CN111117982B - 一种拟除虫菊酯降解酶、其编码基因、重组菌株和应用 - Google Patents

一种拟除虫菊酯降解酶、其编码基因、重组菌株和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种拟除虫菊酯降解酶编码基因，所述编码基因YLL2‑C244A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；还提供了含上述的拟除虫菊酯降解酶的编码基因YLL2‑C244A的重组菌株YLL2‑X33以及由上述重组菌株YLL2‑X33表达得到的拟除虫菊酯降解酶。本发明还提供上述编码基因YLL2‑C244A在制备拟除虫菊酯类农药降解酶方面的应用、上述拟除虫菊酯降解酶在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用以及采用上述重组菌株YLL2‑X33经摇瓶培养、发酵培养、过滤、防腐，得到拟除虫菊酯降解酶酶液的方法。本发明的拟除虫菊酯降解酶降解菊酯范围广，降解效果相对明显，对蔬果上残留的常见拟除虫菊酯的降解率平均达85%以上，可用于食品或环境中菊酯类农药残留的降解。

Description

一种拟除虫菊酯降解酶、其编码基因、重组菌株和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种拟除虫菊酯降解酶、其编码基因、重组菌株和应用。
背景技术
拟除虫菊酯是20世纪70年代开发出来的，可用于防治茶树、蔬菜、果树、花卉、林木及卫生害虫等领域，是目前用量比肩有机磷的一类杀虫剂。这类农药普遍具有对环境稳定、降解速度慢等特点，对生态环境产生了一定影响；对人有蓄积毒性，长期低剂量接触会引起慢性疾病，对哺乳动物具有中等神经毒性、免疫系统毒性、心血管毒性和遗传毒性，有些品种甚至具有致畸、致癌、致突变作用。
降低食用农产品中农药残留量常用方法有清洗、削皮、烹饪、储存、臭氧法等，存在普适性弱，局限性大等缺陷。相比而言，酶催化拟除虫菊酯类农药降解能够有效地降解，具有高效专一、安全、成本低等优点，具有较好的发展前景。
解开治等研究一株降解菊酯恶臭假单胞菌XP12提出粗酶液在弱碱性条件下对氯氰菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊酯降解率为70%。申请号为201711068912.2的专利公开了一种用于催熟农作物及降解残存拟除虫菊酯降解的拟除虫菊酯降解剂，所含的菊酯降解酶粉先由基因工程大肠杆菌胞内分泌，经离心出沉淀、磷酸缓冲液分散超声波破壁裂解，再对上清液离心并过亲和层析柱层析、透析、干燥而获得，制备工艺复杂，没有提及菊酯降解酶收率。中山大学的刘玉焕等（一种新型酯酶及其应用，专利号ZL201010547206.8）构建出具有菊酯降解能力的大肠杆菌E.coli BL21（DE3）/Pet -28a-est 825，所生产的重组酶在常温下对氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解率分别为80.98%、82.98%、69.23%和69.65%，不仅降解率底，而且能够降解的拟除虫菊酯农药种类少。刘玉焕等还构建了重组酯酶Est816（专利号ZL201710019869.4）并分别表达在大肠杆菌体系和毕赤酵母体系，所得菊酯降解酶仍属于胞内酶，且仅仅考察了重组酯酶Est816对氯氟菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等含氰基的菊酯的降解效果，对其他典型结构的菊酯如氯菊酯、联苯菊酯等降解率没有提及。若用于食用农产品清洗相关领域，上述来源的菊酯降解酶带入大肠杆菌内毒素的风险相对大，制备工艺复杂，也没有提及菊酯降解酶收率。
由此可见，目前对拟除虫菊酯农药的酶法清除技术仍然存在菊酯降解酶的来源菌株使用风险相对大、制备工艺复杂、菊酯降解酶收率不明以及能够明显降解的拟除虫菊酯农药种类少等缺陷。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种拟除虫菊酯降解酶、其编码基因、重组菌株和应用，能够扩展拟除虫菊酯降解酶降解菊酯范围。
