CN101228282A - 利用解脂耶氏酵母改进突变株生产二羧酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产具有长烃链的二羧酸(DCA)，也称为二酸的方法，其包括在基本上由包括至少一种碳源和一种氮源的高能底物组成的培养基中，培养通过定点诱变，以及更特定地，至少被破坏了编码乙酰基－CoA氧化酶的POX2、POX3、POX4和POX5基因而获得的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的突变菌株，并且使所述菌株经受选自有至少10个碳原子的n－烷烃，有至少10个碳原子的脂肪酸，其烷基酯类和天然油类的生物转化底物。

Description

利用解脂耶氏酵母改进突变株生产二羧酸
发明领域
本发明涉及一种利用解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的突变菌株，从由转化底物经过发酵生产二羧酸的方法。
二羧酸(也称作″二酸(diacid)″)被用来作为合成聚酰胺和聚酯、润滑油、塑化剂或芳香剂的基本原料。
二酸生产方法依据所涉及的二酸碳骨架的碳原子数目而不同(Johnson RW，Pollock CM，Cantrell RR，Editors Kirk-Othmer Encyclopediaof Chemical Technology，4th Edition，1983，pp.118-136)。因此，壬二酸(C9二酸)通常是通过油酸经由臭氧的化学氧化而获得，而癸二酸(C10二酸)是经蓖麻油酸的碱性氧化而产生；十二烷二酸(C12二酸)是石油化学的产品。微生物学用于从十三烷生产巴西基酸(C13二酸)。
考虑到相应于多种应用的二酸的多样性，能适用于最广泛二酸的可能生产路线的优势是勿庸置疑的。尽管生物生产比化学生产的反应速率要低，但是生物生产具有能够适用于多种底物的优势(在图1中用图解法显示了这个生物学的二酸生产过程)。
实际上，许多野生的微生物物种，例如新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，阴沟假丝酵母(Candida cloacae)等都能够分泌少量的二酸(Chan etal：Stimulation ofn-atkane conversion to dicaiboxylic acid by organic-solvent-and detergent-treated microbes.Appl.Microbiol.Biotechnol.34，1991，772-777；Shiio etal：Microbial Production of Long-chain Dicarboxylic Acids from n-Alkancs.Part I.Scrcening and Properties of Microorganisms Producing DicarboxylicAcids.A.Biol.Chcm.35，No.13，1971，p.2033-2042)。
然而为了获得足够量的二酸分泌物，必须使用阻断β-氧化反应的突变株。对于多数物种来说，这样的突变株是经过随机诱变、继之以适当的筛选而获得的(专利号EP 0229252B1；Shiio et al；Jiao et al.Isolation and Enzyme Determination of Candida tropicalis Mutants forDCA Production.I.Gen.Appi.Microbiol.2000，46：245-249)。
目前针对热带假丝酵母(Candida tropicalis)已经开发出更为精细、但同时更多限制的、利用定向诱变技术的备选方法。Picataggio等人对属于这个物种的野生菌株连续破坏了编码催化第一β-氧化阶段的乙酰基-CoA氧化酶(Aox)的两个同工酶的四个基因(Determination of Candidatropicalis Acylcoenzyme A Oxidase lsoenzyme Function by SequentialGene Diswption.Mol.Cell.Biol.11，1991，4333-4339，专利号US 5254466Al)。
