CN104087563A - 提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法 - Google Patents

提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104087563A
CN104087563A CN201410244963.6A CN201410244963A CN104087563A CN 104087563 A CN104087563 A CN 104087563A CN 201410244963 A CN201410244963 A CN 201410244963A CN 104087563 A CN104087563 A CN 104087563A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plasmid
primer
product
mtg
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410244963.6A
Other languages
English (en)
Inventor
李荣杰
徐斌
常珠侠
许�鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Original Assignee
Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd filed Critical Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Priority to CN201410244963.6A priority Critical patent/CN104087563A/zh
Publication of CN104087563A publication Critical patent/CN104087563A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12Y203/02013—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其是将pET-MTG与pA-GESP两种质粒共转化大肠杆菌DE3，诱导后的上清中，微生物转谷氨酰胺酶呈可溶性表达。本发明利用pET系统高效表达MTG，并建立了分子伴侣共表达体系，提高MTG表达产物的可溶性，对其表达产物进行SDS-PAGE分析，结果表明，本发明可以提高MTG在大肠杆菌中的可溶性表达，且表达效果明显，为今后工业化生产打下了良好的基础。

Description

提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法。
背景技术
微生物转谷氨酰胺酶(MTG)是一种催化多肽链中谷氨酰胺的γ-酰基转移至另一底物中氨基，形成γ-谷氨酰化合物的转移酶。目前，MTG已广泛应用于食品工业。转谷氨酰胺酶广泛存在于动物许多组织中，但由于含量低、分离困难、热稳定性差、对钙离子的依赖性，使之工业化生产十分困难。目前，MTG已广泛应用于食品工业。转谷氨酰胺酶广泛存在于动物许多组织中，但由于含量低、分离困难、热稳定性差、对钙离子的依赖性，使它的工业化生产十分困难。
大肠杆菌由于生长速度快，培养简单，价格低廉，遗传背景清楚等优点，其表达系统得到广泛应用。但是，该系统也存在不足，如表达的外源蛋白质常以不溶性无功能的包涵体形式存在。人们利用多种方法改善外源蛋白在大肠杆菌中的折叠，其中，共表达分子伴侣由于对蛋白的折叠较为有效，纯化的外源蛋白不需要除去融合标签等优点而备受关注。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法。
为了实现本发明目的，本发明的一种提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其是将pET-MTG与pA-GESP两种质粒共转化大肠杆菌DE3(E.coli Rosetta)，诱导后的上清中，微生物转谷氨酰胺酶呈可溶性表达。通过与分子伴侣共表达，从而提高MTG在大肠杆菌中的可溶性表达。
前述的方法，诱导所使用的诱导剂为IPTG，IPTG的终浓度为0.4-0.6mmol/L，诱导温度为27-29℃，诱导时间为10-14h。
优选地，诱导所使用的IPTG的终浓度为0.4mmol/L，诱导温度为28℃，诱导时间为12h。
前述的方法，诱导后的上清中含有共表达产物微生物转谷氨酰胺酶以及大肠杆菌分子伴侣GroEL、GroES和GrpE，采用亲和层析法对共表达产物进行分离纯化。
本发明中涉及的微生物转谷氨酰胺酶(MTG)来自于茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)。
本发明中涉及的质粒pET-MTG的构建方法为
以1μg茂原链轮丝菌基因组DNA为PCR反应模板，设计引物1：5′-TAAAAACATATGGACTCCGACGACAGGGTCAC-3′和引物2：5′-TAAAAACTCGAGTTACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3′，进行PCR扩增，回收PCR扩增产物用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，回收酶切片段，与同样用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的pET-22b载体连接(于16℃连接16h)，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切分析验证，并进行DNA测序鉴定，插入序列正确的质粒命名为pET-MTG。
本发明中涉及的质粒pA-GESP的构建方法包括以下步骤：
(1)粘性末端PCR技术扩增含有分子伴侣的人工操纵子
