ES2346773T3 - Produccion de acidos dicarboxilicos mediante cepas mutantes mejoradas de yarrowia lipolytica. - Google Patents
Produccion de acidos dicarboxilicos mediante cepas mutantes mejoradas de yarrowia lipolytica. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de producción de ácidos dicarboxílicos, caracterizado por que comprende: a) una fase de crecimiento, en la que se cultiva una cepa mutante de Yarrowia lipolytica que tiene alterados al menos los genes que codifican las isoenzimas de acil-CoA oxidasa POX2, POX3, POX4 y POX5; en un medio de cultivo constituido esencialmente por un sustrato energético que comprende al menos una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno; b) una fase de bioconversión, en la que se somete a dicha cepa a un sustrato de bioconversión seleccionado entre n-alcanos de al menos 10 átomos de carbono, ácidos grasos de al menos 10 átomos de carbono, ésteres de alquilo de 1 a 4 átomos de carbono de estos ácidos grasos, y aceites naturales, en presencia de un sustrato energético; y c) una fase de recuperación del ácido dicarboxílico formado.
Description
Producción de ácidos dicarboxílicos mediante
cepas mutantes mejoradas de Yarrowia lipolytica.
La invención se refiere a un procedimiento de
producción de ácidos dicarboxílicos mediante una fermentación que
emplea una cepa mutante de la levadura Yarrowia lipolytica a
partir de un sustrato de bioconversión.
Los ácidos dicarboxílicos (también llamados
"diácidos") se utilizan como materias primas, por ejemplo, en
la síntesis de poliamidas y de poliésteres, de aceites lubricantes,
de agentes plastificantes o de perfumes.
Los procedimientos de producción de los diácidos
varían según el número de átomos de carbono del esqueleto carbonado
del diácido en cuestión (Johnson RW, Pollock CM, Cantrell RR,
Editors Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical
Technology, 4^{th} Edition, 1983, págs. 118-136).
De este modo, el ácido azelaico (diácido de C9) se obtiene
convencionalmente mediante oxidación química del ácido oleico con
ozono mientras que el ácido sebácido (diácido de C10) se produce
mediante oxidación alcalina del ácido ricinoleico. El ácido
dodecanodioico (diácido de C12) es un producto petroquímico. La vía
microbiológica se utiliza para la producción de ácido brasílico
(diácido de C13) a partir de tridecano.
Teniendo en cuenta la diversidad de los diácidos
que se utilizan en las diferentes aplicaciones, el interés de una
vía de producción aplicable a la más amplia gama posible de diácidos
es incontestable. Aunque caracterizándose por una velocidad de
reacción más lenta que la de la vía química, la vía biológica
presenta el interés de ser aplicable a gran variedad de sustratos
(el proceso de producción de diácidos por vía biológica se
representa esquemáticamente en la figura 1).
De hecho, numerosas especies microbianas
silvestres tales como Cryptococcus neoformans, Pseudomonas
aeruginosa, Candida cloacae, etc. son capaces de
excretar pequeñas cantidades de diácidos (Chan et al.,
Stimulation of n-alkane conversion to dicarboxylic
acid by organic-solvent- and
detergent-treated microbes. Appl. Microbiol.
Biotechnol., 34, 1991, 772-777; Shiio et al.:
Microbial Production of Long-chain Dicarboxylic
Acids from n-Alkanes. Part I. Screening and
Properties of Microorganisms Producing Dicarboxylic Acids. Agr.
Biol. Chem. 35, No. 13, 1971, págs. 2033-2042).
Sin embargo, para obtener excreciones
sustanciales de diácidos, es conveniente utilizar mutantes que hayan
sido bloqueados a nivel de la \beta-oxidación.
Para muchas especies, dichos mutantes se obtuvieron mediante una
mutagénesis aleatoria, seguida de una selección apropiada (patente
EP 0 229 252 B1; Shiio et al.; Jiao et al. Isolation
and Enzyme Determination of Candida tropicalis Mutants for
DCA Production. J. Gen. Appl. Microbiol. 2000, 46:
245-249). Una vía mucho más elegante, pero más
exigente, que emplea las técnicas de mutagénesis dirigida, se ha
desarrollado sin embargo para Candida tropicalis. A partir de
una cepa silvestre que pertenece a esta especie, Picataggio et
al., alteraron secuencialmente los cuatro genes que codifican
las dos isoenzimas de acil-CoA oxidasa (Aox) que
catalizan la primera etapa de la \beta-oxidación
(Determination of Candida tropicalis Acylcoenzyme A Oxidase
Isoenzyme Function by Sequential Gene Disruption. Mol. Cell. Biol.
