CN100389199C - T载体及其构建方法与其前t载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了T载体及其构建方法与其前T载体。该T载体，是3′端均带有单个T突出末端的线性双链DNA质粒，其中，在一个3′T突出末端的内侧连接有attL1序列，在另一个3′T突出末端的内侧连接有attL2序列。其制备方法包括以下步骤：1)制备含有attL1-attL2盒的前T载体；所述attL1-attL2盒包括AhdI盒和位于所述AhdI盒上游的attL1序列以及位于所述AhdI盒下游的attL2序列；所述AhdI盒包括间隔DNA序列、紧密连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个AhdI酶切位点序列；2)用AhdI或AhdI的同裂酶酶切步骤1)中的前T载体，得到T载体。该T载体可作为入门载体。

Description

T载体及其构建方法与其前T载体

技术领域

本发明涉及基因工程领域中的T载体及其构建方法与其前T载体。

背景技术

λ噬菌体依靠一套位点特异性重组系统整合到细菌染色体中以及完成溶菌周期和溶源周期之间的转换(Bushman W，Thompson J F，Vargas L，et al.Control ofdirectionality in lambda site specific recombination.Science，1985，230：906-911；Landy A.Dynamic，structural，and regulatory aspects of lambdasite-specific recombination.Ann Rev Biochem，1989，58：913-949)。Invitrogen公司根据λ噬菌体的这种位点特异性重组系统开发了一套用于DNA体外重组的技术，称为Gateway克隆技术。Gateway技术是一种通用性的克隆方法，利用该技术可以快速和高效地将目的DNA序列同时构建到多种与Gateway技术兼容的载体系统，用于功能分析和蛋白表达(Hartley J L，Temple G F，Brasch M A.DNA cloning usingin vitrosite-specific recombination.Genome Research，2000，10：1788-1795)。其基本过程可以表示为：attL×attR→attB+attP。为了利用Gateway克隆技术，首先需要将目的DNA序列按正确的方向和合适的读码框克隆到入门载体(Entryvector)的两个attL重组位点之间，获得入门克隆(Entry clone)。入门克隆与含有两个attR位点的目的载体(Destination vector)在LR Clonase enzyme mix的作用下进行位点特异性重组，使得目的DNA序列按确定的方向和读码框整合到目的载体上，获得目的克隆(destination clone)。目的克隆可用于下一步的功能分析及蛋白表达。LR Clonase enzyme mix由整合酶(integrase，Int)，宿主整合因子(integration host factor，IHF)和切除酶(excisionase，Xis)组成(HartleyJ L，Temple G F，Brasch M A.DNA cloning using in vitro site-specificrecombination.Genome Research，2000，10：1788-1795)。与传统的克隆方法相比，Gateway克隆技术的优点是：可以不必考虑目的DNA是否有合适的酶切位点，也不必进行繁琐而费时费力的酶切和连接反应，一旦获得入门克隆，就可以按确定的方向和读码框快速而准确地将目的DNA克隆到各种与Gateway技术兼容的目的载体上。

Invitrogen公司开发了系列目的载体，包括适用于原核、酵母、昆虫和哺乳动物等不同宿主的表达载体，大大提高了Gateway技术的适用性和兼容性。此外，Invitrogen公司还提供Gateway载体转换系统(Gateway vector conversionsystem)，可以很方便地将现有的载体系统改建为与Gateway技术兼容的目的载体。Karimi等(Karimi M，Inze′D，Depicker A.GATEWAY vectors forAgrobacterium-mediated plant transformation.Trends Plant Sci，2002，7：193-195)以及Curtis和Grossniklaus(Curtis M D，Grossniklaus U.A Gatewaycloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.Plant Physiol，2003，133：462-469)利用Gateway载体转换系统分别构建了一套与Gateway兼容的植物双元表达载体。这些与Gateway兼容的农杆菌双元载体系统为高通量分析植物基因的功能提供了有力的工具。Curtis和Grossniklaus(CurtisM D，Grossniklaus U.A Gateway cloning vector set for high-throughputfunctional analysis of genes in planta.Plant Physiol，2003，133：462-469)构建的全套共21种植物表达载体可以免费索要。

为了利用上述与Gateway兼容的农杆菌双元载体系统及其它目的载体系统，首先需要将目的DNA构建到入门载体上获得入门克隆。但如何简单、经济而高效地获得入门克隆是应用这些载体系统的一个瓶颈问题。

