CN114958900B - 一种解脂耶氏酵母高效无标记基因整合载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种解脂耶氏酵母无标记整合载体及其应用用，属于微生物基因工程领域。该整合载体包括重组反应区，重组反应区包括从5’至3’顺序的左臂突变型lox序列、待剔除DNA片段和右臂突变型lox序列；左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列方向相同；待剔除DNA片段包括解脂耶氏酵母筛选标记、Cre基因诱导表达盒、大肠杆菌筛选标记和复制起点；所述左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列能在所述载体整合至解脂耶氏酵母基因组后，在Cre重组酶作用下切除左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列之间的序列，并在基因组上生成双臂突变型lox序列。本发明仅需单个载体即可高效便捷地实现基因的无标记整合，为在解脂耶氏酵母体内整合多个基因提供了极大的便利。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，更具体地，涉及一种解脂耶氏酵母高效无标记基因整合载体及其应用。
背景技术
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是目前应用十分广泛的一种非常规酵母，已被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)认定为安全型(Generally Recognized as Safe，GRAS)微生物。解脂耶氏酵母可利用多种亲水性或疏水性碳源，如糖类、醇类、烃类和脂类等。该酵母含有丰富的胞内外酶系，且其体内的油脂含量较高，常用于异源表达重组蛋白和生产各种有机酸、脂质等方面。
为了在解脂耶氏酵母中实施多种基因工程策略或进行合成生物学研究，通常需要在单个宿主体内进行多个基因的遗传转化。目前，一些抗生素标记和营养缺陷型标记均被开发用于解脂耶氏酵母转化子的筛选。然而，解脂耶氏酵母对除潮霉素B和腐草霉素之外的诸多常见抗生素均具有天然的耐受性，其在进行抗生素筛选时也易产生高频的自发抗性突变，且引入抗生素基因也可能影响该酵母的GRAS级别。此外，解脂耶氏酵母可用的营养缺陷型筛选标记有限，且以该类筛选标记进行多次遗传转化时需预先构建相应的多缺陷型宿主，也存在一定的应用局限。
近年来，Cre/loxP位点特异性重组系统已被成功开发用于各种真核生物细胞体内的基因操作。该系统中，loxP序列由两个13bp的反向重复序列和其之间8bp的间隔序列组成，间隔序列决定了loxP的方向，而Cre重组酶可识别两个同向的loxP位点并发生切除反应，利用该原理可实现载体转化后筛选标记的剔除。常规方法如Fickers等[Newdisruption cassettes for rapid gene disruption and marker rescue in the yeastYarrowia lipolytica[J].Journal of microbiological methods,2003,55(3):727-737.]已成功利用Cre/loxP位点特异性重组系统在解脂耶氏酵母中实现了筛选标记的剔除并克服了筛选标记不足的限制，但其loxP特异性整合位点和Cre重组酶基因表达盒分别位于两个重组载体或DNA片段，采用该方法实现单次基因无标记整合需使用两种遗传筛选标记并进行两次遗传转化，这使得实验过程相对低效且繁琐。此前，专利文献CN201910747704.8中公开了一种利用Cre/loxP位点特异性重组系统实现解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统及方法，但该方法实现多轮无标记整合需要按特定顺序的使用3个含有不同组合的左臂或右臂突变loxP位点的重组质粒，这也给实验造成了诸多不便。
因此，构建一种解脂耶氏酵母高效无标记基因整合方法，具有重要的应用价值。
发明内容
针对现有技术的以上技术缺陷或改进需求，本发明提供了一种解脂耶氏酵母高效无标记基因整合载体及其应用，其目的在于利用单个载体可在该酵母体内多次高效地进行基因的无标记整合。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种解脂耶氏酵母高效无标记基因整合载体，该整合载体包括重组反应区，所述重组反应区包括从5’至3’顺序的左臂突变型lox序列、待剔除DNA片段和右臂突变型lox序列；所述左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列方向相同；