11, 1991, 4333-4339, y Patente de Estados Unidos Nº
5254466 A1).
Estos mismos autores sobreexpresaron a
continuación los genes que codifican la citocromo P450 monooxigenasa
y la NADPH-citocromo reductasa, que constituyen las
actividades que limitan la cinética de la conversión de los
n-alcanos en diácidos (Picataggio et al.: Metabolic
Engineering of Candida tropicalis for the Production of
Long-chain Dicarboxylic Acids. Biotechnol. 10, 1992,
894-898, y Patente de Estados Unidos Nº 5 648 247
A1). Sin embargo, los mutantes de Candida tropicalis
producidos de acuerdo con un sistema de amplificación de múltiples
copias no parecen totalmente estables y se prestan a posibles
reversiones. Es por esta razón que se han debido aportar mejoras a
la técnica anterior (Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº
2004/0014198 A1).
Whang et al., (J. of Bacteriology, vol.
181, nº 17, septiembre de 1999, páginas 5140-5148)
describe mutantes de Yarrowia lipolytica cuyos genes que
codifican acil-CoA oxidasa han sido alterados.
Wache et al., (Applied and Environmental
Microbiology, vol 67, nº 12, diciembre de 2001, páginas
5700-5704) describe la transformación de
ricinoleato en \gamma-decalactona, mediante cepas
mutantes de Yarrowia lipolytica en las que se han alterado
los genes que codifican acil-CoA oxidasa.
El objeto de la invención es remediar los
inconvenientes de la técnica anterior. Se ha descubierto, en efecto,
que era posible, de manera ventajosa, producir diácidos utilizando
mutantes de Yarrowia lipolytica cuyos genes que codifican
acil-CoA oxidasa han sido alterados.
Los diácidos que el procedimiento de la
invención pretende preparar son compuestos orgánicos de cadena
hidrocarbonada lineal de al menos 10 átomos de carbono que
comprenden una función carboxílica en cada extremo de la cadena.
Se utiliza como microorganismo un mutante de
Yarrowia lipolytica en el que al menos los genes POX2,
POX3, POX4 y POX5 han sido alterados, para
bloquearlo parcialmente a nivel de la
\beta-oxidación.
Aparte de las acil-CoA oxidasas
codificadas por los genes POX2, POX3, POX4 y
POX5, otras dos acil-CoA oxidasas
codificadas por los genes POX1 y POX6, de función
desconocida, están presentes en el genoma de Yarrowia
lipolytica.
Estas dos acil-CoA oxidasas
están implicadas en el consumo de nuevo de los diácidos
biosintetizados mediante eliminación secuencial de dos átomos de
carbono. La alteración suplementaria de los genes POX1 y
POX6 conlleva por lo tanto la producción de diácidos que
corresponden al perfil del sustrato de bioconversión. Por ejemplo,
si se utiliza el aceite de girasol oleico, compuesto en su mayoría
por ácidos grasos con 18 átomos de carbono, como sustrato de
bioconversión, la cepa a la que se le delecionó el conjunto de los
genes POX, producirá en su mayoría diácidos con 18 átomos de
carbono.
Por otro lado, el sustrato de bioconversión
puede almacenarse en forma de triglicéridos en la propia célula en
forma de cuerpos lipídicos y volverse, por lo tanto, inaccesible
para su bioconversión en diácidos. Se identificaron genes, mediante
análisis proteómico, que estaban implicados en la acumulación del
sustrato de bioconversión. Se identificaron los genes: DGA1
(acil-CoA:diacilglicerol aciltransferasa)
TGL1 (triacilglicerol lipasa), G3P
(glicerol-3-fosfato deshidrogenasa),
SCP2 (supuesto transportador de esterol), LR01
(supuesta lecitina colesterol aciltransferasa) así como los IFP 621
(función desconocida), IPF 905 (función desconocida), e IPF 2569
(sub-unidad NADH-ubiquinona
reductasa).
La modificación de la actividad de estos genes
(mediante alteración o sobreexpresión) conlleva, por lo tanto, una
disminución de la acumulación del sustrato de bioconversión en forma
de cuerpos lipídicos en el interior de la célula de Yarrowia
lipolytica.
Se observará que el sistema genético de
Yarrowia lipolytica es muy diferente del de Candida
tropicalis. Al contrario que Candida tropicalis que es
una levadura diploide, Yarrowia lipolytica es, en efecto,
una especie haploide. En este último microorganismo, las operaciones
de deleción génica son, por lo tanto, mucho más eficaces y más
seguras, debido también a la presencia de un único juego de
cromosomas.
Por otro lado, un promotor del gen POX2 que
codifica acil-CoA oxidasa se utiliza para
sobreexpresar genes tales como, por ejemplo, los que codifican la
citocromo P450 mono-oxigenasa y la
NADPH-citocromo reductasa. El promotor pPOX2 tiene
la propiedad de ser un promotor fuerte inducible por los sustratos
de bioconversión. De este modo, la sobreexpresión de un gen de
interés se realiza mediante la adición de una sola copia del gen
bajo el control del promotor pPOX2, permitiendo obtener mutantes de
Yarrowia lipolytica eficaces, estables y que no revierten,
al contrario que los mutantes de Candida tropicalis obtenidos
mediante un sistema de amplificación de múltiples copias.