根据扩增人工操纵子(GenBank ID：NC_010473.1)上、下游基因的序列，设计两对引物，引物3：5′-CATGGCAGCTAAAGACGTAAAATTC-3′和引物4：5′-GTTAAGCTTTTGCTTTCGCTACAGT-3′,以及引物5：5′-GCAGCTAAAGACGTAAAATTCGGTA-3′和引物6：5′-TCGAGTTAAGCTTTTGCTTTCGCTA-3′，分别用引物3和4、引物5和6，在两个管中同时进行PCR扩增，加入3μl的质粒大肠杆菌基因组DNA为模板，回收PCR扩增产物，测定A260值，将两个PCR产物等摩尔混匀，于94℃变性5min，37℃保温40min，取16μl反应产物，加入2μl的10×T4连接酶缓冲液，2μl的10U/μl T4多聚核苷酸激酶，37℃保温3h后，回收磷酸化的PCR产物；
(2)质粒pA-GESP的构建
将磷酸化的PCR产物用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，回收酶切片段，与同样用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切的pACYC Duet-1质粒连接(于16℃连接16h)，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切分析验证，即构建得到质粒pA-GESP。
步骤(1)中进行PCR扩增所采用的反应条件为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，共30个循环。
本发明进一步提供一种基因工程菌，其是将上述pET-MTG与pA-GESP两种质粒共转化大肠杆菌DE3获得。
共表达分子伴侣能促进重组蛋白在大肠杆菌的正确折叠。大肠杆菌GroEL是分子伴侣，GroES和GrpE是辅助分子伴侣，它们能够改善某些蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。应选择不同抗生素抗性的载体进行共转化。质粒pET-MTG具有氨苄青霉素抗性，分子伴侣载体pA-GESP具有氯霉素抗性，它们可以进行共转化。将这两种质粒共转化大肠杆菌(Rosetta DE3)，以提高MTG在大肠杆菌中的可溶性表达。
通过SDS-PAGE电泳分析表明，本发明可以提高MTG在大肠杆菌中的可溶性表达，且表达效果明显，为今后工业化生产打下了良好的基础。
附图说明
图1为本发明实施例1中构建的pET-MTG质粒双酶切图；其中，1为DNA分子量标准，2为pET-MTG质粒。
图2为本发明实施例2中构建的质粒pA-GESP双酶切图；其中，1为DNA分子量标准，2为pA-GESP质粒。
图3为本发明实施例4中通过SDS-PAGE电泳分析分子伴侣对MTG蛋白表达的影响；其中，M：蛋白Marker；1：诱导的MTG；2：MTG与分子伴侣共表达；S：细胞上清液；I：细胞沉淀。
图4为本发明实施例4中纯化MTG蛋白的SDS-PAGE电泳分析结果；其中，M：蛋白Marker；1：MTG与分子伴侣共表达；2：纯化的MTG。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1质粒pET-MTG的构建方法
1.1PCR扩增MTG基因
以1μg茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)基因组DNA为PCR反应模板，设计引物1：5′-TAAAAACATATGGACTCCGACGACAGGGTCAC-3′和引物2：5′-TAAAAACTCGAGTTACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3′，进行PCR扩增。PCR反应在50μl总体积中进行，反应条件为：94℃变性5min；94℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
1.2MTG表达质粒的构建
凝胶回收PCR扩增产物用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，回收酶切片段，与同样用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的pET-22b载体连接(于16℃连接16h)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切分析验证，结果如图1所示，并进行DNA测序鉴定，插入序列正确的质粒命名为pET-MTG。
实施例2质粒pA-GESP的构建方法
2.1粘性末端PCR技术扩增含有分子伴侣的人工操纵子
根据扩增人工操纵子(GenBank ID：NC_010473.1)上、下游基因的序列，设计两对引物，引物3：5′-CATGGCAGCTAAAGACGTAAAATTC-3′和引物4：5′-GTTAAGCTTTTGCTTTCGCTACAGT-3′,以及引物5：5′-GCAGCTAAAGACGTAAAATTCGGTA-3′和引物6：5′-TCGAGTTAAGCTTTTGCTTTCGCTA-3′，分别用引物3和4、引物5和6，在两个管中同时进行PCR扩增，加入3μl的质粒大肠杆菌基因组DNA为模板.PCR反应在50μl总体积中进行，反应条件为：94℃变性30s；55℃退火30s，72℃延伸4min，共30个循环。
回收PCR扩增产物，测定A260值，将两个PCR产物等摩尔混匀，于94℃变性5min，37℃保温40min，取16μl反应产物，加入2μl的10×T4连接酶缓冲液，2μl的10U/μl T4多聚核苷酸激酶，37℃保温3h后，回收磷酸化的PCR产物。
2.2pA-GESP表达载体的构建
将磷酸化的PCR产物用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，回收酶切片段，与同样用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切的pACYC Duet-1质粒连接，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切分析验证，结果如图2所示，即构建得到质粒pA-GESP。
实施例3分子伴侣与MTG的共转化
