CN110408645B - 一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统及方法 - Google Patents

一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统及方法，属于基因工程技术领域。本发明所述系统通过质粒1转化解脂耶氏酵母能够引入lox位点，而后通过质粒2和质粒3依次转化，能够实现目的基因任意次数无痕整合到解脂耶氏酵母基因组。本发明仅需一个酵母筛选标记即可实现目的基因任意次数的整合，同时，本发明极大地降低了非目的基因的引入，且每次整合后的基因组均是已知可控的，这有利于解脂耶氏酵母表达系统在食品、医药、农产品加工等领域的应用。

Description

一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统及方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统及方法。
背景技术
自上世纪40年代被发现以来，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)由于独特且优良的特性越来越受到研究者的关注，且在上世纪90年代已经被成功开发为一种新的酵母表达系统。解脂耶氏酵母是一种具代表性的非常规酵母，它可利用的碳源广泛、分泌表达能力很强且无致病性，是一种经过认证的安全酵母。解脂耶氏酵母对大多数抗生素具有天然耐受性，仅可使用潮霉素B和腐草霉素等抗生素抗性标记进行转化筛选。然而，使用抗生素筛选时容易产生基因渗漏和回复突变，且抗生素抗性标记基因的引入可能造成一些生物安全性问题。因此，构建解脂耶氏酵母工程菌时，多用营养缺陷型标记进行筛选，其中最常用的是亮氨酸缺陷型Leu2和尿嘧啶缺陷型Ura3。由于营养缺陷型标记种类较少，大多数解脂耶氏酵母工程菌构建时往往受此限制。这些明显限制了解脂耶氏酵母表达系统更深层次的研究和广泛利用。
Cre/loxp位点特异性重组系统源于P1噬菌体，目前已经广泛应用于高等真核生物基因组的定点敲除、置换、插入等操作。loxp位点由一个8bp的非对称间隔区和两个13bp的反向重复序列组成，间隔区序列决定lox位点的方向性，反向重复序列是Cre重组酶的识别和结合区域，lox位点的相对位置和方向决定重组反应的结果。当一个反向重复序列发生突变时，可形成左臂突变型lox位点(LE mutant site，LE)或右臂突变型lox位点(RE mutantsite，RE)，仍可被Cre重组酶识别并发生重组，但两个反向重复序列发生突变形成的双臂突变型lox位点(LE+RE mutant site，LE+RE)则极难继续发生重组反应。
近年来，Cre/loxp系统在解脂耶氏酵母中已有广泛应用。相关研究多集中于基因敲除和筛选标记回收，但实验过程常需要多次整合且效率不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统及方法。利用本发明提供的位点特异性重组系统能够实现解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合，克服整合位点、整合方式、筛选标记等造成的限制。
本发明提供了一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统，所述系统包括质粒1、质粒2和质粒3；
所述质粒1包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段A和两个同向lox位点；两个同向lox位点设在同源片段A两侧，其余元件无顺序要求；两个同向lox位点整合到酵母基因组后发生重组反应，反应后在基因组上生成一个左臂突变型lox位点或一个右臂突变型lox位点；所述同源片段A为解脂耶氏酵母基因组序列，长度不小于1000bp；
所述质粒2包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点和目的基因表达盒；两个反向互补的左或右臂突变lox位点需在目的基因表达盒两侧，且紧靠同源片段B，其余元件无顺序要求；两个反向互补的左或右臂突变lox位点能够与质粒1反应后在基因组上生成的左或右臂突变型lox位点发生重组反应，反应后在基因组生成双臂突变型位点；所述同源片段B位于同源片段A上游或下游序列，长度不小于1000bp；
所述质粒3包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点和目的基因表达盒；两个反向互补的左或右臂突变lox位点需在目的基因表达盒两侧，且紧靠同源片段B，其余元件无顺序要求；两个反向互补的左或右臂突变lox位点能够与质粒2反应后在基因组生成的左或右臂突变型lox位点发生重组反应，反应后在基因组生成双臂突变型位点；同源片段B位于同源片段A上/下游序列，长度不小于1000bp；
所述酵母筛选标记包括营养缺陷型标记和抗生素抗性标记；
所述Cre基因表达盒由诱导启动子-Cre基因-终止子组成；
所述细菌部分基因片段包括大肠杆菌复制起点和抗性基因。
优选的是，所述质粒1中的两个同向lox位点包括四个组合：5’-左臂突变型lox位点和3’-左臂突变型lox位点的组合、5’-左臂突变型lox位点和3’-野生lox位点的组合、5’-右臂突变型lox位点和3’-右臂突变型lox位点的组合以及5’-野生lox位点和3’-右臂突变型lox位点的组合。
优选的是，当所述质粒1中的两个同向lox位点为5’-左臂突变型lox位点和3’-左臂突变型lox位点的组合或5’-左臂突变型lox位点和3’-野生lox位点的组合时，质粒1反应后在基因组上生成一个左臂突变型lox位点，质粒2含两个反向互补的右臂突变lox位点，质粒3含两个反向互补的左臂突变lox位点；当所述质粒1中的两个同向lox位点为5’-右臂突变型lox位点和3’-右臂突变型lox位点的组合或5’-野生lox位点和3’-右臂突变型lox位点的组合时，质粒1反应后在基因组上生成一个右臂突变型lox位点，质粒2含两个反向互补的左臂突变lox位点，质粒3含两个反向互补的右臂突变lox位点。
优选的是，同源片段B位于同源片段A的相对位置影响质粒2和质粒3中同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点、目的基因表达盒的相对位置：
当所述同源片段B位于同源片段A下游序列时，5’到3’的顺序为：lox位点1-目的基因表达盒-lox位点2-同源片段B；
当所述同源片段B位于同源片段A上游序列时，5’到3’的顺序为：同源片段B-lox位点2-目的基因表达盒-lox位点1；
同一质粒中，所述lox位点1和lox位点2反向互补；
质粒2中同源片段B紧邻lox反向互补序列，质粒3中同源片段B紧邻lox位点；
质粒2中的lox位点1与质粒1反应后在基因组上生成的lox位点同向，但突变型相反：一个为左臂突变型，一个为右臂突变型；
质粒3中的lox位点与质粒1反应后在基因组上生成的lox位点方向相反，但突变型相同：同为左臂突变型或同为右臂突变型。
