CN103205428A

CN103205428A - 用于微生物发酵的启动子及其应用

Info

Publication number: CN103205428A
Application number: CN2013101033116A
Authority: CN
Inventors: 孙俊松; 王庆龙; 刘莉; 沈兆兵; 史吉平; 姜标
Original assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Current assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2013-07-17

Abstract

本发明公开了一种用于微生物发酵的启动子及其应用，该启动子包括选自下列核苷酸序列中的一种：1）如SEQ ID NO.1、2、3或4所示的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列；2）在严格条件下与SEQ ID NO.1、2、3或4所示的核苷酸序列杂交且具有相同启动子功能的核苷酸序列；3）对SEQ ID NO.1、2、3或4所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失或添加修饰且具有相同启动子功能的核苷酸序列；4）与SEQ ID NO.1、2、3或4所示的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有相同启动子功能的核苷酸序列。本发明的启动子用在厌氧发酵中，无需诱导物，能高效地启动其下游基因的转录及表达。

Description

用于微生物发酵的启动子及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物基因工程领域中的启动子及其应用，特别是涉及一种用于微生物发酵的启动子及其应用。

背景技术

现代的微生物基因工程涉及一系列的基因操作，包括利用强启动子对某些关键酶进行过量表达，例如，在实验室甚至在商业发酵生产中，都会利用来自噬菌体的T7启动子，以大肠杆菌为宿主细胞进行外源蛋白的表达。但T7启动子有其局限性，它在大肠杆菌进行厌氧生长时的转录效率不高，许多外源蛋白利用厌氧发酵获得的表达多是利用了宿主细胞在有氧生长时积累的mRNA；该启动子的另一个缺点是需要价格不廉的诱导物才能进行。另外，该启动子的作用特点也不适合那些需要在厌氧环境下进行催化反应的酶蛋白的生产，因为这类对氧化还原电位敏感的酶蛋白，在有氧环境下表达时，蛋白结构因为氧化的缘故往往不能得到正确折叠，或因为只在厌氧环境下才表达的伴侣蛋白的缺失而失活，因此，这类蛋白往往需要特殊的厌氧启动子进行表达。

出于对减少污染物排放、石油资源的日益枯竭等主客观因素的影响下，对利用生物质废弃物为原料，以微生物发酵法生产大宗化学中间体的研究十分迫切，一些化学品的生物法生产甚至已完全替代以前的石油化工法。尽管如此，这一绿色产业的兴起还需要大量的基础研究和下游的中试发酵优化研究，这其中非常重要的一个环节是开发出高效的厌氧启动子元件，而国内外对于专门用于厌氧发酵的高效启动子所作的研究并不多，很多研究机构还是使用传统的高效启动子，如T7启动子进行厌氧环境下蛋白的表达。在实验室中，诱导物所占生产成本不被视作问题，但实际的绿色化工产品的工业化生产则对成本十分敏感，同时因为这类化学中间体在微生物细胞内的合成通常是由一个包含电子传递在内的生化反应完成的，因此，常常需要经过厌氧发酵才能完成，此时T7启动子在耗时常达数天的发酵生产应用中的实际效率不能令人满意。因此，开发出高效地用于厌氧发酵的特殊启动子不仅是一种重要的基础研究，更是当前绿色生物产业的一种实际需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于微生物发酵的启动子及其应用。该启动子可用于微生物的厌氧或兼性厌氧发酵，以生产化学中间体。

为解决上述技术问题，本发明中的用于微生物发酵的启动子，包括选自下列核苷酸序列中的一种：

1）如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列；

2）如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列；

3）如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列；

4）如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列；

5）在严格条件下与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列杂交且具有相同启动子功能的核苷酸序列；

6）对SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失或添加修饰且具有相同启动子功能的核苷酸序列；

7）与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有相同启动子功能的核苷酸序列。

其中，SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列如下：

ccttctcttttactcgtttagcaaccggctaaacatccccaccgcccggccaaaagaaaaataggtccatttttatcgctaaaagataaatccacacagtttgtattgttttgtgcaaaagtttcactacgctttattaacaatactttctggcgacgtgcgccagtgcagaaggatgagctttcgttttcagcatctcacgtgaagcgatggtttgccttgctacagggacgtcgcttgccgaccataagcgcccggtgtcctgccggtgtcgcaa

SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列如下：

tagaatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttgtatatgatgaaataaagttagtttattggataaacaaactaactttattaaggtagttgatggataaacttgttcacttaaatcaacccgggaacaa

SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列如下：

ccttctcttttactcgtttagcaaccggctaaacatccccaccgcccggccaaaagaaaaataggtccatttttatcgctaaaagataaatccacacagtttgtattgttttgtgcaaaagtttcactacgctttattaacaatactttctggcgacgtgcgccagtgcagaaggatgagctttcgttttcagcatctcacgtgaagcgatggtttgccttgctacagggacgtcgcttgccgaccataagcgcccggtgtcctgccggtgtcgcaaaattcgaggaaacatatg

SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列如下：

GaattctagaatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttgtatatgatgaaataaagtTagtttattggataaacaaactaactttattaaggtagttgatggataaacttgttcacttaaatcaacccgggaacaaggaggaataacatatg

所述用于微生物发酵的启动子，优选为如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

所述如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，其制备方法如下：

提取大肠杆菌BW25113细胞的基因组DNA作为模板，利用该模板进行PCR扩增得到，其中，PCR扩增中的上游引物序列如SEQ ID NO.7所示、下游引物序列如SEQ ID NO.8所示。

另外，本发明还公开了一种引物对，该引物对是扩增上述启动子全长或其任意片段的引物对。

本发明还公开了一种表达载体，所述表达载体含有上述启动子，优选为含有上述启动子的质粒pENA-TA、pCNA-PHC或pENX-TA。

本发明还公开了一种重组细胞，所述重组细胞含有上述表达载体，优选为含有上述表达载体（如含有上述启动子的质粒pENA-TA、pCNA-PHC及pENX-TA）的大肠杆菌BW25113细胞。

本发明还公开了一种调控用于发酵的微生物中基因表达的方法，所述方法包括：将上述表达载体转入用于发酵的微生物中；其中，用于发酵的微生物，包括：产丁醇的大肠杆菌。

本发明还公开了一种上述启动子的应用，所述启动子在调控用于发酵的微生物中目的基因表达的用途；其中，目的基因包括：用于合成丁醇的酶基因。

本发明还公开了一种上述启动子的应用，所述启动子在制备用于厌氧或兼性厌氧发酵生产化学中间体的微生物中的应用（或上述启动子在微生物的厌氧或兼性厌氧发酵生产化学中间体中的应用）。优选地，所述启动子在制备用于厌氧发酵生产化学中间体的微生物中的应用；其中，所述微生物包括：大肠杆菌；化学中间体包括：丁醇。

本发明中，出于微生物厌氧发酵生产中的启动子需要问题，经过筛选天然启动子，开发出两种可高效转录、用于微生物发酵产业的启动子Phya（SEQ ID NO.1所示）和Pxya（SEQID NO.2所示）。其中，启动子Phya（SEQ ID NO.1所示）可从大肠杆菌BW25113中以PCR方式获得。

另外，对于启动子Phya和Pxya经人工设计改进后，本发明还提供了这两种启动子的优化序列，其中包含为方便DNA克隆所设计的内切酶位点序列，即优化后的启动子Phya和Pxya的序列分别如SEQ ID NO.3所示和SEQ ID NO.4所示。

启动子Pxya可进行高效的厌氧转录，但与Phya不同的是，其在有氧环境下也有转录活性，适合在厌氧环境时工作，但在有氧环境下蛋白功能不受影响的工业酶类表达；启动子Phya感受培养基中的氧化还原电位，只在厌氧环境下自发启动，适合需要对氧气敏感的蛋白质的表达及其所进行的催化反应的进行。

作为本发明的启动子改进：启动子还包括序列表所示的核苷酸序列中添加、删除和缺失等操作所产生有核苷酸序列变化的突变休和衍生物，或与其它核苷酸序列在高严谨条件下与以上所述序列进行杂交，获得的具有相同功能的核苷酸序列。

使用启动子Phya和Pxya，可以让包括大肠杆菌在内的微生物能够在厌氧环境下，高效表达所需的催化酶，且无需诱导物，如以产丁醇大肠杆菌为目标时，分别使用了Phya和Pxya，构建了产丁醇合成途径生物酶的表达质粒（如说明书附图），这些表达质粒成功地表达五个合成丁醇的酶，在宿主细胞构建了外源的丁醇合成途径，从而以葡萄糖为底物，发酵生产出丁醇。这两种启动子的序列可以部分修改或优化，以方便表达质粒的构建，验证发现，经部分修改或优化后的启动子序列仍然可以高效表达，基因工程大肠杆菌的产丁醇水平不变。