所述待剔除DNA片段包括解脂耶氏酵母筛选标记、Cre基因诱导表达盒、大肠杆菌筛选标记和复制起点；所述Cre基因诱导表达盒包括从5’至3’顺序的解脂耶氏酵母诱导型启动子、乳糖操纵基因序列lacO、Cre基因和终止子；
所述左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列能在所述载体整合至解脂耶氏酵母基因组后，在Cre重组酶作用下切除左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列之间的序列，并在基因组上生成双臂突变型lox序列；
所述整合载体在所述重组反应区外，还包括目的基因表达盒和同源片段，所述同源片段为解脂耶氏酵母宿主基因组中的序列，且其内部含有至少一个在所述整合载体上唯一存在的酶切位点。
优选地，所述解脂耶氏酵母筛选标记为抗生素筛选标记或营养缺陷型筛选标记。
优选地，所述解脂耶氏酵母诱导型启动子为pPOX2油酸诱导型启动子。
优选地，所述同源片段长度不小于500bp。
优选地，所述目的基因表达盒两端紧邻一对在所述整合载体上唯一存在的同尾酶，用于体外构建含多个基因表达盒的整合载体。
根据本发明另一方面，提供了任一所述的解脂耶氏酵母无标记基因整合载体的应用，用于解脂耶氏酵母中基因无标记整合的应用。
优选地，所述的应用包括以下步骤：
(1)将所述解脂耶氏酵母无标记基因整合载体在同源片段内部线性化，再转化解脂耶氏酵母宿主感受态细胞，使用筛选培养基进行转化子筛选，所述筛选培养基为所述解脂耶氏酵母筛选标记对应的筛选培养基；
(2)将步骤(1)中筛选过的转化子接种于液体诱导培养基中培养至菌体浑浊，再取菌液划线接种于生长培养基平板分离得到单克隆；所述液体诱导培养基为所述Cre基因表达盒选用的解脂耶氏酵母诱导型启动子所需的诱导培养基；
(3)将步骤(2)中分离获得的单克隆分别接种至步骤(1)中的筛选培养基和步骤(2)中的生长培养基，在筛选培养基无法正常生长而能在生长培养基上正常生长的克隆子即为成功剔除筛选标记的阳性克隆子，进一步进行基因组验证确认，即获得目的基因无标记整合入解脂耶氏酵母的重组菌株。
优选地，重复进行步骤(1)-步骤(3)，即得到所述目的基因多次无标记整合的重组菌株。
优选地，将所述解脂耶氏酵母无标记基因整合载体中的目的基因替换为其它的目的基因，并按照步骤(1)-步骤(3)进行操作，得到不同目的基因无标记整合的重组菌株。
优选地，步骤(1)中，转化解脂耶氏酵母宿主采用锂转化法或电转化法。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明设计的解脂耶氏酵母高效无标记基因整合载体，通过结合在含lacIq抑制子的大肠杆菌宿主中可利用乳糖操纵基因序列lacO阻遏其下游基因的表达的特性，可有效避免Cre基因在大肠杆菌的泄露表达，从而成功将诱导性启动子调控的Cre基因表达盒和一对同向的左臂突变型和右臂突变型lox位点成功构建于单个重组载体。此外，解脂耶氏酵母筛选标记、Cre基因诱导表达盒、大肠杆菌筛选标记和复制起点等待剔除的DNA片段均置于一对同向的左臂突变型和右臂突变型lox位点之间，该载体转化后，通过诱导Cre位点特异性重组反应从而剔除筛选标记并生成难以再次参与位点特异性重组反应的双臂突变型lox位点，利用该原理可重复使用本发明的载体实现多轮基因的无标记整合。解脂耶氏酵母常规方法中，loxP特异性整合位点和Cre重组酶基因表达盒分别位于两个重组载体或DNA片段相比，实现单次基因的无标记整合需进行两次载体的整合，而本发明仅需使用单个载体进行单次转化即可实现目的基因的无标记整合，操作过程更简便快速，可极大地提高实验效率并有效缩减工作量。此外，专利CN201910747704.8中公开的技术实现多轮无标记整合需要按一定的顺序使用3个含有不同组合和方向的左臂突变型或右臂突变型lox位点的重组质粒，使用过程中具有的限定条件更多，而本发明仅需重复使用单个载体即可实现多轮无标记整合，显得更加简单实用。另一方面，专利CN201910747704.8中进行每轮基因无标记整合获得的剔除筛选标记的阳性克隆子中，均有较大比例的克隆子中存在目的基因表达盒方向颠倒的情况，还需额外进行基因型的加以筛选验证，而本发明剔除筛选标记过程中目的基因表达盒的方向始终保持不变，这也更有助于减少后期筛选阳性菌株所需的工作量。