本发明还提供了基于上述技术方案所述系统在解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合的方法，包括以下步骤：
质粒1转化解脂耶氏酵母初始菌而后诱导筛选，得到菌株1；菌株1基因组相比于初始菌，基因组插入一个单臂突变型lox位点和一个同源片段A；
质粒2转化菌株1而后诱导筛选，得到菌株2；菌株2基因组去除了同源片段A，相比于初始菌，基因组插入1个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和1个目的基因表达框；
质粒3转化菌株2而后诱导筛选，得到菌株3；菌株3基因组相比于初始菌，基因组插入2个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和2个目的基因表达框；
质粒2转化菌株3而后诱导筛选，得到菌株4；菌株4基因组相比于初始菌，基因组插入3个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和3个目的基因表达框；
质粒3转化菌株4而后诱导筛选，得到菌株5；菌株5基因组相比于初始菌，基因组插入4个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和4个目的基因表达框；
质粒2转化菌株5而后诱导筛选，得到菌株6；菌株6基因组相比于初始菌，基因组插入5个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和5个目的基因表达框；
质粒3转化菌株6而后诱导筛选，得到菌株7；菌株7基因组相比于初始菌，基因组插入6个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和6个目的基因表达框；
采用质粒2和质粒3进行交替转化：
质粒2转化菌株2N-1而后诱导筛选，得到菌株2N；菌株2N基因组相比于初始菌，基因组插入2N-1个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和2N-1个目的基因表达框；菌株2N中目的基因表达框包括任意数量的正向表达框或反向互补表达框，且正向表达框或反向互补表达框的数量总和为2N-1个；
质粒3转化菌株2N而后诱导筛选，得到菌株2N+1；菌株2N+1基因组相比于初始菌，基因组插入2N个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和2N个目的基因表达框；菌株2N+1中目的基因表达框包括任意数量的正向表达框或反向互补表达框，且正向表达框或反向互补表达框的数量总和为2N个；
N为大于等于1的正整数。
优选的是，所述转化为将质粒经酶切线性化后，采用化学转化法或电转化法转化酵母基因组。
优选的是，所述诱导筛选的过程包括：使用筛选培养基进行连续两次筛选，将筛选得到的阳性菌株进行诱导培养，分离单克隆菌株并转接到相应的筛选培养基和YPD培养基，在筛选培养基上不能生长，但在YPD培养基上能够正常生长的单菌落，为阳性克隆子，对阳性克隆子进行基因组验证。
优选的是，所述筛选培养基为与质粒中酵母筛选标记对应的营养缺陷型筛选培养基或抗生素抗性标记筛选培养基。
优选的是，所述诱导用诱导培养基为与Cre基因表达盒中诱导启动子对应的诱导培养基。
本发明提供了一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统。本发明通过转化质粒1以引入lox位点，而后通过质粒2和质粒3依次转化以实现目的基因任意次数无痕整合到解脂耶氏酵母基因组，与现有技术相比，利用本发明所述系统进行整合的优势在于：
1)本发明仅需一个酵母筛选标记即可实现目的基因任意次数的整合；
2)本发明每次完成目的基因整合时，相比上次整合仅引入一个双臂突变型lox位点和目的基因表达框，极大地降低了非目的基因的引入；
3)本发明转化目的基因时，可人为控制每个目的基因表达框相对于基因组的方向；
4)本发明每次整合后的基因组都是已知的，这有利于解脂耶氏酵母表达系统在食品、医药、农产品加工等领域的应用；
5)本发明仅需三种质粒即可达到任意次数整合目的基因，质粒2和质粒3仅lox位点不同，且均可以由质粒1迅速改造而来；
6)本发明每次转化筛选后所得菌株的lox位点均会发生相应变化，故可通过测序lox位点快速准确地筛选目的菌株。
附图说明
图1为质粒1组分及转化后菌株1基因组变化示意图；
图2为质粒2组分及转化后菌株2基因组变化示意图；
图3为质粒3组分及转化后菌株3基因组变化示意图；
图4为转化后菌株4、菌株5、菌株6和菌株7基因组示意图；
图5为Cre-Y1质粒构建流程图；
图6为菌株FY1基因组PCR验证图；
图7为Cre-Y2质粒构建流程图；
图8为菌株FY2基因组PCR验证图；
图9为Cre-Y3质粒构建流程图；
图10为菌株FY3基因组PCR验证图；
图11为初始菌株至菌株FY2N+1(N为正整数)构建示意图；
图12为菌株FY4基因组PCR验证图；
图13为菌株FY5基因组PCR验证图；
图14为菌株FY6基因组PCR验证图；
图15为菌株FY7基因组PCR验证图。
具体实施方式
本发明提供了一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统，所述系统包括质粒1、质粒2和质粒3；
所述质粒1包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段A和两个同向lox位点；两个同向lox位点设在同源片段A两侧，其余元件无顺序要求；两个同向lox位点整合到酵母基因组后发生重组反应，反应后在基因组上生成一个左臂突变型lox位点或一个右臂突变型lox位点；所述同源片段A为解脂耶氏酵母基因组序列，长度不小于1000bp；
所述质粒2包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点和目的基因表达盒；两个反向互补的左或右臂突变lox位点需在目的基因表达盒两侧，且紧靠同源片段B，其余元件无顺序要求；两个反向互补的左或右臂突变lox位点能够与质粒1反应后在基因组上生成的左或右臂突变型lox位点发生重组反应，反应后在基因组生成双臂突变型位点；所述同源片段B位于同源片段A上游或下游序列，长度不小于1000bp；
所述质粒3包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点和目的基因表达盒；两个反向互补的左或右臂突变lox位点需在目的基因表达盒两侧，且紧靠同源片段B，其余元件无顺序要求；两个反向互补的左或右臂突变lox位点能够与质粒2反应后在基因组生成的左或右臂突变型lox位点发生重组反应，反应后在基因组生成双臂突变型位点；同源片段B位于同源片段A上/下游序列，长度不小于1000bp；
所述酵母筛选标记包括营养缺陷型标记和抗生素抗性标记；
所述Cre基因表达盒由诱导启动子-Cre基因-终止子组成；
所述细菌部分基因片段包括大肠杆菌复制起点和抗性基因。
