CN101979596A - 一种构建同时表达多个基因的重组表达载体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种构建同时表达多个基因的重组表达载体的方法。MISSA系统由菌株和载体组成。菌株包括供体菌和受体菌，载体包括供体载体和受体载体。供体菌染色体上携带的复制起始蛋白负责自杀式供体载体的复制扩增，携带的接合转移蛋白Tra负责供体载体的接合转移。受体菌能够诱导表达两套位点特异性重组蛋白：Cre重组酶和λ噬菌体位点特异性重组蛋白。当混和供体菌和受体菌时，供体菌和受体菌发生接合生殖，供体菌中的供体载体由于携带oriT元件而转移到受体菌中；在受体菌中供体载体和受体载体在两套位点特异性重组酶的作用下发生重组反应，导致供体载体上携带的目标基因组装到受体载体上。重复上述过程，即可把多个目标基因按预订的方向和顺序组装到受体载体上。

Description

一种构建同时表达多个基因的重组表达载体的方法

技术领域

本发明涉及一种构建同时表达多个基因的重组表达载体的方法。

背景技术

很多农艺性状包括作物产量性状、代谢途径、蛋白复合体及信号传导途径等受多基因控制。遗传操纵多个基因无论对于基础研究还是生物工程均具有重要的应用前景。金大米(Ye X，Al Babili S，Kloti A，Zhang J，Lucca P，Beyer P，Potrykus I(2000)Engineering theprovitamin A(beta-carotene)biosynthetic pathway into(carotenoid-free)riceendosperm.Science 287：303-305)和紫番茄(Butelli E，Titta L，Giorgio M，Mock HP，Matros A，Peterek S，Schijlen EG，Hall RD，Bovy AG，Luo J，Martin C(2008)Enrichmentof tomato fruit with health-promoting anthocyanins by expression of selecttranscription factors.Nat Biotechnol 26：1301-1308)的培育即是多基因转基因作物的两个成功案例。将多个基因组装到同一个表达载体转化作物是培育多基因转基因作物直接和高效的方法，但这一方法的限制因子是表达载体的构建。因为很难找到合适的酶切位点，当使用传统的酶切连接方法将5个以上的基因组装到同一个表达载体上时将非常困难。

为此，几个研究小组建立了几种方便多基因组装的方法，包括基于归位内切酶建立的pRCS/pAUX和pSAT载体系统(Goderis IJ，De Bolle MF，Francois IE，Wouters PF，BroekaertWF，Cammue BP(2002)A set of modular plant transformation vectors allowing flexibleinsertion of up to six expression units.Plant Mol Biol 50：17-27；Tzfira T，TianGW，Lacroix B，Vyas S，Li J，Leitner-Dagan Y，Krichevsky A，Taylor T，Vainstein A，Citovsky V(2005)pSAT vectors：a modular series of plasmids for autofluorescentprotein tagging and expression of multiple genes in plants.Plant Mol Biol 57：503-516；Dafny-Yelin M，Tzfira T(2007)Delivery of multiple transgenes to plant cells.PlantPhysiol 145：1118-1128)，基于Cre/loxP和归位内切酶建立的的载体系统(Lin L，Liu YG，Xu X，Li B(2003)Efficient linking and transfer of multiple genes by a multigeneassembly and transformation vector system.Proc Natl Acad Sci U S A 100：5962-5967)以及基于Gateway技术建立的MultiRound Gateway(Chen QJ，Zhou HM，Chen J，Wang XC(2006)A Gateway-based platform for multigene plant transformation.Plant Mol Biol 62：927-936)。然而，使用上述方法进行多基因组装仍然比较费时、费力和费钱。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建同时表达多个基因的重组表达载体的方法。

本发明提供的构建同时表达两个以上基因的重组表达载体的方法，命名为MISSA，包括交替进行的两组重组；第一组重组：将类型I供体菌与类型I受体菌共培养，类型I供体菌中的目标基因整合到类型I受体菌中的类型I受体载体上，得到重组菌；第二组重组：将类型II供体菌与类型II受体菌共培养，类型II供体菌中的目标基因整合到类型II受体菌中的类型II受体载体上，得到重组菌；两组重组各进行一次以上，将两个以上的目标基因组装到同一受体载体上；

所述类型I受体菌为如下(a)或(b)：

(a)将类型I受体载体导入出发菌A得到的重组菌；

(b)所述第二组重组得到的重组菌；

所述类型II受体菌为如下(c)或(d)：

(c)将类型II受体载体导入出发菌A得到的重组菌；

(d)所述第一组重组得到的重组菌；

所述类型I受体菌在所述第一组重组后转变为所述类型II受体菌；所述类型II受体菌在所述第二组重组后转变为所述类型I受体菌；所述类型I受体载体在所述第一组重组后转变为所述类型II受体载体；所述类型II受体载体在所述第二组重组后转变为所述类型I受体载体；

所述出发菌A为满足如下条件的大肠杆菌：含有Cre重组酶编码基因和λ噬菌体位点特异性重组蛋白编码基因；

所述类型I受体载体满足如下条件：容量为100-300kb、单拷贝、含有loxP-attR2框；loxP-attR2框的功能如下：loxP位点在Cre重组酶作用下与另一载体上的loxP位点发生特异性重组；attR2位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attL2位点发生特异性重组；

所述类型II受体载体满足如下条件：容量为100-300kb、单拷贝、含有loxP-attL1框；loxP-attL1框的功能如下：loxP位点在Cre重组酶作用下与另一载体上的loxP位点发生特异性重组；attL1位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attR1位点发生特异性重组；

所述类型I供体菌是将类型I供体载体导入出发菌B得到的；所述类型I供体载体满足如下条件：不能在受体菌中复制、含有接合转移必须元件oriT和loxP-attL1-attL2框、目标基因位于attL1位点和attL2位点之间；loxP-attL1-attL2框的功能如下：loxP位点在Cre重组酶作用下与另一载体上的loxP位点发生特异性重组；attL1位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attR1位点发生特异性重组，形成attB1位点；attL2位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attR2位点发生特异性重组，形成attB2位点；