Otra ventaja de Yarrowia lipolytica sobre
Candida tropicalis para la producción de diácidos a partir
de ésteres de ácidos grasos o de aceites naturales, por ejemplo
vegetales, es la siguiente: la transformación de los aceites
naturales en diácidos mediante Candida tropicalis requiere
una hidrólisis química al menos parcial del sustrato antes de la
realización de la fermentación (véase la Patente de Estados Unidos
Nº 5 962 285). Esta hidrólisis se realiza mediante una
saponificación realizada en presencia de hidróxido de calcio o de
magnesio. Ésta produce las sales de ácidos grasos (jabones)
correspondientes. Ahora bien, Yarrowia lipolytica presenta
la capacidad de asimilar los triglicéridos como fuente de carbono.
La primera etapa de este catabolismo implica la hidrólisis de los
triglicéridos en ácidos grasos libres y glicerol por las enzimas
lipolíticas (lipasas), identificadas por Peters y Nelson en 1951. A
continuación se describirán una actividad lipasa extracelular y dos
lipasas membranarias de 39 y 44 kDa (Barth et al.,
Yarrowia lipolytica. en: Nonconventional Yeasts in
Biotechnology A Handbook (Wolf, K., Ed.), Vol. 1, 1996, págs.
313-388. Springer-Verlag).
Yarrowia lipolytica es capaz de producir varias lipasas
(actividad extracelular, membranaria e intracelular).
Recientemente, se han identificado los genes correspondientes a las
lipasas descritas. El gen LIP2 codifica una lipasa
extracelular, Lip2p (Pignede et al., 2000). Éste ha
demostrado que ella hidrolizaba preferiblemente los triglicéridos
de cadena larga de los restos oleicos (Barth et al,
1996).
Yarrowia lipolytica hidroliza, por lo
tanto, directamente los ésteres y los aceites naturales en ácidos
grasos libres y glicerol en condiciones de pH compatibles con la
realización de la fermentación. En estas condiciones, la hidrólisis
del éster o del aceite y su conversión en diácidos tienen lugar
simultáneamente, lo que presenta la ventaja de llevar a un
protocolo operatorio simplificado, ya que se elimina la etapa de
hidrólisis química.
De manera más detallada, la invención propone un
procedimiento de producción de al menos un ácido dicarboxílico que
comprende:
- (a)
- una fase de crecimiento, en la que se cultiva una cepa mutante de Yarrowia lipolytica que tiene alterados al menos los genes POX2, POX3, POX4 y POX5 (que codifican acil-CoA oxidasa) en un medio de cultivo constituido esencialmente por un sustrato energético que comprende al menos una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno;
- (b)
- una fase de bioconversión, en la que se somete a dicha cepa a un sustrato de bioconversión seleccionado entre n-alcanos de al menos 10 átomos de carbono, ácidos grasos de al menos 10 átomos de carbono, ésteres de alquilo de 1 a 4 átomos de carbono de estos ácidos grasos, tales como las mezclas de ésteres metílicos o etílicos, o también aceites naturales (mezclas de ésteres de ácidos grasos de glicerol), en presencia de un sustrato energético; y
- (c)
- una fase de recuperación del ácido dicarboxílico formado.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas utilizadas en el procedimiento de la
invención derivan de la cepa silvestre de Yarrowia lipolytica
W29 (ATCC 20460, catalogada como CLIB89 en la Collection de
Levures d'interêt Biotechnologique-CLIB). De este modo, pueden
utilizarse nuevas cepas mutantes que derivan de la cepa de
Yarrowia lipolytica ATCC 20460 por medio de la cepa Po1d
[cepa auxótrofa para leucina (leu-) y uracilo (ura-)], descrita en
la revisión de G. Barth et al. Ésta está catalogada como
CLIB139 en la CLIB.
La obtención de estas nuevas cepas mutantes
(MTLY37, MTLY66, MTLY74, MTLY79, MTLY80, MTLY81, FT120 y FT130) se
describirá más adelante.
En el procedimiento de producción de diácidos de
acuerdo con la invención, se cultiva la cepa mutante seleccionada
en un medio constituido esencialmente por un sustrato energético que
comprende al menos una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno
hasta finalizar el crecimiento. Se añade entonces el sustrato de
bioconversión (alcano o mezcla de alcanos, ácido graso o mezcla de
ácidos grasos, éster de ácido graso o mezcla de ésteres de ácidos
grasos o aceite natural o mezcla de estos diferentes sustratos) para
iniciar la bioconversión en diácidos y se recuperan los diácidos
formados mediante una técnica conocida por el especialista en la
técnica, tal como precipitación con sales de
calcio.
calcio.
Durante la fase de bioconversión, el medio de
cultivo puede comprender un aporte de sustrato energético secundario
que consiste en general en al menos un compuesto polihidroxilado,
tal como por ejemplo glicerol o un azúcar.