在本发明中，质粒1中，所述同源片段A为解脂耶氏酵母基因组序列，长度不小于1000bp以保证整合效率，且整合表达载体后不影响酵母正常生长；在本发明中，质粒2中，同源片段B位于同源片段A上/下游序列，长度不小于1000bp以保证整合效率，且表达载体整合后不影响酵母正常生长；在本发明中，质粒3中，同源片段B位于同源片段A上/下游序列，长度不小于1000bp以保证整合效率，且整合表达载体后不影响酵母正常生长。
在本发明中，目的基因表达应不影响酵母正常生长。每次整合时，质粒2和质粒3均可选用不同的目的基因表达盒。
在本发明中，所述质粒1中的两个同向lox位点包括四个组合：5’-左臂突变型lox位点和3’-左臂突变型lox位点的组合、5’-左臂突变型lox位点和3’-野生lox位点的组合、5’-右臂突变型lox位点和3’-右臂突变型lox位点的组合以及5’-野生lox位点和3’-右臂突变型lox位点的组合。同源片段B位于同源片段A下游序列时，质粒2,3中lox位点情况如表1所示：
表1质粒1中两个lox位点与质粒1反应后、质粒2以及质粒3中lox位点的关系(同源片段B位于同源片段A下游序列)
Figure BDA0002166139470000041
Figure BDA0002166139470000051
LE：左臂突变型lox；RE：右臂突变型lox；loxp：野生lox。
当同源片段B位于同源片段A上游序列时，质粒2,3lox位点情况如表2所示：
表2质粒1中两个lox位点与质粒1反应后、质粒2以及质粒3中lox位点的关系(同源片段B位于同源片段A上游序列)
Figure BDA0002166139470000052
LE：左臂突变型lox；RE：右臂突变型lox；loxp：野生lox。
在本发明中，当所述质粒1中的两个同向lox位点为5’-左臂突变型lox位点和3’-左臂突变型lox位点的组合或5’-左臂突变型lox位点和3’-野生lox位点的组合时，质粒1反应后在基因组上生成一个左臂突变型lox位点，质粒2含两个反向互补的右臂突变lox位点，质粒3含两个反向互补的左臂突变lox位点；当所述质粒1中的两个同向lox位点为5’-右臂突变型lox位点和3’-右臂突变型lox位点的组合或5’-野生lox位点和3’-右臂突变型lox位点的组合时，质粒1反应后在基因组上生成一个右臂突变型lox位点，质粒2含两个反向互补的左臂突变lox位点，质粒3含两个反向互补的右臂突变lox位点。
本发明图1作图是按照表1中第1种情况作的(为作图方便，质粒1选择两个左臂突变lox位点，即LE lox，质粒1也可选用其它lox位点组合，但转化后菌株基因组及质粒2、3也应发生相应变化；图中序号及箭头表示引物在基因组中的位置，→表示引物对PCR扩增可得到DNA片段，
Figure BDA0002166139470000053
表示引物存在于基因组其他位置但PCR扩增不可得到DNA片段)，质粒Cre-Y1选用特定的左臂突变型lox71，如果选用第3种情况，质粒2/3不需要改变，Cre-Y2/3不需要改变；如果选用第2、4种情况，质粒2/3需要改变，Cre-Y2/3需要改变。
在本发明中，同源片段B位于同源片段A的相对位置影响质粒2和质粒3中同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点、目的基因表达盒的相对位置：
当所述同源片段B位于同源片段A下游序列时，5’到3’的顺序为：lox位点1-目的基因表达盒-lox位点2-同源片段B；
当所述同源片段B位于同源片段A上游序列时，5’到3’的顺序为：同源片段B-lox位点2-目的基因表达盒-lox位点1；
同一质粒中，所述lox位点1和lox位点2反向互补；
质粒2中同源片段B紧邻lox反向互补序列，质粒3中同源片段B紧邻lox位点；
质粒2中的lox位点1与质粒1反应后在基因组上生成的lox位点同向，但突变型相反：一个为左臂突变型，一个为右臂突变型；
质粒3中的lox位点与质粒1反应后在基因组上生成的lox位点方向相反，但突变型相同：同为左臂突变型或同为右臂突变型。
具体的，在本发明具体实施例中，当同源片段B位于同源片段A下游序列时，质粒2为lox66-目的基因表达盒-lox66反向互补-同源片段Leu2；质粒3为lox71反向互补-目的基因表达盒-lox71-同源片段Leu2；
当同源片段B位于同源片段A上游序列时，相对应的质粒2’应该为同源片段Leu2-lox66反向互补-目的基因表达盒-lox66；相对应的质粒3’应该为同源片段Leu2-lox71-目的基因表达盒-lox71反向互补。
本发明还提供了基于上述技术方案所述系统在解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合的方法，包括以下步骤：
质粒1转化解脂耶氏酵母初始菌而后诱导筛选，得到菌株1；菌株1基因组相比于初始菌，基因组插入一个单臂突变型lox位点和一个同源片段A；
质粒2转化菌株1而后诱导筛选，得到菌株2；菌株2基因组去除了同源片段A，相比于初始菌，基因组插入1个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和1个目的基因表达框；
质粒3转化菌株2而后诱导筛选，得到菌株3；菌株3基因组相比于初始菌，基因组插入2个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和2个目的基因表达框；
质粒2转化菌株3而后诱导筛选，得到菌株4；菌株4基因组相比于初始菌，基因组插入3个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和3个目的基因表达框；
质粒3转化菌株4而后诱导筛选，得到菌株5；菌株5基因组相比于初始菌，基因组插入4个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和4个目的基因表达框；
质粒2转化菌株5而后诱导筛选，得到菌株6；菌株6基因组相比于初始菌，基因组插入5个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和5个目的基因表达框；
质粒3转化菌株6而后诱导筛选，得到菌株7；菌株7基因组相比于初始菌，基因组插入6个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和6个目的基因表达框；
采用质粒2和质粒3进行交替转化：
质粒2转化菌株2N-1而后诱导筛选，得到菌株2N；菌株2N基因组相比于初始菌，基因组插入2N-1个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和2N-1个目的基因表达框；菌株2N中目的基因表达框包括任意数量的正向表达框或反向互补表达框，且正向表达框或反向互补表达框的数量总和为2N-1个；