继而上述作者过表达了编码细胞色素P450单加氧酶和NADPH-细胞色素还原酶的基因，其促成了限制n-烷烃转化为二酸的动力学活性(Picataggio et al：Metabolic Engineering of Candida tropicalis for theProduction of Long-chain Dicarboxylic Acids，Biotechnol，10，1992，394-898，专利US 5648247A1)。然而该热带假丝酵母突变株依照多拷贝扩增系统的生产并不是完全稳定的，其可能发生逆转。由此仍需要对现有技术(专利申请US 2004/0014198A1)进行改进。
发明目的
本发明的目的是为了克服现有技术的缺陷，本发明人发现使用被破坏掉编码乙酰辅酶A氧化酶基因的解脂耶氏酵母突变株来生产二酸是方便可行的。
根据本发明方法制备的二酸是带有具有至少10个碳原子，并且在链的两端分别有羧基功能团的线性烃链的有机化合物。
所使用的微生物是解脂耶氏酵母突变株，其中至少POX2，POX3，POX4和POX5基因破坏以部分阻断其β-氧化反应。
除POX2，POX3，POX4和POX5基因编码的乙酰辅酶A氧化酶之外，其他两个功能未知的、由POX1和POX6基因编码的乙酰辅酶A氧化酶也存在于解脂耶氏酵母的基因组中。
这两个乙酰辅酶A氧化酶通过连续除去两个碳原子，参与了二酸生物合成的再消耗。额外的POX1和POX6基因的破坏导致相应于生物转化底物分布的二酸生产。例如，如果主要由18个碳原子的脂肪酸组成的油酸向日葵油(oleic sunflower oil)用作生物转化底物，那么，去除了全部POX基因的突变株将会生产出主要含18个碳原子的二酸。
另一方面，该生物转化底物能够以甘油三酯的形式被储存起来，在细胞内部以脂肪体的形式存在，并因此变得难以通过生物转化成为二酸。通过蛋白质组分析鉴定了涉及该生物转化底物积聚的基因。我们鉴定了下列基因：DGA1(脂酰辅酶A：二酰甘油酰基转移酶)、TGL1(三酰基甘油酯酶)、G3P(甘油-3-磷酸脱氢酶)、SCP2(推定的固醇载体)、LR01(推定的卵磷脂胆固醇酰基转移酶)、以及IPF 621IPF(功能未知)、IPF 905(功能未知)，和IPF2569(NADH-泛醌还原酶亚基)。
因此这些基因活性的改变(通过破坏或过表达)导致在解脂耶氏酵母细胞内以脂肪体形式存在的生物转化底物的积累减少。
可注意到解脂耶氏酵母的遗传系统与热带假丝酵母(Candidatropicalis)的遗传系统差别悬殊。与二倍体的酵母热带假丝酵母不同，实际上解脂耶氏酵母是一个单倍体物种。因此在后者中，由于单套染色体的存在，基因的缺失操作更加有效且稳定。
另一方面，编码乙酰辅酶A氧化酶的POX2基因的启动子被用于过表达基因，例如那些编码P450单加氧酶细胞因子的基因和编码NADPH-细胞色素还原酶的基因。启动子pPOX2具有被生物转化底物高度诱导的特性。因此，与热带假丝酵母突变株通过一个多拷贝扩增系统来获得过表达不同，为了获得有效、稳定和不逆转的解脂耶氏酵母突变株，目的基因的过表达通过在启动子pPOX2的控制下添加单个基因拷贝来进行。
对于从诸如脂肪酸酯或天然油类、植物油中生产二酸，解脂耶氏酵母超过热带假丝酵母的另一个优点如下：由热带假丝酵母将天然油类转换为二酸，要求在发酵之前底物发生部分的化学水解(见专利US5,962,285)。这些水解反应是在有钙或镁氢氧化物存在下经过皂化作用完成的。这产生了相应的脂肪酸盐(皂)。现在，解脂耶氏酵母具有同化甘油三酯作为碳源的能力。这些分解代谢的第一个阶段包括经过脂肪分解酶(解脂酶)作用，甘油三酯成为游离脂肪酸的水解反应。细胞外的脂肪酶活性和两个分别为39和44kDa的细胞膜脂肪酶(Barth etat.Yarrowia lipolytica.in：Nonconventional Yeasts in Bioteclmology AHandbook(Wolf，K.Ed.)，Vol.1，1996，pp.313-388.Springer-Verlag)在后文有描述。解脂耶氏酵母可以产生若干脂肪酶(细胞外的、细胞膜的和胞内活性)。最近，相对于所述脂肪酶的基因已经被鉴定出来。LIP2基因编码细胞外的脂肪酶，Lip2p(Piede et al.2000)。已经显示该酶更适于水解油酸残基的长链甘油三酯(Barth et al 1996)。