(2)本发明仅需单个筛选标记即可实现目的基因的多次无标记整合，对宿主可用筛选标记的要求更低。
(3)在宿主基因组可以容纳的范围内，使用本发明的解脂耶氏酵母高效无标记基因整合载体可用于相同或不同基因在宿主菌株中任意次数的转化，应用范围广。
(4)本发明最终构建的解脂耶氏酵母重组菌株不含任何抗生素基因，有利于其在食品、药品等工业领域的应用。
附图说明
图1为解脂耶氏酵母高效无标记整合载体实现目的基因无标记基因整合的原理图。其中，Marker为解脂耶氏酵母筛选标记，P为用于调控Cre基因表达的诱导型启动子，M-ori为大肠杆菌筛选标记和复制起点，GOI为目的基因表达盒，HF为同源片段，lox71和lox66分别代指一对左臂和右臂突变型lox序列。
图2为解脂耶氏酵母高效无标记整合载体pUAxp7166-ROL的示意图。
图3为Po1h/ROL单克隆分别在YPD和MD平板的生长情况。
图4为Po1h/ROL阳性克隆使用ROL-F和kpnROL-R引物进行基因组PCR验证的结果；其中，泳道1-7为随机挑选的7个Po1h/ROL阳性克隆子，CK为Po1h宿主(阴性对照)。
图5为pUAxp7166-vgb载体的示意图。
图6为Po1h/ROL-vgb克隆子Yvgb-F和Yvgb-R进行基因组PCR的验证结果；其中，泳道1-5为随机挑选的5个Po1h/ROL-vgb阳性克隆子，CK为Po1h/ROL菌株(阴性对照)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例中所用的材料：大肠杆菌Top10F’感受态细胞购自上海唯地生物，解脂耶氏酵母Po1h菌株由本实验室保存；hp4d-rml、Cre-Y3、Mlu-vgb为本实验室构建并保存(周清华.解脂耶氏酵母中基于基因整合新工具的米黑根毛霉脂肪酶高效表达[D].华中科技大学，2021)；限制性内切酶、PCR所用的酶制剂、酶连试剂盒等购于TaKaRa公司，TreliefSosoo Cloning Kit重组连接试剂盒购于擎科生物有限公司；质粒提取试剂盒和DNA回收试剂盒购于Omega公司；根据解脂耶氏酵母密码子偏好性优化后的米根霉脂肪酶ROL基因的合成、DNA测序和PCR引物合成委托武汉擎科生物技术有限公司和武汉天一辉远生物技术有限公司完成。
生长条件：大肠杆菌于37℃生长，解脂耶氏酵母菌株于28℃下培养。
合成引物：
实施例1：一种解脂耶氏酵母高效无标记基因整合载体
所述载体包括由解脂耶氏酵母筛选标记、Cre基因诱导表达盒、大肠杆菌筛选标记和复制起点所构成的待剔除DNA片段、一对同向的左臂和右臂突变型lox序列、同源片段和目的基因表达盒；
所述一对同向的左臂和右臂突变型lox序列分别紧邻所述待剔除DNA片段的两侧，其在所述载体上的顺序依次是左臂突变型lox序列、待剔除DNA片段、右臂突变型lox序列；
所述一对同向的左臂和右臂突变型lox序列能在Cre重组酶作用下发生切除事件并生成难以再次参与位点特异性重组反应的双臂突变型lox序列；
所述解脂耶氏酵母筛选标记可为抗生素筛选标记或营养缺陷型筛选标记；
所述Cre基因诱导表达盒由解脂耶氏酵母诱导型启动子-乳糖操纵基因序列lacO-Cre基因-终止子组成；
所述同源片段为解脂耶氏酵母宿主基因组中的序列，且其内部应含有至少一个在所述载体上唯一存在的酶切位点；
用于转化所述载体的大肠杆菌中间宿主携带lacIq抑制子。
优选地，用于转化所述载体的大肠杆菌中间宿主为Top10F’。
实施例2：目的基因在解脂耶氏酵母中的高效无标记基因整合
解脂耶氏酵母高效无标记整合载体实现目的基因无标记基因整合的原理如图1所示。解脂耶氏酵母高效无标记整合载体转化入宿主感受态细胞后，使用其采用的酵母筛选标记所对应的筛选培养基进行阳性转化子的筛选，优选地，得到的转化子进一步经过基因组验证确认所述载体整合入基因组。随后通过诱导型启动子调控Cre重组酶表达，Cre重组酶在lox71和lox66位点之间发生剪切反应并在基因组中留下难以再次参与重组反应的lox72双臂突变位点，同时使得两lox位点之间的解脂耶氏酵母筛选标记、Cre基因表达盒、大肠杆菌筛选标记和复制起点等均被剔除，从而高效地实现目的基因在解脂耶氏酵母中的无标记整合。
实施例3：用于ROL基因在解脂耶氏酵母高效无标记整合载体pUAxp7166-ROL的构建
重组载体pUAxp7166-ROL的构建步骤如下：