质粒3转化菌株2N而后诱导筛选，得到菌株2N+1；菌株2N+1基因组相比于初始菌，基因组插入2N个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和2N个目的基因表达框；菌株2N+1中目的基因表达框包括任意数量的正向表达框或反向互补表达框，且正向表达框或反向互补表达框的数量总和为2N个；
N为大于等于1的正整数(N＝1，2，3，…)。
利用本发明所述方法，最终得到的菌株2N或2N+1(N＝1，2，3，…)基因组带有2N-1或2N个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点和2N-1或2N个目的基因表达框；其中目的基因表达框可包含任意数量的正向表达框或反向互补表达框，两者总数为2N-1或2N。
在本发明中，所述转化为将质粒经酶切线性化后，采用化学转化法或电转化法转化酵母基因组。在本发明中，所述化学转化法优选包括醋酸锂转化法。
在本发明中，所述诱导筛选的过程包括：使用筛选培养基进行连续两次筛选，将筛选得到的阳性菌株进行诱导，分离单克隆菌株并转接到相应的筛选培养基和YPD培养基，在筛选培养基上不能生长，但在YPD培养基上能够正常生长的单菌落，为阳性克隆子，对阳性克隆子进行基因组验证。
在本发明中，所述筛选培养基为与质粒中酵母筛选标记对应的营养缺陷型筛选培养基或抗生素抗性标记筛选培养基。在本发明中，所述筛选培养基优选还包括碳源，氮源，生长因子，水，氨基酸或抗生素等。本发明连续两次筛选能够更好地保证阳性率。本发明所述诱导用诱导培养基一般由筛选培养基衍生，并根据Cre基因表达盒中诱导启动子的要求改变相应成分，诱导培养一定时间使Cre/loxp系统发生作用。本发明对具体诱导时间没有具体限定，不同筛选标记或菌种类型可能导致生长速率及诱导时间有所不同。在本发明中，所述筛选培养基包括液体培养基或固体培养基，液体培养基和固体培养基优选交替使用以便节约时间。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统及方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1.质粒1的构建转化及整合后菌株的诱导筛选
构建质粒1。质粒1包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段A、两个同向lox位点。其中，酵母筛选标记可选用营养缺陷型标记或抗生素抗性标记；Cre基因表达盒由诱导型启动子-Cre基因-终止子组成；细菌部分基因片段包括大肠杆菌复制起点和抗性基因；同源片段A为解脂耶氏酵母基因组序列，长度不小于1000bp以保证整合效率，且表达载体整合后不影响酵母正常生长；两个同向lox位点整合到酵母基因组后可发生重组反应，且反应后在基因组上生成一个左臂突变型lox位点或右臂突变型lox位点；两个同向lox位点需在同源片段A两侧，其余元件无顺序要求。
质粒1转化酵母基因组及诱导筛选。质粒1在同源片段A由限制酶酶切线性化，经醋酸锂转化法转化酵母基因组，而后经由液体筛选培养基连续筛选两次以保证阳性率，再转接适当体积到液体诱导培养基诱导培养一定时间使Cre/loxp系统发生作用，最后平板划线分离单克隆菌落。不同筛选标记或菌种类型可能导致生长速率及诱导时间有所不同。
阳性克隆子筛选及验证。将上述平板划线分离得到的单克隆转接到营养缺陷型/抗性平板和YPD平板，在营养缺陷型/抗性平板上不能生长但在YPD平板上正常生长的单菌落即为阳性克隆子。挑选阳性克隆子抽取基因组进行PCR验证，并选取符合预期目标的PCR验证结果测序，以进一步确定lox位点及基因组的正确性，得到的正确菌株命名为菌株1。相比于初始菌，菌株1基因组插入一个单臂突变型lox位点以供后续质粒转化，而多余的同源片段A则可在后续转化中去除。
2.质粒2的构建转化及整合后菌株的诱导筛选
构建质粒2。质粒2包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点、目的基因表达盒。其中，酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段与质粒1相同或类似；同源片段B位于同源片段A上/下游序列(同源片段B位与同源片段A的相对位置影响质粒2中同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点、目的基因表达盒的相对位置)，长度不小于1000bp以保证整合效率，且表达载体整合后不影响酵母正常生长；两个反向互补的左或右臂突变lox位点由质粒1中的lox位点决定，可与质粒1转化后在基因组遗留的左或右臂突变型lox位点发生重组反应并生成双臂突变型位点；目的基因表达应不影响酵母正常生长；两个反向互补的左或右臂突变lox位点需在目的基因表达盒两侧，且紧靠同源片段B，其余元件无顺序要求。
质粒2转化酵母基因组及诱导筛选。质粒2在同源片段B由限制酶酶切线性化，而后转化菌株1，液体筛选操作同质粒1。目的菌株中，诱导筛选时lox位点第一次相互作用有三种可能情况(如图2所示)：a，菌株1遗留的单臂突变lox位点与质粒2携带的同向单臂突变lox位点相互作用生成一个双臂突变型位点，同时去除基因组冗余部分，得到目的基因表达框正向的目的菌株；b，菌株1遗留的单臂突变lox位点与质粒2携带的异向单臂突变lox位点相互作用生成一个双臂突变型位点和一个野生型lox位点，野生型lox位点再与质粒2携带的另一个单臂突变lox位点相互作用生成一个单臂突变型位点，同时去除基因组冗余部分，得到目的基因表达框序列反向互补的目的菌株；c，质粒2携带的两个lox位点相互作用，此时基因表达框序列反向互补，但无其他变化，lox位点之间仍可相互作用，故基因组不稳定，仍会发生上述a或b情况。通过设计不同的PCR引物，可以得到目的基因表达框正向或反向互补的菌株，筛选验证得到的正确菌株命名为菌株2。菌株2基因组去除了冗余的同源片段A，同时带有一个很难继续作用的双臂突变型lox位点、一个可以继续作用的单臂突变型lox位点和一个目的基因表达框。
此外，当目的基因表达产物可引起表观变化时，可用相应筛选平板替代YPD平板进行筛选。
3.质粒3的构建转化及整合后菌株的诱导筛选
构建质粒3。质粒3包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点、目的基因表达盒。其中，酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段与质粒1相同或类似；同源片段B位于同源片段A上/下游序列(同源片段B位与同源片段A的相对位置影响质粒2中同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点、目的基因表达盒的相对位置)，长度不小于1000bp以保证整合效率，且表达载体整合后不影响酵母正常生长；两个反向互补的左或右臂突变lox位点由质粒2中的lox位点决定，可与质粒2转化后在基因组遗留的左或右臂突变型lox位点发生重组反应并生成双臂突变型位点；目的基因表达应不影响酵母正常生长，目的基因的选择不受质粒2影响，即质粒3可选用与质粒2相同的目的基因，也可选用与质粒2不同的目的基因；两个反向互补的左或右臂突变lox位点需在目的基因表达盒两侧，且紧靠同源片段B，其余元件无顺序要求。