同样，许多化学中间体也可以由生物质经微生物发酵产生，随着石油资源的枯竭及对环境污染问题的重视，生物发酵法生产这些化工原料的技术研究日益重要。而许多化学中间体原料的生成是由厌氧环境的电子传递过程中催化产生的，许多基因工程菌利用外源特异性的酶催化这些反应，因此，高效的厌氧启动子就成了构筑基因工程菌必不可少的单元。

综上所述，本发明从包括大肠杆菌的微生物细胞内的原始启动子出发，经过实验验证，开发出基于两种启动子的人工合成启动子序列，成功用于大肠杆菌产丁醇的研究实例，并证实了这两种启动子在厌氧环境下的可靠性，而且本发明的启动子在厌氧发酵过程中，无需诱导物，能够高效地启动其下游基因的转录及表达。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是克隆了Phya启动子的表达质粒pENA-TA和pCNA-PHC图；

图2是克隆了Pxya启动子的表达质粒pENX-TA图。

具体实施方式

下面再举具体实例对本发明方法予以说明。

实施例中所用分子生物学的方法均为公知的常用技术。另外，关于实验材料，除非特别说明均购自商业公司。

实施例1构建质粒pENA-TA和pCNA-PHC并生成产丁醇大肠杆菌菌株

1、质粒pEN-TA/pCN-PHC的构建

首先，由上海生工生物技术公司利用DNA化学合成法生成基因片段ter/AdhE2（即TA基因片段，如SEQ ID NO.5所示）和phaA/hbd/crt（即PHC基因片段，如SEQ ID NO.6所示），并将这两种线性DNA克隆到质粒pGEM-T（购自上海生工生物工程公司）中，生成pGEM-T-TA及pGEM-T-PHC质粒。

取来自Novagen公司的pETDuet-1和pGEM-T-TA质粒，用限制性内切酶NdeI/XhoI同时双切，经0.7%（0.7g/100mL）的琼脂糖凝胶电泳回收，以T4DNA连接酶连接质粒DNApETDuet-1和TA片段，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自上海生工生物工程公司），在含氨苄青霉素（100mg/L）的LB培养板上长出转化子，挑取单克隆菌落、以Axygen质粒提取试剂盒抽提质粒，再由NdeI/XhoI双酶切及DNA测序（由上海生工生物工程公司提供服务），鉴定出正确的阳性克隆，获得的质粒命名为pEN-TA。

同样的，取pACYCDuet-1（购自Novagen公司）和pGEM-T-PHC质粒，用限制性内切酶NdeI/KpnI同时双切，经0.7%的琼脂糖凝胶电泳回收，以T4DNA连接酶连接质粒pACYCDuet-1的DNA片段和PHC片段，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含氨苄氯霉素（30mg/L）的LB培养板上长出转化子，挑取单克隆菌落、以Axygen质粒提取试剂盒抽提质粒，再由NdeI/KpnI双酶切及DNA测序（由上海生工生物工程公司提供服务），获得的质粒命名为pCN-PHC。

质粒pEN-TA和pCN-PHC经电转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，由含氨苄青霉素100μg/ml、氯霉素30μg/ml的LB琼脂平板筛选获得，取菌液进行质粒的扩增。

2、启动子Phya的克隆

本实施例中，以启动子Phya（SEQ ID NO.1所示）的序列为基础，并且在其两端加上了限制性酶切位点EcoRI和NdeI，形成了优化后带有酶切位点序列的启动子Phya（SEQ ID NO.3所示），以用于厌氧表达质粒的构建。

优化的启动子Phya（SEQ ID NO.3所示），可以大肠杆菌BW25113（购自美国大肠杆菌菌种保藏中心，CGSC）的基因组为模板，通过PCR方式获得。

其中，优化的启动子Phya（SEQ ID NO.3所示）的引物序列为：

上游引物：ctcgaattccttctcttttactcgtttag（SEQ ID NO.7所示）

下游引物：tttagttccatatggcacgtctctcctccttgcgac（SEQ ID NO.8所示）

DNA模板的制取方法为：取大肠杆菌BW25113生长至对数生长期（OD600在0.5-1.0之间）的菌液1.0ml，10000g离心2min，去上清，以0.1ml水重悬细胞，取1.0μl加入到PCR混合液中。

PCR反应体系如下：

在Mastercycler普通PCR仪（Eppendorf）上运行以下程序：

1)95℃，2min

2)94℃，20sec

3)55℃，45sec

4)68℃，25sec

5)循环从2)到4)，30次

6)68℃，3min

7)4℃，保存。

PCR产物经Axygen PCR清洁试剂盒回收纯化后，将DNA克隆到质粒pGEM-T（购自上海生工生物工程公司）中，得到质粒并命名为pGEM-T-Phya【即该质粒中含有优化的启动子Phya（SEQ ID NO.3所示）】。