TA克隆的理论依据是：在PCR扩增过程中，由于Taq聚合酶具有不依赖于模板的末端转移酶活性而在PCR产物的3’末端添加单个脱氧核苷酸，并且偏好添加四种脱氧核苷酸中的脱氧腺苷酸(A)(Clark J M.Novel non-templated nucleotideaddition reactions catalyzed prokaryotic and eucaryotic DNA polymerase.Nucleic Acids Res，1988，16：9677-9686)。T载体的制备方法有3种。第一种方法是利用产生平末端的内切酶切割环状质粒，然后利用末端转移酶将单个双脱氧胸腺核苷酸(ddTTP)添加到平末端线状载体的3’端(Holton T A，Graham M W.A simpleand efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailedvectors.Nucleic Acids Res，1991，19：1156)。第二种方法是利用Taq酶将单个脱氧胸腺核苷酸(dTTP)添加到平末端线状载体的3’端(Marchuk D，Drumm M，Saulino A，et al.Construction of T-vectors，a rapid and general system fordirect cloning of unmodified PCR products.Nucleic Acids Res，1991，19：1154)。第三种方法是在质粒载体的多克隆位点中引入特定的序列，用相应的内切酶酶切产生3’端具有单个T突出的线性T载体(Kovalic D，Kwak J H，Weisblum B.Generalmethod for direct cIoning of DNA fragments generated by the polymerase chainreaction.Nucleic Acids Res，1991，19：4560)。与前两种方法相比，第三种方法更快捷、更高效以及更稳定。理论上，可以用来制备T载体的内切酶包括：XcmI、AhdI/Eam1105I/EclHKI/AspEI/NruGI/BspOVI、BfiI/BmrI、HphI/AsuHPI、MboII/NcuI、BfuI/BciVI、HpyAV/Hin4II。其中XcmI和AhdI及其同裂酶在制备T载体中得到广泛应用。无论是使用XcmI还是使用AhdI及其同裂酶构建T载体均存在一个潜在的问题：部分酶切的前T载体混杂在T载体中会导致非重组转化子的本底过高(Mead，D.A.，Pey，N.K.，Herrnstadt，C.，Marcil，R.A.，Smith，L.M.，1991.A universalmethod for the direct cloning of PCR amplified nucleic acid.Bio/Technology9，657-663；Harrison，J.，Molly，P.L.，Clark，S.J.，1994.Direct cioningof polymerase chain reaction products in an XcmI T-vector.Anal.Biochem.216，235-236)。目前，解决这一问题最有效的方法是在前T载体的两个XcmI或两个AhdI酶切位点之间引入足够长的间隔DNA，经琼脂糖凝胶电泳后将完全酶切的质粒和部分酶切的质粒分开(Testori，A.，Sollitti，P.，1996.Cloning unmodifiedPCR products using engineered XcmI restriction sites in a portable cassette.Methods Mol.Biol.67，89-100；Jo，C.，Jo，S.A.，2001.A simple method toconstruct T vectors using Xcm I cassettes amplified by nonspecific PCR.Plasmid 45，37-40；Jeung，J.U.，Cho，S.K.，Shim，K.S.，Ok，S.H.，Lim，D.S.，Shin，J.S.，2002.Construction of two pGEM-7Zf(+)phagemid T-tail vectorsusing Ahd I-restriction endonuclease sites for direct cloning of PCR products.Plasmid 48，160-163)。然而，引入间隔DNA后带来的一个新问题是：由于环型质粒在琼脂糖凝胶电泳中比起分子量相当的线型质粒移动得快，因而，未被酶切的环型质粒(前T载体，带有间隔DNA)往往与分子量小于自身的T载体(不带有间隔DNA)混杂，最终造成非重组转化子的本底过高。

ccdB基因(GenBank Accession No.AP001918)位于F质粒上，它和ccdA基因一起构成F质粒的ccd(control of cell death)位点。ccd位点通过杀死不含F质粒的大肠杆菌细胞达到稳定F质粒的作用。CcdB蛋白干扰大肠杆菌的DNA促旋酶，因而抑制大多数大肠杆菌菌株(例如DH5α，JM109，DHi0B，TOP10)的生长(Bernard，P.，and Couturier，M.，1992.Cell Killing by the F Plasmid CcdB ProteinInvolves Poisoning of DNA-Topoisomerase II Complexes.J.Mol.Biol.226，735-745)。但是大肠杆菌DB3.1菌株中促旋酶的A亚基基因发生了一处突变，突变后的促旋酶可以抵抗CcdB蛋白的毒性效应，因而含有ccdB基因的质粒可以在DB3.1菌株中增殖(Miki，T.，Park，J.A.，Nagao，K.，Murayama，N.，and Horiuchi，T.，1992.Control of Segregat ion of Chromosomal DNA by Sex Factor F inEscherichia coli.Mutants of DNA Gyrase Subunit A Suppress letD(ccdB)ProductGrowth Inhibition.J.Mol.Biol.225，39-52)。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于构建T载体的前T载体，由该前T载体制备的T载体具有较高的TA克隆效率，同时还可作为入门载体。

本发明所提供的前T载体，是含有attL1-attL2盒的双链环状质粒；所述attL1-attL2盒包括AhdI盒和位于所述AhdI盒上游的attL1序列以及位于所述AhdI盒下游的attL2序列；所述AhdI盒包括间隔DNA序列以及连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个AhdI酶切位点序列。

其中，attL1序列是具有序列表中序列1的双链DNA序列；attL2序列是具有序列表中序列2的双链DNA序列。序列1由100个碱基组成，序列2由100个碱基组成。

所述间隔DNA序列为ccdB基因序列。所述ccdB基因序列可为ccdB基因全序列(GenBank Accession No.AP001918)，也可为ccdB基因的开放阅读框。

为了增强由其制备的T载体与各种目的载体的兼容性，所述AhdI盒和attL1序列之间连接有两个、三个或四个碱基对，使其具有3种读码框。

为了便于筛选阳性克隆，所述前T载体还包括抗性基因；所述抗性基因可为Amp抗性基因、Kan抗性基因或Gen抗性基因。

为了使由其制备的T载体便于对克隆的目的DNA序列进行测序及鉴定插入方向，所述前T载体还包括启动子1，测序引物1，启动子2和测序引物2序列；所述启动子1连接于attL1序列的上游，所述测序引物1连接于所述启动子1的上游，所述启动子2连接于attL2序列的下游，所述测序引物2连接于所述启动子2的下游，构成测序引物1-启动子1-attL1-attL2-启动子2-测序引物2盒。

所述启动子1可为SP6启动子或T3启动子或T7启动子，所述测序引物1为M13F(包括M13Primers M1、M2、M3、M4以及BcaBES^TM Primer M13-20和M13-47)；所述启动子2为T7启动子或SP6启动子或T3启动子，所述测序引物2为M13R(包括M13Primers RV以及BcaBEST^TMPrimer RV-M和RV-P)。

所述测序引物1-启动子1-attL1-attL2-启动子2-测序引物2盒具有序列表中序列3或序列4或序列5的核苷酸序列。

所述前T载体具体可为pGWGEN01A、pGWGEN01B、pGWGEN01C、pGWKAN01A、pGWKAN01B、pGWKAN01C、pGWAMP01A、pGWAMP01B或pGWAMP01C。