质粒3转化酵母基因组及诱导筛选。质粒3在同源片段B由限制酶酶切线性化，而后转化菌株2，筛选操作同质粒2。目的菌株其中，诱导筛选时lox位点相互作用情况类似于质粒2，通过设计不同的PCR引物，可以得到目的基因表达框正向或反向互补的菌株，筛选验证得到的正确菌株命名为菌株3。菌株3基因组带有两个很难继续作用的双臂突变型lox位点、一个可以继续作用的单臂突变型lox位点和两个目的基因表达框。
4.质粒2可继续转化菌株3得到菌株4；质粒3可继续转化菌株4得到菌株5；质粒2可继续转化菌株5得到菌株6；质粒3可继续转化菌株6得到菌株7(转化后菌株4、菌株5、菌株6和菌株7基因组示意图如图4所示)。重复此操作即可实现目的基因任意次数整合解脂耶氏酵母基因组。
在下述实施例中，所述质粒1、质粒2、质粒3中酵母筛选标记为营养缺陷型Ura3(GenBank:AJ306421.1)；所述质粒1、质粒2、质粒3中启动子为油酸诱导型启动子pPox2(GenBank:AJ001300.1)，终止子为lip2t(GenBank:AJ012632.1)，Cre基因表达盒为Pox2-Cre基因-lip2t；所述质粒1中同源片段A为紧靠Leu2基因(GenBank:AF260230.1)上游的1000bp，质粒2和质粒3中同源片段B为Leu2基因；所述质粒1两个lox位点依次为lox71和lox71,所述质粒2两个lox位点依次为lox66和lox66反向互补序列，所述质粒3两个lox位点依次为lox71反向互补序列和lox71；质粒2和质粒3中目的基因表达盒相同；选取目的基因表达盒正向的菌株进行下一步操作；目的基因表达盒为hp12d-rml-xpr2t，hp12d启动子，xpr2t终止子均为商业化质粒元件，rml为米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase，RML)基因，Genbank:A02536.1。
实施例2
Cre-Y1质粒构建整合及FY1菌株的诱导筛选
1)本发明所用感受态细胞大肠杆菌Top10-F’、大肠杆菌DH5α等购自上海唯地生物技术有限公司；质粒pINA1296、解脂耶氏酵母野生型W29、解脂耶氏酵母Po1f由本实验室保存；限制性内切酶、连接酶试剂盒购于Takara公司；DNA聚合酶、重组连接酶试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司；DNA测序和引物合成由武汉擎科生物技术有限公司、武汉天一辉远生物科技有限公司等完成。Cre-Y1质粒构建构建流程见图5，本发明PCR所用引物名称和序列如下：
Figure BDA0002166139470000091
Figure BDA0002166139470000101
2)以W29基因组为模板，使用引物对Pox2-F 1/Pox2-R1扩增启动子Pox2；以T-Cre质粒为模板，使用引物对Cre-F 1/Cre-R1扩增Cre基因编码区；以W29基因组为模板，使用引物对lip2t-F 1/lip2t-R1扩增终止子lip2t，并增加lox71位点；以W29基因组为模板，使用引物对Upleu-F 1/Upleu-R1扩增Leu2基因上游1000bp部分Upleu基因序列并增加lox71位点。利用重叠延伸PCR技术依次连接以上四组PCR产物，最终所得PCR产物以ApaI/NdeI双酶切并纯化回收。
3)hp12d-rml质粒以ApaI/NdeI双酶切并纯化回收Amp-ori部分，并与上述酶切片段组成酶连体系，转化大肠杆菌，所得克隆子以引物对Pox2-F1/lip2t-R1和Upleu-F1/Upleu-R1菌落PCR筛选，取阳性克隆子抽质粒测序，可得中间质粒1296-Cre。
4)以W29基因组为模板，使用引物对Ura-F1/Ura-R1扩增Ura3基因，将中间质粒1296-Cre以NdeI单酶切并纯化回收，利用重组连接酶连接两个片段，转化大肠杆菌，所得克隆子以引物对Ura-F1/Ura-R1菌落PCR筛选，取阳性克隆子抽质粒测序，可得质粒Cre-Y1。
5)质粒Cre-Y1由SalI线性化，经醋酸锂转化法转化解脂耶氏酵母Po1f,，而后经由5mL MD(补加亮氨酸)液体培养基连续筛选两次以保证阳性率，再转接100μL到5mL补加亮氨酸的MO液体培养基(油酸20mL/L,无氨基酵母13.4g/L，生物素0.4mg/L)诱导培养12h，最后以YPD平板划线分离单克隆菌落。将上述得到的单克隆转接到MD(补加亮氨酸)平板和YPD平板，在MD(补加亮氨酸)平板不能生长但在YPD平板上正常生长的克隆子即为阳性。所得阳性克隆子命名为FY1。
6)挑选FY1克隆子抽取基因组进行PCR验证。由图1可知，FY1阳性克隆子仅有一种。如图6所示(Lane M,Marker；lane 1-10，FY11#，4#，8#，9#，13#，19#，22#，25#，29#，31#；lane11，Po 1f；lane 12为水对照；A为引物对Upleu-F2/Apa-R6验证；B为引物对Upleu-F3/Upleu-R3验证)，以引物对Upleu-F2/Apa-R6进行PCR验证时，FY1菌株所得条带约为2400bp，而对照菌株Po1f所得条带约为1300bp；以引物对Upleu-F3/Upleu-R3进行PCR验证时，FY1菌株所得条带约为900bp，而对照菌株Po1f无任何条带。选取阳性菌株以引物对Upleu-F3/Upleu-R3高保真PCR扩增并测序，测序结果表明lox位点及基因组变化完全符合图1预测。
实施例3
Cre-Y2质粒构建整合及FY2菌株的诱导筛选
Cre-Y2质粒构建构建流程见图7，引物见实施例2。
1)质粒Cre-Y1以ApaI/NheI双酶切并纯化回收Amp-ori-Ura3-Cre表达盒部分，质粒hp12d-rml以ApaI/XbaI双酶切并纯化回收rml基因表达框和部分Leu2，NheI和XbaI是一组同尾酶，故可酶连两个片段并转化大肠杆菌，所得克隆子以引物对RML-F/RML-R菌落PCR筛选，取阳性克隆子抽质粒测序，可得中间质粒hp12d-rml-cre。
2)以W29基因组为模板，使用引物对lip2t-F1/lip2t-R2扩增终止子lip2t，并增加lox66位点，所得PCR产物与中间质粒hp12d-rml-cre以AvrII/MluI双酶切并纯化回收，酶连并转化大肠杆菌，所得克隆子以引物对lip2t-F1/lip2t-R2菌落PCR筛选，取阳性克隆子抽质粒测序，可得中间质粒hp12d-rml-cre-lox66。
3)以pINA1296质粒为模板，使用引物对leu-F2/leu-R2扩增部分Leu2基因序列并增加lox66位点反向互补序列，所得PCR产物与中间质粒hp12d-rml-cre-lox66以NheI/ApaI双酶切并纯化回收，酶连并转化大肠杆菌，所得克隆子以引物对leu-F2/leu-R2菌落PCR筛选，取阳性克隆子抽质粒测序，可得质粒Cre-Y2。