所述类型II供体菌是将类型II供体载体导入出发菌B得到的；所述类型II供体载体满足如下条件：不能在受体菌中复制、含有接合转移必须元件oriT和loxP-attR2-attR1框，目标基因位于attR1位点和attR2位点之间；loxP-attR2-attR1框的功能如下：loxP位点在Cre重组酶作用下与另一载体上的loxP位点发生特异性重组；attR1位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attL1位点发生特异性重组，形成attB1位点；attR2位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attL2位点发生特异性重组反应，形成attB2位点；

所述类型I供体菌和/或所述II供体菌中，出发菌B为满足如下条件的大肠杆菌：含有接合转移蛋白Tra的编码基因和自杀载体的复制起始蛋白的编码基因。

所述方法在应用中，可自第二次重组开始，每次重组都以上一次重组得到的重组菌作为受体菌与类型I供体菌或类型II供体菌共培养；类型I供体菌和类型II供体菌交替采用；类型I受体菌和类型II受体菌交替转换。

所述类型I供体载体为(1)或(2)或(3)；所述类型II供体载体为(4)或(5)或(6)；

(1)将目标基因插入载体pL-ccdB的attL1位点和attL2位点之间得到的重组质粒；(2)将目标基因插入载体pLC-ccdB的attL1位点和attL2位点之间得到的重组质粒；(3)通过Gateway BP反应将目标基因插入载体pP-ccdB的attP1位点和attP2位点之间得到的重组质粒(Gateway BP反应后attP1-attP2框转变为attL1-attL2框)；(4)将目标基因插入载体pR-ccdB的attR1位点和attR2位点之间得到的重组质粒；(5)将目标基因插入载体pRG-ccdB的attR1位点和attR2位点之间得到的重组质粒；(6)通过Gateway BP反应将目标基因插入载体pPr-ccdB的attP2位点和attP1位点之间得到的重组质粒(Gateway BP反应后attP2-attP1框转变为attR2-attR1框)；

所述载体pL-ccdB自上游至下游依次包括：loxP位点、attL1位点、ccdB基因、pUC\origin、attL2位点、sacB基因、抗性筛选基因和oriT位点；所述载体pLC-ccdB自上游至下游依次包括：loxP位点、抗性筛选基因、attL1位点、ccdB基因、pUC\origin、attL2位点、sacB基因、oriR6kγ和oriT位点；所述载体pR-ccdB自上游至下游依次包括：loxP位点、attR2位点、ccdB基因、pUC\origin、attR1位点、sacB基因、抗性筛选基因、oriR6kγ和oriT位点；所述载体pRG-ccdB自上游至下游依次包括：loxP位点、抗性筛选基因、attR2位点、ccdB基因、pUC\origin、attR1位点、sacB基因、oriR6kγ和oriT位点；所述载体pP-ccdB自上游至下游依次包括：loxP位点、attP1位点、pUC\origin、ccdB基因、attP2位点、sacB基因、抗性筛选基因、oriR6kγ和oriT位点；所述载体pPr-ccdB自上游至下游依次包括：loxP位点、attP2位点、pUC\origin、ccdB基因、attP1位点、sacB基因、抗性筛选基因、oriR6kγ和oriT位点；

所述类型I受体载体可为载体TAC-RTL、载体TAC-LTR、载体BIBAC-RTL或载体BIBAC-LTR；所述载体TAC-RTL自上游至下游依次包括：RB、attR2位点、loxP位点、LB、抗性筛选基因、pRiA4\ori和P1\ori；所述载体TAC-LTR自上游至下游依次包括：RB、loxP位点、attR2位点、LB、抗性筛选基因、pRiA4\ori和P1\ori；所述载体BIBAC-RTL自上游至下游依次包括：RB、attR2位点、loxP位点、LB、抗性筛选基因、F\ori、pRiA4\ori和oriT位点；所述载体BIBAC-LTR自上游至下游依次包括：RB、loxP位点、attR2位点、LB、抗性筛选基因、F\ori、pRiA4\ori和oriT位点。

所述RB为T-DNA右边界；所述LB为T-DNA左边界；所述抗性筛选基因为卡那霉素抗性基因(KnR)、氯霉素抗性基因(CmR)或硫酸庆大霉素抗性基因(GmR)。

所述loxP位点的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第1至34位所示；所述attL1位点的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第423至522位所示；所述ccdB基因的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第673至978位所示；所述pUC\origin的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第1102至1775位所示；所述attL2位点的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第2165至2264位所示；所述sacB基因的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第2401至3822位所示；所述氯霉素抗性基因(CmR)的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第4403至5110位所示；所述oriR6kγ的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第5169至5522位所示；所述oriT位点的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第5530至5851位所示；所述硫酸庆大霉素抗性基因(GmR)的核苷酸序列如序列表的序列4自5’末端第290至823位所示；所述attR2位点的核苷酸序列如序列表的序列3自5’末端第430至554位所示；所述attR1位点的核苷酸序列如序列表的序列3自5’末端第2210至2334位所示；所述attP1位点的核苷酸序列如序列表的序列5自5’末端第424至655位所示；所述attP2位点的核苷酸序列如序列表的序列5自5’末端第2305至2536位所示。