本发明的另一目的是提供T载体及其制备方法，该载体具有较高的TA克隆效率，同时还可作为入门载体。

本发明所提供的T载体，是3′端均带有单个T突出末端的线性双链DNA质粒，其中，在一个3′T突出末端的内侧连接有attL1序列，在另一个3′T突出末端的内侧连接有attL2序列。

其中，attL1序列是具有序列表中序列1的双链DNA序列；attL2序列是具有序列表中序列2的双链DNA序列。序列1由100个碱基组成，序列2由100个碱基组成。

为了增强入门克隆与各种目的载体的兼容性，所述T载体的3′T突出末端为AhdI或AhdI的同裂酶的粘性末端；所述attL1与粘性末端之间具有两个、三个或四个碱基对，使所述T载体具有3种读码框。

为了便于筛选阳性克隆，所述T载体还含有抗性基因。所述抗性基因可为Amp抗性基因、Kan抗性基因或Gen抗性基因。

为了便于对克隆的目的DNA序列进行测序及鉴定插入方向，所述T载体的attL1序列的内侧连接有启动子1，在所述启动子1的内侧连接有测序引物1；所述attL2序列的内侧连接有启动子2，在所述启动子2的内侧连接有测序引物2。

其中，所述启动子1可为SP6启动子或T3启动子或T7启动子，所述测序引物1为M13F(包括M13Primers M1、M2、M3、M4以及BcaBEST^TMPrimer M13-20和M13-47)；所述启动子2为T7启动子或SP6启动子或T3启动子，所述测序引物2为M13R(包括M13Primers RV以及BcaBEST^TMPrimer RV-M和RV-P)。

本发明的T载体具体可为pGWGEN01A-T(图2A)、pGWGEN01B-T、pGWGEN01C-T、pGWKAN01A-T(图2C)、pGWKAN01B-T、pGWKAN01C-T、pGWAMP01A-T(图2B)、pGWAMP01B-T或pGWAMP01C-T。

本发明所提供的制备上述T载体的方法，包括以下步骤：

1)制备含有attL1-attL2盒的前T载体；所述attL1-attL2盒包括AhdI盒和位于所述AhdI盒上游的attL1序列以及位于所述AhdI盒下游的attL2序列；所述AhdI盒包括间隔DNA序列以及连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个AhdI酶切位点序列；

2)用AhdI或AhdI的同裂酶酶切步骤1)中的前T载体，得到T载体。

所述AhdI的同裂酶包括Eam1105I/EclHKI/AspEI/NruGI/BspOVI。

所述间隔DNA序列可为ccdB基因序列。所述ccdB基因序列可为ccdB基因全序列(GenBank Accession No.AP001918)，也可为ccdB基因的开放阅读框。

为了使所构建的T载体具有3种读码框，所述AhdI盒和attL1序列之间连接有两个、三个或四个碱基对，如

5′-TT/TTG/TTGG-3′

3′-AA/AAC/AACC-5′

为了便于筛选阳性克隆，所述前T载体还包括抗性基因；所述抗性基因可为Amp抗性基因、Kan抗性基因或Gen抗性基因。

为了便于对克隆的目的DNA序列进行测序及鉴定插入方向，所述前T载体还包括启动子1，测序引物1，启动子2和测序引物2序列；所述启动子1连接于attL1序列的上游，所述测序引物1连接于所述启动子1的上游，所述启动子2连接于attL2序列的下游，所述测序引物2连接于所述启动子2的下游，构成测序引物1-启动子1-attL1-attL2-启动子2-测序引物2盒。所述启动子1可为SP6启动子或T3启动子或T7启动子，所述测序引物1为M13F(包括M13Primers M1、M2、M3、M4以及BcaBEST^TM Primer M13-20和M13-47)；所述启动子2为T7启动子或SP6启动子或T3启动子，所述测序引物2为M13R(包括M13 Primers RV以及BcaBEST^TM Primer RV-M和RV-P)。

所述测序引物1-启动子1-attL1-attL2-启动子2-测序引物2盒具有序列表中序列3(其结构示意图如图1A所示)或序列4(其结构示意图如图1B所示)或序列5(其结构示意图如图1C所示)的核苷酸序列。

序列3中，自5′端第1位-6位碱基为AflII酶切位点序列，第22位-36位碱基为M13M1引物序列，第19位-33位碱基为M13M2引物序列，第34位-50位碱基为M13M3引物序列，第14位-30位碱基为M13M4引物序列，第27位-50位碱基为BcaBEST^TM Primer M13-20引物序列，第7位-30位碱基为BcaBEST^TM Primer M13-47引物序列，第52位-75位碱基为SP6启动子序列，第58位-77位碱基为SP6启动子引物序列，第78位-83位碱基为ApaI酶切位点序列，第84位-183位碱基为attL1序列，第184位-185位碱基为TT，第186位-196位碱基为AhdI酶切位点序列，第197位-853位碱基为ccdB基因序列，第854位-864位碱基为AhdI酶切位点序列，第865位-869位碱基为TCTAG，第870位-969位碱基为attL2序列，第978位983位碱基为PstI酶切位点序列，第985位-1004位碱基为T7启动子互补序列，第1016位-1032位碱基为M13RV互补引物序列，第1029位-1052位碱基为BcaBEST^TM PrimerRV-M互补引物序列，第1007位-1030位碱基为BcaBEST^TM Primer RV-P互补引物序列，第1053位-1058位碱基为BspHI酶切位点序列。