\vskip1.000000\baselineskip
Para obtener esta cepa, puede procederse de la
siguiente manera:
- 1)
- se secuencia el gen de interés (o bien se dispone de la secuencia de este gen en un banco de datos);
- 2)
- se construye una casete de alteración mediante PCR ("Polymerase Chain Reaction" [reacción en cadena de la polimerasa]) o mediante clonación, utilizando un marcador contra-seleccionable, por ejemplo el marcador URA3 (con el que se puede seleccionar el fenotipo Ura+ o el fenotipo Ura-);
- 3)
- se seleccionan las cepas con el gen de interés delecionado (transformación y selección de los transformantes (ventajosamente Ura+ si el marcador es URA3) y se verifica la alteración del gen.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describe un método particular
de obtención de la cepa mutante MTLY37.
En primer lugar se clonan y se secuencian genes
POX de la cepa silvestre, cuyas secuencias son diferentes de
las de Candida tropicalis. A continuación se construyen
casetes de alteración de los genes que codifican las
iso-enzimas de acil-CoA oxidasa. Se
alteran los genes de acil-CoA oxidasa utilizando el
marcador seleccionable URA3. Se amplifican las regiones promotoras
y terminadoras mediante una primera PCR, utilizando pares de
oligonucleótidos específicos, lo que elimina la secuencia completa
del marco abierto de lectura (ORF: "Open Reading Frame"). A
continuación se realiza una segunda PCR con los cebadores externos y
los productos de PCR de los promotores y terminadores, que se
fusionan mediante una extensión común de 20 pb que comprende un
sitio para la enzima de restricción I-Scel. El
producto de PCR se clona para dar una serie de plásmidos (designados
mediante pPOX-PT) que contienen el módulo
promotor-terminador (casete de alteración 2).
Un gen URA3 se introduce en el sitio
I-Scel de la casete POX-PT. Se
construye una serie de plásmidos pPOX-PUT que
contienen el módulo
promotor-URA3-terminador (casete de
alteración 1). A estas construcciones se les llama
pPOX1-PUT, pPOX2-PUT,
pPOX3-PUT, pPOX4-PUT y
pPOX5-PUT para los plásmidos que contienen
la casete de alteración 1, por un lado, y
pPOX1-PT, pPOX2-PT,
pPOX3-PT, pPOX4-PT y
pPOX5-PT para los plásmidos que contienen la
casete de alteración 2, por el otro.
Las casetes de alteración se amplifican por PCR
con los cebadores específicos externos utilizando, por ejemplo, la
Pfu polimerasa (suministrada por Stratagene, La Jolla,
California). El análisis final de las secuencias de proteínas
revela que las acil-CoA oxidasas de Yarrowia
lipolytica tienen un grado de identidad del 45% (50% de
similitud) con el de las otras levaduras. El grado de identidad
entre ellas varía entre el 55 y el 70% (65 y 76% de similitud).
\newpage
Después de construir las casetes de alteración
de los genes que codifican la acil-CoA oxidasa,
puede realizarse la transformación de Yarrowia lipolytica
mediante diferentes métodos. Puede emplearse una electroporación,
en la que el ADN entra gracias al choque eléctrico. Más
ventajosamente, se empleará el método con acetato de litio y con
polietilenglicol. Este método es descrito por Gaillardin et
al.: LEU2 Directed Expression of
Beta-gallactosidase Activity and Phleomycin
Resistance in Yarrowia lipolytica. Curr. Genet. 11, 1987,
369-375.
La presencia de alteración se verifica mediante
PCR de acuerdo con la técnica de Gussow et al.: Direct Clone
Characterization from Plaques and Colonies by the Polymerase Chain
Reaction. Nucleic Acids Res. 17, 1989, 4000, y a continuación se
confirma mediante hibridación por transferencia de Southern.
A partir de la cepa Po1d, las alteraciones se
realizan en dos etapas.
En un primer momento, se transforma Po1d con la
casete 1 de alteración de PCR PUT y se selecciona. En un segundo
momento, los clones Ura+ se transforman con la casete de alteración
2, para eliminar el gen URA3 y se seleccionan. Este protocolo
permite la obtención del cuádruplo de alteración MTLY37 -
pox2\DeltaPT- pox3\DeltaPT -
pox4\DeltaPT-pox5\DeltaPUT. La representación
esquemática de la construcción de este mutante se resume en la
Tabla 1 a continua-
ción.
ción.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La alteración de un gen y la escisión del
marcador también pueden realizarse mediante un método que emplea
una recombinación o una recombinasa. Pueden utilizarse por ejemplo
marcadores con, a uno y otro lado, una secuencia repetida (que
permite la recombinación que se ha seleccionado) o una secuencia lox
que es reconocida por la recombinasa Cre. La escisión tiene lugar
cuando se expresa la Recombinasa Cre, Fickers et al., 2003
New Disruption Casetes for Rapid Gene Disruption and Marker Rescue
in the Yeast Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. Methods
55/3:
727-737.
727-737.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir del mutante MTLY37, se construyó la
cepa MTLY74 Leu+Ura-.
- 2a.