因此，在与发酵处理相适合的pH状况下，解脂耶氏酵母直接水解酯和天然油类变为游离脂肪酸和甘油。在这样的情况下，酯或油类的水解反应以及其转换为二酸是同时发生的，因为化学的水解反应阶段被去除了，这样一个简单的操作方案具有优势。
发明详述
以更详细的方式，本发明提供一种生产至少一种二羧酸的方法，包括：
(a)生长阶段，其中在基本上由包括至少一种碳源和一种氮源的高能底物组成的培养基中培养至少被破坏了POX2、POX3、POX4和POX5基因(编码乙酰基-CoA氧化酶)的解脂耶氏酵母突变体菌株，
(b)生物转化阶段，其中，在高能底物存在下，使所述的菌株与下述生物转化底物作用，所述生物转化底物选自具有至少10个碳原子的n-烷烃，具有至少10个碳原子的脂肪酸，这些脂肪酸的具有1到4个碳原子的烷基酯类和天然油类，例如甲基或乙基酯的混合物，或天然油类(甘油的脂肪酸酯的混合物)，以及
(c)回收所形成二羧酸的阶段。
根据本发明的方法所使用的菌株来自于野生的解脂耶氏酵母W29菌株(ATCC 20460，在Collection de Lenires 
Figure A20058004832200101
Biotechnologique-CLIB中以CLIBS9记录)。
因此，借助于在G.Barth等人的综述中描述的Pold菌株【亮氨酸(leu-)和尿嘧啶(ura-)营养缺陷型菌株】方式，使用来源于解脂耶氏酵母ATCC20460菌株的新的突变株是可行的。其在CLIB中记录为CLIB139。
获得这些新的突变株(MTLY37，MTLY66，MTLY74，MTLY79，MTLY80，MTLY81，FT 120和FT 130)的方法描述如下。
在本发明所述的二酸生产方法中，选择的突变株培养在基本上由包括至少一种碳源和一种氮源的高能底物组成的培养基中直到生长结束。然后加入该生物转化底物(链烷或链烷混合物，脂肪酸或脂肪酸混合物，脂肪酸酯或脂肪酸酯混合物或天然油脂或这些不同底物的混合物)，以起始二酸的生物转化，并且形成的二酸通过本领域技术人员已知的技术，例如钙盐沉淀来回收。
在生物转化阶段中，培养基可包含通常由至少一个多羟基化合物，例如甘油或糖组成的一定量次级高能底物。
1.获得突变菌株MTLY37
获得这个菌株的方法可以如下：
1)对感兴趣的基因测序(或这个基因的序列可在数据库中获得)，
2)利用可反选的标记，例如标记URA3(用这个标记可以选择Ura+表现型或Ura-表现型)，经PCR(聚合酶链式反应)或克隆构建破坏盒(disruption cassette)，
3)选择被缺失了感兴趣基因的菌株(转化和转化子的选择)(如果标记是URA3则Ura+更有利)和检查该基因的破坏。
获得突变株MTLY37的特定方法后文有描述。
序列不同于热带假丝酵母的野生菌株的POX基因序列首先被克隆和测序。然后构建了编码乙酰辅酶A氧化酶的同工酶基因的破坏盒。使用可选择标记URA3破坏乙酰辅酶A氧化酶的基因。使用特殊的寡核苷酸对，经过第一PCR扩增启动子和终止子区域，其来消除来自开放阅读框(ORF)的完全序列。然后用外部引物和该启动子和终止子的PCR产物进行第二PCR，其通过包括限制性酶I-Secl位点的20bp的共同延伸来融合。克隆该PCR产物以产生一系列包含该启动子-终止子模块(破坏盒2)的质粒(通过pPOX-PT设计)。
将URA3基因导入POX-PT盒的I-Scel位点。构建一系列包含该启动子-URA3-终止子模块的pPOX-PUT质粒(破坏盒1)。一方面，对于包含破坏盒1的质粒，这些构建体被称为pPOX1-PUT，pPOX2-PUT，pPOX3-PUT，pPOX4-PUT和pPOX5-PUT，另一方面，对于含有破坏盒2的质粒，这些构建体被称为pPOX1-PT，pPOX2PT，pPOX3-PT，pPOX4-PT和pPOX5-T。