序列4中，自5′端第1位-6位碱基为AflII酶切位点序列，第22位-36位碱基为M13M1引物序列，第19位-33位碱基为M13M2引物序列，第34位-50位碱基为M13M3引物序列，第14位-30位碱基为M13M4引物序列，第27位-50位碱基为BcaBEST^TM Primer M13-20引物序列，第7位-30位碱基为BcaBEST^TM Primer M13-47引物序列，第52位-75位碱基为SP6启动子序列，第58位-77位碱基为SP6启动子引物序列，第78位-83位碱基为ApaI酶切位点序列，第84位-183位碱基为attL1序列，第184位-186位碱基为TTG，第187位-197位碱基为AhdI酶切位点序列，第198位-854位碱基为ccdB基因序列，第855位-865位碱基为AhdI酶切位点序列，第866位-870位碱基为TCTAG，第871位-970位碱基为attL2序列，第979位984位碱基为PstI酶切位点序列，第986位-1005位碱基为T7启动子互补序列，第1017位-1033位碱基为M13RV互补引物序列，第1030位-1053位碱基为BcaBEST^TM PrimerRV-M互补引物序列，第1008位-1031位碱基为BcaBEST^TM Primer RV-P互补引物序列，第1054位-1059位碱基为BspHI酶切位点序列。

序列5中，自5′端第1位-6位碱基为AflII酶切位点序列，第22位-36位碱基为M13M1引物序列，第19位-33位碱基为M13M2引物序列，第34位-50位碱基为M13 M3引物序列，第14位-30位碱基为M13 M4引物序列，第27位-50位碱基为BcaBEST^TM Primer M13-20引物序列，第7位-30位碱基为BcaBEST^TM Primer M13-47引物序列，第52位-75位碱基为SP6启动子序列，第58位-77位碱基为SP6启动子引物序列，第78位-83位碱基为ApaI酶切位点序列，第84位-183位碱基为attL1序列，第184位-187位碱基为TTGG，第188位-198位碱基为AhdI酶切位点序列，第199位-855位碱基为ccdB基因序列，第856位-866位碱基为AhdI酶切位点序列，第867位-871位碱基为TCTAG，第872位-971位碱基为attL2序列，第980位985位碱基为PstI酶切位点序列，第987位-1006位碱基为T7启动子互补序列，第1018位-1034位碱基为M13RV互补引物序列，第1031位-1054位碱基为BcaBEST^TM PrimerRV-M互补引物序列，第1009位-1032位碱基为BcaBEST^TM Primer RV-P互补引物序列，第1055位-1060位碱基为BspHI酶切位点序列。

所述前T载体具体可为pGWGEN01A、pGWGEN01B、pGWGEN01C、pGWKAN01A、pGWKAN01B、pGWKAN01C、pGWAMP01A、pGWAMP01B或pGWAMP01C。

上述前T载体均可按照本领域的常规方法制备。

本发明通过在质粒载体的两个attL位点之间引入两个AhdI酶切位点，构建了前T载体，包括具有Gen抗性的pGWGEN01A、pGWGEN01B、pGWGEN01C，具有Kan抗性的pGWKAN01A、pGWKAN01B、pGWKAN01C和具有Amp抗性的pGWAMP01A、pGWAMP01B和pGWAMP01C。利用Ahd I单酶切上述前T载体即可制备与Gateway兼容的T载体，包括：具有Gen抗性的pGWGEN01A-T、pGWGEN01B-T和pGWGEN01C-T，具有Kan抗性的pGWKAN01A-T、pGWKAN01B-T和pGWKAN01C-T以及具有Amp抗性的pGWAMP01A-T、pGWAMP01B-T和pGWAMP01C-T。

本发明将传统的TA克隆技术与Gateway重组克隆技术进行整合，构建了与Gateway技术兼容的前T载体及相应的T载体，用于在克隆PCR产物或其它来源的目的DNA片段的同时获得入门克隆。

本发明构建的与Gateway技术兼容的前T载体及相应的T载体具有如下几个方面的特点：

1、本发明的T载体既是T载体又是入门载体：线性质粒的3’端带有单个T突出的尾巴，TA克隆位点(两个3’T突出末端)的两侧分别含有attL1和attL2重组序列。

2、本发明的T载体由相应的系列前T载体制备而来。前T载体的核心结构可表示如下(阴影部分显示AhdI酶切位点，中间框中部分代表ccdB基因序列，N为任意碱基，两侧框中部分分别代表attL1和attL2重组序列，“^”表示酶切割的具体位点)：

3、前T载体核心结构中的AhdI盒(由两个AhdI酶切位点及中间的ccdB基因序列构成)中的ccdB基因具有间隔DNA和负选标记的双重作用。ccdB作为间隔DNA是指ccdB基因序列将两个AhdI酶切位点间隔开，ccdB基因作为负选标记基因是指含有ccdB基因的质粒转化到普通大肠杆菌菌株细胞后将杀死大肠杆菌细胞。

4、使用AhdI内切酶或其同裂酶(Eam1105I/EcIHKI/AspEI/NruG/BspOVI)酶切与Gateway技术兼容的前T载体，酶切体系经琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收的大片段即是相应的T载体。

5、本发明的T载体是包括Amp抗性、Kan抗性和Gen抗性的T载体，因此提高了T载体与各种目的载体的兼容性。

6、本发明的T载体中，具有相同抗性(或Amp或Kan或Gen)的各有3种，例如pGWGEN01A、pGWGEN01B和pGWGEN01C，分别代表3种读码框。也就是说，当同一抗性的3种T载体分别克隆同一PCR产物或DNA酶切片段时，重组反应后可分别以3种读码框与目的载体(表达载体)的上游形成融合蛋白，因而大大增强了入门克隆与各种目的载体的兼容性。

7、本发明的前T载体中attL1的上游和下游分别引入了完全与pUC载体的测序引物(M13 primers)兼容的序列，并分别引入了SP6和T7启动子序列，因此可以很方便地对克隆的PCR产物进行测序以及鉴定PCR产物的插入方向。

