EP3274464A1 - Microorganismes et leur utilisation pour la production de diacides - Google Patents

Microorganismes et leur utilisation pour la production de diacides

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Publication number
EP3274464A1
EP3274464A1 EP16712852.9A EP16712852A EP3274464A1 EP 3274464 A1 EP3274464 A1 EP 3274464A1 EP 16712852 A EP16712852 A EP 16712852A EP 3274464 A1 EP3274464 A1 EP 3274464A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
strain
oil
alk3
genes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP16712852.9A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
France Thevenieau
Jean-Marc Nicaud
Vincent Sauveplane
Heber GAMBOA-MELÉNDEZ
Nicolas Morin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
FONDS DE DEVELOPPEMENT DES FILIERES DES OLEAGINEUX ET PROTEAGINEUX FIDOP
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
FONDS DE DEVELOPPEMENT DES FILIERES DES OLEAGINEUX ET PROTEAGINEUX FIDOP
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA, FONDS DE DEVELOPPEMENT DES FILIERES DES OLEAGINEUX ET PROTEAGINEUX FIDOP filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP3274464A1 publication Critical patent/EP3274464A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention relates to microorganisms and their use for the production of dicarboxylic acids.
  • dicarboxylic acids also called “diacids” are used as raw materials for example in the synthesis of polyamides and polyesters, lubricating oils, plasticizers or perfumes.
  • the processes for producing the diacids vary according to the number of carbon atoms of the carbon skeleton of the diacid considered.
  • azelaic acid (C 9 diacid) is conventionally obtained by chemical oxidation of oleic acid with ozone while sebacic acid (C 10 diacid) is produced by alkaline oxidation of ricinoleic acid.
  • Dodecanedioic acid (C12 diacid) is a product of petrochemicals.
  • the microbiological route is used for the production of brassylic acid (C13 diacid) from tridecane.
  • the interest of a production route applicable to the widest possible range of diacids is desirable.
  • the biological pathway has the advantage of being applicable to a wide variety of substrates.
  • mutants that have been blocked at the level of ⁇ -oxidation should be used.
  • WO 2014100461 relates to biological processes which make it possible to obtain acids fatty dicarboxylic. To do this, certain genes of the apart-oxidation metabolic pathway have been overexpressed, in order to allow the formation of diacids.
  • the invention aims to overcome the disadvantages of the prior art.
  • One of the aims of the invention is to provide a process for synthesizing diacids which allows increased production.
  • Another object of the invention is to provide modified microorganisms for carrying out this method.
  • Yet another object of the invention is to use new genetic tools for improving the production of diacids by microorganisms.
  • the invention relates to the use of a strain of yeast incapable of degrading fatty acids, in particular a Yarrowia lipolytica strain, overexpressing at least the following genes:
  • the ALK3 gene encoding a cytochrome P450 monooxygenase
  • At least one of the ADH2 and ADH5 genes each encoding a dehydrogenase of alcohols
  • FALDH3 and FALDH4 genes each encoding a fatty aldehyde dehydrogenase or the FA01 gene encoding a fatty alcohol oxidase
  • dicarboxylic acid for the preparation, by fermentation, of at least one dicarboxylic acid, from fatty acids or from hydrocarbons, in particular from fatty acids derived from vegetable oils.
  • the invention is based on the surprising finding made by the inventors that the overexpression of the genes Alk3, of at least one gene chosen from ADH2 and ADH5 and of at least one gene chosen from FALDH3, FALDH4 and FA01 makes it possible to significantly increase the production of diacids, especially from fatty acids or hydrocarbons (alkanes, alkenes or alkynes).
  • the inventors have demonstrated a synergy of the overexpressing of the aforementioned genes on the production of diacids, whereas the simple overexpression of each of these genes has little or no effect or the opposite effect: the production of diacids is greatly diminished.
  • This result is surprising because it is known from the state of the art that, for example, overexpression of cytochrome P450 can convert fatty acids or hydrocarbons to diacids, without involving other ⁇ -oxidation enzymes, ie dehydrogenases. fatty aldehydes and fatty alcohol dehydrogenase.
  • diacids or dicarboxylic acids are organic compounds having two carboxyl functions.
  • the molecular formula of these compounds is generally denoted HOOC-R-COOH, where R can be an alkyl, alkenyl, alkynyl or aryl group.
  • the diacids obtained by the process of the invention are derived from saturated or non-saturated hydrates, linear or branched, or their equivalent carboxylic acids, and are converted by the ⁇ -oxidation route.
  • overexpression is meant in the invention the level of expression of a gene that has been artificially introduced into the genome of a yeast strain, ectopically or not, (measured by the amount of RNA produced , or by the amount of protein derived from this RNA), which is at least twice the level of expression of the same endogenous gene.
  • the gene is said to be “overexpressed” if the sum of the expressions of the gene (exogenous and possibly endogenous) is at least twice greater than the expression of the endogenous gene when the yeast strain is not transformed or is said to be wild reference.
  • the yeast strains used in the invention were previously transformed by a nucleic acid molecule encoding said ALK3 gene, placed under the control of elements regulating its expression which do not correspond to the regulatory elements of the gene in its natural context (for example a constitutive promoter which is not the endogenous promoter of the ALK3 gene, presence of sequence (s) of increase or facilitation of expression - enhancer. ). Overexpression will occur if the total amount of product expressed by the transformed strain is at least two times greater than the amount of product expressed by a yeast strain not transformed by the ALK3 gene.
  • the yeast strains used in the context of the invention to implement the production process are incapable of degrading fatty acids.
  • the yeast strains used can not degrade, or the fatty acids (carboxylic acids having a long carbon chain, saturated or unsaturated, branched or unbranched), nor the diacids obtained by conversion during stages of ⁇ ' ⁇ - oxidation.
  • the fatty acids can be considered free or in esterified form with glycerol to form monoglycerides, diglycerides or triglycerides.
  • At least one of the ADH2 and ADH5 genes coding for alcohol dehydrogenases and
  • FALDH3 At least one of the FALDH3, FALDH4 genes coding for fatty aldehyde dehydrogenases and FA01, encoding a fatty alcohol oxidase.
  • YALI0B01298g is also named HFD4 (Iwama et al., 2014) at Yarrowia lipolytica.
  • FALDH4 YALI0A17875g is also named FALDH1 (Gatter et al., 2014) and HFD3 (Iwama et al., 2014) at Yarrowia lipolytica.
  • the advantageous yeast strains used in the context of the invention are the following: Yeast strains Candida spp. (eg C. tropicalis, C. viswanathii), yarrow strains Yarrowia spp. (in particular Y. lipolytica), Pichia spp. yeast strains, Saccharomyces spp. and the yeast strains Kluyveromyces spp.
  • the advantageous strains according to the invention are strains of Yarrowia lipolytica incapable of degrading fatty acids, and which over-express at least one of the 21 gene combinations of the invention, listed above.
  • the ALK3 gene overexpressed in the invention comprises or consists essentially of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1.
  • ALK3 of the invention may also cover genes having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 1 provided that these sequences encode proteins which possess a cytochrome P450 monooxygenase activity, and in particular the genes of the following sequences: SEQ ID NO: 2 (YAAL0S03-16006g1_1), SEQ ID NO: 3 (YAGA0E09252g1_1) and SEQ ID NO: 4 (YAYA0S2-22892g1_1).
  • the ADH2 gene overexpressed in the invention comprises or consists essentially of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5.
  • the ADH2 gene of the invention may also cover genes having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 5 provided that these sequences encode proteins that possess alcohol dehydrogenase activity.
  • the ADH5 gene overexpressed in the invention comprises or consists essentially of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6.
  • the ADH5 gene of the invention can also cover genes having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 6 provided that these sequences encode proteins that possess alcohol dehydrogenase activity.
  • the FALDH3 gene overexpressed in the invention comprises or consists essentially of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 7.
  • the FADH3 gene of the invention may also cover genes having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 7 provided that these sequences encode proteins that possess a fatty aldehyde dehydrogenase activity.
  • the FALDH4 gene overexpressed in the invention comprises or consists essentially of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 8.
  • the FADH4 gene of the invention may also cover genes having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 8 provided that these sequences encode proteins that possess a fatty aldehyde dehydrogenase activity.
  • the FA01 gene overexpressed in the invention comprises or consists essentially of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 9.
  • the FADH4 gene of the invention may also cover genes having at least 80% identity. with the sequence SEQ ID NO: 9 provided that these sequences encode proteins which have a fatty alcohol oxidase activity, and in particular the sequences SEQ ID NO: 10 (YAYA0S1 -26698g), SEQ ID NO: 11 (YAGA0F17920g), SEQ ID NO: 12 (YAAL0S04-08768g) and SEQ ID NO: 13 (YAPH0S5-07338g).
  • the cytochrome P450 monooxygenase activity can be measured spectrally.
  • Spectrum CO Differential spectrum between reduced P450 and the presence of carbon monoxide and reduced P450, as described in Estabrook and Werringloer 1978. Methods Enzymol. 52: 212-220.
  • Another method is to substitute the enzymes (7-ethoxyresorufin, 7-pentoxyresorufine) for metabolism.
  • the product of the reaction, resorufin is fluorescent and can be quantified for example by means of a fluorescence reader.
  • the dehydrogenase activity of fatty aldehydes can be measured by studying the metabolism of pyrene-decanal by HPLC.
  • the reaction In the presence of 20 mM sodium pyrophosphate at pH 8, 1 mM NAD, 1% Triton X-100 (v / v in its reduced form) and 50 ⁇ M pyrene-decanal, the reaction is carried out in the presence of 'enzyme. After reaction at 37 ° C for 20-30 min, the reaction is quenched with methanol, and the reaction mixture is centrifuged at 16,000 g before analysis by HPLC.
  • n-decane is added to a final concentration of 1% for 6h.
  • the cells are washed and taken up in a homogenization buffer (25 mM HEPES-NaOH (pH 7.3), 100 mM KCl, 10% glycerol, 1 mM dithiothreitol, and 1% protease inhibitors) and ground with beads. diameter 0.45 to 0.5 mm in diameter.
  • the homogenate is centrifuged twice at 1000 g for 10 min at 4 ° C.
  • 1% v / v Tween 80 is added to the supernatant, and the mixture is left for 20 min at 4 ° C and then centrifuged at 13000g for 10 min. The supernatant is then analyzed by mass spectrometry to measure the products of the conversion of n-decane.
  • the alcohol dehydrogenase activity can be measured according to the Naporo-Wijata et al. Biomolecules 2013, 3, 449-460. Briefly, the alcohol dehydrogenase activity is determined by measuring the reduction of NAD (P) + at 340 nm. 20 L of solution (alcohol or sugar, 100 mM in 50 mM potassium phosphate, 40 mM KCl, pH 8.5) are added to 140 ⁇ l of potassium phosphate (50 mM, 40 mM KCl, pH 8.5), followed by 20 ⁇ l of enzyme (in 10 mM sodium phosphate, pH 7.5).
  • solution alcohol or sugar, 100 mM in 50 mM potassium phosphate, 40 mM KCl, pH 8.5
  • enzyme in 10 mM sodium phosphate, pH 7.5.
  • the reaction is initiated by adding 20 ⁇ l of NAD + (NADP + gold, 10 mM in water) and the reaction is carried out for 10 minutes. Reactions without substrates are carried out as controls.
  • the activity is defined as the amount of enzyme capable of producing 1 ⁇ of NADH per min.
  • the aforementioned yeast strain may be a strain of Yarrowia lipolytica transformed so that it overexpresses any of the aforementioned gene combinations. In this case, it is an "autologous" overexpression. However, it is possible to transfer the metabolic pathway to another organism so that the diacid biosynthetic pathway is reproduced. Also, it is possible to overexpress a yeast of another genus than the genus Yarrowia, for example yeasts of the genera Candida, Pichia or Saccharomyces (without being limiting) the genes of the above combinations. This will be a "heterologous or orthologous" overexpression.
  • the yeast strains used are incapable of degrading fatty acids.
  • the object of the invention is to increase the production of diacids by limiting as much as possible any metabolic pathway which would aim to degrade the biosynthesized diacids. To do this, it is possible,
  • ⁇ -oxidation for example by carrying out a deletion or a disruption of the POX genes encoding the iso-enzymes of acyl-CoA oxidase, involved in the first step of the ⁇ -oxidation peroxisomal, including the POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 and POX6 genes, which will inhibit the degradation of peroxisomal fatty acids,
  • the FAA 1 gene codes for a cytoplasmic fatty acid CoA synthetase and the PXA 1 and PXA 2 genes encode an ABC transporter involved in the transport fatty acids in the peroxysosomes.
  • the preferred source of fermentation substrate is a fatty acid, a hydrocarbon or a mixture of fatty acids and hydrocarbons.
  • the composition used as substrate comprises several fatty acids or hydrocarbons of different nature (carbon chain of different size, presence of substitutions, etc.), the result of the fermentation will lead to obtaining a mixture of diacids corresponding to the substrates.
  • the substrates comprise a C5 hydrocarbon and a C10 hydrocarbon
  • the result of the fermentation will be obtaining a mixture of C5 and C10 diacids.
  • carboxylic acids also applies to carboxylic acids.
  • the invention relates to the use of a strain of Yarrowia lipolytica or Candida tropicalis unable to degrade fatty acids, overexpressing at least the following genes:
  • the ALK3 gene comprising or consisting of the following sequence SEQ ID NO: 1, encoding a cytochrome P450 monooxygenase, or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 1,
  • At least one of the ADH2 and ADH5 genes comprising or consisting respectively in the sequence SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, each coding an alcohol dehydrogenase, and
  • FALDH3 and FALDH4 genes comprising or consisting respectively in the following sequence SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8, each coding a fatty aldehyde dehydrogenase or the FA01 gene comprising or consisting of the following sequence SEQ ID NO: 9 encoding a fatty alcohol dehydrogenase,
  • the invention relates to the aforementioned use, wherein said yeast strain further overexpresses the CPR1 gene which encodes an NADPH-cytochrome reductase.
  • the inventors have shown that overexpression of the CPR1 gene encoding a cytochrome P450 reductase makes it possible to increase the production of diacid.
  • the CPR1 gene is defined as comprising or consisting of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 14, or any sequence having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 14 provided that these sequences encode a protein having cytochrome P450 reductase activity.
  • the invention relates to the aforementioned use, wherein said yeast is further disrupted, or has a deletion for the genes encoding the iso-enzymes of acyl-CoA oxidase POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 and POX6.
  • the invention relates to the aforementioned use, wherein said yeast is further disrupted or has a deletion for the DGA 1, DGA2 and / or LR01 genes.
  • the invention relates to the aforementioned use, wherein said yeast is further disrupted or has a deletion for at least one of the genes DGA 1, DGA2 and LR01.
  • the technical effect of this disruption is to limit the storage of fatty acids. Indeed, once produced, the fatty acids can be stored and thus escape the conversion to dicarboxylic acids.
  • the pool of stored fatty acids represents from 10 to 70% of the total amount of fatty acids produced or assimilated by a microorganism. Also, in order to avoid the escape of the transformation into diacids, and increase the production of these, it is advantageous to limit the storage.
  • the disruption or the deletion of at least one of the DGA 1, DGA2 and / or LR01 genes inhibits said storage.
  • DGA 1, DGA2 and / or LR01 is meant the following combinations: DGA 1 alone, DGA2 alone, LR01 alone, the combination DGA 1 and DGA2, the combination DGA 1 and LR01, the combination DGA2 and LR01, and the combination DGA 1 and DGA 2 and / or Or.
  • the DGA2 gene encodes a diacylglycerol acyl transferase of the DGAT1 type
  • the DGA1 gene codes for a diacylglycerol acyl transferase of the DGAT2 type
  • the LR01 gene codes for a phospholipid: diacylglycerol acyltransferase involved in the synthesis of triglycerol from diacylglycerol by the independent aceltyl CoA pathway.
  • the DGA1 gene comprises or consists of the sequence SEQ ID NO: 15
  • the DGA2 gene comprises or consists of the sequence SEQ ID NO: 16
  • the LR01 gene comprises or consists of the sequence SEQ ID NO: 17.
  • the invention relates to the above-mentioned use, wherein said yeast strain overexpressing said genes is derived from the yeast strain Yarrowia lipolytica OLEO-X.
  • the yeast strain OLEO-X is itself derived from strain w29 deposited with the ATCC (American Type Culture Collection) under the number ATCC 20460, and has the following genotype: MATA ura-3-302 leu2-270 xpr2- 322 ⁇ 1-6 ⁇ dgalA IrolA dga2A fad2A.