所述载体pL-ccdB的核苷酸序列如序列表的序列1所示(GenBank accession numbers：GU574771)；所述载体pLC-ccdB的核苷酸序列如序列表的序列2所示(GenBank accessionnumbers：GU574773)；所述载体pR-ccdB的核苷酸序列如序列表的序列3所示(GenBankaccession numbers：GU574774)；所述载体pRG-ccdB的核苷酸序列如序列表的序列4所示(GenBank accession numbers：GU574776)；所述载体pP-ccdB的核苷酸序列如序列表的序列5所示(GenBank accession numbers：GU574772)；所述载体pPr-ccdB的核苷酸序列如序列表的序列6所示(GenBank accession numbers：GU574775)。所述载体TAC-RTL的核苷酸序列如GenBank accession numbers：GU574777所示；所述载体TAC-LTR的核苷酸序列如GenBank accession numbers：GU574778所示；所述载体BIBAC-RTL的核苷酸序列如GenBank accession numbers：GU574779所示；所述载体BIBAC-LTR的核苷酸序列如GenBank accession numbers：GU574780所示。

所述出发菌B为大肠杆菌BW20767或具有类似功能特征的其它大肠杆菌菌株；所述出发菌A为将pAH57-cre转化大肠杆菌DH10B得到的重组菌或具有类似功能特征的其它大肠杆菌菌株。所述pAH57-cre的制备方法如下：以序列表的序列7所示DNA(CreF)和序列表的序列8所示DNA(CreR)为引物，以大肠杆菌SW106的的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶BstXI和NheI酶切，得到酶切产物；用限制性内切酶BstXI和NheI酶切pAH57，得到载体骨架；将酶切产物和载体骨架连接，得到重组质粒pAH57-cre。

所述方法可用于多基因表达。

所述方法在可用于培育转基因动物、转基因植物或转基因微生物。

应用所述方法培育得到的转基因植物、动物或微生物也属于本发明的保护范围。

MISSA系统由菌株和载体组成。菌株包括供体菌和受体菌，载体包括供体载体和受体载体。供体菌染色体上携带的复制起始蛋白Pir负责供体载体的复制扩增，携带的接合转移蛋白Tra负责供体载体的接合转移。受体菌能够诱导表达两套位点特异性重组蛋白：Cre重组酶(表达受阿拉伯糖诱导，受葡萄糖抑制)和λ噬菌体位点特异性重组蛋白(包括Int，Xis和IHF，表达受42℃热击诱导)。当混和供体菌和受体菌时，供体菌和受体菌发生接合生殖，供体菌中的供体载体由于携带oriT元件而转移到受体菌中；在受体菌中供体载体和受体载体在两套位点特异性重组酶的作用下发生重组反应。

受体载体含loxP-attR2或loxP-attL1框，来自单拷贝高容量的TAC或BIBAC载体；供体载体由pL和pR两个系列组成；pL系列供体载体含loxP-attL1-attL2框，pR系列的供体载体含loxP-attR2-attR1框，基因或表达框或功能DNA元件位于attL1和attL2之间或attR2和attR1之间。多轮的体内重组过程由pL系列和pR系列的供体载体交替与受体载体进行的重组反应构成。每轮重组反应由两个重组事件构成：供体载体首先在Cre/loxP介导下重组进而整合到受体载体，然后在λ噬菌体位点特异性重组蛋白介导下重组进而去除多余的loxP位点和载体骨架序列。由于上轮重组反应引入了下轮重组反应的序列特异性位点(attL1或attR2)，重组反应可以循环进行下去。这样，经过多轮循环重组反应，可以将多个基因组装到表达载体上。图1和图2为MISSA载体系统及组装原理示意图，图2与图1的区别在于供体载体中抗性筛选基因的位置不同；A：MISSA载体由受体载体和供体载体构成；B和C为MISSA体内重组反应；R2代表attR2，L1代表attL1，L2代表attL2，G1代表要表达的第一个目的基因，R2代表attR2，R1代表attR1，G2代表要表达的第二个目的基因；Kn，卡那霉素；Ap，氨苄青霉素；Cm，氯霉素；Glu，葡萄糖；Suc，蔗糖。

供体载体是将目的基因插入骨架载体得到的，可通过酶切连接的方法用功能性DNA序列取代骨架载体pL-/pR-/pLC-/pRG-ccdB中的pUC_ori-ccdB框来获得功能型pL-/pLC-和pR-/pRG-供体载体，也可通过Gateway BP克隆(Invitrogen)的方法取代pP-/pPr-ccdB中的pUC_ori-ccdB框获得pL-/pR-系列的供体载体。pLC-与pL-系列的供体载体相似，所不同的是前者的细菌筛选标记基因位于loxP和attL1之间；pRG-与pR-系列的供体载体相似，所不同的是前者的细菌筛选标记基因为庆大霉素抗性基因，且位于loxP和attR2之间。

发明人基于细菌接合生殖和两套体内位点特异性重组系统建立了省时、省力和省钱的多基因组装方法，命名为MISSA(multiple-round in vivo site-specific assembly，多轮体内位点特异性组装)。当使用MISSA技术进行多基因组装时，一旦将目标基因构建到供体载体上，剩下的工作就是混和供体菌和受体菌等极其简单的实验，不需要额外的体外分子操作，不需要购买昂贵的重组酶，在大大节约成本的同时极大地提高了工作效率。因此，MISSA是一种省时、省力和省钱的多基因组装技术。

附图说明

图1为MISSA载体系统及组装原理示意图；

图2为第二套MISSA供体载体及组装原理图；

图3为十种重组质粒的结构示意图；

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pDNR-Dual：购自BD Biosciences Clontech，产品目录号639610。pENTR1A：购自Invitrogen，产品目录号A10462。pDONR221：购自Invitrogen，产品目录号12536017。pUC18：购自宝生物工程(大连)有限公司，目录号：D3218。

