装方法，包括以下步骤：
S1.构建待组装基因的表达盒并分别克隆至载体中；
S2.构建DNA组装载体：分析待组装的基因序列，选择序列中相邻缺刻酶识别位点间的序列的Tm值大于70℃的缺刻酶识别位点，与特异核苷酸序列和具有筛选标记功能的基因表达盒构建得到权利要求1所述缺刻酶组装元件，并构建 DNA组装载体；
S3.扩增待组装基因：依据基因的组装顺序，选择不同的特异核苷酸序列设计嵌合引物，通过PCR扩增在基因表达盒两端引入特异核苷酸序列和缺刻酶位点，使第一个基因片段的一端与线性化的步骤S2所述载体的一端互补，另一端与第二个基因的一端互补，第二个基因的另一端与第3个基因的一端互补；以此类推，最后一个基因的一端与所述载体的另一端互补；
S4.多基因的组装：用可识别缺刻酶位点的缺刻酶分别酶切步骤S2所得DNA 组装载体和步骤S3中扩增得到的基因片段，将酶切后和加热(70℃)后的基因片段与线性载体连接并转化，筛选阳性转化子。
具体地，上述方法中的缺刻酶组装元件中的具有筛选标记功能的基因表达盒为LacZ表达盒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述特异核苷酸序列分别为UA1和UA21，其序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.22所示；所述缺刻酶位点为缺刻酶Nt.BtsI的识别位点，其序列如SEQ ID NO.23所示。
本发明还提供了一种利用本发明所述的特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导 DNA组装在植物中进行代谢物生物合成的方法，通过将多个代谢物合成通路基因同时组装到UNiEDA载体中，实现在植物中目标代谢产物的生物合成。
本发明还申请所述由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的长片段DNA的组装方法或由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的多基因的组装方法在构建功能互补转化体、稳定转基因植株、瞬时转化植株、组建植物多基因代谢通路或在植物代谢物生物合成中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过设计优化得到了一组特异核苷酸序列，并通过连接具有筛选标记功能的基因表达盒和缺刻酶识别序列，构建了一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶组装元件，并在此基础上构建了由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导DNA组装兼容载体和多基因叠加系统(TGSII-UNiE)。利用本发明所述兼容载体和多基因叠加系统(TGSII-UNiE)能实现长片段DNA的组装以及多个长片段DNA 的一次性高效连接，具有高效、操作过程简单、省时、成本低等优势，可应用于植物功能基因组研究和植物生物反应器进行目标代谢物生产。
附图说明
图1为本发明所述缺刻酶组装元件(UNiE)和由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导DNA组装(UNiEDA)载体的示意图；其中，图A为缺刻酶组装元件UNiE的示意图，红色字母为缺刻酶(Nb.BtsI)识别位点，箭头位置表示Nb.BtsI 的切割位点，具有紫色和棕色背景的是特异核苷酸序列(UNSs)；图B和C分别为pYL1300H/N/B-UNiE和pYLTAC380H/N/B-UNiE双元载体的示意图；图D 和E分别为基于TGSII系统的pYL322d1-UNiE和pYL322d2-UNiE供体载体的示意图；所述载体均以LacZ作为阴性克隆的筛选标记。
图2为使用本发明所述UNiEDA方法组装长片段DNA；其中，图A长片段 DNA的组装过程示意图；图B和C分别为通过UNiEDA和Gibson组装方法比较10.3kb长片段组装到pYL1300H-UNiE和14.8kb长片段DNA组装到 pYLTAC380H-UNiE的效率；图D为UNiEDA策略的克隆能力和效率，误差线表示3个技术重复的标准差；图E为通过Not I酶切验证使用UNiEDA方法构建的重组载体在大肠杆菌和农杆菌中的稳定性结果，图中M表示DNA电泳分子标记，EV表示空载体。
图3为使用UNiEDA方法同时组装多个基因；其中，图A为用嵌合引物扩增BvCYP76AD1S(CYP)、BvDODA1S(DOD)、cDOPA5GT(5GT)、ADH 和eGFP的表达盒，并用Nb.BtsI酶切，然后将五个片段同时组装到Nb.BtsI酶切后的pYL1300H-UNiE或pYLTAC380H-UNiE质粒中的示意图；图B为通过 UNiEDA方法和Gibson组装比较4个2.5kb左右的片段组装到pYL1300H-UNiE 和pYLTAC380H-UNiE的效率，误差线表示3个技术重复的标准差；图C为使用UNiEDA方法在pYL1300H-UNiE和pYLTAC380H-UNiE载体中组装不同表达单元(CDeG、CDGeG、CDGAeG)的克隆效率，误差线表示3个技术重复的标准差；图D为通过Kpn I和BamH I酶切验证pYL1300H-CDeG、CDGeG、 CDGAeG载体在大肠杆菌和农杆菌中的结构稳定性；图E为通过Not I酶切验证 pYLTAC380H-CDeG、CDGeG、CDGAeG载体在大肠杆菌和农杆菌中的结构稳定性的结果，图中M表示DNA电泳分子标记，EV表示空载体。
图4为TGSII-UNiE系统提高多条生物合成通路的组装效率；其中，图A为利用UNiEDA方法将3个HP基因组装到pYL322d1-UNiE供体载体中，将1个 GS基因组装到pYL322d2-UNiE供体载体中，然后通过两轮Cre/loxp重组将HPs 和GSs组装到pYLTAC380H-Betanin双元质粒中的示意图；图B为通过Pme I 和Stf I酶切验证重组的pYL322d1-HPs和pYL322d2-GSs中间载体的结果；图C 为通过Not I酶切验证pYLTAC380H-双元载体(pYLTAC380H-Betanin、 HPs/Betanin、GSs/HPs/Betanin)在大肠杆菌和农杆菌中的结构稳定性的结果，图中M表示DNA电泳分子标记，EV表示空载体。