- A partir del mutante MTLY37 protótrofo (Leu+, Ura+), se construyó una cepa de Yarrowia lipolytica mutante MTLY66 auxótrofa para leucina y uracilo (Leu-, Ura-). La primera etapa es la construcción de la cepa MTLY40 auxótrofa para uracilo (Leu+, Ura-) mediante conversión del marcador URA3 con el marcador ura3-41 transformando el fragmento de PCR que contiene este marcador y seleccionando los Ura- en presencia de 5FOA. A partir del mutante MTLY40, se construyó una cepa de Yarrowia lipolytica mutante MTLY64 auxótrofa para leucina (Leu-, Ura-, Hyg+) mediante alteración del marcador LEU2 transformando la casete de alteración PHTleu2 y seleccionando los transformantes resistentes a higromicina (leu2::Hyg). A partir del mutante MTLY64, se construyó una cepa de Yarrowia lipolytica mutante MTLY66 auxótrofa para leucina (Leu-, Ura-) mediante escisión del marcador HYG transformando el vector de replicación pRRQ2 que contiene la recombinasa Cre y el marcador LEU2 (Cre-LEU2) y seleccionando los transformantes sensibles a higromicina, Leu+. La pérdida del plásmido pRRQ2 se realiza mediante un cultivo en medio rico YPD y mediante el aislamiento de un clon (Leu-, Ura-, Hyg-).
- 2b.
- A partir del mutante MTLY66, se construyó una cepa de Yarrowia lipolytica mutante MTLY74 Leu+ Ura- que sobreexpresa la NADPH-citocromo reductasa, expresándola bajo el control del promotor fuerte pPOX2, inducido por los sustratos de bioconversión, de tipo ácido graso, éster de ácido graso o aceite natural.
\vskip1.000000\baselineskip
Se introdujo el gen que codifica la
NADPH-citocromo reductasa (CPR) en un vector que
comprende el gen de selección LEU2, por ejemplo JMP21, bajo el
control del promotor pPOX2 inducible por ácidos grasos, ésteres de
ácido graso o aceites naturales. La casete
marcador-promotor-gen (LEU2-
pPOX2-CPR) se introduce mediante transformación.
La representación esquemática de la construcción
de este mutante se resume en la Tabla 2 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
A partir del mutante MTLY74, se construyó una
cepa de Yarrowia lipolytica mutante MTLY79 que sobreexpresa
la NADPH-citocromo reductasa y la citocromo P450
monooxigenasa ALK1 en condiciones de bioconversión, bajo el control
del promotor fuerte pPOX2 inducido por los sustratos de
bioconversión de tipo ácido graso, éster de ácido graso o aceite
natural.
Se introdujo el gen ALK1 que codifica la
citocromo P450 monooxigenasa en un vector que contiene el gen de
selección URA3, por ejemplo JMP61, bajo el control del promotor
pPOX2 inducible mediante ácidos grasos, ésteres de ácido graso o
aceites naturales. La casete
marcador-promotor-gen (URA3-
pPOX2-AKL1) se introduce mediante
transformación.
La representación esquemática de la construcción
de este mutante se resume en la Tabla 3 a continuación.
A partir del mutante MTLY74, se construyó una
cepa de Yarrowia lipolytica mutante MTLY80 que sobreexpresa
los genes que codifican la NADPH-citocromo reductasa
(CPR) y la citocromo P450 monooxigenasa (ALK2) en las
condiciones de bioconversión, bajo el control del promotor fuerte
pPOX2 inducido mediante sustratos de bioconversión de tipo ácido
graso, éster de ácido graso o aceite natural.
Se introdujo el gen ALK2 que codifica la
citocromo P450 monooxigenasa en un vector que contiene el gen de
selección URA3, por ejemplo JMP61, bajo el control del promotor
pPOX2 inducible mediante ácidos grasos, ésteres de ácido graso o
aceites naturales. La casete
marcador-promotor-gen
(URA3-pPOX2-AKL2) se introduce mediante
transformación.
La representación esquemática de la construcción
de este mutante se resume en la Tabla 4 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A partir del mutante MTLY74, se construyó una
cepa de Yarrowia lipolytica mutante MTLY81 que sobreexpresa
el gen que codifica la NADPH-citocromo reductasa
(CPR) bajo el control del promotor fuerte pPOX2 inducido
mediante sustratos de bioconversión de tipo ácido graso, éster de
ácido graso o aceite natural.
Se hizo al mutante MTLY74 protótrofo mediante
transformación con el plásmido JMP61 que lleva el marcador URA3.
La representación esquemática de la construcción
de este mutante se resume en la Tabla 5 a continuación.
Para obtener esta cepa, puede procederse como
para la construcción de la cepa MTLY37 o de la cepa MTLY66:
- 1)
- se construye una casete de alteración mediante PCR ("Polymerase Chain Reaction") o mediante clonación, utilizando un marcador contra-seleccionable, por ejemplo el marcador URA3 (con el que se puede seleccionar el fenotipo Ura+ o el fenotipo Ura-), o utilizando un marcador con, a uno y otro lado, una secuencia repetida (que permite la recombinación que se selecciona) o una secuencia lox que es reconocida por la recombinasa Cre;
- 2)
- se seleccionan las cepas con el gen de interés delecionado (transformación y selección de los transformantes; ventajosamente Ura+ si el marcador es URA3) y se verifica la alteración del gen;
- 3)
- se seleccionan las cepas con el marcador delecionado (transformación y selección de los transformantes); ventajosamente 5FOA^{R} si el marcador es URA3 o ventajosamente un plásmido que expresa la recombinasa si el marcador presenta la secuencia lox y se verifica la alteración del gen.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, se describe un método particular
de obtención de la cepa mutante FT120.