8、采用本发明所述方法制备的T载体进行TA克隆时可以在克隆PCR产物的同时简单、经济而高效地获得入门克隆。本发明的pGWGEN01A-T载体分别克隆1.8kb和0.68kb的PCR产物进行TA克隆效率分析的实验表明TA克隆效率在95％左右，其中PCR产物正向和反向插入的阳性克隆各占约50％，正向或反向插入的克隆效率在45％左右，相当于每5个克隆中平均有2个以上的正向插入和2个以上的反向插入的阳性克隆。该克隆效率足可以满足常规克隆PCR产物的需要。本发明的T载体将在DNA体外重组中得到广泛的应用。

附图说明

图1A为前T载体pGWGEN01A、pGWAMP01A和pGWKAN01A中测序引物1-启动子1-attL1-attL2-启动子2-测序引物2盒结构示意图

图1B为前T载体pGWGEN01B、pGWAMP01B和pGWKAN01B中测序引物1-启动子1-attL1-attL2-启动子2-测序引物2盒结构示意图

图1C为前T载体pGWGEN01C、pGWAMP01C和pGWKAN01C中测序引物1-启动子1-attL1-attL2-启动子2-测序引物2盒结构示意图

图2A为pGWGEN01A-T的物理图谱

图2B为pGWAMP01A-T的物理图谱

图2C为pGWKAN01A-T的物理图谱

具体实施方式

实施例1、构建Gen抗性的前T载体

1、构建Gen抗性的中间载体

1)以pEZ-TNL载体(http://deepgreen.stanford.edu/cell imaging site/html/vectors.html)为模板，GenF和GenR为引物扩增Gen基因序列。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，用BspHI+SmaI双酶切后回收。PCR引物如下：

GenF：5’-AAAA

GACGCACACCGTGGAAACGGATGAAGGCAC-3’(方框中的碱基序列为BspHI酶切位点)；GenR：5’-AAAA

CGGCGTTGTGACAATTTACCGAACAACTCC-3’(方框中的碱基序列为SmaI酶切位点)。PCR扩增的反应体系为：50μL反应体系中含5U Pfu，0.2mmol/L dNTPs，1×Pfu buffer，引物各10μmol/L，模板5ng；PCR扩增的循环程序为：94℃预变性5min，(94℃，30S；60℃，30S；72℃，2min)×30，72℃最后延伸5min。

2)以pENTR1A(Invitrogen)为模板，以GWORIF和GWORIR为引物，用Pfu聚合酶扩增除Kan基因之外的序列。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，以BspHI单酶切后回收。PCR引物如下：GWORIF：5’-GCCCCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCGGTAG-3’；GWORIR；5’-TGCG

GAGATTTTGAGACACGGGCCAGAG-3’(方框中的碱基序列为BspHI酶切位点)。PCR扩增的反应体系为：50μL反应体系中含5U Pfu，0.2mmol/L dNTPs，1×Pfu buffer，引物各10μmol/L，模板5ng；PCR扩增的循环程序为：94℃预变性5min，(94℃，30S；60℃，30S；72℃，5min)×30，72℃最后延伸5min。

3)将1)和2)中的PCR酶切产物建立连接反应体系：10μL连接体系中含3U连接酶(Promega)，1×连接Buffer，各约50ng PCR酶切产物。4℃连接16小时。连接产物转化大肠杆菌DB3.1菌株(Invitrogen)，Gen抗性平板上筛选阳性克隆。命名为pGWGEN01P1。

2、在attL1的上游引入M13F和SP6测序引物，在attL2的下游引入T7和M13R测序引物

1)以pEZ-TNL载体为模板，分别以GWF1和GWR1、GWF2和GWR2以及GWF3和GWR3为引物进行三轮PCR扩增，在PCR扩增产物中引入pUC测序引物序列及SP6和T7启动子序列。其中，引物序列如下：

GWF1：5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAGAAGGGCCCACAAGTTCAGCGTGTCCG-3’

GWR1：5’-TACGGTAATACGACTCACTATAGGGCCTGCAGTTCACCTTGATGCCGTTC-3’

GWF2：5’-ACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’

GWR2：5’-ACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGTAATACGACTCACTATAGGGC-3’

GWF3：5’-AAAACTTAAGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3’

GWR3：5’-AGCCTCATGAGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATG-3’

每轮PCR扩增的反应体系为：50μL反应体系中含5U Pfu，0.2mmol/L dNTPs，1×Pfu buffer，引物各10μmol/L，第一轮PCR扩增的模板为约5ng的pEZ-TNL载体，第一轮PCR扩增产物稀释1,000倍后作为第二轮PCR扩增的模板，第二轮PCR扩增产物稀释1,000倍后作为第三轮PCR扩增的模板；每轮PCR扩增的循环程序为：94℃预变性5min，(94℃，30S；60℃，30S；72℃，1min)×25，72℃最后延伸5min。

PCR扩增产物的序列结构可表示如下(其中阴影部分为引入的酶切位点，两边方框中的部分为引入的M13测序引物及SP6和T7启动子序列，中间方框中的序列为EGFP基因片段)：

2)上述PCR扩增产物用AflII和BspHI双酶切。同样用AflII和BspHI双酶切pGWGEN01P1(去掉attL1-attL2盒)，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收大片段，切胶回收的大片段和PCR酶切产物连接。连接产物转化大肠杆菌DH10B，用ApaI和PstI酶切鉴定阳性克隆。命名为pGWGEN01P2。

