CN102358906B

CN102358906B - 一种构建重组质粒的方法

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Publication number: CN102358906B
Application number: CN201110330257.XA
Authority: CN
Inventors: 查向东
Original assignee: GUANGDONG XIPU BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: GUANGDONG XIPU BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2011-10-26
Filing date: 2011-10-26
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2031-10-26
Also published as: CN102358906A

Abstract

本发明公开一种构建重组质粒的方法，旨在公开一种利用平末端随机连接和限制性内切酶切割，有效、快捷的拼接DNA片段构建重组质粒的简便方法；其技术要点依次包括下述步骤：1)采用聚合酶链式反应对至少两个DNA基因进行扩增，得到对应的末端带限制性内切酶识别和切割位点的PCR产物；2)采用连接酶对步骤1)所得的PCR产物进行平末端连接；3)将步骤2)所得的连接产物双酶切，检测，回收获取目的片段；4)将目的片段与双酶切后的载体质粒连接，获得重组质粒；属于基因工程领域。

Description

一种构建重组质粒的方法

技术领域

本发明涉及一种构建重组质粒的方法，具体的说是，将目标DNA片段用平末端随机连接，随后用限制性内切酶切割，回收特定片段，与载体连接构成重组质粒；属于基因工程领域。

背景技术

基因工程中最基本的技术之一是构建重组质粒，需要目的基因整合到载体质粒。而出于提高表达效率、获得分泌表达、可溶性表达、方便分离纯化等种种原因，在整合到载体质粒之前，常常需要将目的基因与特定融合头(fusion partner)或信号肽连接、或将小片段DNA拼接成完整的目的基因、或不同外源基因串联等，都涉及到DNA片段的拼接技术。

实验室连接不同DNA片段的常用方法当然是DNA连接酶催化连接。DNA酶促连接有粘性末端连接和平末端连接两种。大肠杆菌DAN连接酶催化粘性末端的效率较高，而T4 DNA连接酶对于平头末端和粘性末端都能高效连接，所以在实验室得到更多的使用。平末端连接产生的主要问题，其一是连接的非定向性，即DNA片段以不同的方向连接，仅从连接形成的片段大小无法区分方向；其二是底物的浓度难以把握，浓度过低影响连接效率，浓度稍高则极易形成自连和多拷贝重复连接。若使用粘性末端连接，则要求两个DNA片段必须具有互补的粘性末端，但大多数情况下在有关DNA片段之间不存在或者不允许引入限制性酶切位点。

如果两个待拼接的DNA片段较短，也可以采取从头合成的方式直接得到；但如果两个待拼接的DNA片段较长时，目前常采用重叠PCR的方法来获取目的融合片段，例如当需要序列已知、却无现成模板的较长的目的基因，通常采用此法。该方法的缺点在于需要设计合成多个引物和较长的重叠区序列，然后还要进行多次PCR，有时因为退火温度的差异给实验带来不便，或者重叠区的前后两段乃至重叠区自身有可能形成一定的空间结构，增加了出现错误的几率，且较耗费时间。

特别是在实际情况下，实验室常面临的一个重要问题是：两个待拼接DNA片段都有现成的双链模板，如何利用这一优势高效率地把他们拼接起来？例如欲将某一目的基因分别与不同的信号肽编码序列拼接以比较分泌效果，将某一目的基因分别与不同融合头基因拼接以比较表达产量，等等。对此问题上述方法皆有缺陷，且尚未见报道其它有效的解决途径。

发明内容

针对上述问题，本发明公开一种利用平末端随机连接和限制性内切酶切割，有效、快捷的拼接DNA片段构建重组质粒的的简便方法。

本发明的技术方案是这样的：一种构建重组质粒的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：1)采用聚合酶链式反应对至少两个DNA基因进行扩增，得到对应的末端带限制性内切酶识别和切割位点的PCR产物；2)采用连接酶对步骤1)所得的PCR产物进行平末端连接；3)将步骤2)所得的连接产物双酶切，检测，回收获取目的片段；4)将步骤3)所得的目的片段与双酶切后的载体质粒连接，获得重组质粒。