图5为本氏烟草中甜菜红素的生物合成；其中，图A～E分别为 BvCYP76AD1S、BvDODA1S、cDOPA5GT、ADH和eGFP在本氏烟草中的表达水平结果，NA表示不表达，误差线表示3个生物学重复的标准差；图F为用 pYL1300H和pYLTAC380H分别构建不同组合(eG、CDeG、CDGeG、CDGAeG) 载体转化烟草的表型，明场图像是在LED激发下拍摄，eGFP荧光图像是使用便携式GFP荧光检测器在440nm～460nm激发光下拍摄，标尺为2厘米；图G为从含有pYL1300H-eG、CDeG、CDGeG和CDGAeG注射液的烟草叶片中提取甜菜红素的颜色，NC为阴性对照；图H为与阴性对照相比，注射pYL1300H-eG、 CDeG、CDGeG、CDGAeG和pYLTAC380H-eG、CDeG、CDGeG、CDGAeG菌液的烟草叶片中相对甜菜红素含量，误差线表示3个生物学重复的标准差。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 UNiE元件的设计和UNiEDA载体的构建
为克服现有长DNA片段和多基因组装载体所存在的效率低、操作复杂、成本高等缺点，本发明开发了能够高效组装DNA片段的UNiEDA技术，即由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的DNA组装(Unique nucleotide sequence-guided nicking endonuclease-mediatedDNA assembly，UNiEDA)技术。
首先，本发明设计优化得到了一组长15nt的特异核苷酸序列UNSs。本发明所得特异核苷酸序列中的四种碱基均匀分布，不包含起始密码子、常用限制性酶切位点、发夹结构，特异核苷酸序列之间不发生6个碱基连续配对，具体序列如表1所示。在此基础上，本发明通过将UNSs和缺刻酶(Nb.BtsI)位点(位点序列如SEQ ID NO.23所示)组成了一套UNSs引导的PCR嵌合引物，用于通过扩增在目的片段两端引入UNSs和缺刻酶位点以进行UNiEDA，PCR嵌合引物的序列如表2所示。
表1 优化的特异核苷酸序列
表2 特异核苷酸序列引导的PCR嵌合引物
其中，划线部分为特异核苷酸序列，加粗部分(CACTGC)为缺刻酶识别位点，NNN代表与目标基因序列匹配的DNA序列。
在本发明所述特异核苷酸序列的基础上，本发明设计了一个由特异核苷酸序列引导的缺刻酶组装元件UNiE，构建了一套用于长片段DNA克隆和多基因组装的UNiEDA载体。本发明还通过将构建的载体组装至TGSII载体系统上，生成一个功能扩展的新型载体系统TGSII-UNiE。
本发明所述UNiE元件包含一个LacZ表达盒，两侧有两个序列不同的UNSs 和六个Nt.BtsI识别位点(如图1A所示)。其中，LacZ用来作为阴性菌落筛选基因，重组转化后的阳性菌落呈白色，而非重组载体转化菌落呈蓝色。LacZ表达盒两端的Nb.BtsI-UNSs-Nb.BtsI片段可以避免酶切后片段重新连至载体上；经过 Nb.BtsI酶切后，载体线性化并在3’端形成两个15nt的突出同源末端。
本发明所述TGSII-UNiE系统包含六个双元载体，不同载体中含有不同的抗性基因，分别为pYL1300H-UNiE、pYL1300N-UNiE、pYL1300B-UNiE、 pYLTAC380H-UNiE、pYLTAC380N-UNiE和pYLTAC380B-UNiE(载体中的H 代表该载体中含有HPT抗潮霉素基因，N代表该载体中含有NPT II抗卡那霉素基因，B代表该载体中含有Bar抗除草剂基因)；TGSII-UNiE系统中还包括两个供体载体，分别为pYL332d1-UNiE、pYL332d2-UNiE(双元载体和供体载体的示意图分别如图1B～E所示)。
首先使用1300H-UNiE-F/R从pYL322d1质粒上扩增LacZ表达盒，并将其插入到KpnI和BamH I酶切后的pYL1300H/N/B载体上以生成 pYL1300H/N/B-UNiE双元载体。然后将380H-UNiE-F/R扩增出来的UNiE片段与pYLTAC380H/N/B载体骨架(380HV-F/R反向扩增)组装，形成 pYLTAC380H/N/B-UNiE双元受体载体。另外，将322d1-UNiE-F/322d1-UNiE-R 扩增出来的UNiE片段克隆到Asc I和Hind III酶切后的pYL322d1载体中，并将 322d2-UNiE-F/R扩增出来的UNiE片段插入Hind III和Asc I酶切后的pYL322d2 载体中，从而获得pYL322d1-UNiE和pYL322d1-UNiE供体载体(构建UNiEDA 载体所需引物如表3所示)。
pYL1300H/N/B-UNiE和pYLTAC380H/N/B-UniE双元载体能够用于克隆长片段DNA或进行多个基因的同时组装，并通过A.tumefacines(根癌农杆菌)介导的转化将质粒DNA整合到植物基因组中。pYL322d1-UNiE和pYL322d2-UNiE 供体载体中均含有loxP位点，利用UNiEDA方法可同时克隆多个基因，此外可通过Cre/loxP重组至pYLTAC380H/N/B-UNiE受体载体上，从而实现能够通过较少轮的重组组装多个基因至双元载体上。
表3 构建UNiEDA兼容载体所需引物
载体的具体构建过程如下：
1、UNiEDA载体pYL1300H/N/B-UNiE的构建
以本实验室开发的包含LacZ表达盒的质粒作为模板，使用引物 1300H-UNiE-F/1300H-UNiE-R(表3)扩增LacZ表达盒片段，并在其两端添加不同的Nb.BtsI-UNS-Nb.BtsI序列，以生成UNiE元件片段，LacZ表达盒的序列如SEQ ID NO.1所示。
反应体系(30μL)：2×Phanta Max Buffer 15μL，10mM dNTPs 0.6μL，10μM 1300H-UNiE-F 1μL，10μM 1300H-UNiE-R 1μL，Phanta Max Polymerase 0.5U，质粒模板10ng，ddH2O补足到30μL。
反应程序：95℃预变性3min，32个循环包括95℃变性15s，56℃退火30s， 72℃延伸30s，最后72℃充分延伸4min。
用Takara DNA片段纯化试剂盒回收扩增的UNiE片段，并用Kpn I和BamH I分别酶切pYL1300H/N/B质粒。酶切反应体系为：10×Faster digest buffer，Kpn I 5U，BamH I5U，pYL1300H/N/B 300ng，ddH2O补足到10μL。反应条件为 37℃酶切1h；80℃失活5min。然后将回收后的片段和已酶切载体用于Gibson 组装反应(NEB#E5510S)：2×Gibson反应液5μL，已酶切的载体50ng，回收片段与载体摩尔比为1:3，ddH2O补足到10μL；反应条件为50℃连接40min。连接产物在含有0.3×TE的透析膜上透析30min，取1.5μL连接产物，电激转化大肠杆菌DH10B，37℃培养1h左右，取适量菌液涂布于含有卡那霉素抗性的 LB培养基上，37℃培养12～15h。筛选转化单克隆，并将阳性克隆送测序，从而获得pYL1300H/N/B-UNiE质粒(如图1B所示)。