将pET-MTG与pA-GESP两种质粒共转化大肠杆菌(RosettaDE3)，以pET-MTG与pACYC质粒共转化作为对照，共转化的菌液涂含有25μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml氯霉素两种抗生素抗性的平板，37℃培养箱倒置培养12h。挑取单菌落，接种于10ml的LB液体培养基中，培养基中含有25μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml氯霉素两种抗生素，37℃，220r/min振荡培养过夜；以1:100转接到100ml的LB培养基中，当OD600约为0.6时，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，28℃诱导12h，5000×g离心10min收集菌体，加入约1ml的裂解缓冲液(100mmol/L的磷酸钠缓冲液，内含300mmol/L的NaCl和10mmol/L的咪唑，pH8.0)超声破碎，功率为300W，每次3s，间隔9s，共60次，12000×g离心15min，上清液SDS-PAGE分析。沉淀再用8M尿素溶解，4℃放置2h，12000×g离心15min，取上清，用于SDS-PAGE分析。
实施例4MTG蛋白的纯化
上述两种共转化诱导表达的蛋白上清液过NTA柱，由于MTG蛋白带有组氨酸标签，而分子伴侣蛋白不含有组氨酸标签，在此过程中，NTA会吸附带有组氨酸标签的MTG蛋白，分子伴侣蛋白随液体流出。
用2倍柱体积的去离子水洗涤NTA柱，然后加NiSO4溶液至NTA介质结合度达到饱和，用5倍柱体积的NAT-0缓冲液(20mM Tris-HClpH7.9，0.5M NaCl)洗柱。将上述收集破碎菌体离心后得到的上清分别加入到Ni2+-NTA树脂柱中，反复加2-3次后，用5倍柱体积的NAT-1缓冲液(即NAT-0缓冲液含有80mmol/L咪唑)洗涤介质以去除杂蛋白,最后用含有300mmol/L咪唑的上述缓冲液洗脱带有6个组氨酸标签的MTG蛋白，并进行SDS-PAGE分析。(图3和图4)
实施例5MTG的活性测定
采用比色法测定MTG活性。将25μl含酶样品加入到350μl酶反应体系中(200mmol/L，pH6.0Tris-乙酸缓冲液，含30mmol/LCBZ-Gln-Gly，10mmol/L Hydroxylamine和10mmol/L GST)。充分混合后，37℃保温5min。然后加入375μl FeCl3溶液(1mol/L，溶解于5％三氯乙酸中)，混合后离心去除沉淀后，在525nm波长下测定光密度值。对照组为不含MTG的样品缓冲液。一个MTG的酶活力单位定义为：37℃时，1分钟催化底物CBZ-Gln-Gly生成1μmol L-谷氨酰γ-单异羟基肟酸(L-Glutamic acidγ-monohydroxamate)。根据蛋白测定及酶的活性测定，与分子伴侣共转化的MTG的比活为20.8u/mg，对照的MTG比活为0.86u/mg，天然MTG的比活为23u/mg。
由此可见，与分子伴侣共表达，有效提高了MTG在大肠杆菌中的可溶性表达，且纯化的MTG的比活与天然MTG比活很接近。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于，将pET-MTG与pA-GESP两种质粒共转化大肠杆菌DE3，诱导后的上清中，微生物转谷氨酰胺酶呈可溶性表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，诱导所使用的诱导剂为IPTG，IPTG的终浓度为0.4-0.6mmol/L，诱导温度为27-29℃，诱导时间为10-14h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，诱导所使用的IPTG的终浓度为0.4mmol/L，诱导温度为28℃，诱导时间为12h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，诱导后的上清中含有共表达产物微生物转谷氨酰胺酶以及大肠杆菌分子伴侣GroEL、GroES和GrpE，采用亲和层析法对共表达产物进行分离纯化。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物转谷氨酰胺酶来自于茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，质粒pET-MTG的构建方法为：
以1μg茂原链轮丝菌基因组DNA为PCR反应模板，设计引物1：5′-TAAAAACATATGGACTCCGACGACAGGGTCAC-3′和引物2：5′-TAAAAACTCGAGTTACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3′，进行PCR扩增，回收PCR扩增产物用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，回收酶切片段，与同样用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的pET-22b载体连接，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切分析验证，并进行DNA测序鉴定，插入序列正确的质粒命名为pET-MTG。
7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，质粒pA-GESP的构建方法包括以下步骤：
(1)粘性末端PCR技术扩增含有分子伴侣的人工操纵子
根据扩增人工操纵子GenBank ID：NC_010473.1上、下游基因的序列，设计两对引物，引物3：5′-CATGGCAGCTAAAGACGTAAAATTC-3′和引物4：5′-GTTAAGCTTTTGCTTTCGCTACAGT-3′,以及引物5：5′-GCAGCTAAAGACGTAAAATTCGGTA-3′和引物6：5′-TCGAGTTAAGCTTTTGCTTTCGCTA-3′，分别用引物3和4、引物5和6，在两个管中同时进行PCR扩增，加入3μl的质粒大肠杆菌基因组DNA为模板，回收PCR扩增产物，测定A260值，将两个PCR产物等摩尔混匀，于94℃变性5min，37℃保温40min，取16μl反应产物，加入2μl的10×T4连接酶缓冲液，2μl的10U/μl T4多聚核苷酸激酶，37℃保温3h后，回收磷酸化的PCR产物；