pGWC：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Chen QJ，Zhou HM，Chen J，Wang XC(2006)Using a modified TA cloning method to create entry clones.Anal Biochem 358：120-125。pL34R12-CmR-ccdB和pL12R34sB-EGFP：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Chen QJ，Zhou HM，Chen J，Wang XC(2006)A Gateway-based platform for multigeneplant transformation.Plant Mol Biol 62：927-936。pBSL238：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Alexeyev MF，Shokolenko IN(1995)RP4 oriT and RP4 oriT-R6K oriVDNA cassettes for construction of specialized vectors.Biotechniques 19：22-4，26。pGL12：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Chen QJ，Zhou HM，Chen J，Wang XC(2006b)Using a modified TA cloning method to create entry clones.Anal Biochem 358：120-125。pMDC99：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Curtis MD，Grossniklaus U(2003)Agateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.Plant Physiol 133：462-469。pL12R34sB-MAR：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：ChenQJ，Zhou HM，Chen J，Wang XC(2006a)A Gateway-based platform for multigene planttransformation.Plant Mol Biol 62：927-936。pBI121：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：De AF，Patti T，Marchetti S(2007)Improvement of the pBI121 plantexpression vector by leader replacement with a sequence combining a poly(CAA)anda CT motif.Transgenic Res 16：731-738。pGalK：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Warming S，Costantino N，Court DL，Jenkins NA，Copeland NG(2005)Simple andhighly efficient BAC recombineering using galK selection.Nucleic Acids Res 33：e36。pCH20：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Hamilton CM，Frary A，Lewis C，TanksleySD(1996)Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes.Proc Natl Acad Sci U S A 93：9975-9979。pAH57：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Haldimann A，Wanner BL(2001)Conditional-replication，integration，excision，and retrieval plasmid-host systems for gene structure-function studies of bacteria.J Bacteriol 183：6384-6393。pYLTAC747：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Lin L，Liu YG，Xu X，Li B(2003)Efficient linking and transfer of multiple genes by amultigene assembly and transformation vector system.Proc Natl Acad Sci U S A 100：5962-5967。大肠杆菌BW20767：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Metcalf WW，JiangW，Daniels LL，Kim SK，Haldimann A，Wanner BL(1996)Conditionally replicative andconjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning，mutagenesis，and allelereplacement in bacteria.Plasmid 35：1-13。大肠杆菌SW106：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Warming S，Costantino N，Court DL，Jenkins NA，Copeland NG(2005)Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.Nucleic AcidsRes 33：e36。大肠杆菌DH10B：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Durfee T et al.(2008)The complete genome sequence of Escherichia coli DH10B：insights into thebiology of a laboratory workhorse.J Bacteriol 190：2597-606。

表1实施例中各个名称引物对应的核苷酸序列

实施例1、重组表达载体

一、构建CmR基因表达框

1、以CmF01和CmR01为引物，以pGWC为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2、以CmF02和CmR01为引物，以步骤1的PCR扩增产物为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

3、用限制性内切酶BamHI和SalI酶切pL34R12-CmR-ccdB；回收载体骨架，用T4 DNA多聚酶酶切使其产生平末端；将平末端的载体骨架与步骤2的PCR扩增产物连接，得到重组质粒pL34R12-Cm+。

二、去除oriR6KγHindIII位点

1、重组质粒pL4R2mVT的构建

①以CmF03和CmR02为引物，以pL34R12-Cm+为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶NotI和SalI酶切，得到酶切产物；

②用限制性内切酶NotI和SalI酶切pL34R12-CmR-ccdB，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒pL34R12-Cm2；

④用限制性内切酶SacI和SmaI酶切pBSL238，回收小片段；

⑤用限制性内切酶SacI和SmaI酶切pL34R12-Cm2，回收载体骨架；

⑥将步骤④的小片段和步骤⑤的载体骨架连接，得到重组质粒pL34R12-CVT；

⑦用限制性内切酶AflII和HindIII酶切pL34R12-CVT，回收载体骨架；

⑧将omVF和omVR退火形成双链DNA片段，然后与步骤⑦的载体骨架连接，得到重组质粒pL4R2mVT。

2、重组质粒pVTm3的构建

①用限制性内切酶NheI和EcoRI酶切pL34R12-CVT，回收载体骨架；

②将oASF和oASR退火形成双链DNA片段，然后与步骤①的载体骨架连接，得到重组质粒pVTm1；

③用限制性内切酶HindIII酶切pVTm1；回收载体骨架，用T4 DNA多聚酶酶切使其产生平末端；将平末端的载体骨架自连，得到重组质粒pVTm2；

④用限制性内切酶DraI和NheI酶切pVTm2；回收载体骨架，用T4 DNA多聚酶酶切使其产生平末端；将平末端的载体骨架自连，得到重组质粒pVTm3。

三、去除sacB的KpnI和SacII位点

1、pDNR-Dual经NotI酶切后自连，得到质粒pSacB；

2、用限制性内切酶KpnI和SacII酶切pSacB，回收载体骨架；

3、将omsBF和omsBR退火形成双链DNA片段，然后与步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒pSacBm。

四、携带loxP位点的供体载体骨架的构建

1、重组质粒pAVTCsB的构建

①以CmF和CmR为引物，以pL34R12-Cm+为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

②用限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切pUC18；回收载体骨架，用T4 DNA多聚酶酶切使其产生平末端；将平末端的载体骨架与步骤①的PCR扩增产物连接，得到重组质粒pUC18-Cm；

③用限制性内切酶NcoI和SalI酶切pUC18-Cm，回收载体骨架；

④将oloxPF和oloxPR退火形成双链DNA片段，然后与步骤③的载体骨架连接，得到重组质粒pUC18-loxP；

⑤以CmF2和CmR2为引物，以pL34R12-Cm+为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶NotI和NcoI酶切，得到酶切产物；

⑥用限制性内切酶NotI和NcoI酶切pUC18-loxP，回收载体骨架；

⑦将步骤⑤的酶切产物和步骤⑥的载体骨架连接，得到重组质粒pUC18-loxP-Cm；

⑧以sacBF和sacBR为引物，以pSacBm为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶NotI和SalI酶切，得到酶切产物；