2、UNiEDA载体pYLTAC380H/N/B-UNiE的构建
以pYL1300H-UNiE质粒作为模板，使用引物380H-UNiE-F/380H-UNiE-R(表 3)扩增UNiE元件的核苷酸片段，再用引物380HV-F/380HV-R反扩 pYLTAC380H/N/B载体。
UNiE片段扩增体系(30μL)：2×Phanta Max Buffer 15μL，10mM dNTPs 0.6 μL，10μM 380H-UNiE-F 0.6μL，10μM 380H-UNiE-R 0.6μL，Phanta Max Polymerase 0.5U，pYL1300H-UNiE质粒10ng，ddH2O补足到30μL。
UNiE片段扩增程序：95℃预变性3min，32个PCR循环包括95℃变性15s， 56℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃充分延伸4min。
pYLTAC380H/N/B载体反向扩增体系(20μL)：2×KOD FX Neo buffer 10μL， 2mMdNTPs 2μL，10μM 380HV-F 0.4μL，10μM 380HV-R 0.4μL，KOD FX Neo 0.5U，pYLTAC380H/N/B质粒10ng，ddH2O补足到20μL。
pYLTAC380H/N/B载体反向扩增程序：98℃预变性3min，32个循环包括 96℃变性15s，10～18个内循环包括63℃反应10s、65℃反应10s、68℃反应 10s、70℃反应10s和72℃反应10s，最后72℃充分延伸5min。
用Takara DNA片段纯化试剂盒回收扩增的UNiE片段和反向扩增的载体骨架，然后将回收后的片段和线性化的载体用于Gibson组装反应(NEB#E5510S)： 2×Gibson反应液5μL，线性化载体50ng，回收片段与载体摩尔比为1:3，ddH2O 补足到10μL。反应条件为50℃连接40min。连接产物在含有0.3×TE的透析膜上透析30min，取1.5μL连接产物，电激转化大肠杆菌DH10B，37℃培养1h 左右，取适量菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃培养12～15h。筛选转化单克隆，并将阳性克隆送测序，从而获得pYLTAC380H/N/B-UNiE质粒(如图1C所示)。
3、UNiEDA载体pYL322d1-UNiE和pYL322d2-UNiE的构建
以pYL1300H-UNiE质粒作为模板，使用引物322d1-UNiE-F/322d1-UNiE-R 和322d2-UNiE-F/322d2-UNiE-R扩增UNiE片段。
反应体系(30μL)：2×Phanta Max Buffer 15μL，10mM dNTPs Mix 0.6μL， 10μM322d1-UNiE-F或322d2-UNiE-F 1μL，10μM 322d1-UNiE-R或 322d2-UNiE-R 1μL，PhantaMax Polymerase 0.5U，pYL1300H-UNiE质粒10ng， ddH2O补足到30μL。
反应程序：95℃预变性3min，32个PCR循环包括95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，72℃充分延伸4min。
用Takara DNA片段纯化试剂盒回收扩增的UNiE片段，并用Asc I和Hind III 酶切pYL322d1质粒或pYL322d2质粒：10×Faster digest buffer，Asc I 5U，Hind III 5U，pYL322d1或pYL322d2质粒300ng，ddH2O补足到10μL。反应条件为 37℃酶切1h；65℃失活20min。然后将回收后的片段和已酶切载体用于Gibson 组装反应(NEB#E5510S)：2×Gibson反应液5μL，已酶切的载体50ng，回收片段与载体摩尔比为1:3，ddH2O补足到10μL。反应条件为50℃连接40min。连接产物在含有0.3×TE的透析膜上透析30min，取1.5μL连接产物，电激转化大肠杆菌DH10B，37℃培养1h左右，取适量菌液涂布于含有卡那霉素抗性的 LB培养基上，37℃培养12～15h。筛选转化单克隆，并将阳性克隆送测序，从而获得pYL322d1-UNiE和pYL322d2-UNiE质粒(如图1D～E所示)。
实施例2利用UNiEDA策略组装长片段DNA
为了测试UNiEDA方法组装长片段DNA的效率，本发明设计了一对由UNSs 引导的嵌合引物(包括与目的载体中2个UNSs互补的15nt UNSs，一个Nb.BsrDI 位点和基因特异配对序列)扩增出三种不同大小的长片段DNA(10.3kb、14.8kb 和22.9kb)，分别克隆到pYL1300H-UNiE和pYLTAC380H-UNiE双元载体中。同时与Gbison组装效率相比较，并对利用UNiEDA方法组装的载体进行酶切验证。
1、长片段的扩增
以水稻人工细菌染色体BAC载体为模板，使用嵌合引物 10.3-UA1Bsr-F/10.3-UA21Bsr-R、14.8-UA1Bsr-F/14.8-UA21Bsr-R和22.9-UA1Bsr -F/22.9-UA21Bsr-R(长片段DNA扩增所需引物如表4所示)，分别扩增长度为 10.3kb、14.8kb和22.9kb的长片段DNA。
反应体系(20μL)：2×KOD FX Neo buffer 10μL，2mM dNTPs 2μL，10μM 10.3-UA1Bsr-F或14.8-UA1Bsr-F或22.9-UA1Bsr-F 0.4μL，10μM 10.3-UA1Bsr-R 或14.8-UA1Bsr-R或22.9-UA1Bsr-R 0.4μL，KOD FX Neo 0.5U，BAC质粒10ng， ddH2O补足到20μL。
反应程序参考STI-PCR方法(Zhao等2022，Molecular Plant，15(4):620-629)： 98℃预变性3min，32个循环包括96℃变性15s，10～18个内循环包括63℃反应10s、65℃反应10s、68℃反应10s、70℃反应10s和72℃反应10s，最后 72℃充分延伸5min。
2、长片段DNA的组装