3)用ApaI和PstI分别双酶切pGWGEN01P2和pENTR1A，前者的大片段和后者的小片段(attL1-attL2盒)连接。连接产物转化大肠杆菌DB3.1菌株。PCR鉴定阳性克隆。命名为pGWGEN01P3，其ApaI和PstI酶切位点之间的结构如下(其中阴影部分为引入的酶切位点，两边方框中的部分为attL1和attL2重组位点，中间方框中的序列为ccdB基因序列)：

鉴定阳性克隆用到的引物序列如下：

M13-47：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

CcdBR：5’-TCAGCCACTTCTTCCCCGATAACG-3’

3、在attL1和attL2重组序列之间引入AhdI盒：

1)以pMDC45(Curtis M D，Grossniklaus U.A Gateway cloning vector setfor high-throughput functional analysis of genes in planta.Plant Physiol，2003，133：462-469)质粒为模板，分别以AhdFA和AhdR，AhdFB和AhdR，以及AhdFC和AhdR为引物进行PCR扩增。3种PCR扩增产物分别以XbaI单酶切。其中，PCR扩增引物如下：

AhdFA：5’-

GGCTTACTAAAAGCCAGATAACAG-3’(阴影部分的碱基序列为AhdI酶切位点)

AhdFB：5’-

GCTTACTAAAAGCCAGATAACAG-3’(阴影部分的碱基序列为4hdI酶切位点)

AhdFC：5’-G

TTACTAAAAGCCAGATAACAG-3’(阴影部分的碱基序列为AhdI酶切位点)

AhdR：5’-ATG

GTGTATAAGGGAGC-3’(阴影部分的碱基序列为AhdI酶切位点，方框中的碱基序列为XbaI酶切位点)；

PCR扩增的反应体系为：50μL反应体系中含5U Pfu，0.2mmol/L dNTPs，1×Pfu buffer，引物各10μmol/L，模板5ng；PCR扩增的循环程序为：94℃预变性5min，(94℃，30S；60℃，30S；72℃，1min 30S)×30，72℃最后延伸5min。

2)以DraI和XbaI双酶切pGWGEN01P3，经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收大片段。切胶回收的大片段和上述3种PCR酶切产物分别连接，其中，10μL连接体系中含3U连接酶(Promega)，1×连接Buffer，约50ng PCR酶切产物，100ng回收的大片段。4℃连接16小时。3种连接产物分别转化大肠杆菌DB3.1菌株。AhdI酶切鉴定阳性菌落。相应的质粒就是具有Gen抗性的前T载体pGWGEN01A、pGWGEN01B和pGWGEN01C。

实施例2、构建Amp抗性的前T载体

1、去除pBlueScript SK(-)载体上的AhdI酶切位点

在PCR引物中引入突变的碱基，以pBluescript II SK(-)载体(GenBankAccession No.X52330)为模板，用Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收PCR扩增产物，建立连接反应体系，4℃连接16小时，使PCR扩增产物(线性载体)环化。其中，PCR扩增的反应体系为：50μL反应体系中含5U Pfu，0.2mmol/L dNTPs，1×Pfu buffer，引物各10μmol/L，模板5ng左右；PCR扩增的循环程序为：94℃预变性5min，(94℃，30S；60℃，30S；72℃，5min)×30，72℃最后延伸5min。连接反应体系：10μL连接体系中含3U连接酶(Promega)，1×连接Buffer，50ng PCR产物。将得到的连接产物转化大肠杆菌(DH10B)后，随机挑取6个克隆，逐一测序，直至获得AhdI酶切位点被破坏的pBluescript II SK(-)载体，命名为pSKΔAhd。引物序列如下：

AmpF：5’-CTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGG-3’

AmpR：5’-TTATCTACAC

AGGCAAC-3’

Amp18：5’-AATAGACTGGATGGAGGC-3’

其中，加框的C为引入的突变位点(在原始序列中为G)，阴影部分为突变破坏后的AhdI酶切位点。Amp18为测序引物。

2、构建Amp抗性的前T载体

1)以pSKΔAhd为模板，以AmporiF和AmporiR为引物进行PCR扩增。PCR扩增产物用NcoI和NheI双酶切。其中，PCR扩增的反应体系和循环程序同步骤1；PCR引物序列如下：

AmporiF：5’-AACCC

AGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCG-3’(阴影部分的碱基为NcoI酶切位点)

AmporiR：5’-AACGCT

TCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCG-3’(阴影部分的碱基为NheI酶切位点)。

2)用NheI和BspHI分别酶切pGWGEN01A、pGWGEN01B和pGWGEN01C，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后分别切胶回收3种小片段。3种小片段分别和上述PCR酶切产物连接。3种连接产物分别转化大肠杆菌DB3.1菌株，在Amp抗性平板上筛选阳性克隆。阳性克隆用AhdI酶切鉴定。相应的质粒就是具有Amp抗性的前T载体pGWAMP01A、pGWAMP01B和pGWAMP01C。

实施例3.构建Kan抗性的前T载体

用NheI和BspHI分别酶切pGWGEN01A、pGWGEN01B和pGWGEN01C，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后分别切胶回收3种小片段。同样用NheI和BspHI酶切pENTR1A质粒，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收大片段。3种小片段和大片段分别4℃连接16小时。其中，10μL连接体系中含3U连接酶(Promega)，1×连接Buffer，各约100ng大片段，各约50ng小片段。连接产物转化大肠杆菌DB3.1菌株，在Kan抗性平板上筛选阳性克隆。阳性克隆用AhdI酶切鉴定。相应的质粒就是具有Kan抗性的前T载体pGWKAN01A、pGWKAN01B和pGWKAN01C。