⑨用限制性内切酶NotI和XhoI酶切pUC18-loxP-Cm，回收载体骨架；

⑩将步骤⑧的酶切产物和步骤⑨的载体骨架连接，得到重组质粒pUC18-loxP-CsB；

以oriVTF和oriVTR为引物，以pL4R2mVT为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶NheI和BspHI酶切，得到酶切产物；

用限制性内切酶XbaI和NcoI酶切pUC18-loxP-CsB，回收载体骨架；

将步骤

的酶切产物和步骤

的载体骨架连接，得到重组质粒pAVTCsB。

2、重组质粒pAGVTsB的构建

①以oriVTF2和oriVTR为引物，以pVTm3为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶XhoI和BspHI酶切，得到酶切产物；

②用限制性内切酶XhoI和NcoI酶切pUC18-loxP-Cm，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒PUC18-loxP-VT；

④以sacBF和sacBR为引物，以pSacBm为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶NotI和SalI酶切，得到酶切产物；

⑤用限制性内切酶NotI和XhoI酶切pUC18-loxP-VT，回收载体骨架；

⑥将步骤④的酶切产物和步骤⑤的载体骨架连接，得到重组质粒pUC18-loxP-VTsB；

⑦以CmF3和CmR3为引物，以pL34R12-Cm+为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

⑧用限制性内切酶SalI酶切pUC-loxP-VTsB；回收载体骨架，用T4 DNA多聚酶酶切使其产生平末端；将平末端的载体骨架与步骤⑦的PCR扩增产物连接，得到重组质粒pACVTsB；

⑨以GmF和GmR为引物，以pGWG为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

⑩用限制性内切酶SalI酶切pUC-loxP-VTsB；回收载体骨架，用T4 DNA多聚酶酶切使其产生平末端；将平末端的载体骨架与步骤⑨的PCR扩增产物连接，得到重组质粒pAGVTsB。

五、attR2-attR1框的构建

1、以ApF2和ApR2为引物，以pUC18为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2、用限制性内切酶NotI和SalI酶切pL34R12-CmR-ccdB；回收载体骨架，用T4 DNA多聚酶酶切使其产生平末端；将平末端的载体骨架与步骤1的PCR扩增产物连接，得到重组质粒pL34R12-A；

3、用限制性内切酶PacI和BspHI酶切pL34R12-A，回收载体骨架；

4、将oPaBsF和oPaBsR退火形成双链DNA片段，然后与步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pL3R12-A；

5、用限制性内切酶AscI和AflII酶切pL3R12-A，回收载体骨架；

6、将oAsAfF和oAsAfR退火形成双链DNA片段，然后与步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒pR-GA；

7、以ccdBF和ccdBR为引物，以pENTR1A为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物用限制性内切酶BspHI酶切，得到酶切产物；

8、用限制性内切酶BspHI和EcoRV酶切pR-GA，回收载体骨架；

9、将步骤7的酶切产物和步骤8的载体骨架连接，得到重组质粒pRAcB。

六、attL1-attL2框的构建

1、以pUC-oriF和pUC-oriR为引物，以pUC18为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物用限制性内切酶NheI酶切，得到酶切产物；

2、用限制性内切酶DraI和XbaI酶切pGL12，回收载体骨架；

3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒pL-2ori；

4、以ApF和ApR为引物，以pUC18为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物用限制性内切酶NcoI和XbaI酶切，得到酶切产物；

5、用限制性内切酶BspHI和NheI酶切pL-2ori，回收载体骨架；

6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒pL-Ap；

7、用限制性内切酶AscI和PacI酶切pRAcB，回收约1623bp的片段；

8、用限制性内切酶AscI和PacI酶切pL-Ap，回收含attL框片段(约1856bp)；

9、将步骤7的大片段和步骤8的片段连接，得到重组质粒pLAcB。

七、attP1-attP2框的构建

1、以ApF3和ApR3为引物，以pUC18为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2、用限制性内切酶SalI酶切pDONR221；回收载体骨架，用T4 DNA多聚酶酶切使其产生平末端；将平末端的载体骨架与步骤1的PCR扩增产物连接，得到重组质粒p221-A；

3、用限制性内切酶ApaI和PvuII酶切pGWG，回收约2063bp的片段；

4、用限制性内切酶ApaI和PvuII酶切p221-A，回收含attP框的片段(约1637bp)；

5、将步骤3的小片段与步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒p221-AG；

6、用限制性内切酶AscI和PacI酶切pL-Ap，回收小片段(约700bp)；

7、用限制性内切酶AscI和PacI酶切p221-AG，回收载体骨架；

8、将步骤6的小片段与步骤7的载体骨架连接，得到重组质粒p221G-2ori；

9、以ApF和ApR为引物，以pUC18为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶XbaI和NocI酶切，得到酶切产物；

10、用限制性内切酶NheI和BspHI酶切p221G-2ori，回收载体骨架；

11、将步骤9的酶切产物和步骤10的载体骨架连接，得到重组质粒pP-A；

12、用限制性内切酶AscI和PacI酶切pRAcB，回收约1623bp的片段；

13、用限制性内切酶AscI和PacI酶切pP-A，回收载体骨架；

14、将步骤12的小片段与步骤13的载体骨架连接，得到重组质粒pPAcB。

八、attP2-attP1盒的构建

1、用限制性内切酶ApaI和NheI酶切pDONR221；回收载体骨架，用T4 DNA多聚酶酶切使其产生平末端；将平末端的载体骨架自连，得到重组质粒p221Δ；

2、以ApF2和ApR2为引物，以pUC18为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

3、用限制性内切酶SalI酶切p221Δ；回收载体骨架，用T4 DNA多聚酶酶切使其产生平末端；将平末端的载体骨架与步骤2的PCR扩增产物连接，得到重组质粒p221Δ-Ap；