用Takara DNA片段纯化试剂盒回收扩增的长片段DNA，在缺刻酶Nb.BsrDI 的作用下，可以产生两端含有15nt的3’突出UNS粘性末端的长片段DNA。酶切反应体系为：10×Cutsmart buffer，Nb.BsrDI 0.5U，长片段DNA 300ng，ddH2O 补足到10μL。反应条件为：65℃酶切1h；70℃30min(为了解离掉缺刻短链产生15nt的3’突出UNS，并失活酶)。同样，通过Nb.BtsI将两个双元载体线性化，也形成含有15nt UNS突出互补末端的载体片段：10×Cutsmart buffer，Nb.BtsI 0.5U，pYL1300H-UNiE质粒或pYLTAC380H-UNiE质粒500ng，ddH2O补足到 10μL。反应条件为37℃酶切1h；70℃30min(为了解离掉缺刻短链产生15nt的3’突出UNS，并失活酶)。最后在HiFi Taq DNA连接酶的作用下，将长片段DNA 通过相同UNSs同源互补配对插入到线性化的双元载体中(组装过程如图2A所示)，反应体系为：10×Ligation buffer 1μL，HiFi Taq DNA连接酶0.5U，载体骨架50ng，DNA片段与载体骨架摩尔比为1:1～1:4，ddH2O补足到10μL。反应程序为：70℃1min，60℃1min，加入0.5U Taq DNA连接酶；然后18个循环包括46℃反应5min、55℃反应2min和60℃反应2min，最后65℃反应2min。 Gibson组装反应(NEB#E5510S)：2×Gibson反应液5μL，载体骨架50ng，DNA 片段与载体骨架摩尔比为1:1～1:4，ddH2O补足到10μL。反应条件50℃连接40 min。连接产物在含有0.3×TE的透析膜上透析30min，取1.5μL连接产物，电激转化大肠杆菌DH10B，37℃培养1h左右，取适量菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃培养12～15h。
用检测引物1300H-CF/10.3-CR、380H-CF/10.3-CR、380H-CF/14.8-CR和 380H-CF/22.9-CR进行菌落PCR来筛选阳性单克隆(长片段DNA检测所需引物如表4所示)。
3、UNiEDA和Gibson组装的效率比较
本发明统计了pYL1300H-UNiE载体中10.3kb片段的阳性克隆效率和 pYLTAC380H-UNiE载体中14.8kb片段的阳性克隆效率，并将其与Gibson组装的效率进行比较，结果如图2B所示。由图2B所示结果可知，使用不同的载体与片段摩尔比，UNiEDA的克隆效率和Gibson组装相当。本发明还统计了使用 UNiEDA组装较长的DNA片段时，长片段与载体的摩尔比对阳性克隆效率的影响，结果如图2C所示。对于使用UNiEDA组装较长的DNA片段，长片段与载体的摩尔比为3:1是效率最高的(图2B～C)。所有用UNiEDA方法构建的 pYL1300H-UNiE载体均通过Kpn I和BamH I验证其在大肠杆菌和农杆菌中的结构稳定性，所有用UNiEDA方法构建的pYLTAC380H-UNiE载体均用Not I酶切验证其在大肠杆菌和农杆菌中的结构稳定性。反应体系为：10×Faster digest buffer， Not I 5U，载体500ng，ddH2O补足到10μL。反应条件为：37℃酶切1h；80℃失活5min。结果如图2D和2E所示，由图可知，利用UNiEDA方法构建的载体的结构稳定。上述结果表明使用UNiEDA克隆长片段DNA是一种高效的载体构建方法。
表4 长片段DNA扩增和检测所需引物
实施例3利用UNiEDA策略介导多基因同时组装
为了测试UNiEDA介导多基因组装的效率，本发明选择了甜菜红素生物合成通路中的几个关键基因(BvCYP76AD1S、BvDODA1S、cDOPA5GT和ADH，分别简称为C、D、G和A)(Chen etal.,2017；Grützner et al.,2021)进行多基因组装，并将增强型绿色荧光蛋白eGFP基因(简称eG)作为蛋白表达的标记。
通过对甜菜红素基因的序列分析，选择了Nb.BtsI缺刻酶来酶切片段。通过Overlapping PCR将CaMV35S启动子(P35s)、nopaline合成酶终止子(Tnos) 和基因拼接成完整的表达盒。再由UNSs引导的嵌合引物分别扩增每个基因的表达盒，利用UNiEDA方法将每个片段同时组装到pYL1300H-UNiE和 pYLTAC380H-UNiE双元载体中。同时与Gbison组装效率相比较，并对利用 UNiEDA方法组装的载体进行酶切验证。
1、甜菜红素基因表达盒的构建
以本实验室前期开发的包含35s启动子、甜菜红素通路合成基因、eGFP基因和Tnos终止子的质粒为模板，使用引物P35s-OEF/P35s-CYP-OER、 P35s-CYP-OEF/CYP-Tnos-OER和CYP-Tnos-OEF/Tnos-OER分别扩增出35s启动子、CYP和Tnos，使用引物P35s-OEF/P35s-DOD-OER、P35s-DOD-OEF/DOD-Tnos -OER和DOD-Tnos-OEF/Tnos-OER分别扩增出35s启动子、DOD和Tnos，使用引物P35s-OEF/P35s-5GT-OER、P35s-5GT-OEF/5GT-Tnos-OER和5GT-Tnos-OEF/Tnos-OER分别扩增出35s启动子、5GT和Tnos，使用引物P35s-OEF/P35s-ADH- OER、P35s-ADH-OEF/ADH-Tnos-OER和ADH-Tnos-OEF/Tnos-OER分别扩增出 35s启动子、ADH和Tnos以及使用引物P35s-OEF/P35s-eGFP-OER、P35s- eGFP-OEF/eGFP-Tnos-OER和eGFP-Tnos-OEF/Tnos-OER分别扩增出35s启动子、 eGFP和Tnos(相关引物序列见表5)。通过OverlappingPCR将35s启动子、基因和Tnos终止子拼接成完整的表达盒。
反应体系(30μL)：2×Phanta Max Buffer 15μL，10mM dNTPs Mix 0.6μL， 10μM上游引物0.6μL，10μM下游引物0.6μL，Phanta Max Polymerase 0.5U，模板质粒10ng，ddH2O补足到30μL。
反应程序：95℃预变性3min，32个循环包括95℃变性15s，56℃退火30s， 72℃延伸1kb/30s，最后72℃充分延伸4min。