A partir del mutante MTLY66, se construyó la
cepa FT120 Leu- Ura-, \Deltapox1-6.
- 4a.
- A partir del mutante MTLY66 \Deltapox2-5, se construyó una cepa de Yarrowia lipolytica mutante MTLY95 \Deltapox1-6 mediante inserción de deleción de los genes POX1 y POX6 y deleción del marcador de acuerdo con el método descrito anteriormente.
- 4b.
- A partir del mutante MTLY95, se construyó una cepa de Yarrowia lipolytica mutante FT101 Leu+ Ura- que sobreexpresa el gen que codifica la NADPH-citocromo reductasa (CPR) en las condiciones de bioconversión, expresándola bajo el control del promotor fuerte pPOX2, inducido mediante los sustratos de bioconversión, de tipo ácido graso, éster de ácido graso o aceite natural.
\vskip1.000000\baselineskip
Se introdujo el gen que codifica la
NADPH-citocromo reductasa en un vector que contiene
el gen de selección LEU2 escindible, por ejemplo
JMP21-LEU2ex, bajo el control del promotor pPOX2
inducible mediante ácidos grasos, ésteres de ácido graso o aceites
naturales. La casete
marcador-promotor-gen
(LEU2ex-pPOX2-CPR) se introduce
mediante transformación. La cepa FT120 se obtiene después de la
escisión del marcador LEU2ex mediante transformación con el
plásmido pUB4-CRE, selección Hyg+, pérdida del
plásmido en YPD y finalmente aislamiento de un clon Leu-.
La representación esquemática de la construcción
de este mutante se resume en la Tabla 6 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Para obtener esta cepa, puede procederse como
para la construcción de la cepa FT120:
- 1)
- se construye una casete de alteración mediante PCR ("Polymerase Chain Reaction") o mediante clonación, utilizando un marcador contra-seleccionable, por ejemplo el marcador URA3 (con el que se puede seleccionar el fenotipo Ura+ o el fenotipo Ura-), o utilizando un marcador con, a uno y otro lado, una secuencia repetida (que permite la recombinación que se selecciona) o una secuencia lox que es reconocida por la recombinasa Cre;
- 2)
- se seleccionan las cepas con el gen de interés delecionado (transformación y selección de los transformantes; ventajosamente Ura+ si el marcador es URA3) y se verifica la alteración del gen;
- 3)
- se seleccionan las cepas con el marcador delecionado (transformación y selección de los transformantes); ventajosamente 5FOA^{R} si el marcador es URA3 o ventajosamente un plásmido que expresa la recombinasa Cre si el marcador presenta la secuencia lox y se verifica la alteración del gen.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describe un método particular
de obtención de la cepa mutante FT130.
A partir del mutante FT120, se construyó la cepa
FT130 Leu- Ura-, \Deltapox1-6, \Deltaga1.
6. A partir del mutante FT120 Leu-
Ura-, \Deltapox1-6, pPOX2-CPR se
construyó una cepa de Yarrowia lipolytica mutante FT130 Leu-
Ura+, \Deltapox1-6, pPOX2- CPR, \Deltadga1
mediante inserción de deleción del gen DGA1 que codifica
acil-CoA diacilglicerol
aciltransferasa.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas MTLY66, MTLY81, FT120 y FT 130 se
depositaron en la Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes con los respectivos números de registro CNCM
I-3319, CNCM I-3320, CNCM
I-3527 y CNCM I-3528.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención
sin limitar su alcance.
En estos ejemplos, se ensayó la influencia de
las condiciones de cultivo y de la composición del medio sobre la
producción de diácidos. De este modo, se constató con el mutante
MTLY37 que la utilización de peptona favorecía en gran medida la
producción de diácidos, particularmente con respecto a la
bacto-triptona (Ejemplos 1 y 2).
También se ensayaron en las mismas condiciones
los mutantes MTLY79, MTLY80 y MTLY81. De este modo se constató que
la NADPH-citocromo reductasa catalizaba una etapa
limitante en la producción de diácidos. En efecto, la
sobreexpresión de esta enzima en solitario permite aumentar
significativamente la producción y la productividad de los diácidos
(Ejemplos 4 a 6).
Se ensayaron en idénticas condiciones las cepas
mutantes FT120 y FT130 (ejemplos 7 y 8). La deleción de los genes
POX1 y POX6 permite disminuir la degradación de los diácidos para
FT120. La deleción de un gen suplementario DGA1 que codifica
acil-CoA diacilglicerol aciltransferasa conlleva una
disminución de la acumulación del sustrato de bioconversión en
forma de cuerpos lipídicos en el interior de la célula de
Yarrowia lipolytica. De este modo, la mayoría de los
diácidos obtenidos en estos ejemplos está compuesta por diácidos con
18 átomos de carbono a imagen del sustrato de bioconversión
utilizado, compuesto es su mayoría por ácidos grasos con 18 átomos
de
carbonos.
carbonos.