为实现上述目的，本发明的技术方案为一种拟除虫菊酯降解酶的编码基因YLL2-C244A，所述编码基因YLL2-C244A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供上述拟除虫菊酯降解酶的编码基因YLL2-C244A在制备拟除虫菊酯类农药降解酶方面的应用。
本发明还提供一种含上述的拟除虫菊酯降解酶的编码基因YLL2-C244A的重组菌株YLL2-X33，构建YLL2-C244A突变体分泌型表达载体并转化至毕赤酵母X33，通过抗生素Zeocin筛选得到多拷贝重组菌株YLL2-X33。
本发明还提供一种拟除虫菊酯降解酶，由上述的重组菌株YLL2-X33表达得到。
本发明还提供上述的拟除虫菊酯降解酶在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用，用于降解氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯及氯菊酯。
本发明还提供一种拟除虫菊酯降解酶酶液的制备方法，采用上述的重组菌株YLL2-X33经摇瓶培养、发酵培养、过滤、防腐，即得。
进一步地，先上述的重组菌株YLL2-X33活化，继续用YPD培养基在28℃、150rpm摇床上摇瓶培养21h，备用；再将BSM培养基装入发酵罐内，灭菌后冷却，然后接入上述摇瓶内的菌种，发酵90-160h完成后放罐得到拟除虫菊酯降解酶发酵液；最后将拟除虫菊酯降解酶发酵液与助滤剂直接混合后经板框过滤得滤液，向得到的滤液中加入防腐剂即得拟除虫菊酯降解酶酶液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明拟除虫菊酯降解酶的编码基因甄选自耶氏解脂酵母脂肪酶YLL2，对多种拟除虫菊酯农药有明显降解效果，对蔬果上常见的氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯及氯菊酯等不同结构类型的拟除虫菊酯平均降解率达到85%以上。
（2） 本发明的拟除虫菊酯降解酶编码基因构建出YLL2-X33重组毕赤酵母菌，分泌出拟除虫菊酯降解酶属于胞外酶，无内毒素引入风险，适宜用于制备食用农产品拟除虫菊酯降解酶。
（3）本发明的拟除虫菊酯降解酶重组菌株YLL2-X33多批次生物发酵，均可获得发酵效价在400-600U/mL的拟除虫菊酯降解酶，发酵稳定性好，其中拟除虫菊酯降解酶降解菊酯在pH5.3-7.6之间稳定性强，在40℃以下非常稳定，在正常使用条件下（常温、自来水）耐受性较好。
（4）本发明采用重组菌株YLL2-X33经摇瓶培养、发酵培养、直接混合硅藻土助滤剂板框压滤、防腐，即得拟除虫菊酯降解酶酶液，制备工艺简洁，酶收率可达70%。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明的拟除虫菊酯降解酶和氯氰菊酯按照1:1混合反应结果与水和氯氰菊酯按照1:1混合反应结果的对比图；
图2为菊酯类农药速测盒图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例提供一种拟除虫菊酯降解酶的编码基因YLL2-C244A，所述编码基因YLL2-C244A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供一种含上述的拟除虫菊酯降解酶的编码基因YLL2-C244A的重组菌株YLL2-X33；其构建方法如下：用毕赤酵母通用信号肽α-factor作为引导，以pPICZaA为表达载体，通过筛选系列的脂肪酶，构建出YLL2-C244A突变体分泌型表达载体并转化至毕赤酵母菌X33，通过抗生素博莱霉素Zeocin筛选得到多拷贝重组菌株YLL2-X33。本实施例的重组毕赤酵母菌YLL2-X33所用毕赤酵母菌菌种稳定、安全，发酵工艺简洁，发酵效价高，能明显降解多种拟除虫菊酯农药。
本发明还提供一种拟除虫菊酯降解酶，由上述的重组菌株YLL2-X33表达得到。
实施例2 拟除虫菊酯降解酶酶液的制备方法
种子的摇瓶培养：取含有核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的编码基因YLL2-C244A的重组菌株YLL2-X33活化，继续用YPD培养基在28℃、150rpm摇床上摇瓶培养21h，备用；