使用例如Pfu聚合酶(由加利福尼亚的Stratagenc La Jolla提供)，用特异性外部引物经PCR来扩增破坏盒。该蛋白质序列的最终分析表明，解脂耶氏酵母的乙酰辅酶A氧化酶与其他酵母的乙酰辅酶A氧化酶具有45％的同一性程度(50％相似性)。它们之间的同一性程度范围在55到70％之间(65到76％相似性)。
在构建编码乙酰辅酶A氧化酶基因的破坏盒之后，可以通过各种方法进行解脂耶氏酵母的转化。可通过电击方法导入DNA来进行电穿孔。更有利的是，可使用乙酸锂和聚乙二醇方法。Gaillardin等人对此有描述：LEU2Directed Expression of Beta gallactosidase Activity PhleomycinResistance in Yarrowia lipolytica.Curr.Genet.11.987，369-375。
按照Gussow等人的方法：Direct Clone Characterization from Plaquesand Colonies by the Polymerase Chain Reaction.Nucleic Acids Res.17，1989，4000，通过PCR检验破坏的存在，之后用Southern印迹杂交来确认。
首先对Pold菌株的在两个阶段进行破坏。
先用PCR PUT破坏盒1转化Pold并选择。然后用破坏盒2来转化Ura+克隆以消除URA3基因并对其选择。这个操作方案允许获得经破坏的MTLY37-pox2ΔPT-pox3ΔPT-pox4ΔPT pox5ΔPUT。这个突变体的构建体的图示总结在下述表1中。
表1：不再生长在油酸中的突变体MTLY37的生产所需要的转化阶段
基因的破坏和标记的切除还可通过涉及重组或重组酶的方法来进行。例如可使用在两边都带有重复序列(可进行所选择的重组)或被重组酶Cre所识别的lox序列的标记。当重组酶Cre表达时就会发生切除，Fickers等：2003New Disruption Cassettes for Rapid Gene Disruption andMarker Rescue in the Yeast Yarrowia lipolytica.3.Microbiol.Methods55/3：727-737。
2.获得解脂耶氏酵母菌株突变体MTLY74
菌株MTLY74Leu+Ura-从突变体MTLY37构建。
2a.从原养的突变体MTLY37(Leu+，Ura+)构建对亮氨酸和尿嘧啶是营养缺陷的(Leu-，Ura-)解脂耶氏酵母菌株突变体MTLY66。第一个阶段是构建尿嘧啶营养缺陷型的菌株MTLY40(Leu+，Ura-)，通过转化包含ura3-41标记的PCR片段，来将标记URA3转换为标记ura3-41，并在有5FOA存在下选择Ura-。从突变株MTLY40构建对亮氨酸呈营养缺陷型的突变株解脂耶氏酵母菌株MTLY64(Leu-，Ura-，Hyg+)，其通过转化破坏盒PHTleu2来破坏标记LEU2并对抗性潮霉素转化子进行选择(leu2::Hyg)来完成。从突变株MTLY64构建对亮氨酸营养缺陷型的突变株解脂耶氏酵母菌株MTLY66(Leu-，Ura-)，其通过转化含有重组酶Cre和标记LEU2的复制型载体pRRQ2(Cre-LEU2)来切除HYG标记，并选择潮霉素敏感的转化子，Leu+来实现。通过在丰富培养基YPD上培养和分离克隆来实现质粒pRRQ2的丢失(Leu-，Ura-，Hyg-)。
2b.从突变株MTLY66构建在经脂肪酸、脂肪酸酯或天然油脂型的生物转化底物诱导强启动子pPOX2的控制下进行表达而过表达NADPH-细胞色素还原酶的解脂耶氏酵母菌株突变体MTLY74Leu+Ura-。
将编码NADPH-细胞色素还原酶(CPR)的基因被导入含有选择基因LEU2的载体，例如JMP21载体中，使其在可用脂肪酸、脂肪酸酯或天然油类来诱导的启动子pPOX2的控制下。通过转化导入该标记-启动子-基因盒(LEU2-pPOX2-CPR)。
该突变株的构建总结于下述表2中。
表2：从MTLY37生产突变株MTLY74所需要的转化阶段
Figure A20058004832200141
3.从共同的突变株MTLY74获得菌株MTLY79、MTLY80和MTLY81