\vskip1.000000\baselineskip
Un precultivo del mutante MTLY37, conservado en
medio de agar de composición: extracto de levadura 10 g.l^{-1};
peptona 10 g.l^{-1}; glucosa 10 g.l^{-1}; Agar 20 g.l^{-1}, se
realiza gracias a una siembra que proporciona una absorbancia
inicial del medio de precultivo próxima a 0,30. El precultivo se
realiza en agitación orbital (200 rpm) durante 24 h a 30ºC en un
matraz con pestañas de 500 ml que contiene 25 ml de medio (10
g.l^{-1} de extracto de levadura; 10 g.l^{-1} de peptona; 20
g.l^{-1} de glucosa).
El medio utilizado para el cultivo está
compuesto por agua desionizada, extracto de levadura a 10
g.l^{-1}; triptona a 20 g.l^{-1}; glucosa a 40 g.l^{-1}; y
aceite de girasol oleico a 30 g.l^{-1}.
La siembra del fermentador se realiza con la
totalidad del matraz de precultivo.
El cultivo se realiza a 3ºC en un fermentador de
4 l con 2 l de medio con un caudal de aireación de 0,5 vvm y una
velocidad de agitación de 800 rpm asegurada por una turbina
centrípeta con efecto doble.
Después de 17 horas de cultivo, desde que la
glucosa del medio se ha agotado, se añaden 60 ml de aceite de
girasol oleico, compuesto en su mayoría por ácidos grasos con 18
átomos de carbono, en el reactor que se somete a una alimentación
continua de glicerol a razón de 1 ml.h^{-1}. El pH del cultivo se
mantiene entonces en el valor constante de 8 mediante adición
regulada de sosa 4 M. La fermentación dura 130 h.
Al finalizar el cultivo, se elimina la biomasa
celular mediante centrifugado. El sobrenadante se acidifica a
continuación hasta pH 2,5 mediante adición de HCl 6 M y los ácidos
dicarboxílicos insolubles se recuperan mediante centrifugado del
mosto acidificado y después se secan.
La composición de ácidos dicarboxílicos de la
mezcla se determina mediante cromatografía en fase gaseosa en una
columna DB1 después de la conversión de los ácidos dicarboxílicos en
diésteres de acuerdo con el método descrito por Uchio et al:
Microbial Production of Long-chain Dicarboxylic
Acids from n-Alkanes. Part II. Production by
Candida cloacae Mutant Unable to Assimilate Dicarboxylic Acid. Agr
Biol. Chem. 36, No. 3, 1972, 426-433. La
temperatura del horno del cromatógrafo se programa de 150ºC a 28ºC a
razón de 8ºC por minuto.
Los resultados muestran una producción máxima de
diácidos en los sobrenadantes de 5,9 g.l^{-1} después de 130
h.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repite el Ejemplo 1 sustituyendo en el medio
de cultivo triptona por peptona a la misma concentración. Al cabo
de 130 h de cultivo, se obtienen 9,9 g.l^{-1} de ácidos
dicarboxílicos, es decir un aumento de la producción de
aproximadamente el 68% con respecto al Ejemplo 1.
\newpage
Se repite el Ejemplo 2 eliminando el aceite de
girasol oleico del medio de cultivo y sustituyéndolo por una
inyección continua de este mismo aceite a un flujo
sub-limitante de 1 ml en el reactor.
En estas condiciones, se producen 14,7
g.l^{-1} de ácidos dicarboxílicos en el medio de cultivo después
de 130 h.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repite el Ejemplo 3 sustituyendo el mutante
MTLY37 por el mutante MTLY79 que sobreexpresa los genes CPR
y ALK1. Al cabo de 130 h de cultivo, se obtienen 16
g.l^{-1} de ácidos dicarboxílicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repite el Ejemplo 3 sustituyendo el mutante
MTLY37 por el mutante MTLY80 que sobreexpresa los genes CPR
y ALK2. Al cabo de 130 h de cultivo, se obtienen 16
g.l^{-1} de ácidos dicarboxílicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repite el Ejemplo 3 sustituyendo el mutante
MTLY37 por el mutante MTLY81 que sobreexpresa únicamente el gen
CPR. Al cabo de 130 h de cultivo, se obtienen 16 g.l^{-1}
de ácidos dicarboxílicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repite el Ejemplo 3 sustituyendo el mutante
MTLY37 por el mutante FT120 con los seis genes POX
delecionados y que sobreexpresa el gen CPR. Al cabo de 130 h
de cultivo, se obtienen 18 g.l^{-1} de ácidos dicarboxílicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repite el Ejemplo 3 sustituyendo el mutante
MTLY37 por el mutante FT130 con los seis genes POX y el gen
DGA1 delecionados y que sobreexpresa el gen CPR. Al
cabo de 130 h de cultivo, se obtienen 23 g.l^{-1} de ácidos
dicarboxílicos.