实施例4.兼容Gateway技术的系列T载体的制备及TA克隆效率分析用AhdI分别酶切上述前T载体，经琼脂糖凝胶电泳后分别切胶回收大片段。切胶回收纯化的大片段即是相应的T载体。为了测试T载体的TA克隆效率，以pGWGEN01A-T、pGWAMP01A-T和pGWKAN01A-T作为9种T载体的代表对TA克隆效率进行分析。用Taq DNA聚合酶以NCEDF和NCEDR为引物扩增拟南芥NCED3(1.8kb，GenBank Accession No.AT3G14440)基因片段和以DREBF和DREBR为引物扩增DREB1A(680bp，GenBank Accession No.At4g25480)基因片段，其中，引物序列如下：

NCEDF 5’-AACGGATCCATGGCTTCTTTCACGGCAACGGC-3’

NCEDR 5’-AACGAGCTCTCACACGACCTGCTTCGCCAAATC-3’

DREBF 5’-AAGGATCCTTCTGATCAATGAACTCATTTTCTG-3’

DREBR 5’-AACACGTGGTTTTAATAACTCCATAACGATACG-3’

PCR扩增NCED3的循环程序为：94℃预变性5min，(94℃，30S；60℃，30S；72℃，2min)×30，72℃最后延伸5min。PCR扩增DREB1A的循环程序为：94℃预变性5min，(94℃，30S；60℃，30S；72℃，1min)×30，72℃最后延伸5min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。将上述T载体与上述PCR回收产物分别建立6个连接反应体系(10μL连接体系中含3U连接酶(Promega)，1×连接Buffer，大约50ng的T载体和大约92ng的NCED3或35ng的DREB1A)，4℃连接16小时。连接产物转化大肠杆菌DH10B。每个转化分别随机挑选30个阳性克隆进行菌落PCR鉴定，计算阳性克隆所占的百分比。结果表明，3种T载体(pGWGEN01A-T、pGWAMP01A-T和pGWKAN01A-T)克隆DREB1A的效率分别为100％(30/30)、96％(29/30)、96％(29/30)，克隆NCED3效率分别为93％(28/30)、90％(27/30)和96％(29/30)。这些结果表明，本发明制备的T载体具有较高的TA克隆效率。

序列表

<160>5

<210>1

<211>100

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

caaataatga ttttattttg actgatagtg acctgttcgt tgcaacaaat tgataagcaa    60

tgctttttta taatgccaac tttgtacaaa aaagcaggct                         100

<210>2

<211>100

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

acccagcttt cttgtacaaa gttggcatta taagaaagca ttgcttatca atttgttgca    60

acgaacaggt cactatcagt caaaataaaa tcattatttg                         100

<210>3

<211>1058

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

cttaagcgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gcatacgatt    60

taggtgacac tatagaaggg ccccaaataa tgattttatt ttgactgata gtgacctgtt   120

cgttgcaaca aattgataag caatgctttt ttataatgcc aactttgtac aaaaaagcag   180

gctttgactt taggtcggct tactaaaagc cagataacag tatgcgtatt tgcgcgctga   240

tttttgcggt ataagaatat atactgatat gtatacccga agtatgtcaa aaagaggtat   300

gctatgaagc agcgtattac agtgacagtt gacagcgaca gctatcagtt gctcaaggca   360

tatatgatgt caatatctcc ggtctggtaa gcacaaccat gcagaatgaa gcccgtcgtc   420

tgcgtgccga acgctggaaa gcggaaaatc aggaagggat ggctgaggtc gcccggttta   480

ttgaaatgaa cggctctttt gctgacgaga acaggggctg gtgaaatgca gtttaaggtt   540

tacacctata aaagagagag ccgttatcgt ctgtttgtgg atgtacagag tgatattatt   600

gacacgcccg ggcgacggat ggtgatcccc ctggccagtg cacgtctgct gtcagataaa   660

gtctcccgtg aactttaccc ggtggtgcat atcggggatg aaagctggcg catgatgacc   720

accgatatgg ccagtgtgcc ggtctccgtt atcggggaag aagtggctga tctcagccac   780

cgcgaaaatg acatcaaaaa cgccattaac ctgatgttct ggggaatata aatgtcaggc   840

tcccttatac acagacctaa agtctctaga cccagctttc ttgtacaaag ttggcattat   900

aagaaagcat tgcttatcaa tttgttgcaa cgaacaggtc actatcagtc aaaataaaat   960

cattatttgc catccagctg caggccctat agtgagtcgt attaccgtaa tcatggtcat  1020

agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tctcatga                          1058

<210>4

<211>1059

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

cttaagcgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gcatacgatt     60

taggtgacac tatagaaggg ccccaaataa tgattttatt ttgactgata gtgacctgtt    120

cgttgcaaca aattgataag caatgctttt ttataatgcc aactttgtac aaaaaagcag    180

gctttggact ttaggtcggc ttactaaaag ccagataaca gtatgcgtat ttgcgcgctg    240

atttttgcgg tataagaata tatactgata tgtatacccg aagtatgtca aaaagaggta    300

tgctatgaag cagcgtatta cagtgacagt tgacagcgac agctatcagt tgctcaaggc    360

atatatgatg tcaatatctc cggtctggta agcacaacca tgcagaatga agcccgtcgt    420

ctgcgtgccg aacgctggaa agcggaaaat caggaaggga tggctgaggt cgcccggttt    480

attgaaatga acggctcttt tgctgacgag aacaggggct ggtgaaatgc agtttaaggt    540

ttacacctat aaaagagaga gccgttatcg tctgtttgtg gatgtacaga gtgatattat    600

tgacacgccc gggcgacgga tggtgatccc cctggccagt gcacgtctgc tgtcagataa    660

agtctcccgt gaactttacc cggtggtgca tatcggggat gaaagctggc gcatgatgac    720

caccgatatg gccagtgtgc cggtctccgt tatcggggaa gaagtggctg atctcagcca    780

ccgcgaaaat gacatcaaaa acgccattaa cctgatgttc tggggaatat aaatgtcagg    840

ctcccttata cacagaccta aagtctctag acccagcttt cttgtacaaa gttggcatta    900

taagaaagca ttgcttatca atttgttgca acgaacaggt cactatcagt caaaataaaa    960

tcattatttg ccatccagct gcaggcccta tagtgagtcg tattaccgta atcatggtca   1020

tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctctcatga                          1059