4)质粒Cre-Y2由ApaI线性化，经醋酸锂转化法转化FY11#，而后经由5mL MD液体培养基连续筛选两次以保证阳性率，再转接100μL到5mLMO液体培养基诱导培养12h，最后以YPD平板划线分离单克隆菌落。将上述得到的单克隆转接到MD平板和BMSY-三丁酸甘油酯平板(山梨醇50g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，磷酸盐缓冲液100mM，无氨基酵母13.4g/L，生物素0.4mg/L，三丁酸甘油酯10mL/L)，在MD平板不能生长但在BMSY-三丁酸甘油酯平板上正常生长的克隆子即为阳性。所得阳性克隆子命名为FY2，由脂肪酶的特性可知，在BMSY-三丁酸甘油酯平板上出圈较大的克隆子酶活相对较高。
5)挑选FY2克隆子抽取基因组进行PCR验证。由图2可知，FY2包含两种阳性克隆子，即基因组所插入RML表达框正向(情况a，简写为FY2-rml)或RML表达框反向互补(情况b，简写为FY2-lmr)。如图8所示，其中，Lane M,Marker；lane 1-10，FY22#，3#，4#，6#，11#，13#，18#，23#，29#，30#。A为引物对KNC-F2/Apa-R6验证，lane 11为水对照；B为引物对SXB-R2/Apa-R3验证，lane 11为水对照；C为引物对Upleu-F3/Apa-R6验证，lane 11为阴性对照FY11#，lane 12为对照Po1f。以引物对Upleu-F3/Apa-R6进行PCR验证时，FY2菌株所得条带约为3400bp，而对照菌株FY1所得条带约为400bp和1400bp，对照菌株Po1f所得条带约为400bp。以引物对KNC-F2/Apa-R6进行PCR验证时，菌株FY2-rml所得条带约为650bp，而对菌株FY2-lmr无任何条带；以引物对SXB-R2/Apa-R3进行PCR验证时，菌株FY2-rml无任何条带，而对菌株FY2-lmr所得条带约为800bp。选取两种阳性菌株以相对应引物对高保真PCR扩增并测序，测序结果表明lox位点及基因组变化完全符合图2预测。目的基因RML表达框正向或反向互补菌株均为正确菌株，但为了实验方便，本发明统一选用基因组所插入RML表达框正向的菌株进行后续操作。
实施例4
Cre-Y3质粒构建整合及FY3菌株的诱导筛选
Cre-Y3质粒构建流程见图9，引物见实施例2。
1)以W29基因组为模板，使用引物对lip2t-F1/lip2t-R3扩增终止子lip2t，并增加lox71位点反向互补序列，所得PCR产物与中间质粒hp12d-rml-cre以AvrII/MluI双酶切并纯化回收，酶连并转化大肠杆菌，所得克隆子以引物对lip2t-F1/lip2t-R3菌落PCR筛选，取阳性克隆子抽质粒测序，可得质粒hp12d-rml-cre-17xol。
2)以pINA1296质粒为模板，使用引物对leu-F3/leu-R2扩增部分Leu2基因序列并增加lox71位点，所得PCR产物与中间质粒hp12d-rml-cre-17xol以NheI/ApaI双酶切并纯化回收，酶连并转化大肠杆菌，所得克隆子以引物对leu-F3/leu-R2菌落PCR筛选，取阳性克隆子抽质粒测序，可得质粒Cre-Y3。
3)质粒Cre-Y3由ApaI线性化，经醋酸锂转化法转化FY23#，而后筛选及诱导操作同实施例3。所得阳性克隆子命名为FY3。
4)挑选FY3克隆子抽取基因组进行PCR验证。由图3可知，FY3包含两种阳性克隆子，即基因组所插入RML表达框正向(情况a，简写为FY3-rml)或RML表达框反向互补(情况b，简写为FY3-lmr)。如图10所示(Lane M,Marker；lane 1-6，FY34#，10#，15#，22#，23#，31#；lane7为水对照；A为引物对KNC-F2/Apa-R6验证；B为引物对SXB-R2/Apa-R3验证)。以引物对KNC-F2/Apa-R6进行PCR验证时，菌株FY3-rml所得条带约为650bp，而对菌株FY3-lmr无任何条带；以引物对SXB-R2/Apa-R3进行PCR验证时，菌株FY3-rml无任何条带，而对菌株FY3-lmr所得条带约为800bp。选取两种阳性菌株以相对应引物对高保真PCR扩增并测序，测序结果表明lox位点及基因组变化完全符合图3预测。
实施例5
FY4菌株的整合及诱导筛选
1)质粒Cre-Y2由ApaI线性化，经醋酸锂转化法转化FY34#，而后筛选及诱导操作同实施例3。所得阳性克隆子命名为FY4(图11)。
2)挑选FY4克隆子抽取基因组进行PCR验证。如图12所示(Lane M,Marker；lane 1-6，FY410#，14#，20#，22#，29#，30#；lane7为水，对照A为引物对KNC-F2/Apa-R6验证；B为引物对SXB-R2/Apa-R3验证)，FY4包含两种阳性克隆子，即FY4-rml和FY4-lmr，验证结果类似于FY2菌株。
实施例6
FY5菌株的整合及诱导筛选
1)质粒Cre-Y3由ApaI线性化，经醋酸锂转化法转化FY410#，而后筛选及诱导操作同实施例3。所得阳性克隆子命名为FY5(图11)。
2)挑选FY5克隆子抽取基因组进行PCR验证。如图13所示(Lane M,Marker；lane 1-6，FY55#，6#，12#，23#，31#，32#；lane7为水对照A为引物对KNC-F2/Apa-R6验证；B为引物对SXB-R2/Apa-R3验证；)，FY5包含两种阳性克隆子，即FY5-rml和FY5-lmr，验证时结果类似于FY3菌株。
实施例7
FY6菌株的整合及诱导筛选
1)质粒Cre-Y2由ApaI线性化，经醋酸锂转化法转化FY531#，而后筛选及诱导操作同实施例3。所得阳性克隆子命名为FY6(图11)。
2)挑选FY6克隆子抽取基因组进行PCR验证。如图14所示(Lane M,Marker；lane 1-6，FY63#，12#，13#，18#，19#，25#；lane7为水对照A为引物对KNC-F2/Apa-R6验证；B为引物对SXB-R2/Apa-R3验证)，FY6包含两种阳性克隆子，即FY6-rml和FY6-lmr，验证结果类似于FY2菌株。
实施例8
FY7菌株的整合及诱导筛选
1)质粒Cre-Y3由ApaI线性化，经醋酸锂转化法转化FY612#，而后筛选及诱导操作同实施例3。所得阳性克隆子命名为FY7(图11)。
2)挑选FY7克隆子抽取基因组进行PCR验证。如图15所示(Lane M,Marker；lane 1-6，FY74#，9#，15#，16#，21#，26#；lane7为水对照A为引物对KNC-F2/Apa-R6验证；B为引物对SXB-R2/Apa-R3验证)，FY7包含两种阳性克隆子，即FY7-rml和FY7-lmr，验证结果类似于FY3菌株
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华中科技大学
<120> 一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统及方法
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcatatgat gccatcccac aagacgaa 28