发酵培养：取发酵罐，采用BSM培养基，底料配方为磷酸二氢、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸钾、硫酸钙、氢氧化钾，甘油、PTM1、生物素等和自来水；120℃灭菌30min，冷却接入摇瓶菌种控温28℃、pH4.8条件下发酵110h。通过补料、控制通风量及转速，控制发酵罐溶氧始终大于20%；期间含甲醇2#补料流加速度120-240 g/h，含甲醇3#补料由30 g/h逐步升到50-60g/h，增幅为10g/2h，每隔一定时间取样检测酶活力，120h后放罐即得拟除虫菊酯降解酶发酵液，离心取上清液检测即拟除虫菊酯降解酶发酵液酶活力达501U/mL；
发酵液过滤：取上述发酵液，添加发酵液质量0.2%的616型硅藻土作为助滤剂，选用0.2m2板框滤布进行压滤，滤出液加0.1%凯松防腐剂即成拟除虫菊酯降解酶液。
本实施例的重组重组毕赤酵母菌YLL2-X33能够稳定发酵出拟除虫菊酯降解酶，工艺简洁，且发酵效价高，过滤后菊酯降解酶收率达70%，发酵液离心上清液酶活力达501U/mL。
实施例3 所述菊酯降解酶的酶学性质
1、所述拟除虫菊酯降解酶酶活力
1克拟除虫菊酯降解酶粉（或1mL拟除虫菊酯降解酶液），在25℃、pH7.6缓冲液中，1min水解棕榈酸对硝基苯酯产生1umol的对硝基苯酚，即为1个酶活力单位，以u/g（或u/mL）表示。
酶活力检测采用自建的测定棕榈酸对硝基苯酯（记为“pNPP”）生成对硝基苯酚的生产速率方法，具体方法如下：
准备一支10mL玻璃试管，吸取5900mL 0.05mmol/L pH7.6Tris-盐酸缓冲液75mL10mmol/L棕榈酸对硝基苯酯异丙醇液混匀并在25℃水浴锅水浴3min，再加入120uL菊酯降解酶样水稀释液后即刻开始由0s正计时、混合均匀，以空白样为对照调分光光度计零点，在400nm处测定试管中反应液的吸光值，第30s时测值记为A1（用于衡量稀释程度，应控制在0.15 -0.25之间），第90s时测值记为A2。
读取吸光值的环境温度尽量接近25℃；同一样品两个平行测定值的相对误差不超过10.0%，两者平均值为最终的酶活力测定值。
试样中拟除虫菊酯降解酶酶活力按下式计算：
X=Vt*(A2-A1)*N/14.7*1.0*Vs*t=3.455*(A2-A1)*N
式中： X--液（固）态样品中拟除虫菊酯降解酶酶活力，u/mL（或u/g），结果取整数；Vt--反应总体积，为6095μL；Vs--样品体积，为120μL；1.0--光径，cm；N--稀释倍数； t--时间间隔，1min； 14.7--对硝基苯酚400nm摩尔消光系数（cm2/umol）。
本实施例提供的拟除虫菊酯降解酶的酶活力检测方法简洁、快速。
2、所述拟除虫菊酯降解酶的性质
（1）等电点为6.5；
（2）最适pH值8.3，最适温度40℃；
（3）不同金属离子及化学试剂的影响：
Mg2+、Ca2+促进拟除虫菊酯降解酶酶活力提升，SDS、硼砂、K+、EDTA-2Na明显抑制拟除虫菊酯降解酶酶活力；
（4）经SDS-PAGE电泳分析知，所述拟除虫菊酯降解酶分子量在26KDa左右。
实施例4 所述拟除虫菊酯降解酶酶制剂的安全性
样Z2019052401组成：本发明的拟除虫菊酯降解酶+0.08%甲基异噻唑啉酮；对样Z2019052401中的菌落总数和大肠菌群进行检测，如表1所示。由表1知，拟除虫菊酯降解酶液微生物限量指标符合洗涤剂领域国标GB14930.1-2015。
实施例5 所述拟除虫菊酯降解酶酶制剂的有效性
1、菊酯速测盒显色法检测拟除虫菊酯降解酶与氯氰菊酯反应前后颜色变化
将所述拟除虫菊酯降解酶与氯氰菊酯按照1:1混合反应，反应结果如图1中左侧反应瓶中所示；将水与氯氰菊酯按照1:1混合，结果如图1中右侧反应瓶中所示；
将图1中的反应瓶中颜色与图2中菊酯类农药速测盒对比，可以看出，本发明的拟除虫菊酯降解酶对氯氰菊酯降解后颜色明显减弱，即该拟除虫菊酯降解酶对菊酯类农药很有效。
2、HPLC法检测拟除虫菊酯降解酶对菊酯降解效果
菊酯酶应用实验反应体系如下：Tris-HCl（0.1 M，pH7.6）400μL，稀释上清液 100μL，底物 20μL；