上述的一种构建重组质粒的方法，所述的聚合酶链式反应采用的酶为Pfu DNA聚合酶或其它扩增结果为平末端的高温DNA聚合酶。

上述的一种构建重组质粒的方法，所述的检测是采用0.5～1.5％琼脂糖电泳检测。

上述的一种构建重组质粒的方法，步骤2)所述的连接酶为T4 DNA连接酶；

进一步的，上述的一种构建重组质粒的方法，对步骤2)获得连接产物可进一步用PfuDNA聚合酶进行PCR强化扩增。

上述的一种构建重组质粒的方法，步骤3)所述的双酶为Nco I和EcoR I或其它限制性内切酶。

上述的一种构建重组质粒的方法，步骤3)所述的载体质粒线性化的载体质粒。

进一步的，上述的一种构建重组质粒的方法，步骤2)所述的目的片段是用琼脂糖凝胶电泳分离水解产物，回收大小相同的目标片段。

进一步的，上述的一种构建重组质粒的方法，步骤3)是将所得的目的片段与双酶切后的线性化的载体质粒连接，获得重组质粒。

本发明所依据的原理：

本方法在两个待拼接DNA片段的末端各添加一个酶切位点，将平末端连接与酶切、电泳分离选择结合。尽管连接的方向和拷贝数存在一定随机性(参见附图1)，但在正常的酶切反应情况下，只有正确连接的产物出现在目的条带位置，其余大都是较小的片段。当然，当DNA片段I和II长度相差不大时，附图1第③种连接产物可能在电泳时不能很好地与目标产物分离，但由于其被酶切后两端有相同的粘性末端，所以不能有效地与带有两个不同粘性末端的线型质粒连接，故对最终的克隆结果不会产生干扰。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的方法是拼接DNA片段，并将融合片段克隆至载体质粒；该方法在待拼接片段之间无须引入粘性末端，采取平末端连接，对于连接反应的底物浓度无苛刻要求，通过酶切、电泳后能直接获得正确连接数目和连接方向的被拼接片段，直接与线性化的载体质粒连接得到重组质粒；相对于重叠区扩增法，所合成的引物数目和长度减少，降低了成本，缩短了操作周期，提高重组效率。

附图说明

图1是DNA片段平末端随机连接各种可能结果示意图；

图2是本发明具体实施例1平末端连接产物琼脂糖凝胶电泳图；

图3是本发明具体实施例1双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；

图4是本发明具体实施例1对连接产物的强化扩增结果图；

图5是本发明具体实施例2的测序图；

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明做进一步的详细说明，但不够成对本发明的任何限制。

试验方法：

1、基因扩增：根据密码子偏好合成抗菌肽基因，下游引物添加酶切位点及保护碱基；融合蛋白上游引物添加酶切位点及保护碱基，使用PCR技术进行扩增两个片段。

2、平末端连接，T4 DNA连接酶连接两个PCR产物。

3、目的片度获取：双酶切连接产物，胶回收目的片段预期大小的琼脂糖电泳条带。

4、克隆与转化：目的片段与双酶切后的质粒连接，转化大肠杆菌感受态细胞。

5、诱导表达：筛选正确的克隆，振荡培养基因工程菌至对数生长期，然后加入诱导剂诱导。

6、分离纯化：取诱导上清液酸水解，用阳离子交换树脂吸附，洗脱得到阳离子抗菌肽。

实施例1

以保存的带有肽X编码序列的质粒为模板，上游引物加入Nco I酶切位点及保护碱基。引物如下：XF：5’-CCCATGGATGGCAGAACAAAGC-3’；XR：5’-AAGGGTTTCCGAAGGCTTGGC-3’，此引物的5’端磷酸化。反应条件：95℃ 5min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，2.5U生工公司生产的Pfu DNA Polymerase(20μl反应体系)，25个循环，72℃ 10min。PCR产物经1％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收，得到纯化的DNA片段I。

其中SEQ ID：NO 1(肽X编码序列)：

CACCATCATCATCATCATATGGCAGAACAAAGCGACAAGGATGTGAAGTACTACACTCTGGAGGAGATTCAGAAGCACAAAGACAGCAAGAGCACCTGGGTGATCCTACATCATAAGGTGTACGATCTGACCAAGTTTCTCGAAGAGCATCCTGGTGGGGAAGAAGTCCTGGGCGAGCAAGCTGGGGGTGATGCTACTGAGAACTTTGAGGACGTCGGGCACTCTACGGATGCACGAGAACTGTCCAAAACATACATCATCGGGGAGCTCCATCCAGATGACAGATCAAAGATAGCC

以含抗菌肽G13编码序列的重组质粒pThioHisA-G13为模板；上游引物加入DP氨基酸序列，下游引物加入终止密码子和EcoR I酶切位点及保护碱基。引物如下：G13F：5’-GATCCGCAGCGTTCTG-3’，G13R：5’-GGAATTCTTACGGATC-3’。反应条件：95℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，72℃ 10min，Pfu DNA Polymerase催化25个循环。反应在MJResearch公司的PTC-200型PCR热循环仪进行。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测，试剂盒回收得到纯化的DNA片段II。