(1)DNA元件的克隆：以Cre-Y3质粒为模板，使用引物dwCre-F和lipTT66-R扩增得到lip2TT终止子与lox66序列融合的lipTT66片段，使用引物XprTT-F和Xprlox71-R扩增获得Xpr2TT终止子与lox71序列融合的XprTT71片段；以Po1h基因组DNA为模板，使用引物66upAxp-F和upAxp-R克隆获得upAxp同源片段；以hp4d-rml质粒为模板，通过hp4d-F和Xpr2pre-R引物PCR获得融合有Xpr2pre信号肽的hp4d启动子片段；以合成的ROL基因为模板，使用引物对ROL-F和kpnROL-R扩增获得ROL基因；
(2)以步骤(1)中获得的lipTT66、upAxp、hp4d、ROL和XprTT71纯化回收后以该顺序进行重叠延伸PCR融合，获得含有lox66、upAxp同源片段、ROL目的基因表达盒和lox71的融合片段lip2TT-lox66-upAxp-hp4d-ROL-XprTT-lox71；
(3)Cre-Y3经过AvrII和EcoRI双酶切后，纯化回收获得含有ura3标记基因表达盒和以油酸诱导型启动子pPOX2调控的Cre基因表达盒(Cre基因上游含lacO乳糖操纵基因序列)的片段，该片段与步骤(2)中融合片段以体积比1:2混合后，通过Trelief SosooCloning Kit重组连接试剂盒在50℃下连接15min后转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，转化子经含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选，克隆子经过ROL-F和kpnROL-R引物对菌落PCR筛选后，经测序验证正确的载体命名为pUAxp7166-ROL(图2)。
实施例4：ROL基因在解脂耶氏酵母Po1h中的高效无标记整合
本实施例采用pUAxp7166-ROL载体实现ROL基因在解脂耶氏酵母Po1h中无标记基因整合，实施过程包括以下步骤：
(1)质粒pUAxp7166-ROL经NsiI与upAxp同源片段处线性化后，经醋酸锂转化法转入解脂耶氏酵母Po1h感受态细胞，并将转化子接种于5mL的MD液体培养基(无氨基酵母氮碱13.4g/L，生物素0.4mg/L，20g/L葡萄糖)进行初筛，24h后取100μL生长液转接于新的5mL的MD液体培养基直至菌体浑浊，以进一步富集阳性转化子；
(2)将步骤(1)中获得的菌体取100μL转接至含有尿嘧啶的MO油酸诱导液体培养基(油酸20mL/L，无氨基酵母氮碱13.4g/L，生物素0.4mg/L，尿嘧啶22.4mg/L)，此时油酸诱导型启动子pPOX2被激活并调控Cre基因表达，诱导培养12-24h后，取菌液划线至YPD平板分离获得单克隆Po1h/ROL；
(3)随机挑选步骤(2)中的Po1h/ROL单克隆并分别点板至YPD和MD平板。如图3所示，几乎所有的克隆子均能在YPD平板正常生长而无法在MD平板生长，表明这些阳性克隆子中ura3标记基因被成功剔除。随机挑选7个Po1h/ROL阳性克隆子抽取基因组，通过ROL-F和kpnROL-R引物对进行PCR验证。如图4所示，从7个克隆子中均能扩增出略大于1000bp的明显条带，与ROL基因的理论大小相符，表明这7个克隆子中均含有ROL目的基因，即成功实现了ROL基因在解脂耶氏酵母Po1h中的高效无标记基因整合。
实施例5：Po1h/ROL菌株中进一步进行vgb基因的无标记整合
(1)以pUAxp7166-ROL质粒为模板，分别使用引物对mLeu-F/mLeu-R和XprTT-F2/Ampup-R扩增得到最小亮氨酸启动子mLeu和Xpr2TT’终止子片段；以Mlu-vgb质粒为模板，使用引物Yvgb-F和Yvgb-R克隆获得vgb基因片段。将mLeu、vgb和Xpr2TT’扩增产物等体积混合后作为模板，使用mLeu-F和Ampup-R引物重叠延伸PCR得到融合的mLeu-vgb-Xpr2TT’片段，该片段通过BglII和NotI双酶切后与经过相同双酶切后的pUAxp7166-ROL载体骨架片段进行连接，并转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，使用含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行筛选，克隆子经过Yvgb-F和Yvgb-R引物对菌落PCR筛选后，经测序验证正确的重组质粒命名为pUAxp7166-vgb(图5)。