<210>5

<211>1060

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

cttaagcgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gcatacgatt     60

taggtgacac tatagaaggg ccccaaataa tgattttatt ttgactgata gtgacctgtt    120

cgttgcaaca aattgataag caatgctttt ttataatgcc aactttgtac aaaaaagcag    180

gctttgggac tttaggtcgg cttactaaaa gccagataac agtatgcgta tttgcgcgct    240

gatttttgcg gtataagaat atatactgat atgtataccc gaagtatgtc aaaaagaggt    300

atgctatgaa gcagcgtatt acagtgacag ttgacagcga cagctatcag ttgctcaagg    360

catatatgat gtcaatatct ccggtctggt aagcacaacc atgcagaatg aagcccgtcg    420

tctgcgtgcc gaacgctgga aagcggaaaa tcaggaaggg atggctgagg tcgcccggtt    480

tattgaaatg aacggctctt ttgctgacga gaacaggggc tggtgaaatg cagtttaagg    540

tttacaccta taaaagagag agccgttatc gtctgtttgt ggatgtacag agtgatatta    600

ttgacacgcc cgggcgacgg atggtgatcc ccctggccag tgcacgtctg ctgtcagata    660

aagtctcccg tgaactttac ccggtggtgc atatcgggga tgaaagctgg cgcatgatga    720

ccaccgatat ggccagtgtg ccggtctccg ttatcgggga agaagtggct gatctcagcc    780

accgcgaaaa tgacatcaaa aacgccatta acctgatgtt ctggggaata taaatgtcag    840

gctcccttat acacagacct aaagtctcta gacccagctt tcttgtacaa agttggcatt    900

ataagaaagc attgcttatc aatttgttgc aacgaacagg tcactatcag tcaaaataaa    960

atcattattt gccatccagc tgcaggccct atagtgagtc gtattaccgt aatcatggtc   1020

atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctctcatga                         1060

Claims (14)

1.前T载体，是含有attL1-attL2盒的双链环状质粒；所述attL1-attL2盒包括AhdI盒和位于所述AhdI盒上游的如SEQ ID NO：1所示的attL1序列以及位于所述AhdI盒下游的如SEQ ID NO：2所示的attL2序列；所述AhdI盒包括间隔DNA序列以及连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个AhdI酶切位点序列。

2.根据权利要求1所述的前T载体，其特征在于：所述间隔DNA序列为ccdB基因序列。

3.根据权利要求1或2所述的前T载体，其特征在于：所述AhdI盒和attL1序列之间连接有两个、三个或四个碱基对。

4.根据权利要求3所述的前T载体，其特征在于：所述前T载体还包括抗性基因。

5.根据权利要求4所述的前T载体，其特征在于：所述前T载体还包括启动子1、测序引物1、启动子2和测序引物2序列；所述启动子1连接于attL1序列的上游，所述测序引物1连接于所述启动子1的上游，所述启动子2连接于attL2序列的下游，所述测序引物2连接于所述启动子2的下游，构成测序引物1-启动子1-attL1-attL2-启动子2-测序引物2盒。

6.根据权利要求5所述的前T载体，其特征在于：所述启动子1为SP6启动子或T3启动子或T7启动子，所述测序引物1为M13F；所述启动子2为T7启动子或SP6启动子或T3启动子，所述测序引物2为M13R；其中，所述测序引物M13F为M13 PrimersM1、M2、M3、M4、BcaBEST^TM Primer M13-20或BcaBEST^TM Primer M13-47，所述测序引物M13R为M13 Primers RV、BcaBEST^TM Primer RV-M或BcaBEST^TM Primer RV-P。

7.根据权利要求6所述的前T载体，其特征在于：所述测序引物1-启动子1-attL1-attL2-启动子2-测序引物2盒具有序列表中序列3或序列4或序列5的核苷酸序列。

8.T载体，是3′端均带有单个T突出末端的线性双链DNA质粒，其特征在于：在一个3′T突出末端内侧连接有如SEQ ID NO：1所示的attL1序列，在另一个3′T突出末端的内侧连接有如SEQ ID NO：2所示的attL2序列。

9.根据权利要求8所述的T载体，其特征在于：所述3′T突出末端为AhdI或AhdI的同裂酶的粘性末端；所述attL1与粘性末端之间具有两个、三个或四个碱基对。

10.根据权利要求9所述的T载体，其特征在于：所述T载体还含有抗性基因。

11.根据权利要求8、9或10所述的T载体，其特征在于：所述attL1序列的内侧连接有启动子1，在所述启动子1的内侧连接有测序引物1；所述attL2序列的内侧连接有启动子2，在所述启动子2的内侧连接有测序引物2。

12.根据权利要求11所述的T载体，其特征在于：所述启动子1为SP6启动子或T3启动子或T7启动子，所述测序引物1为M13F；所述启动子2为T7启动子或SP6启动子或T3启动子，所述测序引物2为M13R；其中，所述测序引物M13F为M13 PrimersM1、M2、M3、M4、BcaBEST^TM Primer M13-20或BcaBEST^TM Primer M13-47，所述测序引物M13R为M13 Primers RV、BcaBEST^TM Primer RV-M或BcaBEST^TM Primer RV-P。

13.一种制备权利要求8所述T载体的方法，包括以下步骤：

1)制备权利要求1所述的前T载体；

2)用AhdI或AhdI的同裂酶酶切步骤1)中的前T载体，得到T载体。

14.权利要求8-12中任一权利要求所述的T载体在DNA体外重组中的应用。

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