3a.在脂肪酸、脂肪酸酯或天然油类可诱导的启动子pPOX2的控制下，MTLY79表达NADPH-细胞色素还原酶和细胞色素P450单加氧酶ALK1。
从突变株MTLY74构建突变株解脂耶氏酵母菌株MTLY79，所述的MTLY79在生物转化条件下过表达在由脂肪酸，脂肪酸酯或天然油脂类型的生物转化底物诱导的强启动子pPOX2控制下的NADPH-细胞色素还原酶和细胞色素P450单加氧酶ALK1。
在包含URA3选择基因的，例如JMP61的载体中引入编码细胞因子P450单加氧酶的ALK1基因，使其处于可由脂肪酸或脂肪酸酯或天然油类诱导的启动子pPOX2控制之下。该标记-启动子-基因盒(TJRA3-pPOX2-AKL1)经过转化被引入。
这个突变株的构建总结于表3中。
表3：从MTLY74生产过表达ALK1和CPR的突变株MTLY79所需要的转化阶段
Figure A20058004832200151
3b.在受脂肪酸、脂肪酸酯或天然油类诱导的启动子pPOX2的控制下的、表达NADPH-细胞色素还原酶和细胞色素P450单加氧酶ALK2的MTLY80。
从突变株MTLY74构建突变株解脂耶氏酵母菌株MTLY80，其在生物转化条件下过表达受脂肪酸，脂肪酸酯或天然油脂类型的生物转化底物诱导的强启动子的控制的、编码NADPH-细胞色素还原酶(CPR)和细胞色素P450单加氧酶(ALK2)的基因。
将编码细胞色素P450单加氧酶的ALK2基因引入包含URA3选择基因的载体，例如JMP61中，使其处于可由脂肪酸、脂肪酸酯或天然油类诱导的启动子pPOX2的控制之下。该标记-启动子-基因盒(URA3-pPOX2-AKL2)经过转化被引入。
这个突变株的构建总结于下述表4中。
表4：从MTLY74生产过表达ALK2和CPR的突变株MTLY80所需要的转化阶段
3c.在可受脂肪酸、脂肪酸酯或天然油类诱导的启动子pPOX2控制下的、表达NADPH-细胞色素还原酶而没有细胞色素P450单加氧酶的基因(ALK1或ALK2)的MTLY81。
从突变株MTLY74，构建突变株解脂耶氏酵母菌株MTLY81，其在脂肪酸、脂肪酸酯或天然油脂类型的生物转化底物诱导的强启动子pPOX2控制下，过表达编码NADPH-细胞色素还原酶的基因(CPR)。
突变株MTLY74已经用带有标记URA3的质粒JMP61转化而成为原养型。
这个突变株的构建总结于下述表5中。
表5：从MTLY74生产过表达CPR的突变株MTLY81所需要的转化阶段
Figure A20058004832200161
4.获得突变株FT120
这个菌株可通过按照与构建菌株MTLY37或菌株MTLY66同样的方法来获得：
1)用PCR(聚合酶链式反应)或克隆构建破坏盒，其中使用可反选的标记，例如标记URA3(通过该标记可以选择Ura+表现型或Ura-表现型)，或使用在两侧都有重复顺序(可进行所选择的重组)或被重组酶Cre识别的lox序列，
2)选择缺失目的基因的菌株(转化和转化子的选择；如果该标记是URA3则更有利)，并检验该基因的破坏，
3)选择缺失标记的菌株(转化和转化子的选择)；如果该标记是URA3则用5FOAR有更利，或者，如果该标记存在Iox序列则用表达重组酶的质粒更有利，并且检验该基因的破坏。
获得突变株FT120的特定方法在下文有描述。
从突变体MTLY66构建菌株FT120Leu-Ura-，Δpoxl-6。
4a.从突变株MTLY66Δpox2-5中，按照如上所述的方法，利用POX1和POX6基因缺失以及标记缺失的插入，构建突变株解脂耶氏酵母菌株MTLY95Δpoxl-6。
4b.从突变株MTLY95构建在生物转化条件下过表达编码NADPH-细胞色素还原酶基因(CPR)的解脂耶氏酵母菌突变株FT101Leu+Ura-，其是通过使之在脂肪酸、脂肪酸酯或天然油脂类的生物转化底物诱导的强启动子pPOX2控制下表达进行的。
将编码NADPH-细胞色素还原酶的基因引入包含可切除的LEU2选择基因的载体中，例如JMP21-LEU2ex，使其处于可由脂肪酸、脂肪酸酯或天然油类诱导的启动子pPOX2控制之下。该标记-启动子-基因盒(LEU2ex-pPOX2-CPR)通过转化被导入。在用pUB4-CRE质粒转化、Hyg+选择、YPD上的质粒丢失以及Leu-克隆的最后分离，切除标记LEU2ex之后获得FT120菌株。