  • the invention relates to the use of a Yarrowia lipolytica strain of MATA genotype ura-3-302 leu2-270 xpr2-322 ⁇ 1-6 ⁇ dgalA IrolA dga2A fad2A, overexpressing at least the genes following:
  • the ALK3 gene comprising or consisting of the following sequence SEQ ID NO: 1, encoding a cytochrome P450 monooxygenase, or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 1,
  • At least one of the ADH2 and ADH5 genes comprising or consisting respectively in the sequence SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, each coding an alcohol dehydrogenase, and
  • FALDH3 and FALDH4 genes comprising or consisting respectively in the following sequence SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8, each coding a fatty aldehyde dehydrogenase or the FA01 gene comprising or consisting of the following sequence SEQ ID NO: 9 encoding a fatty alcohol oxidase, optionally further overexpressing the CPR1 gene encoding a NADPH-cytochrome reductase comprising or consisting of the following sequence SEQ ID NO: 14.
  • At least one dicarboxylic acid for the preparation, by fermentation, of at least one dicarboxylic acid, in particular from at least one hydrocarbon or at least one fatty acid.
  • hydrocarbons or fatty acids, long chain that is to say having a carbon skeleton of more than 10 carbon atoms.
  • the invention relates to the use of any one of the following strains:
  • the strain Y4832 also called JMY4832, is characterized by the MATA genotype ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ⁇ 1-6 ⁇ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 and has the phenotype [Leu + Ura +].
  • This strain was filed at the CNCM on March 14, 2016 under number CNCM I-5072,
  • the strain Y4833 also called JMY4833, is characterized by the MATA genotype ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ⁇ 1-6 ⁇ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 and has the phenotype [Leu + Ura +].
  • This strain was filed at the CNCM on March 14, 2016 under number CNCM I-5073, and
  • strain Y4834 also called JMY4834, is characterized by the MATA genotype ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ⁇ 1-6 ⁇ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1
  • ADH2-URA3 FA01-LEU2 has the phenotype [Leu + Ura +]. This strain was filed at the CNCM on March 14, 2016 under number CNCM I-5074,
  • the invention also relates to a method for producing at least one dicarboxylic acid comprising the following steps:
  • the ALK3 gene encoding a cytochrome P450 monooxygenase
  • FALDH3 or FALDH4 genes encoding fatty aldehyde dehydrogenases or the FA01 gene encoding a fatty alcohol oxidase
  • a culture medium consisting essentially of an energetic substrate which comprises at least one carbon source and one nitrogen source, and
  • yeast strain is contact with at least one fatty acid, preferably in the presence of an energetic substrate.
  • the strain chosen is cultured in a medium consisting essentially of an energetic substrate which comprises at least one carbon source and a nitrogen source in order to grow said strain. This is the growth phase. This may be important to the extent that the inability to degrade fatty acids may interfere with yeast growth.
  • the bioconversion substrate (alkane or mixture of alkanes, fatty acid or mixture of fatty acids, fatty acid ester or mixture of fatty acid esters or natural oil or mixture of these different substrates) is then added in a to initiate bioconversion into diacids.
  • the culture medium may comprise a supply of secondary energy substrate generally consisting of at least one polyhydroxy compound, such as for example glycerol or a sugar, including glucose.
  • the mutant strains that can be used in the process of the invention can be obtained from the strain Po1 d, which is derived from the wild strain Yarrowia lipolytica W29.
  • the Po1 d strain is an auxotrophic strain for leucine (leu-) and uracyl (ura-). It is described in the review of G. Barth et al .: Yarrowia lipolytica in: Nonconventional Yeasts in Biotechnology A Handbook (Wolf, K., Ed.), Vol. 1, 1996, pp. 313-388. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. It is listed under CLIB139 in the CLIB.
  • the principle of the process according to the invention is therefore to bioconvert the hydrocarbons to diacids, and the fatty acids to diacids.
  • octadecane C 18 H 38 will be converted to octadecanedioic acid just like stearic acid
  • oleic acid cis-octadec-9-enoic acid
  • cis-octadec-9-ene dioic acid those skilled in the art are capable of knowing the diacid obtained from the fatty acid or hydrocarbon which is added during the bioconversion stage.
  • the invention relates to the aforementioned method, wherein said yeast strain further overexpresses the CPR1 gene which codes for an NADPH-cytochrome reductase.
  • the invention relates to a method as defined above, further comprising a step of recovering, isolating or purifying said at least one dicarboxylic acid formed.
  • a step of recovering, isolating or purifying said at least one dicarboxylic acid formed is advantageous when the process is implemented to recover the diacids formed by a technique known to those skilled in the art, such as the precipitation of calcium salts.
  • the invention relates to a method as defined above, in which the fatty acids are in the form of a mixture, and especially in the form of an oil or a mixture of alkanes. , in particular an oil chosen from:
  • vegetable oils such as rapeseed oil, oleic rapeseed oil, sunflower oil, oleic sunflower oil, coconut oil, palm oil, palm kernel oil, olive oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, mustard oil, castor oil, palm olein, palm stearin, safflower oil, sesame oil, linseed oil, walnut oil, reason seed oil, hemp oil or a by-product derived from the extraction thereof at least 30% of a mixture of fatty acids, such as ester waters, bottoms, deodorizing condensates, washings or neutralization pastes,
  • microbial oils derived from so-called oleaginous microorganisms, that is to say capable of storing fatty acids containing more than 20% of their dry weight, derived from yeasts, bacteria or microalgae
  • vegetable oil is understood to mean a fatty substance extracted from an oleaginous plant.
  • oleaginous plant means any plant whose seeds, nuts or fruits contain lipids.
  • a fatty substance is a substance composed of molecules with hydrophobic properties.
  • Fatty substances are mainly composed of fatty acids and triglycerides which are esters consisting of a molecule of glycerol and three fatty acids. The other components form what is called unsaponifiable.
  • Modern methods of oil recovery include breaking and pressing steps, as well as dissolving in a solvent, most often hexane. Extraction of the oil with a solvent is a more efficient method than pressing. The residue left after extraction of the oil (cake or flour) is used as animal feed.
  • Crude vegetable oils are obtained without additional treatment other than degumming or filtration. To make them fit for human consumption, edible vegetable oils are refined to remove impurities and toxic substances, a process involving bleaching, deodorization and cooling.
  • the oils contemplated in the plant invention include crude, refined or fractionated oils or by-products derived from the extraction of oils.
  • vegetable oils contain predominantly unsaturated fatty acids of two kinds: monounsaturated (palmitic acid, oleic acid, erucic acid) and polyunsaturated (linoleic acid).
  • the invention relates to a method as defined above, wherein said yeast is further disrupted for the genes coding for the iso-enzymes of acyl-CoA oxidase POX1, POX2, POX3, POX4. , POX5 and POX6.
  • the invention relates to a method as defined above, wherein said yeast is further disrupted or has a deletion for the genes DGA1, DGA2 and / or LR01.
  • the invention relates to a method as defined above, wherein said yeast strain overexpressing said genes is derived from the OLEO-X strain.
  • the invention relates to a process as defined above, wherein said diacids are obtained from fatty acids or hydrocarbons, which are present in the form of a mixture having, by weight, a amount of more than 30% fatty acids or hydrocarbons having more than 10 carbon atoms including fatty acids or C14-C26 alkanes.
  • fatty acids or hydrocarbons By at least 30% of fatty acids or hydrocarbons is meant in the invention a quantity of fatty acids or hydrocarbons of 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, %, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% , 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% by weight based on total weight of the composition
  • fatty acid or hydrocarbons having more than 10 atoms linear or branched alkanes (CnH 2n + 2), linear or branched alkenes (CnH2n), straight or branched alkynes (CnH2n-2) having at least 10 carbon atoms are defined.
  • fatty acids or C 14 -C 26 hydrocobures is meant fatty acids or C 14, C 15, C 16, C 17, C 18, C 19, C 20, C 21, C 22, C 23, C 24, C 25 or C 26 hydrocarbons.
  • the invention relates to the above-mentioned use, wherein said fatty acids or hydrocarbons are present in the form of a mixture having by weight an amount of more than 30% of fatty acids having more than 10 carbon atoms, especially fatty acids or C14-C26 hydrocarbons, and having by weight in particular more than 30% fatty acids or at least monounsaturated hydrocarbons.
  • said at least one fatty acid is a mixture of fatty acid having by weight an amount of more than 30% oleic acid relative to the total weight of the mixture.
  • the vegetable oils of interest are the following: hazelnut oil which comprises about 77% by weight of oleic acid, olive oil which comprises about 72% by weight of oleic acid, avocado oil which comprises about 68% by weight of oleic acid, rapeseed oil which comprises about 56% by weight of oleic acid, oleic sunflower oil which comprises about 80% by weight of oleic acid, peanut which comprises about 35% by weight of oleic acid, palm olein which comprises about 40% by weight of oleic acid, sesame oil which comprises about 39% by weight of oleic acid or palm oil which comprises about 36% by weight of oleic acid.
  • the invention also relates to a method for producing at least one dicarboxylic acid, especially cis-octadec-9-ene dioic acid, comprising the following steps:
  • a growth phase in which a Yarrowia lipolytica yeast strain is cultured, in particular of the MATA genotype ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ⁇ 1-6 ⁇ dga lA Iro lA dga2A fad2A, incapable of degrading the fatty acids and optionally storing the fatty acids in triglyceride form, overexpressing at least the selected gene combinations in the following group:
  • the ALK3 gene in particular comprising or consisting of the following sequence SEQ ID NO: 1, or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 1 and exhibiting a cytochrome P450 monooxygenase activity; , the ADH2 gene comprising or consisting respectively of the sequence SEQ ID NO: 5 or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 5 and having an alcohol dehydrogenase activity and the gene FALDH3 comprising or consisting respectively in the sequence SEQ ID NO: 7 or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 7 and having a fatty aldehyde dehydrogenase activity
  • the ALK3 gene in particular comprising or consisting of the following sequence SEQ ID NO: 1, or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 1 and exhibiting a cytochrome P450 monooxygenase activity; , the ADH2 gene comprising or consisting respectively of the sequence SEQ ID NO: 5 or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 5 and having an alcohol dehydrogenase activity and the gene FALDH4 comprising or consisting respectively in the sequence SEQ ID NO: 8 or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 8 and having a fatty aldehyde dehydrogenase activity
  • the ALK3 gene in particular comprising or consisting of the following sequence SEQ ID NO: 1, or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 1 and exhibiting a cytochrome P450 monooxygenase activity; , the ADH2 gene comprising or consisting respectively of the sequence SEQ ID NO: 5 or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 5 and having an alcohol dehydrogenase activity and the gene FA01 comprising or consisting respectively in the sequence SEQ ID NO: 9 or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 9 and having a fatty alcohol oxidase activity,
  • the ALK3 gene in particular comprising or consisting of the following sequence
  • SEQ ID NO: 1 or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 1 and having a cytochrome P450 monooxygenase activity
  • the ADH5 gene comprising or consisting respectively in the SEQ ID sequence NO: 6 or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO:
  • the ALK3 gene in particular comprising or consisting of the following sequence SEQ ID NO: 1, or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 1 and exhibiting a cytochrome P450 monooxygenase activity; , the ADH5 gene comprising or consisting respectively of the sequence SEQ ID NO: 6 or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 6 and having an alcohol dehydrogenase activity and the gene FALDH4 comprising or consisting respectively in the sequence SEQ ID NO: 8 or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 8 and having a fatty aldehyde dehydrogenase activity, and
  • the ALK3 gene in particular comprising or consisting of the following sequence SEQ ID NO: 1, or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 1 and exhibiting a cytochrome P450 monooxygenase activity; , the ADH5 gene comprising or consisting respectively of the sequence SEQ ID NO: 6 or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 6 and having an alcohol dehydrogenase activity and the gene FA01 comprising or consisting respectively of the sequence SEQ ID NO: 9 or comprising or consisting of a sequence having at least 75% identity with the sequence SEQ ID NO: 9 and having a fatty alcohol oxidase activity, optionally further overexpressing the CPR1 gene comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO: 14 or comprising or consisting of a sequence having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 14 and having an NADPH-cytochrome reductase activity,
  • a culture medium consisting essentially of an energetic substrate which comprises at least one carbon source and one nitrogen source, and
  • a bioconversion phase wherein said yeast strain is brought into contact with an oil, especially a vegetable oil, such as the above-mentioned oils, a fish or yeast oil, bacteria or microalgae, preferably in the presence of 'an energetic substrate.
  • an oil especially a vegetable oil, such as the above-mentioned oils, a fish or yeast oil, bacteria or microalgae, preferably in the presence of 'an energetic substrate.
  • the invention also relates to a method for producing at least one dicarboxylic acid, especially cis-octadec-9-ene dioic acid, comprising the following steps:
  • a growth phase in which a Yarrowia lipolytica yeast strain is cultured among the following strains:
  • the strain Y4832 also called JMY4832, is characterized by the MATA genotype ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ⁇ 1-6 ⁇ dga IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 and has the phenotype [Leu + Ura +].
  • This strain was filed at the CNCM on March 14, 2016 under number CNCM I-5072,
  • the strain Y4833 also called JMY4833, is characterized by the MATA genotype ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ⁇ 1-6 ⁇ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 and has the phenotype [Leu + Ura +].
  • This strain was filed at the CNCM on March 14, 2016 under number CNCM I-5073, and
  • strain Y4834 also called JMY4834, is characterized by the MATA genotype ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ⁇ 1-6 ⁇ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1
  • ADH2-URA3 FA01-LEU2 has the phenotype [Leu + Ura +]. This strain was filed at the CNCM on March 14, 2016 under number CNCM I-5074,
  • a culture medium consisting essentially of an energetic substrate which comprises at least one carbon source and one nitrogen source, and
  • a bioconversion phase wherein said yeast strain is brought into contact with an oil, especially a vegetable oil, such as the above-mentioned oils, a fish or yeast oil, bacteria or microalgae, preferably in the presence of 'an energy substrate, and
  • an oil especially a vegetable oil, such as the above-mentioned oils, a fish or yeast oil, bacteria or microalgae, preferably in the presence of 'an energy substrate, and
  • the invention furthermore relates to a composition comprising a mixture of dicarboxylic acids that can be obtained by the process as defined above.
  • the diacid compositions obtained by the aforementioned process will not give directly by weight a conversion of the alkanes and fatty acids that will be provided to carry out the process.
  • the fatty acids synthesized by the yeasts during their growth can also be bio-converted into diacids.
  • compositions obtainable by the process of the invention comprise a high proportion of diacid because of the improved efficiency of the yeast strains used.
  • the invention furthermore relates to a composition
  • a composition comprising:
  • said first nucleic acid molecule, second nucleic acid molecule and third nucleic acid molecule being bound or individualized.
  • nucleic acid molecule corresponding to the ALK3 gene or it comprises a first nucleic acid molecule corresponding to the ALK3 gene, a second nucleic acid molecule corresponding to the ADH2 gene, or to the ADH5 gene and a third nucleic acid molecule corresponding to the FALDH3 gene, or to the FALDH4 gene, or to the FA01 gene,
  • nucleic acid molecule corresponding to the CPR1 gene optionally in combination with another nucleic acid molecule corresponding to the CPR1 gene.
  • the invention relates to a composition as defined above, where
  • the first nucleic acid molecule corresponding to the ALK3 gene comprising essentially consisting of or consisting of the sequence SEQ ID NO: 1,
  • the second nucleic acid molecule corresponding to the ADH2 gene comprising, comprising essentially or consisting of the sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 33, or the ADH5 gene comprising, comprising essentially or consisting of the sequence SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 35, and
  • the third nucleic acid molecule corresponding to the FALDH3 gene comprising, essentially comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 36 or SEQ ID NO: 37, or the FALDH4 gene comprising, comprising essentially or consisting of the sequence SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39, or the FA01 gene comprising, essentially comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 41 ,
  • composition optionally in combination with a fourth nucleic acid molecule sequence corresponding to the CPR1 gene comprising, comprising essentially or consisting of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 42 or SEQ ID NO: 43.
  • a fourth nucleic acid molecule sequence corresponding to the CPR1 gene comprising, comprising essentially or consisting of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 42 or SEQ ID NO: 43.
  • the first nucleic acid molecule comprises, essentially comprises or consists of the sequence SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19
  • the second nucleic acid molecule comprises, comprises essentially or consists of the sequence SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 and
  • the third nucleic acid molecule comprises, essentially comprises or consists of the sequence SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 31.
  • nucleic acid molecule sequence comprising, essentially comprising or consisting of SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 25.
  • the invention further relates to the various nucleic acid molecules comprising or consisting of the following sequences: SEQ ID NO: 18 to 31.
  • the invention further relates to a yeast strain transformed by a composition comprising at least one nucleic acid molecule as defined above.
  • the invention relates to a yeast strain mentioned above, wherein said yeast is a strain of Yarrowia lipolytica.
  • the invention furthermore relates to a Yarrowia lipolytica strain selected from the following strains:
  • strain Y3551 of genotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ⁇ 1-6 ⁇ dga U Iro U dga2A fad2A ALK3-LEU2 and phenotype [Leu + lira-],
  • strain JMY3950 derived from strain Y3551, of MATA genotype ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ⁇ 1-6 ⁇ dga U IroU dga2A fad2A ALK3-LEU2 CPR1-URA3 and phenotype [Leu + Ura +], deposited on March 26, 2015 at the CNCM (National Collection of Culture of Microorganisms, Pasteur Institute, 25 rue du Do Budapest Roux, F-75724 PARIS Cedex 15) under number CNCM I - 4963.