其中，SEQ ID：NO 2(抗菌肽G13编码序列)：

GATCCGCAGCGTTCTGTGTCTAACGCAGCAACTCGTGTGTGCCGTACTGGTCGTTCTCGTTGGTAA

将DNA片段I和DNA片段II用T4 DNA连接酶进行平末端连接，平末端连接产物琼脂糖凝胶电泳图如附图2所示，其中图中1、2泳道：随机连接产物，两次重复结果基本相同。M：分子量标准。连接条件：两片段各5μL，10×ligation buffer 2μL，50％PEG4000 solution 2μL，T₄ DNA Ligase 1μL，ddH₂O 5μL。22℃连接1h后，65℃ 10min失活T4DNA连接酶。1％琼脂糖电泳检测，切胶回收目的片段。

将以上连接产物用Nco I和EcoR I双酶切，双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图为图3，其中，左：DNA分子量标准；右：连接产物经Nco I和EcoR I双酶切。反应条件如下：PCR产物10μL，10×buffer Tango 4μL，Nco I和EcoR I各1.5μL，ddH₂O 13μL。37℃孵育4h，65℃热失活20min。酶切产物经由试剂盒纯化后连接载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，涂LB(Amp+)平板，采用Pfu DNA聚合酶进行PCR强化扩增，挑单克隆菌落PCR验证，测序，如图4所示，同时用终浓度1mmol的IPTG诱导表达蛋白。

实施例2

(1)根据多肽G13序列设计引物，正向引物1：5′-CATgCCATggATCAgCgTTCTgTg-3′

添加了Nco I酶切位点和保护碱基；反向引物1：5′-CCAAC gAgAACgACCAgT-3′；根据多肽C序列设计引物：正向引物2：5′-TggCAgAACAAAgC-3′；反向引物2：5′-ggAATTCTAAAAgggTTTCC，添加了EcoR I酶切位点和保护碱基。以含有目标片段的质粒为模板，使用Pfu酶，分别通过PCR获得G13片段和C片段。经1.5％琼脂糖电泳检测后胶回收纯化。

(2)以回收的G13片段和C片段为底物，进行连接(G13和C片段比例为1∶1)：20微升体系如下：

22℃孵育1h，65℃ 10min热失活连接酶。

(3)以连接产物为模板，使用正向引物1和反向引物2，在Pfu酶催化下通过PCR大量扩增已连接的G13-C片段。

(4Nco I、EcoR I双酶切G13-C片段，经1.5％琼脂糖电泳检测后胶回收纯化。

(5)Nco I、EcoR I双酶切pET-22b(+)质粒，经1％琼脂糖电泳检测后胶回收纯化。

(6)使用T4DNA连接酶连接步骤4、5得到的产物，22℃孵育4h，65℃热失活10min。

(7)热激转化BL21(DE3)感受态细胞，氨苄青霉素筛选，转化子经菌液PCR检测后送上海生工测序，如图5所示。

Claims

1.一种构建重组质粒的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：

1)采用聚合酶链式反应对两个DNA基因进行扩增，得到对应的末端带限制性内切双酶Nco I和EcoR I识别和切割位点的PCR产物；

2)采用T4DNA连接酶对步骤1)所得的PCR产物进行平末端连接，进一步用Pfu DNA聚合酶进行PCR强化扩增；

3)将步骤2)所得的连接产物用Nco I和EcoR I双酶切，检测，回收获取目的片段；

4)将步骤3)所得的目的片段与双酶Nco I和EcoR I切后的载体质粒连接，获得重组质粒。

2.根据权利要求1所述的一种构建重组质粒的方法，其特征在于，所述的聚合酶链式反应采用的酶为Pfu DNA聚合酶或其它扩增结果为平末端的高温DNA聚合酶。

3.根据权利要求1所述的一种构建重组质粒的方法，其特征在于，所述的检测是采用0.5～1.5％琼脂糖电泳检测。

4.根据权利要求1所述的一种构建重组质粒的方法，其特征在于，步骤4)所述的载体质粒是线性化的载体质粒。

5.根据权利要求1所述的一种构建重组质粒的方法，其特征在于，步骤3)所述的目的片段是用琼脂糖凝胶电泳分离水解产物，回收大小相同的目标片段。

6.根据权利要求1所述的一种构建重组质粒的方法，其特征在于，步骤4)是将所得的目的片段与双酶切后的线性化的载体质粒连接，获得重组质粒。