这个突变株的构建总结于下述表6中。
表6：从MTLY66生产突变体FT120所需要的转化阶段
Figure A20058004832200181
5.获得突变株FT130
这个菌株可以按照与构建FT120菌株同样的方法来获得：
1)用PCR(聚合酶链式反应)或克隆构建破坏盒，其中利用可反选的标记，例如标记URA3(用这个标记可以选择Ura+表现型或Ura-表现型)、或利用在两侧都有重复顺序(可进行所选择的重组)或被重组酶Cre识别的lox序列，
2)选择缺失目的基因的菌株(转化和选择转化子；如果该标记是URA3，用Ura+更有利)，以及检验该基因的破坏。
3)选择缺失标记的菌株(转化和选择转化子)，如果该标记是URA3，用5FOAR更有利，或者，如果该标记显示lox序列则用表达重组酶Cre的质粒更有利，并且检验该基因的破坏。
获得突变株FT130的特定方法如后文所述。
从突变株FT120构建菌株FT130Leu-Ura-，Δpoxl-6，Δdgal。
6.从突变株FT120Leu-Ura-，Δpoxl-6，pPOX2-CPR，通过插入编码乙酰辅酶A二酰甘油酰基转移酶的DGA1基因的缺失，构建突变株解脂耶氏酵母菌株FT 130Leu-Ura+Δpoxt-6，pPOX2-CPR，Δdgal。
表7：从FT120生产突变株FT130所需要的转化阶段
菌株MTLY66，MTLY81，FT120和FT130保藏在国家微生物保藏中心Collection Nationale de Cultures de Microorganismes中，其各自的保藏号为CNCM I-3319，CNCM I-3320，CNCM I-3527和CNCM I-3528。
下述实施例是对本发明的举例说明，但并不限于此范围。
实施例
在这些实施例中，我们已经测试过培养条件以及培养基组成对二酸生产的影响。因此我们观察到对于突变株MTLY37，利用蛋白胨极大地促进了二酸的生产，与应用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)相比效果尤为显著(实施例1和2)。
我们也已经在同样的条件下测试了突变株MTLY79、MTLY80和MTLY81。我们观察到NADPH细胞色素还原酶在二酸的生产中催化限制性阶段。实际上，该酶单独过表达即可显著提高二酸的产量和产率(实施例4到6)。
我们在相同的条件下测试了突变株FT120和FT130(实施例7和8)。对于FT120，POX1和POX6基因的缺失可使得二酸的降解减少。编码乙酰辅酶A二酰甘油酰基转移酶的额外的DGA1基因的缺失导致了解脂耶氏酵母细胞内部以脂体形态存在的生物转化底物累积的减少。因此在这些实施例中获得的大部分二酸由18个碳原子的二酸组成，类似于所用的生物转化底物基本上由18个碳原子的脂肪酸组成。
实施例1：用突变株MTLY37从油酸向日葵油生产二羧酸的方法
将突变株MTLY37接种于组成为：酵母提取物10g.l-1、蛋白胨10g.l-1、葡萄糖10g.l-1、琼脂20g.l-1的半乳聚糖培养基中，进行预培养，使得该预培养初始吸光率接近于0.30。在含有25毫升培养基(10g.l-1酵母提取物，10g.l-1蛋白胨，20g.l-1葡萄糖)的500毫升凸缘烧瓶(flanged flask)中，在轨道搅拌(orbital stirring)下(200rpm)于30℃进行预培养24小时。
用于培养的培养基由去离子水、10g.l-1酵母提取物，20g.l-1胰蛋白胨，40g.l-1葡萄糖和30g.l-1油酸向日葵油组成。
用全部的预培养烧瓶接种发酵罐。
在30℃下，在装有2L培养基的4-L发酵罐中进行培养，送气速率为0.5vvm，由复动式内流涡轮机提供800rpm的搅拌速度。
培养17小时后、一旦该培养基的葡萄糖用完，将基本上由18个碳原子脂肪酸组成的60ml油酸向日葵油加入到该反应器中，按1ml h-1的速率连续供给甘油。然后通过添加4M苏打来调整培养物的pH值，使之维持在恒定值8。发酵持续130h。
在培养过程的末尾，通过离心除去细胞生物质。然后通过添加6MHCl使上清液酸化达到pH值为2.5，并且不溶解的二羧酸通过离心酸化的麦芽汁来收集，然后干燥。