  • strain Y4428 derived from strain JMY3950, of MATA genotype ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ⁇ 1-6 ⁇ dgaU IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 and phenotype [Leu-Ura-],
  • strain Y4457 derived from strain Y4428, of genotype MATA ura3-302 Ieu2-270 xpr2-322 ⁇ 1-6 ⁇ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 and phenotype [Leu-Ura +], and
  • strains Y4832, Y4833 and Y4834 filed on March 14, 2016 at the CNCM under the respective numbers CNCM I - 5072, CNCM I - 5073 and CNCM I - 5074, these strains being derived from the strain Y4457, and have the genotype MATA ura3 - 302 leu2-270 xpr2 - 322 ⁇ 1 - 6 ⁇ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 and for phenotype [Leu + Ura +].
  • strain Y4832 also called JMY4832
  • JMY4832 is characterized by the MATA genotype ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ⁇ 1-6 ⁇ dgaU IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 and has the phenotype [Leu + Ura +].
  • This strain was filed at the CNCM on March 14, 2016 under number CNCM I-5072.
  • the strain Y4833 also called JMY4833, is characterized by the MATA genotype ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ⁇ 1-6 ⁇ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 and has the phenotype [Leu + Ura +]. This strain was filed at the CNCM on March 14, 2016 under number CNCM I-5073.
  • the strain Y4834 also called JMY4834, is characterized by the MATA genotype ura3-302 leu2-270 xpr2-322 pox1-6A dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 and has the phenotype [Leu + Ura +]. This strain was filed at the CNCM on March 14, 2016 under number CNCM I-5074.
  • Figures 1A to 1E show TLC chromatograms obtained for conversion of C12: 0 with yeast microsomes transformed with different constructs.
  • P, P1 and P2 represent the products of the reaction
  • S represents the substrate.
  • the x-axis represents the mobility in mm
  • the y-axis represents the radioactivity in arbitrary units.
  • Figure 1A shows the TLC histogram of yeast microsomes transformed with an empty vector.
  • Figure 1B shows the TLC histogram of yeast microsomes transformed with a vector expressing ALK2.
  • FIG. 1C represents the TLC histogram of yeast microsomes transformed with a vector expressing ALK 3.
  • Figure 1D shows the TLC histogram of yeast microsomes transformed with a vector expressing ALK 5.
  • Figure 1E shows the TLC histogram of yeast microsomes transformed with a vector expressing ALK 11.
  • Figures 2A to 2C show the conversion of oleic acid in the presence of microsomes expressing Alk3p.
  • Figure 2A shows TLC chromatograms of yeast microsomes transformed with an empty vector (top panel) or with Alk3p (bottom panel).
  • the axis abscissa is the time in minutes. 1 and 2 represent the two conversion products obtained.
  • Figure 2B shows a mass spectrum of the product 1 seen in Figure 2A.
  • Figure 2C shows a mass spectrum of the product 2 seen in Figure 2A.
  • Figures 3A and 3B show the conversion rate of fatty acids.
  • Figure 3A shows a histogram showing the specific activity (in ⁇ g / min / mg) of conversion of 100 ⁇ fatty acids indicated on the abscissa by yeast microsomes expressing Alk3p. Bars in gray represent restoration-oxidation products and bars in white are diacids.
  • Figure 3B shows a histogram showing the specific activity (in pg / min / mg) of conversion of 100 ⁇ fatty acids indicated on the abscissa by yeast microsomes expressing Alk5p. Bars in gray represent restoration-oxidation products and bars in white are diacids.
  • FIG. 4 represents a graph showing the production during diacid by two strains (B and C) of OLEOX yeast overexpressing the ALK3 gene. The production is compared to that obtained by an OLEOX strain not transformed with ALK3 (A).
  • the x-axis represents the culture time in hours and the y-axis represents the amount of DC18 1 in g / L.
  • FIG. 5 represents a graph showing the production over time of diacid by two strains (B and C) of yeast OLEOX-CPR1 overexpressing the FALDH3 and FALDH4 gene respectively. The production is compared with that obtained by a non-transformed OLEOX strain with any of the FALDH3 or 4 (A) genes.
  • the x-axis represents the culture time in hours and the y-axis represents the amount of DC18 1 in g / L.
  • Figure 6 is a graph showing diacid time production by two OLEOX yeast strains overexpressing the CPR1 + ALK3 + ADH2 + FALDH3 (curve with triangles) and CPR1 + ALK3 + ADH2 + FALDH4 (curve with squares) genes. The production is compared with that obtained by an OLEOX strain overexpressing only CPR1 (curve with open squares).
  • the x-axis represents the culture time in hours and the y-axis represents the amount of DC18 1 in g / L.
  • Figure 7 is a graph showing the production over time of diacid by three OLEOX yeast strains overexpressing the genes CPR1 + ALK3 + ADH2 + FA01 (A, B and C). The production is compared to that obtained by an OLEOX strain overexpressing only CPR1 (D).
  • the x-axis represents the culture time in hours and the y-axis represents the amount of DC18 1 in g / L.
  • Figure 8 is a graph showing the productivity of three OLEOX yeast strains overexpressing the CPR1 + ALK3 + ADH2 + FA01 genes (A, B and C). The production is compared to that obtained by an OLEOX strain overexpressing only CPR1 (D).
  • the x-axis represents the culture time in hours and the y-axis represents the amount of DC18 1 in g / L.
  • Figure 9 is a graph showing the productivity of three yeast strains overexpressing the CPR1 + ADH2 (B) genes or the CPR1 + ADH5 (C) genes. The production is compared to that obtained by a strain only CPR1 (A).
  • the x-axis represents the culture time in hours and the y-axis represents the amount of DC18 1 in g / L.
  • Example 1 Process for producing dicarboxylic acids from oleic sunflower oil with a strain according to the invention.
  • a preculture of the strain, preserved on agar medium of composition: yeast extract 10 g / L; peptone 10 g / L; glucose 10 g / L; Agar 20 g / L, is carried out by seeding which provides an initial absorbance of the preculture medium close to 0.30.
  • the preculture is conducted with orbital shaking (200 rpm) for 24 h at 30 ° C. in a 500 ml finned flask containing 25 ml of medium (10 g / l of yeast extract, 10 g / l of peptone, 20 g / l glucose).
  • the medium used for the culture is composed of deionized water, yeast extract at 10 g / L; tryptone at 20 g / L; glucose at 40 g / L and oleic sunflower oil at 30 g / L.
  • Seeding of the fermenter is performed with the entire preculture vial.
  • the culture is conducted at 30 ° C in a fermenter of 4 L with 2 L medium at a ventilation rate of 0.5 vvm and a stirring speed of 800 rpm provided by a centripetal turbine double effect.
  • the dicarboxylic acid composition of the mixture is determined by gas chromatography on a DB1 column after conversion of the dicarboxylic acids to diesters according to the method described by Uchio et al. Agr Biol Chem 36, No. 3, 1972, 426-433.
  • the oven temperature of the chromatograph is programmed from 150 ° C to 280 ° C at a rate of 8 ° C per min.
  • cytochromes P450 In Yarrowia lipolytica, there are 17 genes encoding cytochromes P450, of which 12 belong to the CYP52 family. All these CYP52 genes are inducible in the presence of alkanes.
  • the inventors have thus tested the function of 7 of these Yarrowia lipolytica genes in order to determine their biological role in the metabolism of aliphatic molecules.
  • the inventors have carried out a screening using S. cerevisiae yeast microsomes WAT11 transformed with 6 genes of the CYP52 family cloned in Yarrowia lipolytica: ALK2 , ALK3, ALK4, ALK5, ALK6 and ALK11.
  • reaction mixtures were deposited on TLC plates, then developed and analyzed.
  • Alk5p and Alk11p are able to metabolize lauric acid.
  • each microsomal preparation with free fatty acids of different size and at different levels of unsaturation (for example myristic acid - C14: 0, palmitic acid).
  • - C16 0, stearic acid - C18: 0, oleic acid - C18: 1 and linoleic acid - C18: 2).
  • ALK2 7.3 1, 1 0.5 NDNDND ALK3 65 68 20 3 27 35
  • Alk2p appears to be involved in the metabolism of short chain fatty acids, with a conversion rate that decreases from lauric acid to palmitic acid. No significant conversion of C18: 0 is observed with this enzyme.
  • Alk4p, Alk6p and Alk11 p show either a lack of activity or a very weak activity.
  • microsomes containing Alk3p and Alk5p convert for their part all the substrates with a high conversion rate.
  • Alk3p shows two conversion products for all substrates except for stearic acid. The first peak has an expected profile for a ⁇ -hydroxy fatty acid, while the second appears to correspond to a diacid. Examples of lauric acid conversion are shown in Figures 1A-1E.
  • Preparations of fresh yeast microsomes expressing Alk3p were performed.
  • the inventors normalized the total protein content and performed new incubations with lauric acid and palmitic acid as well as the three aforementioned C18 fatty acids (stearic acid, oleic acid and linoleic acid). All reactions were performed in duplicate in the presence of NADPH for TLC and GC-MS analysis. TLC chromatograms clearly show the ability of Alk3p to convert each of the substrates except stearic acid into two products. Both products have an oo-oxidation and diacid profile, as expected.
  • the second peak shows ions m / z (relative intensity in%) at 55 (60%), 274 (12%), 307 (10%) (M-31) (loss of OCH 3 methyl ester) and 338 (2%) (M).
  • RT of the 1,18-octadeca-9,12-dienedioic acid potential is 45,002 min
  • RT for the 18-hydroxylinoleic acid is 45,511 min.
  • min RT of 1, 18-octadeca-9-enedioic acid is 45.299 min and RT of 18-hydroxyoleic acid is 45.853 min.
  • TLC chromatograms were used to calculate the specific activity of Alk3p and Alk5p for the substrates tested. The results for Alk3p and Alk5p are shown in Figures 3A and 3B.
  • Alk3p is a better candidate for long chain oxidation compared to Alk5p.
  • the conversion of free fatty acid to diacid catalyzed by Alk3p is more efficient than with Alk5p.
  • ALK genes In Yarrowia Iipolytica, the expression of ALK genes is known to be strongly regulated by alkanes. Regarding their in vitro activity on free fatty acids, one hypothesis is that Alk3p and / or Alk5p could be involved in the successive terminal oxidation of alkanes by successively converting them into fatty alcohol, then fatty acids, then hydroxyl fatty alcohols and finally into diacids.
  • the coding sequences of the CYP52 genes were cloned by PCR using a DNA preparation of the Yarrowia lipolytica strain W29.
  • the sense and antisense primers were prepared by including restriction sites at both ends to perform cloning.
  • PCR amplification was performed using Pyrobest Polymerase for 30 cycles (15 seconds at 96 ° C, 30 seconds at 55 ° C, 1 minute 30 seconds at 72 ° C).
  • the resulting DNA fragments were purified by electrophoresis using the QIAquick Freeze Extraction Kit.
  • the purified fragments were digested with the appropriate combination of restriction enzymes and ligated into the pYeDP60 shuttle vector using T4 DNA ligase.
  • Ligation products were used to transform E.coli Mach 1 T1 chemically competent.
  • the transformed E. coli cells were selected on LB medium supplemented with 100 ⁇ g / ml of ampicillin. Plasmids from a single colony were purified by miniprep. The integrity of the plasmid and its sequence were validated by restriction analysis and DNA sequencing (GATC Biotech, Constance, Germany).
  • the expression of the proteins of the 6 members of the cloned 6YP52 family was performed using a heterologous system specifically designed for the expression of cytochrome P450 enzymes, based on the vector pYeDP60 and the strain WAT11 of Saccharomyces cerevisiae.
  • the WAT11 strain was transformed with each of the pYeDP60 constructs using the LiAc lithium acetate method.
  • Transformants were selected by plating on YNB dishes lacking uracil.
  • the yeasts are left in culture and the expression of cytochrome P450 was induced as described in POMPON et al., 1996.
  • the microsomes were prepared by manually breaking the cells using glass beads (0.45 mm thick).
  • microsome pellet was resuspended in 50mM Tris-HCl (pH 7.4), mM EDTA and 30% (v / v) glycerol with a Potter-Elvehjem homogenizer.
  • the volume of buffer used for the resuspension of the microsomes was determined by the approximate mass of the yeast wet pellet obtained after growth (1 ml of buffer for 2 g of cell pellet).
  • cytochrome P450 enzymes were evaluated in vitro using different radio labeled fatty acids.
  • the standard test (0, 1 mL) contained 20mL sodium phosphate (pH 7.4), 1 mL NADPH) a radiolabeled substrate (100 ⁇ ) and 0.15mg of microsomal protein.
  • the reactions were carried out in a water bath at 27 ° C. with continuous stirring. The reaction is initiated by addition of NADPH and stopped after 20min by adding 20 ⁇ of acetonitrile containing 0.2% of acetic acid. The reactions were then revealed by direct application of the incubation medium to the TLC plates or by GC-MS analysis performed by extraction with organic solvents and a derivatization step as described below.
  • the reaction mixtures were deposited directly on silica-coated TLC plates to separate the incubation products from the initial substrate.
  • the plates were developed using an ether / petroleum ether / formic acid mixture (50:50: 1, v / v / v). Plates were scanned using a radioactivity detector. Chromatograms resulting from TLC allow the determination of conversion rates for each cytochrome P450 / fatty acid combination, based on the radioactivity detected by the reader.
  • the mobility of the products on the TLC plate is a good indication of the type of oxygenation reaction that has been performed on the substrate (i.e. hydroxylation, epoxidation, diacid formation).
  • the metabolites were extracted from the reaction mixture by successive liquid / liquid extractions with diethyl ether and hexane as solvents. The solvents were then evaporated under a stream of nitrogen.
  • the lipids were methylated by reaction in acidic methanol (MeOH / H2SO4.99: 1, v / v-1 h-100 ° C) and trimethylsilylates with ⁇ , ⁇ -bistrimethylsilyltrifluoroacetamide containing 1% (v / v) trimethylcholosilane.
  • the GC / MS analyzes were carried out on a gas chromatograph equipped with a capillary column with an internal diameter of 0.25 mm and a film thickness of 0.25 ⁇ m.
  • the gas chromatograph was combined with a quadrupole mass selective detector.
  • the mass spectrum was recorded at 70eV and analyzed as in Eglinton et al. 1996. Hydroxy fatty acids as well as dicarboxylic acids formed during enzymatic reactions were identified by analysis of their mass spectrum and compared with controls when necessary.
  • Example 2 In view of the results obtained in Example 2, the inventors tested the overexpression of the ALK3 gene in Yarrowia lipolytica in order to increase the production of diacid from a source of fatty acid, and in particular of oleic acid.
  • the inventors have identified the genes potentially coding for a fatty aldehyde dehydrogenase activity (four genes named FALDH1 -4). These genes have shown, during transcriptomic analysis during a production kinetics of DC18: 1 (DCA7 fermentation) a strong expression during the diacid production phase.
  • Expression cassettes of the four genes encoding FALDH's were constructed under the control of the constitutive pTEF promoter.
  • the inventors transformed the two strains: Y2149 and Y2159 (production strain and OLEO-X strain). The strains obtained were checked by PCR and put in collection.
  • the inventors tested the production of diacids by comparing the OLEOX strains overexpressing CPR1 and FALDH3 and OLEOX overexpressing CPR1 and FALDH4. In control, the OLEOX strain overexpressing only CPR1 was used.
  • the inventors have also tested the effect of the overexpression of the ADH2 and ADH5 genes on the production of diacids.
  • Strains of Yarrowia lipolytica genotype FT164, pox1-6A, dgalA, lro1 :: URA3, CPR1 were transformed with the overexpression cassettes of alcohols dehydrogenases (ADHs) pPOX2-ADH2 and pPOX2-ADH5.
  • ADHs alcohols dehydrogenases
  • the inventors tested the production of diacids by comparing the strains overexpressing CPR1 and ADH2 and overexpressing CPR1 and ADH5. In control, the strain overexpressing only CPR1 was used.
  • the results obtained for strains overexpressing ALK3 + CPR1 + ADH2 + FALDH3 or ALK3 + CPR1 + ADH2 + FALDH4 are shown in FIG. 6.
  • the strain used as a control is OLEOX which overexpresses the CPR1 gene.
  • the strain overexpressing ALK3 + CPR1 + ADH2 + FALDH4 does not show an improvement in final production, but it has an increased production speed in the production phase of DCA. This represents an interesting improvement in terms of productivity.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'une souche de levure surexprimant au moins les gènes suivants : le gène ALK3, l'un au moins des gènes ADH2 et ADH5 et l'un au moins des gènes FALDH3 et FALDH4, ou le gène FA01 pour la préparation par fermentation de diacides carboxyliques.