使用Asc I对pYL322d1载体进行酶切：10×Faster digest buffer，Asc I 5U，pYL322d1 300ng，ddH2O补足到10μL。反应条件为37℃酶切1h，65℃失活20 min。利用Gibson组装将每个表达盒插入到pYL322d1载体的Asc I位点中。Gibson 组装反应(NEB#E5510S)：2×Gibson反应液5μL，载体骨架50ng，DNA片段与载体骨架摩尔比为1∶3，ddH2O补足到10μL。反应条件为50℃连接40min。连接产物在含有0.3×TE的透析膜上透析30min，取1.5μL连接产物，电激转化大肠杆菌DH10B，37℃培养1h左右，取适量菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃培养12～15h。用检测引物P35s-CF/CYP-CR、 P35s-CF/DOD-CR、P35s-CF/5GT-CR、P35s-CF/ADH-CR和P35s-CF/eGFP-CR进行菌落PCR来筛选阳性单克隆(见表5)。
表5 多基因同时组装和检测所需引物
2、多个表达盒同时组装
以构建的pYL322d1-CYP/DOD/5GT/ADH/eGFP质粒为模板，使用嵌合引物 CYP-UA1Bts-F/CYP-UA2Bts-R、DOD-UA2Bts-F/DOD-UA3Bts-R、eGFP-UA3Bts -F/eGFP-UA21Bts-R、5GT-UA3Bts-F/5GT-UA4Bts-R、eGFP-UA4Bts-F/eGFP-UA 21Bts-R、5GT-UA3Bts-F/5GT-UA4Bts-R、eGFP-UA4Bts-F/eGFP-UA21Bts-R、ADH -UA4Bts-F/ADH-UA5Bts-R、eGFP-UA5Bts-F/eGFP-UA21Bts-R和eGFP-UA1Bts- F/eGFP-UA21Bts-R(引物序列见表5)分别扩增每个基因的表达盒。
反应体系(30μL)：2×Phanta Max Buffer 15μL，10mM dNTPs 0.6μL，10μM 上游引物0.6μL，10μM下游引物0.6μL，Phanta Max Polymerase 0.5U，模板质粒10ng，ddH2O补足到30μL。
反应程序：95℃预变性3min，32个循环包括95℃变性15s，56℃退火30s， 72℃延伸30s，最后72℃充分延伸4min。
用Takara DNA片段纯化试剂盒回收扩增的表达盒，在Nb.BtsI酶切的作用下，表达盒和载体两端可以产生含有15nt UNS突出同源末端的长片段DNA： 10×Cutsmart buffer，Nb.BtsI 0.5U，表达盒300ng或载体500ng，ddH2O补足到10μL。反应条件为37℃酶切1h，70℃30min。最后在HiFi Taq DNA连接酶的作用下，将每个表达盒按照一定的组合顺序通过相同UNSs同源互补配对插入到线性化的双元载体中(构建过程如图3A所示)，反应体系为：10×Ligation buffer 1μL，HiFi Taq DNA连接酶0.5U，载体骨架50ng，DNA片段与载体骨架摩尔比为1:2(2～3个片段同时组装)或DNA片段与载体骨架摩尔比为1:1(4～5 个片段同时组装)，ddH2O补足到10μL。反应程序为：70℃1min，60℃1min，加入0.5U Taq DNA连接酶；然后18个循环包括46℃反应5min、55℃反应2min 和60℃反应2min，最后65℃反应2min。由于上述表达盒的启动子和终止子序列相同，不适合用于Gibson组装，因此选用了四个2.5kb左右的片段进行测试。
Gibson组装反应(NEB#E5510S)体系为2×Gibson反应液5μL，载体骨架 50ng，DNA片段与载体骨架摩尔比为1:2(2～3个片段同时组装)或DNA片段与载体骨架摩尔比为1:1(4～5个片段同时组装)，ddH2O补足到10μL。反应条件为50℃连接60min。连接产物在含有0.3×TE的透析膜上透析30min，取1.5 μL连接产物，电激转化大肠杆菌DH10B，37℃培养1h左右，取适量菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃培养12～15h。用检测引物P35s-CF/CYP-CR、P35s-CF/DOD-CR、P35s-CF/5GT-CR、P35s-CF/ADH-CR和 P35s-CF/eGFP-CR进行菌落PCR来筛选阳性单克隆。
3、UNiEDA和Gibson组装的效率比较
本发明分别统计了使用UNiEDA方法和Gibson组装对四个2.5kb左右的片段的组装效率，结果如图3B所示，由图可知，使用UNiEDA方法将四个2.5kb 左右的片段同时克隆到pYL1300H-UNiE和pYLTAC380H-UNiE中的组装效率分别为12.85％和17.02％，而使用Gibson组装时，其组装效率分别为9.03％和18.75％。此外，还测试了使用UNiEDA方法组装不同甜菜红素表达盒片段(CDeG、CDGeG 和CDGAeG)的效率，结果如图3C所示。由图所示结果可知，随着组装片段数量的增加，两种双元载体的克隆效率都降低，但组装相同数量的片段时，pYLTAC 380H-UNiE的组装效率明显高于pYL1300H-UNiE。所有使用UNiEDA方法构建的pYL1300H均载体通过Kpn I和BamH I酶切验证其在大肠杆菌和农杆菌中的结构稳定性；构建的pYLTAC380H载体均通过Not I酶切验证其在大肠杆菌和农杆菌中的结构稳定性，结果如图3D和3E)所示，由图可知，利用UNiEDA方法构建的载体的结构稳定。上述结果表明UNiEDA方法对于多个基因的同时组装也具有很好的效率。
实施例4 TGSII-UNiE系统高效组装多条生物合成通路
TGSII系统组装多个基因需要更多轮的Cre/loxP重组，这既耗时又麻烦。本发明将UNiEDA方法与TGSII系统相结合，即将UNiE元件应用到TGSII系统的受体载体和供体载体中。改进后的TGSII-UNiE系统相比较TGSII系统能够更高效、更简单地组装来自不同生物合成途径的多个基因。
羟基肉桂酰基转移酶(HP)基因簇由一个脱羧酶基因OsODC、两个葡胺羟基肉桂酰基转移酶基因OsPHT3和OsPHT4组成，参与植物免疫和细胞死亡(Fang et al.,2021)。另外，三个位于细胞质中的谷氨酰胺合成酶(GS)基因(OsGS1；1、 OsGS1:2和OsGS1；3)通过催化谷氨酸和氨缩合反应生产谷氨酰胺，参与植物中氮的同化和循环(Tabuchi et al.,2007；Kusano et al.,2011)。为了测试TGSII-UNiE 系统的高效性，本发明将两个合成通路的基因利用UNiEDA方法分别组装到两个供体载体上，再通过两轮的Cre/loxP重组即可将两条合成代谢通路整合到含有甜菜红素通路的pYLTAC380H-UNiE载体上，这样可以高效地实现不同生物合成通路地快速组装。