4、用限制性内切酶AhdI酶切pRAcB；回收约1623bp的片段，用T4 DNA多聚酶酶切使其产生平末端；

5、用限制性内切酶PvuII酶切p221Δ-Ap，回收载体骨架；回收含attP框片段的片段(约1690bp)；

6、将步骤4的平末端片段与步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒pPrAcB。

九、用于制备供体载体的骨架载体的构建

1、pL-ccdB载体的构建

①用限制性内切酶NotI和SalI酶切pLAcB，回收含attL框片段(约1856bp)；

②用限制性内切酶NotI和SalI酶切pAVTCsB，回收载体骨架；

③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒pL-ccdB。

2、pR-ccdB载体的构建

①用限制性内切酶ApaI和PstI酶切pRAcB，回收含attR框片段(约1926bp)；

②用限制性内切酶ApaI和PstI酶切pL-ccdB，回收载体骨架；

③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒pR-ccdB。

3、pP-ccdB载体的构建

①用限制性内切酶NotI和SalI酶切pAVTCsB，回收约3538bp的大片段；

②用限制性内切酶NotI和SalI酶切pPAcB，回收含attP1框片段(约2592bp)；

③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒pP-ccdB。

4、pPr-ccdB载体的构建

①用限制性内切酶ApaI和PstI酶切pL-ccdB，回收约4001bp的大片段；

②用限制性内切酶ApaI和PstI酶切pPrAcB，回收含attP2框片段(约2168bp)；

③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒pPr-ccdB。

5、pLC-ccdB载体的构建

①用限制性内切酶NotI和SalI酶切pACVTsB，回收约3612bp的大片段；

②用限制性内切酶NotI和SalI酶切pLAcB，回收含attL框片段(约1856bp)；

③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒pLC-ccdB。

6、pRG-ccdB载体的构建

①用限制性内切酶NotI和SalI酶切pAGVTsB，回收约3528bp的大片段；

②用限制性内切酶NotI和SalI酶切pR-ccdB，回收约2389bp片段；

③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒pRG-ccdB。

十、受体载体的构建

1、BIBAC-LTR的构建

①以GalF和GalR为引物，以pGalK为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶SalI酶切，得到酶切产物；

②用限制性内切酶SmaI和SalI酶切pL34R12-CVT，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物与步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒pL34R12-CVTG；

④用限制性内切酶NcoI和SalI酶切pL34R12-CVTG，回收载体骨架；

⑤将oloxPF和oloxPR退火形成双链DNA片段，然后与步骤④的载体骨架连接，得到重组质粒p32CVTGL；

⑥用限制性内切酶SacI和NcoI酶切p32CVTGL；回收载体骨架，用T4 DNA多聚酶酶切使其产生平末端；将平末端的载体骨架自连，得到重组质粒p32CL；

⑦用限制性内切酶PacI和SacII酶切p32CL；回收载体骨架，用T4 DNA多聚酶酶切使其产生平末端；将平末端的载体骨架自连，得到重组质粒pL3R12-CL；

⑧以BIBAC-LTRF和BIBAC-LTRR为引物，以pL3R12-CL为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶AscI和PacI酶切，得到酶切产物；

⑨用限制性内切酶AscI和PacI酶切pCH20，回收载体骨架；

⑩将步骤⑧的酶切产物与步骤⑨的载体骨架连接，得到重组质粒BIBAC-LTR。

2、BIBAC-RTL的构建

①以BIBAC-RTLF和BIBAC-RTLR为引物，以pL3R12-CL为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶AscI和PacI酶切，得到酶切产物；

②用限制性内切酶AscI和PacI酶切pCH20，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物与步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒BIBAC-RTL。

3、TAC-RTL的构建

①用限制性内切酶NotI和PmeI酶切pYLTAC747，回收载体骨架；

②将oTACF和oTACR退火形成双链DNA片段，然后与步骤①的载体骨架连接，得到重组质粒pYLTAC747Δ；

③以TAC-RTLF和TAC-RTLR为引物，以pL3R12-CL为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶HindIII和NotI酶切，回收酶切产物；

④用限制性内切酶HindIII和NotI酶切pYLTAC747Δ，回收载体骨架；

⑤将步骤③的酶切产物和步骤④的载体骨架连接，得到重组质粒TAC-RTL。

4、TAC-LTR的构建

①以TAC-LTRF和TAC-LTRR为引物，以pL3R12-CL为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶HindIII和NotI酶切，回收酶切产物；

②用限制性内切酶HindIII和NotI酶切pYLTAC747Δ，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒TAC-LTR。

实施例2、MISSA实验

一、供体载体的构建

1、供体载体pL-Hyg的构建

①以MarkerF和MarkerR为引物，pMDC99为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切，得到酶切产物；

②用限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切pL-ccdB，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒pL-Hyg。

2、供体载体pR-TM2的构建

①用限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切pL12R34sB-MAR，回收约983bp片段；

②用限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切pR-ccdB，回收载体骨架；

③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒pR-TM2。

3、供体载体pL-GUS的构建

①用限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切pBI121，回收约3032bp片段；

②用限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切pL-ccdB，回收载体骨架；

③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒pL-GUS。

4、供体载体pR-EGFP的构建

①用限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切pL12R34sB-EGFP，回收约1862bp片段；

②用限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切pR-ccdB，回收载体骨架；

③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒pR-EGFP。

二、供体菌和受体菌的构建

1、供体菌的构建

将重组质粒pL-Hyg转化大肠杆菌BW20767，得到的重组菌为供体菌I(pL-Hyg)。

将重组质粒pR-TM2转化大肠杆菌BW20767，得到的重组菌为供体菌II(pR-TM2)。

将重组质粒pL-GUS转化大肠杆菌BW20767，得到的重组菌为供体菌I(pL-GUS)。

将重组质粒pR-EGFP转化大肠杆菌BW20767，得到的重组菌为供体菌II(pR-EGFP)。

2、受体菌的构建

①以CreF和CreR为引物，以大肠杆菌SW106的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶BstXI和NheI酶切，得到酶切产物；