Description

Microorganismes et leur utilisation pour la production de diacides
La présente invention concerne des microorganismes et leur utilisation pour la production de diacides carboxyliques.
Les acides dicarboxyliques (aussi appelés "diacides") sont utilisés comme matières premières par exemple dans la synthèse de polyamides et de polyesters, d'huiles lubrifiantes, d'agents plastifiants ou de parfums.
Les procédés de production des diacides varient suivant le nombre d'atomes de carbone du squelette carboné du diacide considéré. Par exemple, l'acide azélaïque (diacide en C9) est obtenu classiquement par oxydation chimique de l'acide oléique par l'ozone tandis que l'acide sébacique (diacide en C10) est produit par oxydation alcaline de l'acide ricinoléique. L'acide dodécanedioïque (diacide en C12) est un produit de la pétrochimie. La voie microbiologique est utilisée pour la production d'acide brassylique (diacide en C13) à partir de tridécane.
Compte tenu de la diversité des diacides qui sont utilisés dans les différentes applications, l'intérêt d'une voie de production applicable à la plus large gamme possible de diacides est souhaitable. Bien que se caractérisant par une vitesse de réaction plus lente que celle de la voie chimique, la voie biologique présente l'intérêt d'être applicable à une grande variété de substrats.
Bien que de nombreuses espèces microbiennes sauvages telles que Cryptococcus neoformans, Pseudomonas aeruginosa, Candida cloacae, etc. soient capables de biosynthétiser des diacides, les niveaux de production demeurent relativement peu élevés.
Aussi, pour obtenir des excrétions substantielles de diacides, il convient d'utiliser des mutants qui ont été bloqués au niveau de la β-oxydation..
Une autre technique plus contraignante, mettant en œuvre les techniques de mutagénèse dirigée, a été développée pour Candida tropicalis. À partir d'une souche sauvage appartenant à cette espèce, la disruption séquentiellement des quatre gènes codant les deux isoenzymes de acyl-CoA oxydase (Aox) qui catalysent la première étape de la β-oxydation a été réalisée (Détermination of Candida tropicalis Acylcoenzyme A Oxidase Isoenzyme Function by.Sequential Gène Disruption. Mol. Cell. Biol. 11 , 1991 , 4333-4339, et brevet US 5254466 A1 ). Cependant, les souches de Candida tropicalis produites ne semblent pas totalement stables et se prêtent à des réversions possibles. C'est pour cette raison que des améliorations ont dû être apportées à l'art antérieur.
D'autres exemples d'amélioration ont été rapportés. Notamment la demande WO 2014100461 concerne des procédés biologiques qui permettent d'obtenir des acides dicarboxyliques gras. Pour ce faire, certains gènes de la voie métabolique de Γω- oxydation ont été surexprimés, afin de permettre la formation de diacides.
Toutefois, de telles méthodes ne semblent pas permettre une production de diacides à longue chaîne de manière optimale.
Aussi, l'invention a pour but de remédier aux inconvénients de l'art antérieur.
Un des buts de l'invention est de fournir un procédé de synthèse de diacides qui permet une production accrue.
Un autre but de l'invention est de fournir des microorganismes modifiés permettant de mettre en œuvre ce procédé.
Encore un autre but de l'invention est d'utiliser de nouveaux outils génétiques permettant l'amélioration de la production de diacides par des microorganismes.
L'invention concerne l'utilisation d'une souche de levure incapable de dégrader les acides gras, notamment une souche de Yarrowia lipolytica, surexprimant au moins les gènes suivants :
- le gène ALK3, codant une cytochrome P450 mono oxygénase
- l'un au moins des gènes ADH2 et ADH5 codant chacun une déshydrogénase d'alcools, et
- l'un au moins des gènes FALDH3 et FALDH4, codant chacun une déshydrogénase d'aldéhydes gras ou le gène FA01 codant une oxydase d'alcool gras,
pour la préparation, par fermentation, d'au moins un diacide carboxylique, à partir d'acides gras ou d'hydrocarbures, notamment à partir d'acides gras issus d'huiles végétales.
L'invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs que la surexpression des gènes Alk3, d'au moins un gène choisi parmi ADH2 et ADH5 et d'au moins un gène choisi parmi FALDH3, FALDH4 et FA01 permet d'augmenter significativement la production de diacides, notamment à partir d'acides gras ou d'hydrocarbures (alcanes, alcènes ou alcynes).
De manière inattendue, les inventeurs ont mis en évidence une synergie des surexpressions des gènes susmentionnés sur la production de diacides, alors que la simple surexpression de chacun de ces gènes n'a pas ou peu d'effet ou à un effet inverse : la production de diacides est largement diminuée. Ce résultat est surprenant car il est connu de l'état de la technique que par exemple la surexpression de cytochrome P450 peut convertir des acides gras ou des hydrocarbures en diacides, sans faire intervenir d'autres enzymes de Γω-oxydation, i.e. les déshydrogénases d'aldéhydes gras et les déshydrogénase d'alcool gras.
Dans l'invention, on définit par diacides, ou acides dicarboxyliques, des composés organiques possédant deux fonctions carboxyle. La formule moléculaire de ces composés est généralement notée HOOC-R-COOH, où R peut être un groupe alkyle, alcényle, alcynyle ou aryle.
Les diacides obtenus par le procédé de l'invention sont issus d'hydocarbures saturés ou non, linéaires ou branchés, ou de leurs acides carboxyliques équivalents, et sont convertis par la voie de Γω-oxydation.
Par « surexpression », on entend dans l'invention le niveau d'expression d'un gène qui a été introduit artificiellement dans le génome d'une souche de levure, de manière ectopique ou non, (mesuré par la quantité d'ARN produit, ou par la quantité de protéine issue de cet ARN), qui est au moins deux fois supérieur au niveau d'expression du même gène endogène. Le gène est dit « surexprimé » si la somme des expressions du gène (exogène et éventuellement endogène) est au moins deux fois supérieure à l'expression du gène endogène lors que la souche de levure n'est pas transformée ou qu'elle est dite sauvage de référence.
En d'autre termes, pour l'exemple du gène ALK3, les souches de levures utilisées dans l'invention ont été préalablement transformées par une molécule d'acides nucléiques codant ledit gène ALK3, placé sous contrôle d'éléments régulant son expression qui ne correspondent pas aux éléments de régulation du gène dans son contexte naturel (par exemple un promoteur constitutif qui n'est pas le promoteur endogène du gène ALK3, présence de séquence(s) d'augmentation ou de facilitation de l'expression - enhancer..). Il y aura surexpression si la quantité totale de produit exprimé par la souche transformée est au moins deux fois supérieure à la quantité de produit exprimé par une souche de levure non transformée par le gène ALK3.
L'homme du métier, avec ses connaissances générales de biologie moléculaire sera en mesure de quantifier cette surexpression par des techniques de PCR quantitative pour mesurer le niveau d'expression des ARN, ou par des techniques immunologiques pour mesurer la quantité de protéines.
L'exemple ci-dessus concernant le gène ALK3 s'applique mutatis mutandis aux autres gènes surexprimés dans le cadre de l'invention.
Afin de favoriser la production de diacides, il est nécessaire que les souches de levures utilisées dans le cadre de l'invention pour mettre en œuvre le procédé de production soient incapables de dégrader les acides gras. En d'autres termes, il est nécessaire que les souches de levures utilisées ne puissent pas dégrader, ni les acides gras (les acides carboxyliques ayant une longue chaîne carbonée, saturée ou non, ramifiée ou non), ni les diacides obtenus par conversion lors des étapes de Ι'ω- oxydation.
Dans l'invention, les acides gras peuvent être considérés comme libres ou sous forme estérifiée avec du glycérol pour former des monoglycérides, des diglycérides ou des triglycérides.
Ainsi, en limitant la dégradation des acides gras, et par conséquent la dégradation des diacides, ces derniers vont s'accumuler, et leur production sera donc augmentée.
Dans l'invention, on utilise une souche de levure qui surexprime :
- le gène ALK3, codant pour une cytochrome P450 monooxygenase appartenant à la famille,
- l'un au moins des gènes ADH2 et ADH5 codant pour des déshydrogénases d'alcools, et
- l'un au moins des gènes FALDH3, FALDH4 codant pour des déshydrogénases d'aldéhydes gras et FA01, codant pour une oxydase d'alcools gras. FALDH3
YALI0B01298g est également nommé HFD4 (Iwama et al., 2014) chez Yarrowia lipolytica. FALDH4 YALI0A17875g est également nommé FALDH1 (Gatter et al., 2014) et HFD3 (Iwama et al., 2014) chez Yarrowia lipolytica.
Cela signifie donc que dans l'invention les 21 combinaisons de gènes suivantes sont envisagées
- ALK3, ADH2 et FALDH2,
- ALK3, ADH2 et FALDH4,
- ALK3, ADH2 et FA01 ,
- ALK3, ADH2, FALDH2 et FALDH4,
- ALK3, ADH2, FALDH2 et FA01 ,
- ALK3, ADH2, FALDH4 et FA01 ,
- ALK3, ADH2, FALDH2, FALDH4 et FA01 ,
- ALK3, ADH5 et FALDH2,
- ALK3, ADH5 et FALDH4,
- ALK3, ADH5 et FA01 ,
- ALK3, ADH5, FALDH2 et FALDH4,
- ALK3, ADH5, FALDH2 et FA01 ,
- ALK3, ADH5, FALDH4 et FA01 ,
- ALK3, ADH5, FALDH2, FALDH4 et FA01 ,
- ALK3, ADHA2, ADH5 et FALDH2,
- ALK3, ADHA2, ADH5 et FALDH4,
- ALK3, ADHA2, ADH5 et FA01 ,
- ALK3, ADHA2, ADH5, FALDH2 et FALDH4,
- ALK3, ADHA2, ADH5, FALDH2 et FA01 ,
- ALK3, ADHA2, ADH5, FALDH4 et FA01 , et
- ALK3, ADHA2, ADH5, FALDH2, FALDH4 et FA01
Les souches de levure avantageuses utilisées dans le cadre de l'invention sont les suivantes : les souches de levures Candida spp. (par exemple: C. tropicalis, C. viswanathii), les souches de levures Yarrowia spp. (en particulier Y. lipolytica), les souches de levures Pichia spp., les souches de levures Saccharomyces spp. et les souches de levures Kluyveromyces spp.
Les souches avantageuses selon l'invention sont des souches de Yarrowia lipolytica incapables de dégrader les acides gras, et qui surexpriment l'une au moins des 21 combinaisons de gènes de l'invention, listées ci-dessus.
Avantageusement, le gène ALK3 surexprimé dans l'invention comprend ou consiste essentiellement en la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 1. ALK3 de l'invention peut également couvrir des gènes présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 sous réserve que ces séquences codent des protéines qui possèdent une activité cytochrome P450 mono oxygénase, et notamment les gènes de séquences suivantes : SEQ ID NO : 2 (YAAL0S03-16006g1_1 ), SEQ ID NO : 3 (YAGA0E09252g1_1 ) et SEQ ID NO : 4 (YAYA0S2-22892g1_1 ).
Avantageusement, le gène ADH2 surexprimé dans l'invention comprend ou consiste essentiellement en la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 5. Le gène ADH2 de l'invention peut également couvrir des gènes présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 sous réserve que ces séquences codent des protéines qui possèdent une activité déshydrogénase d'alcools.
En outre, le gène ADH5 surexprimé dans l'invention comprend ou consiste essentiellement en la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 6. Le gène ADH5 de l'invention peut également couvrir des gènes présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 sous réserve que ces séquences codent des protéines qui possèdent une activité déshydrogénase d'alcools.
Avantageusement, le gène FALDH3 surexprimé dans l'invention comprend ou consiste essentiellement en la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 7. Le gène FADH3 de l'invention peut également couvrir des gènes présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 sous réserve que ces séquences codent des protéines qui possèdent une activité déshydrogénase d'aldéhydes gras.
Avantageusement, le gène FALDH4 surexprimé dans l'invention comprend ou consiste essentiellement en la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 8. Le gène FADH4 de l'invention peut également couvrir des gènes présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 8 sous réserve que ces séquences codent des protéines qui possèdent une activité déshydrogénase d'aldéhydes gras.
Avantageusement, le gène FA01 surexprimé dans l'invention comprend ou consiste essentiellement en la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 9. Le gène FADH4 de l'invention peut également couvrir des gènes présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 9 sous réserve que ces séquences codent des protéines qui possèdent une activité oxydase d'alcool gras, et notamment les séquences SEQ ID NO : 10 (YAYA0S1 -26698g), SEQ ID NO : 11 (YAGA0F17920g), SEQ ID NO : 12 (YAAL0S04-08768g) et SEQ ID NO : 13 (YAPH0S5-07338g).
L'activité cytochrome P450 monooxygenase peut être mesurée par spectre Spectre CO : Spectre différentiel entre du P450 réduit et présence de monoxyde de carbone et du P450 réduit, comme décrit dans Estabrook et Werringloer 1978. Methods Enzymol.52:212-220. Une autre méthode consiste à mettre les enzymes en présente de substat (7-ethoxyresorufine, 7-pentoxyresorufine) pour qu'ils soient métabolisés. Le produit de la réaction, la resorufine, est fluorescent et peut être quantifié par exemple à l'aide d'un lecteur de fluorescence.
L'activité déshydrogénase d'aldéhydes gras peut être par exemple mesurée en étudiant le métabolisme du pyrènedécanal par HPLC. En présence de pyrophosphate de sodium 20 mM à pH 8, de 1 mM NAD, de Triton X-100 à 1 % (v/v ; sous sa forme réduite) et de 50 μΜ de pyrènedécanal, la réaction est réalisée en présence de l'enzyme. Après réaction à 37°C pendant 20-30 min, la réaction est arrêtée avec du méthanol, et le mélange réactionnel est centrifugé à 16 000 g avant analyse par HPLC.
Une autre méthode peut être inspirée de Iwama et al., 2014, J.Biol. Cell. Dans une culture de cellules du n-décane est ajouté à une concentration finale de 1 % pendant 6h. Les cellules sont lavées, et reprises dans un tampon d'homogénéisation (25 mM HEPES-NaOH (pH 7.3), 100 mM KCI, 10% glycérol, 1 mM dithiothréitol, et 1 % d'inhibiteurs de protéases) et broyées avec des billes de diamètre de 0,45 à 0,5 mm de diamètre. L'homogénat est centrifugé deux fois à 1000g pendant 10 min à 4°C. 1 % v/v de Tween 80 est ajouté au surnageant, et le mélange est laissé 20 min à 4°C puis centrifugé à 13000g pendant 10 min. Le surnageant est alors analysé par spectrométrie de masse pour mesurer les produits de la conversion du n-décane.
L'activité déshydrogénase d'alcool peut être mesurée selon le protocole de Napora- Wijata et al. Biomolecules 2013, 3, 449-460. Brièvement, l'activité alcool déshydrogénase est déterminée en mesurant la réduction de NAD(P)+ at 340 nm. 20 L de solution (alcool ou sucre, 100 mM dans 50 mM potassium phosphate, 40 mM KCI, pH 8.5) sont ajoutés à 140 μί de potassium phosphate (50 mM, 40 mM KCI, pH 8.5), suivi par 20 μί d'enzyme (dans 10 mM sodium phosphate, pH 7.5). La réaction est initiée en ajoutant 20 μί de NAD+ (or NADP+; 10 mM dans l'eau) et la réaction est réalisée pendant 10 min. Des réactions sans substrats sont réalisées comme contrôles. L'activité est définie comme la quantité d'enzyme capable de produire 1 μηηοΙ de NADH par min.
La souche de levure susmentionnée peut être une souche de Yarrowia lipolytica transformée de sorte qu'elle surexprime l'une quelconque des combinaisons de gènes susmentionnés. Dans ce cas, il s'agit d'une surexpression « autologue ». Il est toutefois possible de transférer la voie métabolique dans un autre organisme, de sorte que la voie de biosynthèse des diacides est reproduite. Aussi, il est possible de faire surexprimer à une levure d'un autre genre que le genre Yarrowia, par exemple des levures des genres Candida, Pichia ou Saccharomyces (sans être limitatif) les gènes des combinaisons susmentionnées. Il s'agira alors d'une surexpression « hétérologue ou orthologue ».
Dans l'invention, les souches de levures utilisées sont incapables de dégrader les acides gras. En effet, le but de l'invention est d'augmenter la production de diacides en limitant autant que possible toute voie métabolique qui aurait pour but de dégrader les diacides biosynthétisés. Pour ce faire, il est possible,
- soit d'inactiver la voie de dégradation : la β-oxydation, par exemple en réalisant une délétion ou une disruption des gènes POX codant les iso-enzymes de l'acyl- CoA oxydase, impliqués dans la première étape de la β-oxydation péroxyisomale, notamment les gènes POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 et POX6, ce qui va inhiber la dégradation des acides gras au niveau des péroxysomes,
- soit de réaliser une délétion ou une disruption du gène MFE2, enzyme multifonctionnelle impliquée dans la deuxième et la troisième étapes de la β- oxydation péroxysomal,
- soit en réalisant une délétion ou une disruption des gènes FAA1 et/ou PXA 1 et/ou 2. Le gène FAA 1 code pour une fatty acid CoA synthétase cytoplasmique et les gènes PXA 1 et PXA2 codent pour un ABC transporteur impliqué dans le transport des acides gras dans les péroxysosomes.