(2)质粒pA-GESP的构建
将磷酸化的PCR产物用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，回收酶切片段，与同样用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切的pACYC Duet-1质粒连接，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切分析验证，即构建得到质粒pA-GESP。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中进行PCR扩增所采用的反应条件为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，共30个循环。
9.一种基因工程菌，其是将pET-MTG与pA-GESP两种质粒共转化大肠杆菌DE3获得；
质粒pET-MTG的构建方法为：
以1μg茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)基因组DNA为PCR反应模板，设计引物1：5′-TAAAAACATATGGACTCCGACGACAGGGTCAC-3′和引物2：5′-TAAAAACTCGAGTTACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3′，进行PCR扩增，回收PCR扩增产物用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，回收酶切片段，与同样用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的pET-22b载体连接，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切分析验证，并进行DNA测序鉴定，插入序列正确的质粒命名为pET-MTG；
质粒pA-GESP的构建方法包括以下步骤：
(1)粘性末端PCR技术扩增含有分子伴侣的人工操纵子
根据扩增人工操纵子GenBank ID：NC_010473.1上、下游基因的序列，设计两对引物，引物3：5′-CATGGCAGCTAAAGACGTAAAATTC-3′和引物4：5′-GTTAAGCTTTTGCTTTCGCTACAGT-3′,以及引物5：5′-GCAGCTAAAGACGTAAAATTCGGTA-3′和引物6：5′-TCGAGTTAAGCTTTTGCTTTCGCTA-3′，分别用引物3和4、引物5和6，在两个管中同时进行PCR扩增，加入3μl的质粒大肠杆菌基因组DNA为模板，回收PCR扩增产物，测定A260值，将两个PCR产物等摩尔混匀，于94℃变性5min，37℃保温40min，取16μl反应产物，加入2μl的10×T4连接酶缓冲液，2μl的10U/μl T4多聚核苷酸激酶，37℃保温3h后，回收磷酸化的PCR产物；
(2)质粒pA-GESP的构建
将磷酸化的PCR产物用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，回收酶切片段，与同样用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切的pACYC Duet-1质粒连接，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切分析验证，即构建得到质粒pA-GESP。
10.根据权利要求9所述的基因工程菌，其特征在于，步骤(1)中进行PCR扩增所采用的反应条件为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，共30个循环。
CN201410244963.6A 2014-06-04 2014-06-04 提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法 Pending CN104087563A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410244963.6A CN104087563A (zh) 2014-06-04 2014-06-04 提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410244963.6A CN104087563A (zh) 2014-06-04 2014-06-04 提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104087563A true CN104087563A (zh) 2014-10-08

Family

ID=51635324

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410244963.6A Pending CN104087563A (zh) 2014-06-04 2014-06-04 提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104087563A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108866019A (zh) * 2018-07-18 2018-11-23 青岛农业大学 一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法及其应用
CN110484551A (zh) * 2019-07-29 2019-11-22 因之彩生物科技（武汉）有限公司 金属硫蛋白表达载体及其应用