Claims (17)
1. Procedimiento de producción de ácidos
dicarboxílicos, caracterizado por que comprende:
- a)
- una fase de crecimiento, en la que se cultiva una cepa mutante de Yarrowia lipolytica que tiene alterados al menos los genes que codifican las isoenzimas de acil-CoA oxidasa POX2, POX3, POX4 y POX5; en un medio de cultivo constituido esencialmente por un sustrato energético que comprende al menos una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno;
- b)
- una fase de bioconversión, en la que se somete a dicha cepa a un sustrato de bioconversión seleccionado entre n-alcanos de al menos 10 átomos de carbono, ácidos grasos de al menos 10 átomos de carbono, ésteres de alquilo de 1 a 4 átomos de carbono de estos ácidos grasos, y aceites naturales, en presencia de un sustrato energético; y
- c)
- una fase de recuperación del ácido dicarboxílico formado.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado por que el mutante utilizado
es MTLY37, obtenido de la cepa silvestre ATCC 20460, catalogada
como CLIB89 en la Collection de Levures d'intérêt
Biotechnologique, y obtenido mediante las siguientes operaciones
de transformación a partir de la cepa Po1d catalogada como CLIB139
en la Collection de Levures d'intérêt Biotechnologique,
\newpage
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado por que el mutante utilizado
es MTLY79, obtenido de la cepa silvestre ATCC 20460, catalogada
como CLIB89 en la Collection de Levures d'intérêt
Biotechnologique, que sobreexpresa los genes CPR y ALK1
que codifican respectivamente la NADPH-citocromo
reductasa y la citocromo P450 monooxigenasa, y obtenido mediante las
siguientes operaciones de transformación a partir del mutante
MTLY74, obtenido a su vez a partir del mutante MTLY37 tal como se
describe en la reivindicación 2 de acuerdo con las siguientes
operaciones de transformación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
4. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado por que el mutante utilizado
es MTLY80, obtenido de la cepa silvestre ATCC 20460, catalogada
como CLIB89 en la Collection de Levures d'intérêt
Biotechnologique, que sobreexpresa los genes CPR y
ALK2 que codifican respectivamente la
NADPH-citocromo reductasa y la citocromo P450
monooxigenasa, y obtenido mediante las siguientes operaciones de
transformación a partir del mutante MTLY74, tal como se describe en
la reivindicación 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado por que el mutante utilizado
es MTLY81, obtenido de la cepa silvestre ATCC 20460, catalogada
como CLIB89 en la Collection de Levures d'intérêt
Biotechnologique, que sobreexpresa el gen CPR que codifica la
NADPH-citocromo reductasa, y obtenido mediante las
siguientes operaciones de transformación a partir del mutante
MTLY74, tal como se describe en la reivindicación 3
\vskip1.000000\baselineskip
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado por que el mutante utilizado
es FT120, obtenido de la cepa silvestre ATCC 20460, catalogada como
CLIB89 en la Collection de Levures d'intérêt
Biotechnologique, que sobreexpresa el gen CPR que codifica la
NADPH-citocromo reductasa, y obtenido mediante las
siguientes operaciones de transformación a partir del mutante
MTLY66, tal como se describe en la reivindicación 3
\newpage
7. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado por que el mutante utilizado
es FT130, obtenido de la cepa silvestre ATCC 20460, catalogada como
CLIB89 en la Collection de Levures d'intérêt
Biotechnologique, que sobreexpresa el gen CPR que codifica la
NADPH-citocromo reductasa, y obtenido mediante las
siguientes operaciones de transformación a partir del mutante FT120,
tal como se describe en la reivindicación 6
8. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que dicho sustrato
de bioconversión está constituido por una mezcla de ésteres
metílicos o una mezcla de ésteres etílicos.
9. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que dicho sustrato
de bioconversión está constituido por un aceite de girasol
oleico.
10. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que, en la fase de
bioconversión, el medio de cultivo comprende peptona.
11. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que, en la fase de
bioconversión, el medio de cultivo comprende un aporte de sustrato
energético secundario que está constituido por al menos un
compuesto polihidroxilado.
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, caracterizado por que dicho compuesto
polihidroxilado es glicerol o un azúcar.
13. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que, en la fase
(c), el ácido dicarboxílico se recupera mediante precipitación en
forma de sal de calcio.
14. Cepa de Yarrowia lipolytica mutante
MTLY66 depositada en la Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes con el número de registro CNCM
1-3319.
15. Cepa de Yarrowia lipolytica mutante
MTLY81 depositada en la Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes con el número de registro CNCM
1-3320.
16. Cepa de Yarrowia lipolytica mutante
FT120 depositada en la Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes con el número de registro CNCM
1-3527.
17. Cepa de Yarrowia lipolytica mutante
FT130 depositada en la Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes con el número de registro CNCM
1-3528.
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