Aussi, en résumé, lorsque l'on utilise la souche de levure modifiée telle que définie ci-dessus, il est possible de réaliser une production de diacides par fermentation. La source avantageuse de substrat de fermentation est un acide gras, un hydrocarbures ou un mélange d'acides gras et d'hydrocarbures.
Si la composition utilisée comme substrat comprend plusieurs acides gras ou hydrocarbures de nature différente (chaîne carbonée de taille différente, présence d'instaurations de substitutions, ...), le résultat de la fermentation conduira à l'obtention d'un mélange des diacides correspondants aux substrats. Par exemple, si les substrats comprennent un hydrocarbure en C5 et un hydrocarbure en C10, le résultat de la fermentation sera l'obtention d'un mélange de diacides en C5 et en C10. L'exemple ci- dessus s'applique également aux acides carboxyliques.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'une souche de Yarrowia lipolytica ou de Candida tropicalis incapable de dégrader les acides gras, surexprimant au moins les gènes suivants :
- le gène ALK3 comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 1 , codant une cytochrome P450 mono oxygénase, ou consistant en une séquence présentant au moins 75% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ,
- l'un au moins des gènes ADH2 et ADH5 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6, codant chacun une déshydrogénase d'alcools, et
- l'un au moins des gènes FALDH3 et FALDH4 comprenant ou consistant respectivement en la séquence suivante SEQ ID NO : 7 ou SEQ ID NO : 8, codant chacun une déshydrogénase d'aldéhydes gras ou le gène FA01 comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 9 codant une déshydrogénase d'alcool gras,
pour la préparation, par fermentation, d'au moins un diacide carboxylique.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où ladite souche de levure surexprime en outre le gène CPR1 qui code pour une NADPH-cytochrome réductase.
Avantageusement, outre les combinaisons de gènes susmentionnées (ALK3, ADH2/5, FALDH3/4 et FA01 ), les inventeurs ont montré que la surexpression du gène CPR1 codant une cytochrome P450 réductase permettait d'augmenter la production de diacide.
Dans l'invention, le gène CPR1 est défini comme comprenant ou consistant en la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 14, ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 14 sous réserve que ces séquences codent un protéine possédant une activité cytochrome P450 réductase.
Lorsque le gène CPR1 est surexprimé, les souches possibles couvertes par l'invention sont les suivantes :
- CPR1 , ALK3, ADH2 et FALDH2,
- CPR1 , ALK3, ADH2 et FALDH4,
- CPR1 , ALK3, ADH2 et FA01 ,
- CPR1 , ALK3, ADH2, FALDH2 et FALDH4,
- CPR1 , ALK3, ADH2, FALDH2 et FA01 ,
- CPR1 , ALK3, ADH2, FALDH4 et FA01 ,
- CPR1 , ALK3, ADH2, FALDH2, FALDH4 et FA01 ,
- CPR1 , ALK3, ADH5 et FALDH2,
- CPR1 , ALK3, ADH5 et FALDH4,
- CPR1 , ALK3, ADH5 et FA01 , - CPR1 , ALK3, ADH5, FALDH2 et FALDH4,
- CPR1 , ALK3, ADH5, FALDH2 et FA01 ,
- CPR1 , ALK3, ADH5, FALDH4 et FA01 ,
- CPR1 , ALK3, ADH5, FALDH2, FALDH4 et FA01 ,
- CPR1 , ALK3, ADHA2, ADH5 et FALDH2,
- CPR1 , ALK3, ADHA2, ADH5 et FALDH4,
- CPR1 , ALK3, ADHA2, ADH5 et FA01 ,
- CPR1 , ALK3, ADHA2, ADH5, FALDH2 et FALDH4,
- CPR1 , ALK3, ADHA2, ADH5, FALDH2 et FA01 ,
- CPR1 , ALK3, ADHA2, ADH5, FALDH4 et FA01 , et
- CPR1 , ALK3, ADHA2, ADH5, FALDH2, FALDH4 et FA01 .
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où ladite levure est en outre disruptée, ou présente une délétion pour les gènes codant les iso-enzymes de l'acyl-CoA oxydase POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 et POX6.
Comme mentionné ci-dessus, afin d'augmenter la production de diacides, il est avantageux de limiter la dégradation des acides gras, et notamment la dégradation par la β-oxydation. L'inactivation par délétion ou disruption (c'est-à-dire l'insertion d'un élément dans la séquence du gène qui conduit à une expression d'un produit du gène non fonctionnel ou à une absence d'expression) concomitante des gènes POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 et POX6 permet de limiter voire d'annuler cette dégradation.
La délétion ou la disruption susmentionnée des gènes POX peut être réalisée comme décrit dans la demande internationale WO/2006/064131 .
Il est également possible d'utiliser les souches MTLY66, MTLY81 , FT120 et FT 130 qui ont été déposées à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous les numéros d'enregistrement respectifs CNCM 1 -3319, CNCM I-3320, CNCM I-3527 et CNCM I-3528.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où ladite levure est en outre disruptée ou présente une délétion pour les gènes DGA 1, DGA2 et/ou LR01. En d'autres termes, dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où ladite levure est en outre disruptée ou présente une délétion pour l'un au moins des gènes DGA 1, DGA2 et LR01.
L'effet technique de cette disruption est de limiter le stockage des acides gras. En effet, une fois produits, les acides gras peuvent être stockés et échapper ainsi à la conversion en acides dicarboxyliques. Le pool d'acides gras stockés représente de 10 à 70% de la quantité totale d'acides gras produits ou assimilés par un microorganisme. Aussi, afin d'éviter l'échappement de la transformation en diacides, et augmenter la production de ces derniers, il est avantageux de limiter le stockage.
La disruption ou la délétion de l'un au moins des gènes DGA 1, DGA2 et/ou LR01 inhibe ledit stockage.
Par « DGA 1, DGA2 et/ou LR01 » on entend les combinaisons suivantes : DGA 1 seul, DGA2 seul, LR01 seul, la combinaison DGA 1 et DGA2, la combinaison DGA 1 et LR01, la combinaison DGA2 et LR01, et la combinaison DGA 1 et DGA2 et /.fîOr.
Le gène DGA2 code pour une diacylglycérol acyl transférase de type DGAT1 , le gène DGA 1 code pour une diacylglycérol acyl transférase de type DGAT2, le gène LR01 code pour une phospholipide :diacylglycérol acyl transférase impliquée dans la synthèse de triglycérol à partir de diacylglycérol par la voie aceltyl CoA indépendant.
Le gène DGA1 comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 15, le gène DGA2 comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 16 et le gène LR01 comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 17.
Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où ladite souche de levure surexprimant lesdits gènes est dérivée de la souche de levure Yarrowia lipolytica OLEO-X.
La souche de levure OLEO-X est elle-même dérivée de la souche w29 déposée à l'ATCC (American Type Culture Collection) sous le numéro ATCC 20460, et présente le génotype suivant : MATA ura-3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dgalA IrolA dga2A fad2A.
Aussi, dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'une souche de Yarrowia lipolytica de génotype MATA ura-3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dgalA IrolA dga2A fad2A, surexprimant au moins les gènes suivants :
- le gène ALK3 comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 1 , codant une cytochrome P450 mono oxygénase, ou consistant en une séquence présentant au moins 75% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ,
- l'un au moins des gènes ADH2 et ADH5 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6, codant chacun une déshydrogénase d'alcools, et
- l'un au moins des gènes FALDH3 et FALDH4 comprenant ou consistant respectivement en la séquence suivante SEQ ID NO : 7 ou SEQ ID NO : 8, codant chacun une déshydrogénase d'aldéhydes gras ou le gène FA01 comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 9 codant une oxydase d'alcool gras, éventuellement surexprimant en outre le gène CPR1 codant une NADPH-cytochrome réductase comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 14.
pour la préparation, par fermentation, d'au moins un diacide carboxylique, notamment à partir d'au moins un hydrocarbure ou au moins un acide gras.
Dans le cadre de l'utilisation susmentionnée, il est avantageux d'avoir comme source de bioconversion soit des hydrocarbures, soit des acides gras, à longue chaîne, c'est à dire présentant un squelette carboné de plus de 10 atomes de carbone.
II est notamment avantageux, afin de disposer de diacides présentant au moins une insaturation, d'utiliser des acides gras ou des hydrocarbures mono ou poly insaturés, c'est-à-dire présentant au moins une double liaison carbone-carbone sur ledit squelette carboné.
De manière avantageuse, l'invention concerne l'utilisation de l'une quelconque des souches suivantes :
- la souche Y4832, aussi appelée JMY4832 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5072,
- la souche Y4833, aussi appelée JMY4833 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5073, et
- la souche Y4834, aussi appelée JMY4834 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1
ADH2-URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5074,
pour la préparation par fermentation d'au moins un diacide carboxylique telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne également une méthode de production d'au moins un acide dicarboxylique comprenant les étapes suivantes :
a) une phase de croissance, dans laquelle on met en culture une souche de levure incapable de dégrader les acides gras surexprimant au moins les gènes suivants :
- le gène ALK3, codant une cytochrome P450 mono oxygénase
- l'un au moins des gènes ADH2 et ADH5 codant chacun des déshydrogénases d'alcools, et
- l'un au moins des gènes FALDH3 ou FALDH4, codant des déshydrogénases aldéhydes gras ou le gène FA01 codant une oxydase d'alcool gras,
dans un milieu de culture constitué essentiellement d'un substrat énergétique qui comprend au moins une source de carbone et une source d'azote, et
b) une phase de bioconversion, dans laquelle ladite souche de levure est mise en contact avec au moins un acide gras, de préférence en présence d'un substrat énergétique.
Toutes les définitions et descriptions relatives à l'utilisation définie ci-dessus sont applicables mutatis mutandis au procédé, ou la méthode, susmentionné.
Dans le procédé de production de diacides selon l'invention, on met la souche choisie en culture dans un milieu constitué essentiellement d'un substrat énergétique qui comprend au moins une source de carbone et une source d'azote afin de faire croître ladite souche. Il s'agit de la phase de croissance. Ceci peut être importnant dans la mesure ou l'incapacité à dégrader les acides gras peut interférer avec la croissance des levures.
On ajoute alors le substrat de bioconversion (alcane ou mélange d'alcanes, acide gras ou mélange d'acides gras, ester d'acide gras ou mélange d'esters d'acides gras ou huile naturelle ou mélange de ces différents substrats) de façon à initier la bioconversion en diacides. Lors de la phase de bioconversion, le milieu de culture peut comprendre un apport de substrat énergétique secondaire consistant en général en au moins un composé polyhydroxylé, tel que par exemple le glycérol ou un sucre, dont notamment le glucose.
L'obtention des souches mutantes utilisables dans le procédé de l'invention peut se faire à partir de la souche Po1 d, qui dérive de la souche sauvage Yarrowia lipolytica W29. La souche Po1 d est une souche auxotrophe pour la leucine (leu-) et l'uracyle (ura-). Elle est décrite dans la revue de G. Barth et al.: Yarrowia lipolytica in: Nonconventional Yeasts in Biotechnology A Handbook (Wolf, K., Ed.), Vol. 1 , 1996, pp. 313-388. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Elle est répertoriée sous CLIB139 dans la CLIB.
Le principe du procédé selon l'invention est donc de bioconvertir les hydrocarbures en diacides, et les acides gras en diacides.
Par exemple l'octadécane C18H38 sera converti en acide octadécanedioïque tout comme l'acide stéarique, l'acide oléique (acide cis-octadéc-9-énoïque) sera converti en acide cis-octadéc-9-éne dioïque... l'homme du métier est capable de connaître le diacide obtenu à partir de l'acide gras ou de l'hydrocarbure qui est ajouté lors de l'étape de bioconversion.
Avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné, où ladite souche de levure surexprime en outre le gène CPR1 qui code pour une NADPH-cytochrome réductase.
Avantageusement, l'invention concerne une méthode telle que définie ci-dessus, comprenant en outre une étape de récupération, d'isolement ou de purification, dudit au moins un diacide carboxylique formé. Bien évidemment, il est avantageux, lorsque le procédé est mis en œuvre de récupérer les diacides formés par une technique connue de l'homme du métier, telle que la précipitation des sels de calcium.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode telle que définie ci-dessus, dans laquelle les acides gras sont sous forme d'un mélange, et notamment sous forme d'une huile ou d'un mélange d'alcanes, en particulier une huile choisie parmi :
- les huiles végétales telles que l'huile de colza, l'huile de colza oléique, l'huile de tournesol, l'huile de tournesol oléique, l'huile de coco, l'huile de palme, l'huile palmiste, l'huile d'olive, l'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile de mais, l'huile de moutarde, l'huile de ricin, l'oléine de palme, la stéarine de palme, l'huile de carthame, l'huile de sésame, l'huile de lin, l'huile de noix, l'huile de pépins de raison, l'huile de chanvre ou un sous-produit issus de l'extraction de celles-ci comprenant au moins 30% d'un mélange d'acides gras, comme les eaux d'estérifications, les fonds de bacs, les condensais de désodorisation, les eaux de lavages ou les pâtes de neutralisation,
- les huiles de poissons, notamment de poissons gras, et
- les huiles microbiennes issues de microorganismes dits oléagineux, c'est-à-dire capables de stocker des acides gras à plus de 20% de leur poids sec, issus de levures, bactéries, ou micro-algues
Ces exemples d'huiles sont donnés à titre indicatif et ne sauraient limiter la portée de l'invention.
Dans l'invention, on entend par huile végétale, un corps gras extrait d'une plante oléagineuse.
On entend par plante oléagineuse toutes plantes dont les graines, les noix ou les fruits contiennent des lipides.
Un corps gras est une substance composée de molécules ayant des propriétés hydrophobes. Les corps gras sont majoritairement composés d'acides gras et de triglycérides qui sont des esters constitués d'une molécule de glycérol et de trois acides gras. Les autres composants forment ce que l'on appelle l'insaponifiable.
L'extraction de l'huile végétale par des méthodes traditionnelles nécessite souvent diverses opérations préliminaires, telles que le décorticage. Après ces opérations, la culture est broyée en une pâte. La pâte, ou parfois le fruit entier, est bouillie en présence d'eau et sous agitation jusqu'à séparation de l'huile. Ces méthodes traditionnelles ont un faible taux d'efficacité.
Les méthodes modernes de récupération de l'huile comprennent des étapes de cassage et de pressage, ainsi que la dissolution dans un solvant, le plus souvent l'hexane. L'extraction de l'huile avec un solvant est une méthode plus efficace que le pressage. Le résidu laissé après l'extraction de l'huile (tourteaux ou farine) est utilisé comme aliment pour animaux.
Les huiles végétales brutes sont obtenues sans traitement supplémentaire autre que le dégommage ou la filtration. Pour les rendre propres à la consommation humaine, les huiles végétales comestibles sont raffinées pour éliminer les impuretés et substances toxiques, un processus impliquant le blanchiment, la désodorisation et le refroidissement. Les huiles envisagées dans l'invention végétales comprennent les huiles brutes, raffinées ou fractionnées ou les co-produits issus de l'extraction des huiles.
À quelques exceptions près, et contrairement aux graisses animales, les huiles végétales contiennent des acides gras majoritairement insaturés de deux sortes: monoinsaturés (acide palmitique, acide oléique, acide érucique) et polyinsaturées (acide linoléique).
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode telle que définie ci-dessus, où ladite levure est en outre disruptée pour les gènes codant les iso-enzymes de l'acyl-CoA oxydase POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 et POX6.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode telle que définie ci-dessus, où ladite levure est en outre disruptée ou prrésente une délétion pour les gènes DGA1 , DGA2 et/ou LR01.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode telle que définie ci-dessus, où ladite souche de levure surexprimant lesdits gènes est dérivée de la souche OLEO-X.
Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé tel que défini précédemment, où lesdits diacides sont obtenus à partir d'acides gras ou d'hydrocarbures, qui sont présents sous la forme d'un mélange présentant en poids une quantité de plus de 30% d'acides gras ou d'hydrocarbures ayant plus de 10 atomes de carbone notamment des acides gras ou des alcanes en C14-C26.