1、利用UNiEDA方法介导HP基因簇和GS代谢通路组装到供体载体上
以日本晴基因组DNA为模板，使用引物ODC-UA1Bts-F/ODC-UA2Bts-R、 PHT3-UA2Bts-F/PHT3-UA3Bts-R和PHT4-UA3Bts-F/PHT4-UA21Bts-R将三个由自身启动子和终止子组成的HPs基因扩增出来。使用引物 GS1-UA1Bts-F/GS1-UA2Bts-R、GS2-UA2Bts-F/GS2-UA3Bts-R和GS3-UA3Bts-F/ GS3-UA21Bts-R将三个由自身启动子和终止子组成的GSs基因扩增出来(引物序列如表6所示)。
反应体系(30μL)：2×Phanta Max Buffer 15μL，10mM dNTPs 0.6μL，10μM 上游引物0.6μL，10μM下游引物0.6μL，Phanta Max Polymerase 0.5U，模板质粒10ng，ddH2O补足到30μL。
反应程序：95℃预变性3min，32个循环包括95℃变性15s，56℃退火30s， 72℃延伸30s，最后72℃充分延伸4min。
用Takara DNA片段纯化试剂盒回收扩增的基因片段，在Nb.BtsI酶切的作用下，片段和载体可以产生两端含有15nt UNS突出同源末端的长片段DNA。
酶切反应体系为：10×Cutsmart buffer，Nb.BtsI 0.5U，片段300ng或载体500ng，ddH2O补足到10μL。反应条件为37℃酶切1h，79℃失活20min。最后在 HiFi Taq DNA连接酶的作用下，将HPs基因片段和GSs基因片段通过相同UNSs 同源互补配对分别插入到线性化的pYL322d1-UNiE和pYL322d2-UNiE载体中 (构建过程如图4A所示)，反应体系为：10×Ligation buffer 1μL，HiFi Taq DNA 连接酶0.5U，载体骨架50ng，DNA片段与载体骨架摩尔比为1:2，ddH2O补足到10μL。反应程序为：70℃1min，60℃1min，加入0.5U Taq DNA连接酶；然后18个循环包括46℃反应5min、55℃反应2min和60℃反应2min，最后 65℃反应2min。连接产物在含有0.3×TE的透析膜上透析30min，取1.5μL连接产物，电激转化大肠杆菌DH10B，37℃培养1h左右，取适量菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃培养12～15h。用检测引物ODC-CF/ODC -CR、PHT3-CF/PHT3-CR、PHT4-CF/PHT4-CR、GS1-CF/GS1-CR、GS2-CF/GS2-CR 和GS3-CF/GS3-CR进行菌落PCR来筛选阳性单克隆，并将pYL322d1-HPs和pYL322d2-GSs载体用Pme I和Stf I进行酶切验证，结果如图4B所示，由图可知，本发明成功将HP基因簇和GS代谢通路组装到供体载体上。
2、利用Cre/loxP重组进行多条合成通路的组装
第一轮，将pYL322d1-HPs质粒和pYLTAC380H-Betanin质粒按照摩尔比 1:1～1:2混合均匀，共转到NS3529感受态细胞中，待细菌培养液在37℃，200 rpm/min的摇床中复苏1h，所有的菌液涂布在含有卡那霉素和氯霉素的LB培养基上。第二天收集所有的菌落并抽质粒，取200ng混合质粒进行I-SceI酶切： 10×Cutsmart Buffer，I-SceI 5U，质粒200ng，ddH2O补足到10μL。反应条件为37℃酶切2h，65℃失活20min。在含有0.3×TE的透析膜上透析30min，取 1.5μL连接产物，电激转化大肠杆菌DH10B，37℃培养1h左右，取适量菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃培养12～15h。用检测引物 ODC-CF/ODC-CR、PHT3-CF/PHT3-CR和PHT4-CF/PHT4-CR进行菌落PCR来筛选阳性单克隆。
第二轮，将pYL322d2-GSs质粒和pYLTAC380H-HPs-Betanin质粒按照摩尔比1:1～1:2混合均匀，共转到NS3529感受态细胞中，待细菌培养液在37℃，200 rpm/min的摇床中复苏1h，所有的菌液涂布在含有卡那霉素和氨苄的LB固体培养基上。第二天收集所有的菌落并抽质粒，取200ng混合质粒进行PI-SceI酶切： 10×PI-SceI Buffer，PI-SceI 5U，质粒200ng，ddH2O补足到10μL。反应条件为 37℃酶切2h，65℃失活20min。在含有0.3×TE的透析膜上透析30min，取1.5 μL连接产物，电激转化大肠杆菌DH10B，37℃培养1h左右，取适量菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃培养12～15h。用检测引物 GS1-CF/GS1-CR、GS2-CF/GS2-CR和GS3-CF/GS3-CR进行菌落PCR来筛选阳性单克隆。将以上载体用Not I进行酶切验证，结果如图4C所示，结果表明利用本发明所述TGSII-UNiE系统可以高效组装多条生物合成通路
表6 多条生物合成通路组装所需引物
实施例5利用UNiEDA方法构建甜菜红素通路在烟草中生物合成
为了进一步验证使用UNiEDA方法构建载体的可靠性和功能性，分别将用pYL1300H载体和pYLTAC380H载体构建甜菜红素通路的不同组合质粒以及两个eGFP质粒(pYL1300H-eG和pYLTAC380H-eG)转入本氏烟草叶片中进行瞬时表达。通过对叶片eGFP荧光的观察、基因表达水平的检测以及甜菜红素含量的测定，从而确定这种策略的可行性和在植物合成生物学中的应用。
1、通过GV3101农杆菌介导转化烟草
将利用UNiEDA策略构建的甜菜红素基因载体和两个eGFP载体转化 GV3101农杆菌感受态(购自上海唯地生物技术有限公司)，操作步骤如下：取 200ng质粒转入刚解冻的50μL GV3101农杆菌感受态，混匀，冰上5min，液氮5min，37℃水浴5min，再在冰上5min，转入700μL的LB培养基中，于 28℃，200rpm/min的摇床中孵育2h。取50μL菌液涂布于含有卡那霉素和利福平抗生素的LB培养基上，28℃培养2d左右。挑取单菌落进行农杆菌稳定性的检测(图3D-E)，并将阳性菌加入至2mL含有卡那霉素和利福平抗生素的LB液体培养基中制备种子液，再吸取50μL菌液加入到10mL LB液体培养基中，并加入10μL 25mg/mL Kan、10μL 50mg/mL Rif、200μL 0.5M MES溶液和4μL 100mM乙酰丁香酮溶液(Acetosyringone,As)，28℃过夜培养。4000rpm室温离心10min，弃上清，再加入10mL重悬液(800μL 0.5M MES，60μL 100mMAs，400μL 10mM MgCl2，ddH2O定容至40mL)悬浮菌体，4000rpm室温离心 10min，弃上清，此过程共重复两次。最后用重悬液调OD600至0.8～1.0，将菌液分装于2mL离心管中(若是两种或三种菌液混转，在离心管中按照1:1混合)，置于23℃黑暗条件下孵育4～5h。用1mL注射器吸取菌液注射于生长约4～5 周的烟草叶片的背面，25℃黑暗培养一天，光照培养一天。