CN114763552A (zh) * 2021-01-12 2022-07-19 山东大学 一种微生物转谷氨酰胺酶的重组生产方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
任增亮等: "Streptomyces hygroscopicus谷氨酰胺转胺酶酶原基因的鉴定及在大肠杆菌中的表达", 《微生物学报》 *
徐斌等: "茂原链轮丝菌转谷氨酰胺酶基因在大肠杆菌中高效表达", 《生物工程学报》 *
许鹏等: "表达大肠杆菌分子伴侣GroEL、GroES和GrpE载体的构建及其应用", 《激光生物学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108866019A (zh) * 2018-07-18 2018-11-23 青岛农业大学 一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法及其应用
CN110484551A (zh) * 2019-07-29 2019-11-22 因之彩生物科技（武汉）有限公司 金属硫蛋白表达载体及其应用
CN110484551B (zh) * 2019-07-29 2021-04-02 因之彩生物科技（武汉）有限公司 金属硫蛋白表达载体及其应用
CN114763552A (zh) * 2021-01-12 2022-07-19 山东大学 一种微生物转谷氨酰胺酶的重组生产方法
CN114763552B (zh) * 2021-01-12 2024-04-30 山东大学 一种微生物转谷氨酰胺酶的重组生产方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103789292A (zh) 一种赖氨酸脱羧酶、制备方法及其应用
Woitovich Valetti et al. Polyelectrolytes–protein complexes: A viable platform in the downstream processes of industrial enzymes at scaling up level
CN104087563A (zh) 提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法
WO2018107521A1 (zh) T4多聚核苷酸激酶重组酶及其制备方法、表达基因、表达载体以及宿主细胞
Kumar et al. In-vitro refolding and characterization of recombinant laccase (CotA) from Bacillus pumilus MK001 and its potential for phenolics degradation
Gao et al. Three novel Escherichia coli vectors for convenient and efficient molecular biological manipulations
CN106434699A (zh) Sumo与sumo蛋白酶编码基因及其应用
CN104673809A (zh) 一种苹果酸脱氢酶基因及其重组表达载体
Gimple et al. In vitro and in vivo processing of cyanelle tmRNA by RNase P
Akhani et al. Column chromatography free purification of recombinant α-amylase from bacillus licheniformis by tagging with hydrophobic elastin like polypeptide
CN103898083B (zh) 一种新型水解酶超家族酰胺酶Azl13及其制备与应用
CN104694514B (zh) 一种脱卤酶DhmB及其编码基因与应用
WO2014205882A1 (zh) 一种高保真dna聚合酶及其制备和应用
CN107217064B (zh) 超氧化物歧化酶基因及其编码蛋白
Chen et al. Clostridium thermocellum nitrilase expression and surface display on Bacillus subtilis spores
CN109371047A (zh) 一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法
MA High expression level of human epidermal growth factor (hEGF) using a well-designed fusion protein-tagged construct in E. coli.
CN109337887B (zh) 一种Nucyep的编码基因、重组表达载体、重组工程菌及其制备方法和应用
CN104531725B (zh) 一种可被4’磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列及其用于固定蛋白质的方法
CN106978364A (zh) 一种毒素蛋白的纯化方法
CN104328132A (zh) 一种脂肪酶与其编码基因和应用
CN103740684B (zh) 一种定点突变的Lambda噬菌体Int重组蛋白及其制备方法
CN104480081A (zh) Sso7d-Sau重组DNA聚合酶
MacCready et al. The McdAB Carboxysome Positioning System Is Widespread Among β-Cyanobacteria
CN110066855B (zh) Hel112解旋酶在聚合酶链式反应中的应用、组合物及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20141008

RJ01 Rejection of invention patent application after publication