Par au moins 30% d'acides gras ou d'hydrocarbures, on entend dans l'invention une quantité d'acides gras ou d'hydrocarbures de 30%, 31 %, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41 %, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% en poids par rapport au poids total de la composition. Par acide gras ou hydrocarbures ayant plus de 10 atomes, on définit des alcanes (CnH2n+2) linéaires ou ramifiés, des alcènes (CnH2n) linéaires ou ramifiés, des alcynes (CnH2n-2) linéaires ou ramifiés ayant au moins 10 atomes de carbone
Par acides gras ou hydrocrabures en C14-C26 on entend des acides gras ou des hydrocarbures en C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21 , C22, C23, C24, C25 ou C26.
Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où lesdits acides gras ou hydrocarbures sont présents sous la forme d'un mélange présentant en poids une quantité de plus de 30% d'acides gras ayant plus de 10 atomes de carbone, notamment des acides gras ou des hydrocarbures en C14-C26, et présentant en poids notamment plus 30% d'acides gras ou d'hydrocarbures au moins mono insaturés.
Encore plus avantageusement, l'invention concerne la méthode susmentionnée, ledit au moins un acide gras est un mélange d'acide gras présentant en poids une quantité de plus de 30% d'acide oléique par rapport au poids total du mélange.
Il est avantageux, afin d'obtenir des diacides insaturés d'utiliser des acides gras issus d'huiles végétales, qui présentent un ou plusieurs acides gras insaturés.
En particulier, pour obtenir des diacides en C18 comprenant une insaturation (DC18 :1 ), il est avantageux d'utiliser une huile végétale ou une composition comprenant une quantité d'au moins 30% d'acide oléique de formule I suivante :
(formule I).
Les huiles végétales intéressantes sont les suivantes : l'huile de noisette qui comprend environ 77% en poids d'acide oléique, l'huile d'olive qui comprend environ 72% en poids d'acide oléique, l'huile d'avocat qui comprend environ 68% en poids d'acide oléique, l'huile de colza qui comprend environ 56% en poids d'acide oléique, l'huile de tournesol oléique qui comprend environ 80% en poids d'acide oléique, l'huile d'arachide qui comprend environ 35% en poids d'acide oléique, l'oléine de palme qui comprend environ 40% en poids d'acide oléique, l'huile de sésame qui comprend environ 39 % en poids d'acide oléique ou l'huile de palme qui comprend environ 36 % en poids d'acide oléique.
Par « environ X% en poids » on entend la valeur de X% plus ou moins 1 % en poids. Cette approximation est liée à la variabilité des méthodes de mesure de la quantité d'acide oléique contenu dans une huile, ainsi que la variabilité de production selon les plants utilisés. Avantageusement, l'invention concerne également une méthode de production d'au moins un acide dicarboxylique, notamment de l'acide cis-octadéc-9-éne dioïque, comprenant les étapes suivantes :
a) une phase de croissance, dans laquelle on met en culture une souche de levure de Yarrowia lipolytica, notamment de génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga lA Iro lA dga2A fad2A, incapable de dégrader les acides gras, et éventuellement de stocker les acides gras sous forme de triglycéride, surexprimant au moins les combinaisons de gènes choisies dans le groupe suivant :
- le gène ALK3, notamment comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 1 , ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et présentant une activité cytochrome P450 mono oxygénase, le gène ADH2 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 5 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 5 et présentant une activité déshydrogénase d'alcools et le gène FALDH3 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 7 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 7 et présentant une activité déshydrogénase d'aldéhydes gras
- le gène ALK3, notamment comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 1 , ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et présentant une activité cytochrome P450 mono oxygénase, le gène ADH2 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 5 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 5 et présentant une activité déshydrogénase d'alcools et le gène FALDH4 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 8 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 8 et présentant une activité déshydrogénase d'aldéhydes gras
- le gène ALK3, notamment comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 1 , ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et présentant une activité cytochrome P450 mono oxygénase, le gène ADH2 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 5 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 5 et présentant une activité déshydrogénase d'alcools et le gène FA01 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 9 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 9 et présentant une activité oxydase d'alcools gras,
- le gène ALK3, notamment comprenant ou consistant en la séquence suivante
SEQ ID NO : 1 , ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et présentant une activité cytochrome P450 mono oxygénase, le gène ADH5 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 6 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO:
6 et présentant une activité déshydrogénase d'alcools et le gène FALDH3 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 7 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 7 et présentant une activité déshydrogénase d'aldéhydes gras
- le gène ALK3, notamment comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 1 , ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et présentant une activité cytochrome P450 mono oxygénase, le gène ADH5 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 6 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 6 et présentant une activité déshydrogénase d'alcools et le gène FALDH4 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 8 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 8 et présentant une activité déshydrogénase d'aldéhydes gras, et
- le gène ALK3, notamment comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 1 , ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et présentant une activité cytochrome P450 mono oxygénase, le gène ADH5 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 6 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 6 et présentant une activité déshydrogénase d'alcools et le gène FA01 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 9 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 9 et présentant une activité oxydase d'alcools gras, éventuellement surexprimant en outre le gène CPR1 comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 14 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 14 et présentant une activité NADPH-cytochrome réductase,
dans un milieu de culture constitué essentiellement d'un substrat énergétique qui comprend au moins une source de carbone et une source d'azote, et
b) une phase de bioconversion, dans laquelle ladite souche de levure est mise en contact avec une huile, notamment une huile végétale, comme les huiles susmentionnées, une huile de poisson ou de levures, bactéries ou micro-algues, de préférence en présence d'un substrat énergétique.
Avantageusement, l'invention concerne également une méthode de production d'au moins un acide dicarboxylique, notamment de l'acide cis-octadéc-9-éne dioïque, comprenant les étapes suivantes :
a) une phase de croissance, dans laquelle on met en culture une souche de levure de Yarrowia lipolytica choie parmi les souches suivantes :
- la souche Y4832, aussi appelée JMY4832 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5072,
- la souche Y4833, aussi appelée JMY4833 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5073, et
- la souche Y4834, aussi appelée JMY4834 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1
ADH2-URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5074,
dans un milieu de culture constitué essentiellement d'un substrat énergétique qui comprend au moins une source de carbone et une source d'azote, et
b) une phase de bioconversion, dans laquelle ladite souche de levure est mise en contact avec une huile, notamment une huile végétale, comme les huiles susmentionnées, une huile de poisson ou de levures, bactéries ou micro-algues, de préférence en présence d'un substrat énergétique, et
c) éventuellement une étape de purification des diacides obtenus.
L'invention concerne en outre une composition comprenant un mélange de diacides carboxyliques susceptibles d'être obtenus par le procédé tel que défini ci-dessus. Les compositions de diacides obtenues selon le procédé susmentionné ne donneront pas directement en poids une conversion des alcanes et des acides gras qui seront fournis pour mettre en œuvre le procédé.
En effet, lors de la bioconversion des hydrocarbures et des acides gras par les souches de levure modifiées, telles que définies ci-dessus, outre la synthèse de diacides à partir de l'apport exogène vont être capables de synthétiser leurs propres acides gras pour la formation de leur membrane cellulaire. Ces acides gras ne seront pas stockés ni dégradés puisque les souches de levures de l'invention sont invalidées pour ces voies métaboliques.
Aussi, les acides gras synthétisés par les levures lors de leur croissance pourront également être bio-convertis en diacides.
Par conséquent, il n'existe pas de linéarité entre la quantité d'acide gras apporté par une huile déterminée, et la quantité de diacides obtenus. Toutefois, les compositions susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention comportent une proportion de diacide élevé du fait de l'efficacité améliorée des souches de levure utilisées.
L'invention concerne par ailleurs une composition comprenant:
- une première molécule d'acide nucléique correspondant au gène ALK3, codant une cytochrome P450 mono oxygénase,
- au moins une deuxième molécule d'acide nucléique correspondant à l'un au moins des gènes ADH2 et ADH5 codant chacun des déshydrogénases d'alcools, et
- au moins une troisième molécule d'acide nucléique correspondant à l'un au moins des gènes FALDH3 ou FALDH4, codant des déshydrogénases aldéhydes gras ou correspondant au gène FA01 codant une oxygénase d'alcool gras,
lesdites première molécule d'acide nucléique, deuxième molécule d'acide nucléique et troisième molécule d'acide nucléique étant liées ou individualisées.
La composition susmentionnée doit être comprise de la manière suivante :
- soit elle comprend une première molécule d'acide nucléique correspondant au gène ALK3, une seconde molécule d'acide nucléique correspondant au gène ADH2, ou au gène ADH5 et une troisième molécule d'acide nucléique correspondant au gène FALDH3, ou au gène FALDH4, ou au gène FA01 ,
- soit une première une première molécule d'acide nucléique correspondant au gène ALK3 fusionnée ou liée à une seconde molécule d'acide nucléique correspondant au gène ADH2, ou au gène ADH5, et indépendante des deux premières une troisième molécule d'acide nucléique correspondant au gène FALDH3, ou au gène FALDH4, ou au gène FA01 ,
- soit une première une première molécule d'acide nucléique correspondant au gène ALK3 et indépendamment une seconde molécule d'acide nucléique correspondant au gène ADH2, ou au gène ADH5, fusionnée à une troisième molécule d'acide nucléique correspondant au gène FALDH3, ou au gène FALDH4, ou au gène FA01
- soit une première une première molécule d'acide nucléique correspondant au gène ALK3 fusionnée à une troisième molécule d'acide nucléique correspondant au gène FALDH3, ou au gène FALDH4, ou au gène FA01 et indépendamment une seconde molécule d'acide nucléique correspondant au gène ADH2, ou au gène ADH5,
- soit une première une première molécule d'acide nucléique correspondant au gène ALK3 fusionnée ou liée à une seconde molécule d'acide nucléique correspondant au gène ADH2, ou au gène ADH5, fusionnée à une troisième molécule d'acide nucléique correspondant au gène FALDH3, ou au gène FALDH4, ou au gène FA01 (soit une seule et même molécule),
éventuellement en association avec un autre molécule d'acide nucléique correspondant au gène CPR1 .
Sont également envisagés des vecteurs recombinants comprenant lesdites molécules d'acides nucléiques, et des moyens permettant l'expression desdits gènes.
Avantageusement, l'invention concerne une composition telle que définie précédemment, où
- la première molécule d'acide nucléique correspondant au gène ALK3, ladite première molécule d'acide nucléique comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 1 ,
- la seconde molécule d'acide nucléique correspondant au gène ADH2 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 32 ou SEQ ID NO : 33, ou au gène ADH5 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 34 ou SEQ ID NO : 35, et
- la troisième molécule d'acide nucléique correspondant au gène FALDH3 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 36 ou SEQ ID NO : 37, ou au gène FALDH4 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 38 ou SEQ ID NO : 39, ou au gène FA01 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 40 ou SEQ ID NO : 41 ,
éventuellement en association avec une quatrième séquence molécule d'acide nucléique correspondant au gène CPR1 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 42 ou SEQ ID NO : 43. Dans le cas d'une composition susmentionnée où chacune des molécules est clonée dans un vecteur, la composition comprend
- la première molécule d'acide nucléique comprend, comprend essentiellement ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 18 ou SEQ ID NO : 19
- la seconde molécule d'acide nucléique comprend, comprend essentiellement ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 20, SEQ IDNO : 21 , SEQ ID NO : 22 ou SEQ IDNO : 23 et
- la troisième molécule d'acide nucléique comprend, comprend essentiellement ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 26, SEQ IDNO : 27, SEQ IDNO : 28, SEQ IDNO : 29, SEQ IDNO : 30 ou SEQ IDNO : 31 .
éventuellement en association avec une quatrième séquence molécule d'acide nucléique comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 24 ou SEQ ID NO : 25.
L'invention concerne en outre les différentes molécules d'acide nucléiques comprenant ou consistant en les séquences suivantes : SEQ ID NO : 18 à 31.
L'invention concerne de plus une souche de levure transformée par une composition comprenant au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus.
Les différentes souches de levures envisagées sont celles décrites précédemment. Avantageusement, l'invention concerne une souche de levure susmentionnée, où, la dite levure étant une souche de Yarrowia lipolytica.
L'invention concerne par ailleurs une souche de Yarrowia lipolytica choisie parmi les souches suivantes :
- la souche Y3551 , de génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U Iro U dga2A fad2A ALK3-LEU2 et de phénotype [Leu+ lira-],
- la souche JMY3950, dérivée de la souche Y3551 , de génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3-LEU2 CPR1-URA3 et de phénotype [Leu+ Ura+], déposée le 26 mars 2015 à la CNCM (Collection Nationale de Culture de microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15) sous le numéro CNCM I - 4963.
- la souche Y4428 dérivée de la souche JMY3950, de génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dgaU IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 et de phénotype [Leu- Ura-],
- la souche Y4457 dérivée de la souche Y4428, de génotype MATA ura3-302 Ieu2- 270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 et de phénotype [Leu- Ura+], et
- les souches Y4832, Y4833 et Y4834, déposées le 14 mars 2016 à la CNCM sous les numéros respectifs CNCM I - 5072, CNCM I - 5073 et CNCM I - 5074, ces souches étant dérivées de la souche Y4457, et ont pour génotype MATA ura3- 302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2- URA3 FA01-LEU2 et pour phénotype [Leu+ Ura+].
Plus précisément, la souche Y4832, aussi appelée JMY4832 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dgaU IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5072.
La souche Y4833, aussi appelée JMY4833 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2- URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5073.
La souche Y4834, aussi appelée JMY4834 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 pox1-6A dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2- URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5074.
LEGENDE DES FIGURES
Les Figures 1A à 1 E représentent des chromatogrammes TLC obtenus pour la conversion de C12:0 avec des microsomes de levures transformées avec différentes constructions. P, P1 et P2 représentent les produits de la réaction, S représente le substrat. L'axe des abscisses représente la mobilité en mm, et l'axe des ordonnées représente la radioactivité en unités arbitraires.
La figure 1A représente l'histogramme TLC de microsomes de levures transformée avec un vecteur vide.
La figure 1 B représente l'histogramme TLC de microsomes de levures transformée avec un vecteur exprimant ALK2.
La figure 1 C représente l'histogramme TLC de microsomes de levures transformée avec un vecteur exprimant ALK 3.
La figure 1 D représente l'histogramme TLC de microsomes de levures transformée avec un vecteur exprimant ALK 5.
La figure 1 E représente l'histogramme TLC de microsomes de levures transformée avec un vecteur exprimant ALK 11 .
Les figures 2A à 2C montrent la conversion de l'acide oléique en présence de microsomes exprimant Alk3p.
La figure 2A représente des chromatogrammes TLC de microsomes de levures transformées avec un vecteur vide (panel du haut) ou avec Alk3p (panel du bas). L'axe des abscisses correspond au temps exprimé en minutes. 1 et 2 représentent les deux produits de conversion obtenus.
La figure 2B représente un spectre de masse du produit 1 observé à la figure 2A. La figure 2C représente un spectre de masse du produit 2 observé à la figure 2A. Les figures 3A et 3B montrent le taux de conversion des acides gras.
La figure 3A représente un histogramme montrant l'activité spécifique (en pg/min/mg) de conversion de 100μΜ acides gras indiqués en abscisse par des microsomes de levure exprimant Alk3p. Les barres en gris représentent les produits de Γω-oxydation et les barres en blanc les diacides.
La figure 3B représente un histogramme montrant l'activité spécifique (en pg/min/mg) de conversion de 100μΜ acides gras indiqués en abscisse par des microsomes de levure exprimant Alk5p. Les barres en gris représentent les produits de Γω-oxydation et les barres en blanc les diacides.
La figure 4 représente un graphique montrant la production au cours de diacide par deux souches (B et C) de levure OLEOX surexprimant le gène ALK3. La production est comparée à celle obtenue par une souche OLEOX non transformée avec ALK3 (A). L'axe des abscisses représente le temps de culture en heures et l'axe des ordonnées représente la quantité de DC18 1 en g/L.
La figure 5 représente un graphique montrant la production au cours du temps de diacide par deux souches (B et C) de levure OLEOX-CPR1 surexprimant le gène FALDH3 et FALDH4 respectivement. La production est comparée à celle obtenue par une souche OLEOX non transformée avec l'un quelconque des gènes FALDH3 ou 4 (A). L'axe des abscisses représente le temps de culture en heures et l'axe des ordonnées représente la quantité de DC18 1 en g/L.
La figure 6 représente un graphique montrant la production au cours du temps de diacide par deux souches de levure OLEOX surexprimant les gènes CPR1 +ALK3+ADH2+ FALDH3 (courbe avec des triangles) et CPR1 +ALK3+ADH2+ FALDH4 (courbe avec des carrés). La production est comparée à celle obtenue par une souche OLEOX surexprimant seulement CPR1 (courbe avec des carrés ouverts). L'axe des abscisses représente le temps de culture en heures et l'axe des ordonnées représente la quantité de DC18 1 en g/L.