2、甜菜红素生物合成途径基因表达水平的检测
对注射不同组合菌液的烟草叶片进行总RNA的抽提，以核糖体基因L25 (NbL25)为内参基因，并设计了特异反转录引物NbL25-RT-R、CYP-RT-R、 DOD-RT-R、5GT-RT-R、ADH-RT-R和eGFP-RT-R(引物序列如表7所示)进行反转录生成cDNA。本发明同时设计了定量引物NbL25-qRT-F/NbL25-qRT-R、 CYP-qRT-F/CYP-qRT-R、DOD-qRT-F/DOD-qRT-R、5GT-qRT-F/5GT-qRT-R、 ADH-qRT-F/ADH-qRT-R和eGFP-qRT-F/eGFP-qRT-R(引物序列如表7所示)进行基因表达水平的检测。结果分别如图5A～E所示，结果表明四个甜菜红素生物合成途径基因(BvCYP76AD1S、BvDODA1S、cDOPA5GT和ADH)和eGFP 在不同组合的注射烟草叶片中高度表达。
表7 反转录和定量PCR所需要的引物
3、烟草注射区域的eGFP荧光和表型观察
对培养两天的烟草进行表型观察，可以发现注射含有eG、CDeG、CDGeG 和CDGAeG农杆菌菌液的烟草叶片由绿变红且颜色逐渐加深，而在440nm～460 nm激发光下检测到的eGFP荧光信号却逐渐减弱(图5F)，可能是甜菜红素积累的越多(红色)影响eGFP绿色荧光或者eGFP的表达水平越来越低影响eGFP 绿色荧光。
4、甜菜红素含量的测定
使用甜菜碱含量测定试剂盒对注射不同组合菌液的叶片进行甜菜红素含量的测定，以注射空载体菌液的叶片为阴性对照(Negative control,NC)。将注射过侵入菌液的烟草叶片在80℃烘箱中烘干8～10h至叶片彻底失去水分，取烘干后的叶片约0.04g，加入1.6mL水，置于60℃提取30min，期间每隔10min混匀一次，再加入400μL甜菜碱提取液，混匀后25℃，10000g离心10min。取上清液1.2mL加入2mL粉剂，同时在标准管中加入1.2mL ddH2O和2mL粉剂，两管充分混匀，在4℃中反应2h，然后25℃，12000rpm离心10min，弃上清。然后两管分别加入2mL 99％乙醚，充分混匀，25℃，12000rpm离心10min，弃上清，并置于通风橱中使残余乙醚自然挥发完全。最后两管中再加入1200μL 70％丙酮，震荡使沉淀充分溶解，取1mL溶液置于1mL玻璃比色皿中，用70％丙酮调零，记录标准管和测定管在525nm处吸光值。
甜菜红素含量的计算公式为1.99×(ΔA-0.0057)/W，其中ΔA为是OD525处测量管和标准管吸光度值之间的差值，W是烟草干重的质量。注射 pYL1300H-UNiE空载体菌液的叶片在OD525处的吸光度值为0.253，注射 pYLTAC380H-UNiE空载体菌液的叶片在OD525处的吸光度值为0.665，每个值是三次生物学重复的平均值。结果表明在从含有eG、CDeG、CDGeG和CDGAeG 注射液的烟草叶片提取甜菜红素的过程中，发现提取液颜色逐渐变暗，则相对甜菜碱含量逐渐增加(图5G和5H)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的DNA组装载体及其应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta 60
tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca 120
gctatgacca tgattacgcc agatatcatg tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac 180
tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc 240
tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat 300
ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc 360
agctaagata tcatttaggt g 381
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccagtagcac ttcgt 15
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taggtgaggc tgtga 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caagccacgt cagta 15
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcattgcgtc gtctg 15
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgtgtcgct aactc 15
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tccacgacga tcttc 15
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgttgtacag tgctg 15
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcagcgagt agtct 15
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgtcatacgt gaacg 15
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtacaccgct gagaa 15