(2)pUAxp7166-vgb经NsiI与upAxp同源片段处线性化后，经醋酸锂转化法转入解脂耶氏酵母Po1h/ROL感受态细胞，随后转化子的诱导和筛选过程与实施例4相同，结果几乎所有分离获得的Po1h/ROL-vgb克隆子也均能在YPD平板正常生长而无法在MD平板生长。随机挑选5个阳性克隆子抽取基因组，通过Yvgb-F和Yvgb-R引物对进行PCR验证，结果如图6所示，从这些克隆子中均能扩增出约400bp明显条带，与vgb基因的理论大小相符，表明这5个克隆子中均含有vgb目的基因，即进一步成功实现了vgb基因在解脂耶氏酵母Po1h/ROL中的高效无标记基因整合。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种解脂耶氏酵母无标记基因整合载体，其特征在于，该整合载体包括重组反应区，所述重组反应区包括从5，至3，顺序的左臂突变型lox序列、待剔除DNA片段和右臂突变型lox序列；所述左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列方向相同；
所述待剔除DNA片段包括解脂耶氏酵母筛选标记、Cre基因诱导表达盒、大肠杆菌筛选标记和复制起点；所述Cre基因诱导表达盒包括从5，至3，顺序的解脂耶氏酵母诱导型启动子、乳糖操纵基因序列lacO、Cre基因和终止子；利用所述乳糖操纵基因序列lacO可在含lacIq抑制子的大肠杆菌宿主中阻遏其下游基因表达的特性，避免Cre基因在大肠杆菌的泄露表达；
所述左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列能在所述载体整合至解脂耶氏酵母基因组后，在Cre重组酶作用下切除左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列之间的序列，并在基因组上生成双臂突变型lox序列；
所述整合载体在所述重组反应区外，还包括目的基因表达盒和同源片段，所述同源片段为解脂耶氏酵母宿主基因组中的序列，且其内部含有至少一个在所述整合载体上唯一存在的酶切位点。
2.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母无标记基因整合载体，其特征在于，所述解脂耶氏酵母筛选标记为抗生素筛选标记或营养缺陷型筛选标记。
3.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母无标记基因整合载体，其特征在于，所述解脂耶氏酵母诱导型启动子为pPOX2油酸诱导型启动子。
4.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母无标记基因整合载体，其特征在于，所述同源片段长度不小于500 bp。
5.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母无标记基因整合载体，其特征在于，所述目的基因表达盒两端紧邻一对在所述整合载体上唯一存在的同尾酶酶切位点，用于体外构建含多个基因表达盒的整合载体。
6.如权利要求1-5任一所述的解脂耶氏酵母无标记基因整合载体的应用，其特征在于，用于解脂耶氏酵母中基因无标记整合的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将所述解脂耶氏酵母无标记基因整合载体在同源片段内部线性化，再转化解脂耶氏酵母宿主感受态细胞，使用筛选培养基进行转化子筛选，所述筛选培养基为所述解脂耶氏酵母筛选标记对应的筛选培养基；
（2）将步骤（1）中筛选过的转化子接种于液体诱导培养基中培养至菌体浑浊，再取菌液划线接种于生长培养基平板分离得到单克隆；所述液体诱导培养基为所述Cre基因表达盒选用的解脂耶氏酵母诱导型启动子所需的诱导培养基；
（3）将步骤（2）中分离获得的单克隆分别接种至步骤（1）中的筛选培养基和步骤（2）中的生长培养基，在筛选培养基无法正常生长而能在生长培养基上正常生长的克隆子即为成功剔除筛选标记的阳性克隆子，进一步进行基因组验证确认，即获得目的基因无标记整合入解脂耶氏酵母的重组菌株。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，重复进行步骤（1）-步骤（3），即得到所述目的基因多次无标记整合的重组菌株。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述解脂耶氏酵母无标记基因整合载体中的目的基因替换为其它的目的基因，并按照步骤（1）-步骤（3）进行操作，得到不同目的基因无标记整合的重组菌株。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，转化解脂耶氏酵母宿主采用锂转化法或电转化法。
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