La figure 7 représente un graphique montrant la production au cours du temps de diacide par trois souches de levure OLEOX surexprimant les gènes CPR1 +ALK3+ADH2+ FA01 (A,B et C). La production est comparée à celle obtenue par une souche OLEOX surexprimant seulement CPR1 (D). L'axe des abscisses représente le temps de culture en heures et l'axe des ordonnées représente la quantité de DC18 1 en g/L. La figure 8 représente un graphique montrant la productivité de trois souches de levure OLEOX surexprimant les gènes CPR1 +ALK3+ADH2+ FA01 (A, B et C). La production est comparée à celle obtenue par une souche OLEOX surexprimant seulement CPR1 (D). L'axe des abscisses représente le temps de culture en heures et l'axe des ordonnées représente la quantité de DC18 1 en g/L.
La figure 9 représente un graphique montrant la productivité de trois souches de levure surexprimant les gènes CPR1 + ADH2 (B) ou les gènes CPR1 + ADH5 (C). La production est comparée à celle obtenue par une souche seulement CPR1 (A). L'axe des abscisses représente le temps de culture en heures et l'axe des ordonnées représente la quantité de DC18 1 en g/L.
EXEMPLES
Exemple 1 - Procédé de production d'acides dicarboxyliques à partir d'huile de tournesol oléique avec une souche selon l'invention.
Une préculture de la souche, conservée sur milieu gélosé de composition: extrait de levure 10 g/L; peptone 10 g/L; glucose 10 g/L; Agar 20 g/L, est effectué grâce à un ensemencement qui fournit une absorbance initiale du milieu de préculture voisine de 0,30. La préculture est conduite sous agitation orbitale (200 rpm) pendant 24 h à 30°C dans une fiole à ailettes de 500 ml contenant 25 ml de milieu (10g/L d'extrait de levure; 10g/L de peptone; 20g/L de glucose).
Le milieu utilisé pour la culture est composé d'eau désionisée, d'extrait de levure à 10 g/L; de tryptone à 20 g/L; de glucose à 40 g/L et d'huile de tournesol oléique à 30 g/L.
L'ensemencement du fermenteur est effectué avec la totalité de la fiole de préculture.
La culture est conduite à 30°C dans un fermenteur de 4 L avec 2 L de milieu à un débit d'aération de 0,5 vvm et une vitesse d'agitation de 800 rpm assurée par une turbine centripète à double effet.
Après 17 heures de culture dès lors que le glucose du milieu est épuisé, on ajoute 60 mL d'huile de tournesol oléique dans le réacteur que l'on soumet à une alimentation continue de glycérol à raison de 1 mL/h. Le pH de la culture est alors maintenu dans une gamme de 7,5 à 8 par addition régulée de soude 4 M. La fermentation dure 130 h. En fin de culture, on élimine la biomasse cellulaire par centrifugation. Le surnageant est ensuite acidifié jusqu'à pH 2,5 par addition d'HCI 6M et les acides dicarboxyliques insolubles sont récupérés par centrifugation du moût acidifié puis séchés.
La composition en acides dicarboxyliques du mélange est déterminée par chromatographie en phase gazeuse sur une colonne DB1 après conversion des acides dicarboxyliques en diesters selon la méthode décrite par Uchio et al. Agr Biol Chem 36, No. 3, 1972, 426-433. La température du four du chromatographe est programmée de 150°C à 280°C à raison de 8°C par min.
Exemple 2 - Alk3p convertit in vitro les acides gras en diacides
Chez Yarrowia lipolytica, il existe 17 gènes codant des cytochromes P450, dont 12 appartiennent à la famille CYP52. Tous ces gènes CYP52 sont inductibles en présence d'alcanes.
Il a été montré que leur délétion affectait la croissance des levures en présence d'alcanes.
Les inventeurs ont ainsi testé la fonction de 7 de ces gènes de Yarrowia lipolytica afin de déterminer leur rôle biologique dans le métabolisme des molécules aliphatiques.
Résultats
Les études enzymologiques sur les membres de la famille CYP52 ont été menées en étudiant le métabolisme de l'acide laurique.
Afin de confirmer leurs hypothèses selon lesquelles ces enzymes catalysent les acides gras par réaction d'oxygénation, les inventeurs ont réalisé un criblage en utilisant des microsomes de levure S. cerevisiae WAT11 transformées avec 6 des gènes de la famille CYP52 clonés chez Yarrowia lipolytica : ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6 et ALK11 .
Les incubations ont été réalisées sur le substrat modèle que constitue l'acide laurique (C12.0), en présence de NADPH.
Les mélanges réactionnels ont été déposés sur des plaques TLC, puis développées et analysés.
Comme le montre les Figures 1A à 1 E, seules quatre des 6 préparations microsomales sont capables de convertir l'acide laurique en un produit hautement polaire. Aucun pic n'est observé pour le témoin (réaction sans NADPH) à l'exception du pic correspondant au substrat. Les résultats indiquent que les protéines Alk2p, Alk3p,
Alk5p et Alk11 p sont capables de métaboliser l'acide laurique.
Afin d'étudier la spécificité de substrat de ces enzymes, les inventeurs ont incubé chaque préparation microsomale avec des acides gras libres de taille différente et à différents niveaux d'insaturation (par exemple l'acide myristique - C14:0, l'acide palmitique - C16:0, l'acide stéarique - C18:0, l'acide oléique - C18:1 and l'acide linoléique - C18:2).
Les taux de conversion pour ces substrats incubés à une concentration de 100 μΜ montrent que la plupart des acides gras sont convertis :
Gene Taux de conversion (%)
Cl2:0 Cl4:0 Cl6:0 Cl8:0 Cl8:1 Cl8:2
ALK2 7,3 1 , 1 0,5 N.D. N.D. N.D. ALK3 65 68 20 3 27 35
ALK4 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 3
ALK5 24 27 12 2 13 11
ALK6 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
ALK11 Traces N.D. N.D. N.D. 2 4
ND : non détec table
Par exemple Alk2p semble être impliqué dans le métabolisme des acides gras à courtes chaînes, avec un taux de conversion qui diminue de l'acide laurique à l'acide palmitique. Aucune conversion significative de C18:0 n'est observée avec cette enzyme.
Alk4p, Alk6p et Alk11 p montrent quant à eux soit une absence d'activité soit une activité très faible.
Les microsomes contenant Alk3p and Alk5p convertissent quant à eux tous les substrats avec un fort taux de conversion. De plus, Alk3p montre deux produits de conversion pour tous les substrats sauf pour l'acide stéarique. Le premier pic a un profil attendu pour un acide gras ω-hydroxylé, tandis que le second semble correspondre à un diacide. Les exemples de la conversion de l'acide laurique sont montrés aux Figures 1A à 1 E.
Au vu de ces résultats, les inventeurs ont étudié plus avant Alk3p afin de caractériser les produits de la réaction.
Les préparations de microsomes frais de levure exprimant Alk3p ont été réalisées. Les inventeurs ont normalisé le contenu total en protéines et ont réalisé de nouvelles incubations avec de l'acide laurique et de l'acide palmitique ainsi que les trois acides gras en C18 susmentionnés (acide stéarique, acide oléique et acide linoléique). Toutes les réactions ont été réalisées en double en présence de NADPH pour une analyse par TLC et GC-MS. Les chromatogrammes TLC montrent clairement la capacité d'Alk3p à convertir chacun des substrats sauf l'acide stéarique en deux produits. Les deux produits ont un profil d'oo-oxydation et de diacide, comme attendu.
En ce qui concerne l'acide stéarique, seul un produit d'oo-oxydation est obtenu. Les analyses par GC-MS confirment une ω-oxydation de tous les substrats. Toutefois, dans les conditions utilisées par les inventeurs, aucun diacide n'est détectable pour les acides gras ayant moins de 18 carbones.
L'analyse des produits de réaction obtenus grâce à Alk3p sont :
- Pour une incubation avec l'acide laurique (C12:0) le spectre de masse obtenu pour le pic de produit montre des ions m/Z (intensité relative en %) à 73 (43%) (CH3)3Si+, 75 (50%) [(CH3)2Si+=0], 103 (20%) [CH2(OSi(CH3)3)], 146 (5%) [CH2=C+(OSi(CH3)3-OCH3], 159 (6%) [CH3-0+=C+(OSi(CH3)3)CH=CH2], 255 (100%) (M-47) [perte de méthanol pour le fragment (M-15)], 271 (5%) (M-31 ) (perte de OCH3 de l'ester de méthyle), et 287 (42%) (M-15) (perte de CH3 du groupe TMSi). Ce profil de fragmentation est caractéristique d'un dérivé d'acide 12-hydroxylaurique (M = 302g/mol),
- Pour une incubation avec l'acide palmitique (C16:0) le spectre de masse obtenu pour le pic de produit montre des ions m/Z (intensité relative en %) à 73 (28%) (CH3)3Si+, 75 (39%) [(CH3)2Si+=0], 103 (14%) [CH2(OSi(CH3)3)], 146 (7%) [CH2=C+(OSi(CH3)3-OCH3], 159 (6%) [CH3-0+=C+(OSi(CH3)3)CH=CH2], 311 (100%) (M- 47) [perte de méthanol pour le fragment (M-15)], 327 (4%) (M-31 ) (perte de OCH3 de l'ester de méthyle), et 343 (32%) (M-15) (perte de CH3 du groupe TMSi). Ce profil de fragmentation est caractéristique d'un dérivé d'acide 16-hydroxypalmitique (M = 358g/mol).
- Pour une incubation avec l'acide stéarique (C18:0) le spectre de masse obtenu pour le pic de produit montre des ions m/Z (intensité relative en %) à 73 (51 %) (CH3)3Si+, 75 (94%) [(CH3)2Si+=0], 103 (15%) [CH2(OSi(CH3)3)], 146 (9%) [CH2=C+(OSi(CH3)3-OCH3], 159 (4%) [CH3-0+=C+(OSi(CH3)3)CH=CH2], 339 (100%) (M- 47) [perte de méthanol pour le fragment (M-15)], 355 (3%) (M-31 ) (perte de OCH3 de l'ester de méthyle), 371 (35%) (M-15) (perte de CH3 du groupe TMSi), et 386 (2%) (M). Ce profil de fragmentation est caractéristique d'un dérivé d'acide 18- hydroxystéarique (M = 386 g/mol).
- Pour une incubation avec l'acide oléique (C18:1 ), deux produits ont été détectés par analyse GC-MS (Figures 2A à 2C). Le spectre de masse obtenu pour le premier pic de produit montre des ions m/Z (intensité relative en %) à 73 (86%) (CH3)3Si+, 75 (100%) [(CH3)2Si+=0], 103 (26%) [CH2(OSi(CH3)3)], 146 (14%) [CH2=C+(OSi(CH3)3-OCH3], 159 (18%) [CH3-0+=C+(OSi(CH3)3)CH=CH2], 337 (60%) (M- 47) [perte de méthanol pour le fragment (M-15)], 353 (8%) (M-31 ) (perte de OCH3 de l'ester de méthyle), 369 (19%) (M-15) (perte de CH3 du groupe TMSi), et 384 (12%) (M). Ce profil de fragmentation est caractéristique d'un dérivé d'acide 18- hydroxyoléique (M = 384 g/mol) [30]. Le second pic montre des ions m/z (intensité relative en %) à 55 (100%), 276 (35%), 290 (8%), 309 (18%) (M-31 ) (perte de OCH3 de l'ester de méthyle) and 340 (3%) (M). Ce profil de fragmentation est caractéristique d'un dérivé authentique d'acide 1 , 18-octadeca-9-ènedioique (M=340 g/mol).
- Pour une incubation avec l'acide linoléique (C18:2) deux produits ont été détectés par analyse GC-MS. Le spectre de masse obtenu pour le premier pic de produit montre des ions m/Z (intensité relative en %) à 73 (100%) (CH3)3Si+, 75 (91 %) [(CH3)2Si+=0], 103 (15%) [CH2(OSi(CH3)3)], 146 (7%) [CH2=C+(OSi(CH3)3-OCH3], 159 (8%) [CH3-0+=C+(OSi(CH3)3)CH=CH2], 335 (8%) (M-47) [perte de méthanol pour le fragment (M-15)], 351 (2%) (M-31 ) (perte de OCH3 de l'ester de méthyle), 367 (7%) (M- 15) (perte de CH3 du groupe TMSi), and 382 (2%) (M). Ce profil de fragmentation est caractéristique d'un dérivé d'acide 18-hydroxylinoléique (M = 382 g/mol). Le second pic montre des ions m/z (intensité relative en %) à 55 (60%), 274 (12%), 307 (10%) (M-31 ) (perte de OCH3 de l'ester de méthyle) and 338 (2%) (M). Ce profil de fragmentation pourrait être celui d'un dérivé 1 , 18-octadéca-9, 12-diènedioique (M=338 g/mol). Cette hypothèse est également supportée par le temps de rétention dans le système d'analyse GC-MS utilisé. En effet, ART entre les hydroxyl et les diacides pour l'acide oléique sont de 0,5 minutes. Le même ART entre l'hydroxy et le potentiel diacide est également observe pour l'acide linoléique (RT du potentiel acide 1 , 18-octadéca-9, 12- diènedioique est 45,002 min, RT pour l'acide 18-hydroxylinoléique est 45,511 min, min, RT de l'acide 1 ,18-octadéca-9-ènedioic est 45,299 min et RT de l'acide 18- hydroxyoléique est 45,853 min).
Les mêmes résultats sont obtenus avec la protéine Alk5p.
Les chromatogrammes TLC ont été utilisés pour calculer l'activité spécifique d'Alk3p et Alk5p pour les substrats testés. Les résultats pour Alk3p et Alk5p sont présentés aux Figures 3A et 3B.
Il n'existe pas de grande différence entre Alk3p et Alk5p pour les différents acides gras testés. Cependant, en regardant les profils des acides gras en C19, il apparaît que Alk3p est un meilleur candidat pour une oxydation des longues chaînes comparé à Alk5p. De plus, la conversion d'acide gras libre en diacide, catalysée par Alk3p est plus efficace qu'avec Alk5p.
Conclusion
Chez Yarrowia Iipolytica, l'expression des gènes ALK est connue pour être fortement régulée par les alcanes. Concernant leur activité in vitro sur les acides gras libres, une hypothèse est que Alk3p et/ou Alk5p pourraient être impliqués dans l'oxydation terminale successive des alcanes en les convertissant successivement en alcool gras, puis acides gras, puis hydroxyl alcools gras et finalement en diacides.
Une telle conversion pourrait conduire à des substrats utilisables comme sources de carbone et d'énergie par la voie de la β-oxydation.
Dans les expériences in vitro, les inventeurs ont démontré qu'Alk3p et Alk5p catalysaient effectivement Γω-oxydation des acides gras libres de C12 à Ci8.
Ces travaux révèlent la grande diversité de produit et de substrat des protéines Alk de Y. Iipolytica. Grâce à ces résultats, les inventeurs ont désormais une indication sur quelle protéine est capable de produire un produit d'intérêt. Cette connaissance est importante pour créer de nouvelles souches capables de bioconversion de l'acide oléique en son diacide correspondant.
Matériel et méthodes Clonage des gènes ALK à partir Y. lipolytica
Les séquences codantes des gènes CYP52 ont été clonées par PCR en utilisant une préparation d'ADN de la souche W29 de Yarrowia lipolytica. Les amorces sens et antisens ont été préparées en incluant des sites de restrictions aux deux extrémités pour réaliser les clonages. L'amplification par PCR a été mis en œuvre en utilisant la Polymerase Pyrobest pour 30 cycles (15 secondes à 96°C, 30 secondes à 55°C, 1 minute 30 secondes à 72°C). Les fragments d'ADN résultant ont été purifiés par électrophorèse en utilisant le kit QIAquick Gèle Extraction. Les fragments purifiés ont été digérés par la combinaison appropriée d'enzymes de restriction et lié dans le vecteur navette pYeDP60 en utilisant l'ADN ligase de T4. Les produits de ligations ont été utilisés pour transformer E.coli Mach 1 T1 chimiquement rendu compétente. Les cellules E. coli transformées ont été sélectionnées sur milieu LB additionné de 100μg/ml d'ampicilline. Les plasmides d'une seule colonie ont été purifiés par miniprep. L'intégrité du plasmide et sa séquence ont été validés par analyse de restriction et séquençage d'ADN (GATC Biotech, Constance, Germany).