HPLC检测条件：上样体积：40μL；检测柱型：SB-C18；流速：1mL/min；
流动相：100% 乙腈 检测温度：30℃ 检测波长：210 nm200 rpm
25℃摇床反应30min-60min，反应完后加500μL正己烷剧烈震荡萃取，14000rpm，2min离心取200μL上层油相加至新的EP管中，放通风橱彻底吹干，加500μL乙腈溶解，用有机相滤膜过滤得到上样样品。
如表2所示，拟除虫菊酯降解酶纯液对联苯菊酯降解率最高可达89.4%，对溴氰菊酯降解率最低也为79.3%，故本发明的拟除虫菊酯降解酶纯液对水果蔬菜上常用如上7种菊酯农药的降解率平均值达到85%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
                         序列表
<110>  武汉新华扬生物股份有限公司
<120>  一种拟除虫菊酯降解酶、其编码基因、重组菌株和应用
<130>  2019
<160>  1
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  921
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
gccgttttgc aaaagagagt ttacacttct actgaaactt ctcatattga tcaagaatct  60
tacaactttt tcgaaaaata cgctagattg gctaacattg gttactgtgt tggtcctggt 120
actaagattt ttaagccatt caactgtggt ttgcaatgtg cccattttcc taacgttgaa 180
ttgattgaag aatttcatga tccaagattg atttttgatg tttctggtta cttggctgtt 240
gatcatgctt ctaagcaaat ctacttggtt attagaggta ctcattcttt ggaagatgtt 300
attactgata ttagaattat gcaagcccca ttgactaatt ttgatcttgc tgctaacatc 360
tcttcaactg ctacttgtga tgattgtttg gttcataacg gttttattca atcttacaac 420
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caaattgctg ttactggtca ttctttgggt ggtgctgctg ctttgttgtt tggtattaat 540
ctgaaggtta atgatcatga tccattggtt gttactttgg gtcaacctat tgttggtaac 600
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aaggtttcta aggatagaaa attgtacaga attactcata gaggagatat tgttccacaa 720
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attcatcctc cattgtctaa cgttgttatg tgtcaaggtc aatctaataa gcaatgctct 840
gctggtaaca ctttgttgca acaagttaac gttattggta atcatttgca atactttgtt 900
actgaaggtg tttgtggtat t                                           921

Claims (1)

1.一种拟除虫菊酯降解酶的编码基因YLL2-C244A在制备拟除虫菊酯类农药降解酶方面的应用，所述编码基因YLL2-C244A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
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