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaggtcctag gtaca 15
<210> 13
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cattcgcgga ttcga 15
<210> 14
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagttgttag cgtcg 15
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cactgagcta ctagc 15
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgtgaacggg atatc 15
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctgcgaagtt cagtc 15
<210> 18
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agtgggaagg tcaga 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtgtacaacc gagac 15
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aacgtaggca gcatc 15
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggagtcatca gtcac 15
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctgtgttcca tctgc 15
<210> 23
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cactgc 6
Claims (10)
1.一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶组装元件，其特征在于，所述元件中包含一个具有筛选标记功能的基因表达盒，基因表达盒两侧连接有不同的特异核苷酸序列，基因表达盒和特异核苷酸序列的正向序列和反向互补序列的3’端均存在缺刻酶识别位点；所述特异核苷酸序列为12～16个碱基的核苷酸序列，序列中四种碱基分布均匀，不包含起始密码子或常用限制性酶切位点，不含有4碱基或以上的回文序列，不形成发夹结构，不同的特异核苷酸序列之间不发生6个碱基连续配对。
2.根据权利要求1所述缺刻酶组装元件，其特征在于，所述特异核苷酸序列为UA1～UA21任一所述的15个碱基的单链核苷酸序列，UA1～UA21的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.2～22所示。
3.一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的DNA组装载体，其特征在于，所述载体中含有权利要求1所述由特异核苷酸序列引导的缺刻酶组装元件。
4.一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的多基因叠加系统，其特征在于，所述系统中包含供体载体和受体载体，所有供体载体和受体载体中都含有权利要求1所述由特异核苷酸序列引导的缺刻酶组装元件。
5.根据权利要求4所述多基因叠加系统，其特征在于，所述供体载体的骨架为pYL332d1或pYL332d2，所述受体载体的骨架为pYLTAC380或pYL1300。
6.权利要求3所述DNA组装载体或权利要求4或5所述多基因叠加系统在长片段DNA或多基因组装中的应用。
7.权利要求3所述DNA组装载体或权利要求4或5所述多基因叠加系统在构建功能互补转化体、稳定转基因植株、瞬时转化植株、组建植物多基因代谢通路或在植物代谢物生物合成中的应用。
8.一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的长片段DNA的组装方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.构建DNA组装载体：分析待组装的长片段DNA序列，选择在长片段DNA序列中相邻缺刻酶识别位点间的序列的Tm值大于70℃的缺刻酶识别位点，将选择的缺刻酶识别位点与特异核苷酸序列和具有筛选标记功能的基因表达盒构建得到权利要求1所述缺刻酶组装元件，并构建DNA组装载体；
S2.长片段DNA的扩增：利用与DNA组装载体中相同的特异核苷酸序列设计由特异核苷酸序列引导的嵌合引物，通过PCR扩增在长片段DNA的两端引入缺刻酶识别位点以及与线性化的DNA组装载体克隆末端互补配对的特异核苷酸序列；
S3.长片段DNA的组装：用可识别缺刻酶识别位点的缺刻酶分别酶切步骤S1所得DNA组装载体和步骤S2中扩增得到的长片段DNA，将酶切后的长片段DNA与线性载体加热解离出单链特异核苷酸序列末端，连接并转化，筛选阳性转化子。
9.一种由特异核苷酸序列引导的缺刻酶介导的多基因DNA片段的组装方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.构建待组装基因的表达盒并分别克隆至载体中；
S2.构建DNA组装载体：分析待组装的基因序列，选择序列中相邻缺刻酶识别位点间的序列的Tm值大于70℃的缺刻酶识别位点，与特异核苷酸序列和具有筛选标记功能的基因表达盒构建得到权利要求1所述缺刻酶组装元件，并构建DNA组装载体；
S3.扩增待组装基因：依据基因的组装顺序，选择不同的特异核苷酸序列设计嵌合引物，通过PCR扩增在基因表达盒两端引入特异核苷酸序列和缺刻酶位点，使第一个基因片段的一端与线性化的步骤S2所述载体的一端互补，另一端与第二个基因的一端互补，第二个基因的另一端与第3个基因的一端互补；以此类推，最后一个基因的一端与所述载体的另一端互补；
S4.多基因的组装：用可识别缺刻酶位点的缺刻酶分别酶切步骤S2所得DNA组装载体和步骤S3中扩增得到的基因片段，将酶切后的基因片段与线性载体加热解离出单链特异核苷酸序列末端，连接并转化，筛选阳性转化子。
10.权利要求8或9所述方法在构建功能互补转化体、稳定转基因植株、瞬时转化植株、组建植物多基因代谢通路或在植物代谢物生物合成中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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