3、构建质粒pENA-TA和pCNA-PHC并生成产丁醇菌株

提纯后的质粒pGEM-T-Phya、pEN-TA及pCN-PHC分别以EcoRI和NdeI双酶切，纯化线性质粒pEN-TA的DNA片段、质粒pCN-PHC的DNA片段以及Phya片段后，将线性质粒pEN-TA及pCN-PHC的DNA片段分别与Phya片段以T4DNA连接酶连接，并将连接产物分别转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经挑菌、提取质粒、酶切验证和DNA测序，鉴定出正确的阳性克隆，最后获得终产物质粒并分别命名为pENA-TA【即该质粒中含有优化的启动子Phya（SEQ ID NO.3所示）】和pCNA-PHC【即该质粒中含有优化的启动子Phya（SEQ ID NO.3所示）】。

将质粒pENA-TA和pCNA-PHC经电转入大肠杆菌BW25113感受态细胞，由含氨苄青霉素100μg/ml、氯霉素30μg/ml的LB琼脂平板筛选，获得产丁醇菌株，即含质粒pENA-TA/pCNA-PHC的大肠杆菌BW25113。

实施例2质粒pENX-TA的构建及相关产丁醇菌株的生成

启动子Pxya（SEQ ID NO.2所示）是由综合比较同源的革兰氏阳性菌的木糖利用基因簇的启动子Pxyl-A后，经人工优化后，并由上海生工生物技术公司经化学合成法获得。

本实施例中，以SEQ ID NO.2所示的序列为基础，在其序列两端加上用于克隆的限制性酶切位点EcoRI和NdeI，形成优化的启动子Pxya序列（SEQ ID NO.4所示），以用于厌氧表达质粒的构建。

优化的启动子Pxya序列（SEQ ID NO.4所示）被克隆入T载体pUCM-T（购自上海生工生物工程公司），然后，如同实施例1，对该载体和质粒pEN-TA进行EcoRI/NdeI双酶切，并纯化酶切后的线性质粒pEN-TA的DNA片段及Pxya片段，然后将线性质粒pEN-TA的DNA片段和Pxya片段以T4DNA连接酶连接，并将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经挑菌、提取质粒、酶切验证和DNA测序，鉴定出正确的终产物质粒，命名为pENX-TA【即该质粒中含有优化的Pxya序列（SEQ ID NO.4所示）】。

同样，将质粒pENX-TA和pCNA-PHC经电转入大肠杆菌BW25113感受态细胞，由含氨苄青霉素100μg/ml、氯霉素30μg/ml的LB琼脂平板筛选，获得产丁醇菌株，即含质粒pENX-TA/pCNA-PHC的大肠杆菌BW25113。

实施例3启动子在大肠杆菌产丁醇发酵中的应用

为让大肠杆菌利用培养基中的葡萄糖发酵产丁醇，表达质粒组合pENA-TA/pCNA-PHC或pENX-TA/pCNA-PHC经电转（Bio-Rad MicroPulse165-2100，电转条件：2000V，25μF）到大肠杆菌BW25113。经下述方法培养及发酵，表达产丁醇的外源酶蛋白，并生产丁醇。

1、大肠杆菌在种子培养基中的培养

种子培养基为50ml LB培养基，抗生素浓度为氨苄青霉素50μg/ml、氯霉素25μg/ml，37℃摇床好氧培养，转速为200转每分钟，培养12小时。

2、在5L发酵罐中进行好氧生长

在5L发酵罐中，装入3L配制好的LB培养基，50ml过夜培养后的菌液接种到2L LB培养基中，37℃，通风量4L/分钟，搅拌桨转速为300转每分钟，经4小时左右培养到OD₆₀₀为3.0。

3、无氧发酵产丁醇

将发酵罐中的空气进气阀关闭，扎紧各类输出管道，设定发酵液pH为5.5，继续培养发酵48小时。其中，该发酵过程中，转速调低至150rpm，在无氧发酵开始后1小时，pH迅速降低，之后pH将在氢氧化钠的调节下维持在5.5，并且流加葡萄糖在10g/L/24hr。

经48小时的发酵后，最终的发酵液以岛津的气相色谱GC2010，利用FID氢火焰检测器，在氢气为载气的情况下，测得大肠杆菌BW25113（含质粒pENA-TA/pCNA-PHC）产正丁醇的峰值浓度为2.0g/L，而大肠杆菌BW25113（含质粒pENX-TA/pCNA-PHC）产正丁醇的峰值浓度为2.8g/L。