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaattgtta tccgctcaca attccggatc cggcgtcgtt gcttgtgtga ttt 53
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaattgtga gcggataaca attccatgtc caatttactg accgtaca 48
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agttgtaaag agtgataaat agccctaggc taatcgccat cttccagcag gc 52
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctagggcta tttatcactc tttacaact 29
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctagcacgc gtataacttc gtataatgta tgctatacga agttatctcc acctgtgtca 60
atcttc 66
<210> 7
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcgacacgc gttaccgttc gtataatgta tgctatacga agttatctcc acctgtgtca 60
atcttc 66
<210> 8
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcgacacgc gttaccgttc gtatagcata cattatacga agttatctcc acctgtgtca 60
atcttc 66
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agcatacatt atacgaagtt atgctagcac gcgtctacga taagcagtcc aatattctg 59
<210> 10
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcagggccc ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaac ggtagacagc aactactcct 60
ttcac 65
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caagcccggt cttacggcca tc 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggtgatggga agagtccact ca 22
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catactacaa tcacgagcgc ttc 23
<210> 14
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcgctagcta ccgttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atgataagct gtcaaacatg 60
a 61
<210> 15
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcatcatttc attagcaggg cagggccctt tttatagagt cttatacac 49
<210> 16
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcgctagcta ccgttcgtat agcatacatt atacgaagtt atgataagct gtcaaacatg 60
a 61
<210> 17
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctgtgcggta tttcacaccg catatgtcaa tccaattacc ccccacaac 49
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttcgtcttgt gggatggcat catatggaca aaggcctgtt tctcgg 46
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtacaggttc aggtcctttc gcagc 25
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agcgctatcg aacgtaccca g 21
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
catcaacacc ggcctgtgca cctaa 25
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gcggatccac cattccttgc ggcggcggtg c 31
<210> 23
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cgctaccgcc tttactattc tcacggccgt tctggccatg gtccctatca agcgacagt 59
<210> 24
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccggcaacgt ggggacaggc catggaggta ccttaggtgc acaggccggt gttga 55

Claims (9)

1.一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统，其特征在于，所述系统包括质粒1、质粒2和质粒3；
所述质粒1包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段A和两个同向lox位点；两个同向lox位点设在同源片段A两侧，其余元件无顺序要求；两个同向lox位点整合到酵母基因组后发生重组反应，反应后在基因组上生成一个左臂突变型lox位点或一个右臂突变型lox位点；所述同源片段A为解脂耶氏酵母基因组序列，长度不小于1000bp；
所述质粒2包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点和目的基因表达盒；两个反向互补的左或右臂突变lox位点需在目的基因表达盒两侧，且紧靠同源片段B，其余元件无顺序要求；两个反向互补的左或右臂突变lox位点能够与质粒1反应后在基因组上生成的左或右臂突变型lox位点发生重组反应，反应后在基因组生成双臂突变型位点；所述同源片段B位于同源片段A上游或下游序列，长度不小于1000bp；