②用限制性内切酶BstXI和NheI酶切pAH57，得到载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒pAH57-cra；

④将BIBAC-LTR和pAH57-cre转化至大肠杆菌DH10B中，得到受体菌I。

三、MISSA实验

分别进行四次重组：第一次重组的受体菌为受体菌(类型I)，供体菌为实施例1制备的供体菌I(pL-Hyg)；第二次重组的受体菌(类型II)为第一次重组得到的重组菌，供体菌为供体菌II(pR-TM2)；第三次重组的受体菌(类型I)为第二次重组得到的重组菌，供体菌为供体菌I(pL-GUS)；第四次重组的受体菌(类型II)为第三次重组得到的重组菌，供体菌为供体菌II(pR-EGFP)。

1、相关培养基的制备

C25板：添加氯霉素的LB平板，氯霉素的终浓度为25ug/ml；

KA板：添加卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板，卡那霉素的终浓度为25ug/ml，氨苄青霉素的终浓度为50ug/ml；

KAC板：添加氯霉素、卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板，氯霉素的终浓度为25ug/ml，卡那霉素的终浓度为25ug/ml，氨苄青霉素的终浓度为50ug/ml；

KAGluSuc板：添加卡那霉素、氨苄青霉素、葡萄糖和蔗糖的LB平板，卡那霉素的终浓度为25ug/ml，氨苄青霉素的终浓度为50ug/ml，葡萄糖的终浓度为0.2％(质量百分含量)，蔗糖的终浓度为6％(质量百分含量)。

2、构建同时表达四个基因的重组表达载体

(1)第一次重组

①接合转移及Cre/loxP重组

供体菌在C25板上划线，37℃培养16～24hr(30℃培养24～36hr也可)；受体菌在KA板上划线，30℃培养24～36hr。从平板上刮取等量的供体菌和受体菌，分别重悬在1.2ml的LB中，重复“离心、弃上清、再加1.2ml LB重悬”步骤2次，洗去培养物中的抗生素。供体菌菌液和受体菌菌液各取600ul混和，30℃静置一个小时后，涂KAC板，30℃培养24～36hr。

②λ噬菌体位点特异性重组蛋白介导下体内重组

用牙签挑取18个菌落(每牙签挑6个菌落)，置6ml LB(含质量百分含量为0.2％的葡萄糖)中，42℃水浴中振荡培养1小时。涂KAGluSuc板，30℃培养24～36hr。

③重组克隆鉴定

随机挑选上述生长出来的克隆分别在KA板上和C25板上一对一划线。随机挑取在KA板上生长且C25板上不生长的20个菌落进行PCR鉴定。

PCR鉴定结果表明，第一次重组中，Hyg的克隆效率为90％。

(2)第二次重组

方法同步骤(1)。

PCR鉴定结果表明，第二次重组中，TM2的克隆效率为80％。

(3)第三次重组

方法同步骤(1)。

PCR鉴定结果表明，第三次重组中，GUS的克隆效率为85％。

(4)第四次重组

方法同步骤(1)。

PCR鉴定结果表明，第四次重组中，EGFP克隆效率为92％。

Claims (10)

1.一种构建同时表达两个以上基因的重组表达载体的方法，包括交替进行的两组重组；

第一组重组：将类型I供体菌与类型I受体菌共培养，类型I供体菌中的目标基因整合到类型I受体菌中的类型I受体载体上，得到重组菌；第二组重组：将类型II供体菌与类型II受体菌共培养，类型II供体菌中的目标基因整合到类型II受体菌中的类型II受体载体上，得到重组菌；两组重组各进行一次以上，将两个以上目标基因组装到同一受体载体上；

所述类型I受体菌为如下(a)或(b)：

(a)将所述类型I受体载体导入出发菌A得到的重组菌；

(b)所述第二组重组得到的重组菌；

所述类型II受体菌为如下(c)或(d)：

(c)将所述类型II受体载体导入出发菌A得到的重组菌；

(d)所述第一组重组得到的重组菌；

所述类型I受体菌在所述第一组重组后转变为所述类型II受体菌；所述类型II受体菌在所述第二组重组后转变为所述类型I受体菌；所述类型I受体载体在所述第一组重组后转变为所述类型II受体载体；所述类型II受体载体在所述第二组重组后转变为所述类型I受体载体；

所述类型I受体菌和/或所述类型II受体菌中，所述出发菌A为满足如下条件的大肠杆菌：含有Cre重组酶编码基因和λ噬菌体位点特异性重组蛋白编码基因；

所述类型I受体载体满足如下条件：容量为100-300kb、单拷贝、含有loxP-attR2框；loxP-attR2框的功能如下：loxP位点在Cre重组酶作用下与另一载体上的loxP位点发生特异性重组；attR2位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attL2位点发生特异性重组；

所述类型II受体载体满足如下条件：容量为100-300kb、单拷贝、含有loxP-attL1框；loxP-attL1框的功能如下：loxP位点在Cre重组酶作用下与另一载体上的loxP位点发生特异性重组；attL1位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attR1位点发生特异性重组；

所述类型I供体菌是将类型I供体载体导入出发菌B得到的；所述类型I供体载体满足如下条件：不能在受体菌中复制、含有接合转移必须元件oriT和loxP-attL1-attL2框、目标基因位于attL1位点和attL2位点之间；loxP-attL1-attL2框的功能如下：loxP位点在Cre重组酶作用下与另一载体上的loxP位点发生特异性重组；attL1位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attR1位点发生特异性重组，形成attB1位点；attL2位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attR2位点发生特异性重组，形成attB2位点；

所述类型II供体菌是将类型II供体载体导入出发菌B得到的；所述类型II供体载体满足如下条件：不能在受体菌中复制、含有接合转移必须元件oriT和loxP-attR2-attR1框，目标基因位于attR1位点和attR2位点之间；loxP-attR2-attR1框的功能如下：loxP位点在Cre重组酶作用下与另一载体上的loxP位点发生特异性重组；attR1位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attL1位点发生特异性重组，形成attB1位点；attR2位点在λ噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的attL2位点发生特异性重组反应，形成attB2位点；