该混合物的二羧酸组成按照Uchio等：Microbial Production of Long-chain Dicarboxylic Acids from n-Alkanes.Part II.Production by Candidacloacae Mutant Unable to Assimilate Dicarboxylic Acid.Agr Biol.Chem.36，No，3,1972，426-433，描述的方法，通过将二羧酸转换为二酯之后，在DB1柱中用气相色谱法测定。色谱仪加热炉的温度可程序设置为以8℃/min的速率从150℃到280℃。
该结果显示在130h后，5.9g.l-1的上清液中有最大量的二酸产生。
实施例2
在培养基中用同样浓度的蛋白胨代替胰化蛋白胨，重复实施例1。培养130h后，获得9.9g.l-1的二羧酸，即与实施例1相比增加了大约68％的产量。
实施例3：提供连续的油酸向日葵油，由突变株MTLY37生产二羧酸
重复实施例2，从培养基中移去油酸向日葵油，并且代之以将这种油以1ml的次极限流量连续注入反应器中。
在上述条件下，130h后，在该培养基中产生了14.7g.l-1的二羧酸。
实施例4：用过表达CPR和ALK1的突变株MTLY79从油酸向日葵油生产二羧酸
用过表达CPR和ALK1基因的突变株MTLY79代替突变株MTLY37，重复实施例3。培养130h后，获得16g.l-1的二羧酸。
实施例5：用过表达CPR和ALK2的突变株MTLY80从油酸向日葵油生产二羧酸
用过表达CPR和ALK2基因的突变株MTLY80代替突变株MTLY37，重复实施例3。培养130h后，获得16g.l-1的二羧酸。
实施例6
用单独过表达CPR基因的突变株MTLY81代替突变株MTLY37，重复实施例3。培养130h后，获得16g.l-1的二羧酸。
实施例7：用缺失六个POX(Δpoxl-6)基因和过表达CPR基因的突变株FT 120从油酸向日葵油生产二羧酸
用缺失六个POX基因并且仅过表达CPR基因的突变株FT120代替突变株MTLY37，来重复实施例3。培养130h后，获得18g.l-1的二羧酸。
实施例8：用缺失六个POX(Δpoxl-6)基因和缺失DGA 1基因(Δdgal)以及过表达CPR基因的突变株FT 130从油酸向日葵油生产二羧酸
用缺失六个POX基因和缺失DGA1基因以及过表达CPR基因的突变株FT 130代替突变株MTLY37来重复实施例3。培养130h后，获得23g.l-1的二羧酸。

Claims (24)

1.一种生产二羧酸的方法，包括：
(a)生长阶段，其中将至少被破坏了POX2、POX3、POX4和POX5基因(编码乙酰基-CoA氧化酶)的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)突变体菌株在基本上由包括至少一种碳源和一种氮源的高能底物组成的培养基中培养，
(b)生物转化阶段，其中在高能底物存在下，使所述的菌株与选自具有至少10个碳原子的n-烷烃，具有至少10个碳原子的脂肪酸，这些脂肪酸的具有1到4个碳原子的烷基酯类和天然油类的生物转化底物作用，以及
(c)回收所形成的二羧酸的阶段。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用的突变体是MTLY37。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用的突变体是过表达CPR和ALK1基因的MTLY79。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用的突变体是过表达CPR和ALK2基因的MTLY80。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用的突变体是过表达CPR基因的MTLY81。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用的突变体是过表达CPR基因的FT120。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用的突变体是过表达CPR基因的FT130。