Expression hétéro logue dans S. cerevisiae
L'expression des protéines des 6 membres de la famille 6YP52 clonés a été réalisée en utilisant un système hétérologue spécifiquement conçu pour l'expression des enzymes cytochrome P450, basé sur le vecteur pYeDP60 et la souche WAT11 de Saccharomyces cerevisiae. La souche WAT11 a été transformée avec chacune des constructions pYeDP60 en utilisant la méthode de l'acétate de lithium LiAc. Les transformants ont été sélectionnés par étalement sur des boites YNB dépourvu d'uracile. Les levures sont laissées en culture et l'expression du cytochrome P450 a été induite comme décris dans POMPON et al., 1996. Pour chaque transformant les microsomes ont été préparés en brisant manuellement les cellules en utilisant des billes de verres (0,45mm de diamètre) dans 50mM d'un tampon Tris-HCI (pH 7,5) contenant 1 mM EDTA et 600mM de sorbitol. L'homogénat a été soumis à une centrifugation (10 000g-15min) et le surnageant résultant a été soumis à une ultracentrifugation (100 000g-1 h). Le culot de microsome a été resuspendu dans 50mM Tris-HCI (pH 7,4), mM EDTA et 30% (v/v) de glycérol avec un homogénéisateur Potter-Elvehjem. Le volume de tampon utilisé pour la resuspension des microsomes a été déterminé par la masse approximative du culot humide de levure obtenu après croissance (1 mL de tampon pour 2g de culot cellulaire). Les concentrations totales de protéine dans les microsomes ont été estimées en utilisant le test de Brasdford et homogénéisé à 15mg/mL en utilisant le volume approprié de tampon de resuspension. La préparation de microsomes a été stockés à -20°C. Toutes les expériences pour les préparations des microsomes ont été réalisées entre 0 et 4°C. Test enzymatique in vitro
L'activité des enzymes cytochrome P450 a été évaluée in-vitro en utilisant différents acide gras radio marqués. Le test standard (0, 1 mL) contenait 20mL sodium phosphate (pH 7,4), 1 mL NADPH) un substrat radiomarqué (100μΜ) et 0,15mg de protéine microsomale. Les réactions ont été mises en œuvre dans un bain-marie à 27°C sous agitation continu. La réaction est initiée par ajout de NADPH et stoppée après 20min en ajoutant 20μί d'acétonitrile contenant 0,2% d'acide acétique. Les réactions ont alors été révélées par application directe du milieu d'incubation sur les plaques TLC ou par analyse GC-MS réalisées par une extraction avec des solvants organiques et une étape de dérivation comme décrite ci-après.
Analyse TLC
Les mélanges réactionnels ont été déposés directement sur des plaques TLC recouvertes de silice pour séparer les produits d'incubation du substrat initial. Les plaques ont été développées en utilisant un mélange éther/éther de pétrole/acide formique (50:50 :1 ,v/v/v). Les plaques ont été scannées en utilisant un détecteur de radioactivité. Les chromatogrammes résultant de la TLC permettent la détermination des taux de conversion pour chaque combinaison cytochromes P450/acide gras, basée sur la radioactivité détectée par le lecteur. La mobilité des produits sur la plaque TLC est une bonne indication du type de réaction d'oxygénation qui a été réalisé sur le substrat (i.e. hydroxylation, époxydation, formation de diacides). Ces résultats ont été confirmés par GC/MS autant que possible.
Analyse GC-LS
Les métabolites ont été extraits du mélange réactionnel par des extractions liquides/liquide successives avec de l'éther diéthylique et de l'hexane comme solvants. Les solvants ont ensuite été évaporés sous un flux d'azote. Les lipides ont été méthylés par une réaction dans du méthanol acide (MeOH/H2S04,99 :1 ,v/v-1 h-100°C) et triméthylsilylates avec de la Ν,Ο-bistrimethylsilyltrifluoroacétamide contenant 1 % (v/v) de triméthylcholrosilane. Les analyses GC/MS ont été mises en œuvre sur un chromatographe à gaz équipé avec une colonne capillaire avec un diamètre interne de 0,25mm et une épaisseur de film de 0,25μηι. Le chromatographe à gaz a été combiné à un détecteur sélectif de la masse de type quadrupole. Le spectre de masse a été enregistré à 70eV et analysé comme dans Eglinton et al. 1996. Les acides gras hydroxylés tout comme les acides dicarboxyliques formés durant les réactions enzymatiques ont été identifiés par analyse de leur spectre de masse et comparés avec des contrôles quand cela était nécessaire.
Exemple 3 - Surexpression d'ALK3
Au vu des résultats obtenus à l'exemple 2, les inventeurs ont testé la surexpression du gène ALK3 chez Yarrowia lipolytica en vue d'augmenter la production de diacide à partir d'une source d'acide gras, et notamment d'acide oléique.
Il avait été décidé de réaliser ces modifications dans deux contextes génétique : 1 ) la souche de production Y2149 (souche performante mais qui contenant le gène CYP51A17 de Candida tropicalis et qui n'est pas complètement bloquée pour le stockage de lipide sous forme de TAG ) et la Y2159+CPR1 (dérivée de la souche OLEO-X qui produit un peu moins de diacides, est plus sensible aux lipides, mais qui avait l'avantage de ne plus stocker les acides gras sous formes de triacylglycérol).
La surexpression d'Alk3 et de Cyt B5 dans les deux contextes génétiques n'a pas permis une amélioration de la production d'acide cis-octadéc-9-éne dioïque (DC18 :1 ), au contraire, les inventeurs ont observé une diminution de la production de DC18 :1 (Figure 4).
Ces résultats sont à l'opposé de l'effet observé d'une activité hydroxylase spécifique pour l'acide oléique d'ALK3 in vitro à l'exemple 2.
D'après ces résultats décevant, les inventeurs ont cherché à savoir si d'autres enzymes telles que les enzymes FALDHs, qui sont impliquées dans la dernière étape de la voie de synthèse de diacides ou par d'autres enzymes de la voie de synthèse tels que les ADHs et la FAO pouvaient être intéressantes pour augmenter la production de diacides.
Exemple 4 - Surexpression des gènes FALDH3 ou FALDH4
En parallèle, les inventeurs ont identifié les gènes codant potentiellement pour une activité déshydrogénases d'aldéhydes gras (quatre gènes nommés FALDH1 -4). Ces gènes ayant montrés, au cours de l'analyse transcriptomiques durant une cinétique de production de DC18 :1 (fermentation DCA7) une forte expression au cours de la phase de production de diacide.
Les cassettes d'expression des quatre gènes codant les FALDH's ont été construits sous le contrôle du promoteur constitutif pTEF. Les inventeursont transformé les deux souches : Y2149 et Y2159 (souche de production et souche OLEO-X). Les souches obtenues ont étés vérifiés par PCR et mise en collection.
Afin de connaître si la dernière étape de la synthèse de DC18 :1 , qui implique les enzymes FALDH est cruciale, les inventeurs ont les ont transformé avec les vecteurs de surexpression dans la souche OLEO-X qui surexprime le gène CPR1 .
Les inventeurs n'ont obtenu que des souches qui surexpriment les gènes FALDH3 et FALDH4. Il est possible que la surexpression des gènes FALDH1 et FALDH2 soit toxique et létale pour les souches de production.
Après caractérisation des souches, les inventeurs ont testé la production de diacides en comparant les souches OLEOX surexprimant CPR1 et FALDH3 et OLEOX surexprimant CPR1 et FALDH4. En contrôle, la souche OLEOX ne surexprimant que CPR1 a été utilisée.
Les résultats sont présentés à la Figure 5.
Les résultats montrent que la surexpression de FALDH3 ou FALDH4 n'améliore pas la production de DC18:1 , bien au contraire il y a une diminution de la production de diacides. Ces résultats sont donc similaires à ceux observés pour la surexpression d'ALK3.
Exemple 5 - Surexpression des gènes ADH2 et ADH5
Les inventeurs ont également testé l'effet de la surexpression des gènes ADH2 et ADH5 sur la production de diacides. Des souches de Yarrowia lipolytica de génotype FT164, pox1-6A, dgalA, lro1 :: URA3, CPR1 ont été transformées avec les cassettes de surexpression des alcools déshydrogénases (ADHs) pPOX2-ADH2 et pPOX2- ADH5. Les souches obtenues ont étés vérifiés par PCR et mise en collection
Après caractérisation des souches, les inventeurs ont testé la production de diacides en comparant les souches surexprimant CPR1 et ADH2 et surexprimant CPR1 et ADH5. En contrôle, la souche ne surexprimant que CPR1 a été utilisée.
Les résultats sont présentés à la Figure 9.
Les résultats montrent que la surexpression d'ADH2 ou ADH5 n'améliore pas la production de DC18:1 , bien au contraire il y a une diminution de la productivité de diacides notamment lors de la surexpression d'ADH5. Ces résultats sont donc similaires à ceux observés pour la surexpression d'ALK3 ou la surexpression de FALDH3 ou FALDH4.
Exemple 6 - Surexpression des gènes ALK3 + ADH2 et/ou ADH5 + FALDH3 et/ou FALDH4 et/ou FAQ1
Malgré les résultats négatifs obtenus, qui les ont dissuadés d'utiliser les gènes ALK3 ou FALDH3 ou 4, les inventeurs ont tout de même testé toutes les souches qui surexpriment la voie de synthèse de diacide en entier.
Les souches étudiées dans une première expérience surexpriment l'une quelconque des combinaisons suivantes :
- ALK3 + CPR1 + ADH2 + FALDH3,
- ALK3 + CPR1 + ADH2 + FALDH4,
- ALK3 + CPR1 + ADH5 + FALDH3, et
- ALK3 + CPR1 + ADH5 + FALDH4.
Des cultures en fioles ont été réalisé et les meilleurs résultats ont été obtenus pour la combinaison suivantes ALK3+CPR1 +ADH2+FALDH3,
ALK3+CPR1 +ADH2+FALDH4 et ALK3+CPR1 +ADH5+FALDH3. Une deuxième cinétique de production a été réalisée pour confirmer les résultats précédents.
Les résultats obtenus pour les souches surexprimant ALK3+CPR1 +ADH2 + FALDH3 ou ALK3+CPR1 +ADH2 + FALDH4 sont présentés en Figure 6. La souche utilisée comme contrôle est OLEOX qui surexprime le gène CPR1 .
La cinétique de production de diacide a montré que la souche surexprimant ALK3+CPR1 +ADH2+FALDH3 présente une amélioration dans la production finale de DC18 :1 qui représente une augmentation de 20%.
La souche surexprimant ALK3+CPR1 +ADH2+FALDH4 ne présente pas une amélioration dans la production finale, mais il a une vitesse de production augmentée dans la phase de production de DCA. Ceci représente une amélioration intéressante en termes de productivité.
Au cours de la caractérisation des souches obtenues, un article a été publié par Gatter M et al. (Gatter et al., 2014 FEMS Yeast Res. 2014 Sep; 14(6):858), où ils sont identifiés une enzyme avec une activité oxydase d'alcool gras (FA01 ). Les inventeurs ont surexprimé ce gène sur le promoteur pTEF dans une souche qui surexprime les gènes CPR1 +ALK3 et ADH2.
Trois souches ont été testées pour leur capacité de production de diacide, en fiole. Une première expérience a montré une augmentation de 25%-60% de la production finale de DC18 :1 par rapport à la souche contrôle (OLEOX surexprimant CPR1 ). Les résultats sont représentés à la Figure 7.
Une deuxième expérience a permis aux inventeurs de suivre plus en détail la phase de production de diacide et les résultats précédents ont été confirmés. De plus, une forte amélioration de la productivité dans les 12-24h de la phase de production a été observée. Les résultats sont présentés à la Figure 8.
Ces résultats montrent l'obtention d'une souche capable d'augmenter la production et la productivité de DC18 :1 et en plus, que le gène FA01 joue un rôle très important pour la bioconversion d'acide oléique en DC18 :1.
L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation présentés et d'autres modes de réalisation apparaîtront clairement à l'homme du métier.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une souche de levure incapable de dégrader les acides gras, notamment une souche de Yarrowia lipolytica, surexprimant au moins les gènes suivants :
- le gène ALK3, codant une cytochrome P450 mono oxygénase
- l'un au moins des gènes ADH2 et ADH5 codant chacun une déshydrogénase d'alcools, et
- l'un au moins des gènes FALDH3 et FALDH4, codant chacun une déshydrogénase d'aldéhydes gras ou le gène FA01 codant une oxydase d'alcool gras,
pour la préparation par fermentation d'au moins un diacide carboxylique à partir d'acides gras, notamment des acides gras issus d'huiles végétales.
2. Utilisation selon la revendication 1 , où ladite souche de levure surexprime en outre le gène CPR1 qui code pour une NADPH-cytochrome réductase.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, où ladite levure est en outre disruptée pour les gènes codant les iso-enzymes de l'acyl-CoA oxydase POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 et POX6.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, où ladite levure est en outre disruptée pour les gènes DGA 1, DGA2 et/ou LR01.
5. Méthode de production d'au moins un acide dicarboxylique comprenant les étapes suivantes :
a) une phase de croissance, dans laquelle on met en culture une souche de levure incapable de dégrader les acides gras surexprimant au moins les gènes suivants :
- le gène ALK3, codant une cytochrome P450 mono oxygénase
- l'un au moins des gènes ADH2 et ADH5 codant chacun des déshydrogénases d'alcools, et
- l'un au moins des gènes FALDH3 ou FALDH4, codant des déshydrogénases d'aldéhydes gras ou le gène FA01 codant une oxydase d'alcool gras,
dans un milieu de culture constitué essentiellement d'un substrat énergétique qui comprend au moins une source de carbone et une source d'azote, et
b) une phase de bioconversion, dans laquelle ladite souche de levure est mise en contact avec au moins un acide gras ou un hydrocarbure, de préférence en présence d'un substrat énergétique.
6. Méthode selon la revendication 5, comprenant en outre une étape de récupération dudit au moins un diacide carboxylique formé.
7. Méthode selon la revendication 5 ou la revendication 6, dans laquelle les acides gras sont sous forme d'un mélange, et notamment sous forme d'une huile végétale ou d'un mélange d'alcanes, en particulier une huile choisie parmi l'huile de colza, l'huile de colza oléique, l'huile de tournesol, l'huile de tournesol oléique, l'huile de coco, l'huile de palme, l'huile palmiste, l'huile d'olive, l'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile de mais, l'huile de moutarde, l'huile de ricin, l'oléine de palme, la stéarine de palme, l'huile de carthame, l'huile de sésame, l'huile de lin, l'huile de noix, l'huile de pépins de raison, l'huile de chanvre ou un sous-produit issus de l'extraction de celles-ci, ou des huiles de poisson ou de levures, de bactéries ou de micro-algues.
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, où ladite levure est en outre disruptée pour les gènes codant les iso-enzymes de l'acyl-CoA oxydase POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 et POX6.
9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, où ledit au moins un acide gras est un mélange d'acide gras présentant en poids une quantité de plus de
30% d'acide oléique par rapport au poids total du mélange.
10. Composition comprenant un mélange de diacides carboxyliques susceptibles d'être obtenus par le procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 6 à 9.
11. Composition comprenant:
- une première molécule d'acide nucléique correspondant au gène ALK3, codant une cytochrome P450 mono oxygénase
- au moins une deuxième molécule d'acide nucléique correspondant à l'un au moins des gènes ADH2 et ADH5 codant chacun des déshydrogénases d'alcools, et
- au moins une troisième molécule d'acide nucléique correspondant à l'un au moins des gènes FALDH3 ou FALDH4, codant des déshydrogénases aldéhydes gras ou correspondant au gène FA01 codant une oxydase d'alcool gras,
lesdites première molécule d'acide nucléique, deuxième molécule d'acide nucléique et troisième molécule d'acide nucléique étant liées ou individualisées
12. Composition selon la revendication 11 , où
- la première molécule d'acide nucléique correspondant au gène ALK3, ladite première molécule d'acide nucléique comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 1
- la seconde molécule d'acide nucléique correspondant au gène ADH2 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 5, ou au gène ADH5 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 6, et
- la troisième molécule d'acide nucléique correspondant au gène FALDH3 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID
NO : 7, ou au gène FALDH4 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 8, ou au gène FA01 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 9, éventuellement en association avec une quatrième séquence molécule d'acide nucléique correspondant au gène CPR1 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 14.
13. Souche de levure transformée par une composition comprenant au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie dans la revendication 11 ou 12.
14. Souche de Yarrowia lipolytica choisie parmi les souches suivantes :
- la souche Y3551 , de génotype MATA ura-3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga IroU dga2A fad2A ALK3-LEU2 et de phénotype [Leu+ lira-],
- la souche Y3950 dérivée de la souche Y3551 , de génotype MATA ura3-302 Ieu2- 270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dgaU IroU dga2A fad2A ALK3-LEU2 CPR1-URA3 et de phénotype [Leu+ Ura+], déposée le 26 mars 2015 à la CNCM (Collection Nationale de Culture de microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15) sous le numéro CNCM I - 4963,
- la souche Y4428 dérivée de la souche Y3950, de génotype MATA ura3-302 Ieu2- 270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 et de phénotype
[Leu- lira-],
- la souche Y4457dérivée de la souche Y4428, de génotype MATA ura3-302 Ieu2- 270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 et de phénotype [Leu- Ura+], et
- les souches Y4832, Y4833 et Y4834, déposées le 14 mars 2016 à la CNCM sous les numéros respectifs CNCM I - 5072, CNCM I - 5073 et CNCM I - 5074, ces souches étant dérivées de la souche Y4457, et ont pour génotype MATA ura3- 302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2- URA3 FA01-LEU2 et pour phénotype [Leu+ Ura+].
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