所述类型I供体菌和/或所述类型II供体菌中，出发菌B为满足如下条件的大肠杆菌：含有接合转移蛋白Tra的编码基因和自杀载体的复制起始蛋白的编码基因。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：自第二次重组开始，每次重组都以上一次重组得到的重组菌作为受体菌与类型I供体菌或类型II供体菌共培养；类型I供体菌和类型II供体菌交替采用；类型I受体菌和类型II受体菌交替转换。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述类型I供体载体为如下(1)或(2)或(3)；所述类型II供体载体为如下(4)或(5)或(6)；

(1)将目标基因插入载体pL-ccdB的attL1位点和attL2位点之间得到的重组质粒；

(2)将目标基因插入载体pLC-ccdB的attL1位点和attL2位点之间得到的重组质粒；

(3)通过Gateway BP反应将目标基因插入载体pP-ccdB的attP1位点和attP2位点之间得到的重组质粒；

(4)将目标基因插入载体pR-ccdB的attR1位点和attR2位点之间得到的重组质粒；

(5)将目标基因插入载体pRG-ccdB的attR1位点和attR2位点之间得到的重组质粒；

(6)通过Gateway BP反应将目标基因插入载体pPr-ccdB的attP2位点和attP1位点之间得到的重组质粒；

所述载体pL-ccdB自上游至下游依次包括：loxP位点、attL1位点、ccdB基因、pUC\origin、attL2位点、sacB基因、抗性筛选基因和oriT位点；所述载体pLC-ccdB自上游至下游依次包括：loxP位点、抗性筛选基因、attL1位点、ccdB基因、pUC\origin、attL2位点、sacB基因、oriR6kγ和oriT位点；所述载体pR-ccdB自上游至下游依次包括：loxP位点、attR2位点、ccdB基因、pUC\origin、attR1位点、sacB基因、抗性筛选基因、oriR6kγ和oriT位点；所述载体pRG-ccdB自上游至下游依次包括：loxP位点、抗性筛选基因、attR2位点、ccdB基因、pUC\origin、attR1位点、sacB基因、oriR6kγ和oriT位点；所述载体pP-ccdB自上游至下游依次包括：loxP位点、attP1位点、pUC\origin、ccdB基因、attP2位点、sacB基因、抗性筛选基因、oriR6kγ和oriT位点；所述载体pPr-ccdB自上游至下游依次包括：loxP位点、attP2位点、pUC\origin、ccdB基因、attP1位点、sacB基因、抗性筛选基因、oriR6kγ和oriT位点；

所述类型I受体载体为载体TAC-RTL、载体TAC-LTR、载体BIBAC-RTL或载体BIBAC-LTR；所述载体TAC-RTL自上游至下游依次包括：RB、attR2位点、loxP位点、LB、抗性筛选基因、pRiA4\ori和P1\ori；所述载体TAC-LTR自上游至下游依次包括：RB、loxP位点、attR2位点、LB、抗性筛选基因、pRiA4\ori和P1\ori；所述载体BIBAC-RTL自上游至下游依次包括：RB、attR2位点、loxP位点、LB、抗性筛选基因、F\ori、pRiA4\ori和oriT位点；所述载体BIBAC-LTR自上游至下游依次包括：RB、loxP位点、attR2位点、LB、抗性筛选基因、F\ori、pRiA4\ori和oriT位点。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述RB为T-DNA右边界；所述LB为T-DNA左边界；所述抗性筛选基因为卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因或硫酸庆大霉素抗性基因。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述loxP位点的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第1至34位所示；所述attL1位点的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第423至522位所示；所述ccdB基因的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第673至978位所示；所述pUC\origin的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第1102至1775位所示；所述attL2位点的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第2165至2264位所示；所述sacB基因的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第2401至3822位所示；所述氯霉素抗性基因的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第4403至5110位所示；所述oriR6kγ的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第5169至5522位所示；所述oriT位点的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第5530至5851位所示；所述硫酸庆大霉素抗性基因的核苷酸序列如序列表的序列4自5’末端第290至823位所示；所述attR2位点的核苷酸序列如序列表的序列3自5’末端第430至554位所示；所述attR1位点的核苷酸序列如序列表的序列3自5’末端第2210至2334位所示；所述attP1位点的核苷酸序列如序列表的序列5自5’末端第424至655位所示；所述attP2位点的核苷酸序列如序列表的序列5自5’末端第2305至2536位所示。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述载体pL-ccdB的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述载体pLC-ccdB的核苷酸序列如序列表的序列2所示；所述载体pR-ccdB的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述载体pRG-ccdB的核苷酸序列如序列表的序列4所示；所述载体pP-ccdB的核苷酸序列如序列表的序列5所示；所述载体pPr-ccdB的核苷酸序列如序列表的序列6所示。

7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述出发菌B为大肠杆菌BW20767或具有类似功能特征的其它大肠杆菌菌株；所述出发菌A为将pAH57-cre转化大肠杆菌DH10B得到的重组菌或具有类似功能特征的其它大肠杆菌菌株；所述pAH57-cre的制备方法如下：以序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA为引物，以大肠杆菌SW106的的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物用限制性内切酶BstXI和NheI酶切，得到酶切产物；用限制性内切酶BstXI和NheI酶切pAH57，得到载体骨架；将酶切产物和载体骨架连接，得到重组质粒pAH57-cre。

8.权利要求1至7中任一所述方法在多基因表达中的应用。

9.权利要求1至7中任一所述方法在培育转基因动物、转基因植物或转基因微生物中的应用。

10.应用权利要求1至7中任一所述方法培育得到的转基因植物、转基因动物或转基因微生物。

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