8.如权利要求1至5中任意一项所述的方法，其特征在于所述的生物转化底物由甲酯类物质的混合物或乙酯类物质的混合物组成。
9.如权利要求1至5中任意一项所述的方法，其特征在于所述的生物转化底物由油酸向日葵油组成。
10.如权利要求1至7中任意一项所述的方法，其特征在于在生物转化阶段，培养基包括蛋白胨。
11.如权利要求1至8中任意一项所述的方法，其特征在于在生物转化阶段，培养基包括由至少一个多羟基化合物组成的一定量的次级高能底物。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述的多羟基化合物是甘油或糖。
13.如权利要求1至10中任意一项所述的方法，其特征在于在(c)阶段，以钙盐形式的沉淀回收二羧酸。
14.一种利用作为选择标记的LEU2和URA3基因进行转化的、由原养型突变体MTLY37获得解脂耶氏酵母营养缺陷型突变体菌株MTLY66、Leu-Ura-的方法，其特征在于阶段1到3的转化操作按下述表格进行：
Figure A2005800483220003C1
15.一种从突变体MTLY66获得在生物转化条件下过表达编码NADPH-细胞色素还原酶的CPR基因的解脂耶氏酵母突变体菌株MTLY74Leu+Ura-的方法，该方法通过利用包含选择标记LEU2和带有CPR基因的表达盒的JMP21-CPR载体的转化来获得，其中所述的CPR基因受控于可由脂肪酸、脂肪酸酯或天然油类诱导的启动子pPOX2。
16.一种从解脂耶氏酵母菌株突变体MTLY74获得在生物转化条件下过表达编码NADPH-细胞色素还原酶和细胞色素P450单加氧酶基因的解脂耶氏酵母菌株突变体MTLY79的方法，该方法通过利用包含选择标记URA3和带有ALK1基因的表达盒的JMP21-ALK1载体的转化来获得，其中所述的ALK1基因受控于可由脂肪酸、脂肪酸酯或天然油类诱导的启动子pPOX2。
17.一种在从解脂耶氏酵母菌株突变体MTLY74获得生物转化条件下过表达编码NADPH-细胞色素还原酶和细胞色素P450单加氧酶ALK2基因的解脂耶氏酵母菌株突变体MTLY80的方法，该方法通过利用包含选择标记URA3和带有ALK2基因的表达盒的JMP61-ALK2载体的转化来获得，其中所述的ALK2基因受控于可由脂肪酸、脂肪酸酯或天然油类诱导的启动子pPOX2。
18.一种从解脂耶氏酵母菌株突变体MTTX74获得原养型解脂耶氏酵母菌株突变体MTLY81的方法，其中所述菌株突变体MTLY81在生物转化条件下过表达编码NADPH-细胞色素还原酶的CPR基因，所述的CPR基因在可由脂肪酸、脂肪酸酯或天然油脂类型的生物转化底物诱导的启动子pPOX2控制下表达，且其中通过利用带有URA3标记的JMP61质粒转化使突变体MTLY74成为原养型。
19.一种从解脂耶氏酵母菌株突变体MTLY66获得解脂耶氏酵母菌株突变体FT120 Leu-Ura-的方法，其特征在于按照下述表格阶段1到4的转化操作进行：
Figure A2005800483220005C1
并且突变体菌株FT101 Leu+Ura-的构建是由在生物转化条件下过表达编码NADPH-细胞色素还原酶的基因(CPR)的解脂耶氏酵母菌株MTLY95进行的，其中通过利用包含可切除的选择标记LEU2和可由脂肪酸、脂肪酸酯或天然油类诱导的启动子控制下的CPR基因的载体JMP21LEU2ex-CPR来获得，菌株FT120是通过pUB4-CRE质粒转化切除标记LEU2ex、Hyg+选择、在YPD上的质粒丢失、以及最终分离Leu-克隆之后获得的。
20.一种从解脂耶氏酵母菌株突变体FT120处获得解脂耶氏酵母菌株突变体FT130的方法，其特征在于是按照下述的转化阶段进行的：
Figure A2005800483220006C1
21.新的解脂耶氏酵母菌株突变体MTLY66。
22.新的解脂耶氏酵母菌株突变体MTLY81。
23.新的解脂耶氏酵母菌株突变体FT120。
24.新的解脂耶氏酵母菌株突变体FT130。
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