所述质粒3包括酵母筛选标记、Cre基因表达盒、细菌部分基因片段、同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点和目的基因表达盒；两个反向互补的左或右臂突变lox位点需在目的基因表达盒两侧，且紧靠同源片段B，其余元件无顺序要求；两个反向互补的左或右臂突变lox位点能够与质粒2反应后在基因组生成的左或右臂突变型lox位点发生重组反应，反应后在基因组生成双臂突变型位点；同源片段B位于同源片段A上游或下游序列，长度不小于1000bp；
所述酵母筛选标记包括营养缺陷型标记和抗生素抗性标记；
所述Cre基因表达盒由诱导启动子-Cre基因-终止子组成；
所述细菌部分基因片段包括大肠杆菌复制起点和抗性基因。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述质粒1中的两个同向lox位点包括四个组合：5’-左臂突变型lox位点和3’-左臂突变型lox位点的组合、5’-左臂突变型lox位点和3’-野生lox位点的组合、5’-右臂突变型lox位点和3’-右臂突变型lox位点的组合以及5’-野生lox位点和3’-右臂突变型lox位点的组合。
3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于，当所述质粒1中的两个同向lox位点为5’-左臂突变型lox位点和3’-左臂突变型lox位点的组合或5’-左臂突变型lox位点和3’-野生lox位点的组合时，质粒1反应后在基因组上生成一个左臂突变型lox位点，质粒2含两个反向互补的右臂突变lox位点，质粒3含两个反向互补的左臂突变lox位点；当所述质粒1中的两个同向lox位点为5’-右臂突变型lox位点和3’-右臂突变型lox位点的组合或5’-野生lox位点和3’-右臂突变型lox位点的组合时，质粒1反应后在基因组上生成一个右臂突变型lox位点，质粒2含两个反向互补的左臂突变lox位点，质粒3含两个反向互补的右臂突变lox位点。
4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，同源片段B位于同源片段A的相对位置影响质粒2和质粒3中同源片段B、两个反向互补的左或右臂突变lox位点、目的基因表达盒的相对位置：
当所述同源片段B位于同源片段A下游序列时，5’到3’的顺序为：lox位点1-目的基因表达盒-lox位点2-同源片段B；
当所述同源片段B位于同源片段A上游序列时，5’到3’的顺序为：同源片段B-lox位点2-目的基因表达盒-lox位点1；
同一质粒中，所述lox位点1和lox位点2反向互补；
质粒2中同源片段B紧邻lox反向互补序列，质粒3中同源片段B紧邻lox位点；
质粒2中的lox位点1与质粒1反应后在基因组上生成的lox位点同向，但突变型相反：一个为左臂突变型，一个为右臂突变型；
质粒3中的lox位点与质粒1反应后在基因组上生成的lox位点方向相反，但突变型相同：同为左臂突变型或同为右臂突变型。
5.基于权利要求1～4任一项所述系统在解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合的方法，包括以下步骤：
质粒1转化解脂耶氏酵母初始菌而后诱导筛选，得到菌株1；菌株1基因组相比于初始菌，基因组插入一个单臂突变型lox位点和一个同源片段A；
质粒2转化菌株1而后诱导筛选，得到菌株2；菌株2基因组去除了同源片段A，相比于初始菌，基因组插入1个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和1个目的基因表达框；
质粒3转化菌株2而后诱导筛选，得到菌株3；菌株3基因组相比于初始菌，基因组插入2个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和2个目的基因表达框；
质粒2转化菌株3而后诱导筛选，得到菌株4；菌株4基因组相比于初始菌，基因组插入3个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和3个目的基因表达框；
质粒3转化菌株4而后诱导筛选，得到菌株5；菌株5基因组相比于初始菌，基因组插入4个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和4个目的基因表达框；
质粒2转化菌株5而后诱导筛选，得到菌株6；菌株6基因组相比于初始菌，基因组插入5个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和5个目的基因表达框；
质粒3转化菌株6而后诱导筛选，得到菌株7；菌株7基因组相比于初始菌，基因组插入6个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和6个目的基因表达框；
采用质粒2和质粒3进行交替转化：
质粒2转化菌株2N-1而后诱导筛选，得到菌株2N；菌株2N基因组相比于初始菌，基因组插入2N-1个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和2N-1个目的基因表达框；菌株2N中目的基因表达框包括任意数量的正向表达框或反向互补表达框，且正向表达框或反向互补表达框的数量总和为2N-1个；
质粒3转化菌株2N而后诱导筛选，得到菌株2N+1；菌株2N+1基因组相比于初始菌，基因组插入2N个很难继续作用的双臂突变型lox位点、1个可以继续作用的单臂突变型lox位点、和2N个目的基因表达框；菌株2N+1中目的基因表达框包括任意数量的正向表达框或反向互补表达框，且正向表达框或反向互补表达框的数量总和为2N个；
N为大于等于1的正整数。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转化为将质粒经酶切线性化后，采用化学转化法或电转化法转化酵母基因组。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导筛选的过程包括：使用筛选培养基进行连续两次筛选，将筛选得到的阳性菌株进行诱导培养，分离单克隆菌株并转接到相应的筛选培养基和YPD培养基，在筛选培养基上不能生长，但在YPD培养基上能够正常生长的单菌落，为阳性克隆子，对阳性克隆子进行基因组验证。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述筛选培养基为与质粒中酵母筛选标记对应的营养缺陷型筛选培养基或抗生素抗性标记筛选培养基。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述诱导用诱导培养基为与Cre基因表达盒中诱导启动子对应的诱导培养基。
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